CZ20023772A3

CZ20023772A3 - Stálá biologicky kompatibilní mikroemulze

Info

Publication number: CZ20023772A3
Application number: CZ20023772A
Authority: CZ
Inventors: Francesco Autuori; Carlo Bianchini; Giuseppe Bottoni; Flavio Leoni; Paolo Mascagni; Valmer Monzani; Oreste Piccolo
Original assignee: Italfarmaco S. P. A.
Priority date: 2000-05-26
Filing date: 2001-05-23
Publication date: 2003-02-12
Also published as: IL153011A0; PT1283700E; CZ302059B6; CA2409854A1; NO20025621L; PL203354B1; ZA200209520B; AU8178601A; ITMI20001173A1; BRPI0111016B1; HUP0301921A2; EP1283700A2; IT1318539B1; HU228926B1; US7157099B2; CY1105262T1; WO2001089479A2; ATE321533T1; NO20025621D0; YU88202A

Description

• ·

Stálá biologicky kompatibilní mikroemulze

Oblast techniky

Vynález se týká stálé, biologicky kompatibilní, dobře snášené mikroemulze typu voda v oleji. Obecně se vynález týká farmaceutického prostředku pro parenterální podání, v němž je účinná složka hydrofilní nebo je zpracována tak, aby byla hydrofilní. Takové složky se s výhodou podávají ve formě mikroemulze typu voda v oleji, která se dobře snáší a prostředek je přitom chráněn proti okamžitému rozkladu působení hydrolytických enzymů, přítomných v živém organismu. Tímto způsobem je možno dosáhnout řízeného uvolňování účinné látky v průběhu delšího časového období, tak aby bylo možno odstranit nutnost častého opakovaného podávání. Prostředky jsou určeny pro injekční podávání, nevyvolávají významnější vedlejší účinky a snadno se připravují v průmyslovém měřítku, takže znamenají značné technické zlepšení.

Dosavadní stav techniky

Mikroemulze je možno obecně definovat jako opticky isotropní systémy, které jsou průhledné, nejsou dvoj lomné při pozorování v polarizovaném světle, jsou thermodynamicky stálé a jejich kapičky mají velmi malý průměr v rozmezí 5 až 200 nm. Tyto mikroemulze se získávají dispergováním dvou vzájemně němísitelných kapalin, které jsou stabilizovány přítomností emulgátorů, modifikujících chemickofyzikální vlastnosti povrchu mezi oběma uvedenými kapalinami, zejména snižují povrchové napětí v podstatě na nulové hodnoty. Aby mohla vzniknout emulze, musí být přítomen olej, voda, smáčedlo nebo • 4 ·· ·

• 4 prostředek, měnící povrchové napětí a popřípadě ještě pomocné smáčedlo nebo pomocný prostředek pro změnu povrchového napětí. Tendence ke tvorbě mikroemulze typu voda v oleji nebo olej ve vodě závisí na vzájemných podílech vodné a olejové fáze a také na povaze smáčedla.

Z diagramů, týkajících se ternární fáze se složkami voda, hydrofobní sloučenina a směs smáčedla a pomocného smáčedla, je možno vymezit plochu, v níž mohou existovat stálé emulze typu voda v oleji a olej ve vodě. Například v publikaci Aboofazeli a další, Int. J. Pharm. 111, 1994, 63-72 jsou popsány výsledky studií, při nichž byla sledována schopnost různých látek jako pomocných rozpouštědel napomáhat tvorbě mikroemulzí typu voda v oleji. Systém, sledovaný v této publikaci byl tvořen směsí esterů mastných kyselin a lecitinu jako pomocného smáčedla v poměru 1:1 a příměsí vody v různých poměrech. Byla definována stupnice pro účinnost sloučenin, použitých jako pomocná smáčedla: primární aminy >

> alkoholy > mastné kyseliny. Mimoto bylo prokázáno, že účinnost závisí na délce alkylového řetězce alkoholu a mastné kyseliny. Vzniká tedy stupnice butanol>pentanol>hexanol>kyselina pentanová>kyselina hexanová. Na základě těchto údajů jsou nej výhodnějšími látkami alkoholy, jako butanol a pentanol a v menším také odpovídající mastné kyseliny. Použití takových sloučenin dovoluje přípravu stálých mikroemulzí typu voda v oleji, avšak nezajišťuje, že tyto prostředky budou dobře snášeny, zvláště v případě depotních prostředků, které zůstávají při podkožním nebo nitrosvalovém podání ve styku s tkání po dobu několika dnů nebo dokonce týdnů.

♦ · ♦ · ·« ·« ·· · ·♦ ·· · · · ··· · · ·· · ··«··· · · · · · β • · · · · · · ··· · ··· *·· ·· ····

Mimoto se v literatuře uvádí jako kritický poměr pomocného smáčedla a smáčedla. Údaje ve svrchu uvedené publikaci uvádějí poměr 1:1 mezi těmito dvěma složkami.

V publikaci Atwood a další, Int. J. Phatmacy 84 R5, 1992 jsou popsány výsledky sledování směsí lecithinu, vody, esteru mastné kyseliny a butanolu v případech, že poměr smáčedla k pomocnému smáčedlu byl zvýšen z přibližně 1,7 až na 3. Autoři uvádějí, že při použití menšího množství pomocného smáčedla dochází k dramatickému omezení plochy, na níž je možno pozorovat tvorbu mikroemulze typu voda v oleji, a to i při použití velmi účinného pomocného smáčedla, například butanolu.

Smáčedla se obvykle hodnotí podle empirické stupnice, známé jako hydrofilní-lipofilní rovnováha (HLB), stupnice má hodnoty 1 až 40. Zpravidla mají vhodná smáčedla pro tvorbu mikroemulzí typu voda v oleji nízké hodnoty HLB, kdežto smáčedla, vhodná pro mikroemulze typu olej ve vodě mají vysoké hodnoty HLB. V případě, že povrchové napětí na rozhraní je nižší než x 10’² dyn/cm, může se vytvořit stálá mikroemulze.

Případná přítomnost pomocného smáčedla usnadňuje vznik mikroemulze vzhledem k tomu, že molekuly pomocného smáčedla pronikají mezi molekuly smáčedla, čímž vzniká nehomogenní povrchový film. Pomocná smáčedla mohou také snižovat hydrofilnost vodné fáze a tím i povrchové napětí mezi oběma fázemi. Zásadně je použití pomocných smáčedel výhodné vzhledem k tomu, že při jejich použití je možné snížit množství smáčedla a současně zvýšit stálost mikroemulze. Jak již bylo uvedeno svrchu, je však vhodné jejich použití omezit vzhledem k jejich potenciální místní toxicitě, zvláště při styku s podkožní nebo svalovou tkání v průběhu delšího časového období.

9 ·9 ··

99 9 *9

9 9 9 9

9 9 9 9 9

9 9 9 9 • 99 9 9 · ·9 9999

Značné výhody použití mikroemulze jako nosiče pro různé účinné látky jsou známé.

Mikroemulze se mohou za specifických podmínek nebo při specifickém poměru mezi složkami vytvořit samovolně, aniž by bylo zapotřebí použít větší množství energie pro jejich přípravu, takže jejich příprava v průmyslovém měřítku může být snadná. Takové spontánně vytvořené mikroemulze jsou thermodynamicky stálé, homogenní a průhledné, takže je možno je sledovat spektroskopicky. Je možno připravit mikroemulze s částicemi se středním průměrem nižším než 100 nm, které je možno sterilizovat při nízkých teplotách filtrací přes běžně dodávané filtry s průměrem otvorů 0,22 μπι. Pomocí mikroemulzí je možno podávat nesnadno rozpustné nebo méně stálé účinné látky.

Uvedené systémy mohou v případě přítomnosti přebytku dispergované fáze projít inverzí fází, nebo k tomuto jevu může dojít v důsledku změny teploty. Tato vlastnost může změnit biologickou dostupnost účinné látky mechanismem, který dosud nebyl zcela objasněn.

Při použití mikroemulzí typu voda v oleji je možno řídit uvolňování účinné látky nebo prodloužit stálost této látky ve fyziologických kapalinách tím, že tyto látky jsou chráněny proti působení hydrolytických enzymů. Existuje řada souhrnných publikací, které se mikroemulzí týkají, jde například o publikaci Industrial application of microemulsions, Marcel Dekker ed. 1997, kde se kapitola Microemulsions in the Pharmaceutical Field: perspectives and applications týká použitelnosti mikroemulzí ve farmacii a také Handbook of Microemulsion • 0 ·

0 ·« 0

0 0 0 • 0000 0 0

0 0

000 0 000 0

0·

0 0

0 0 0 0 0

0 0

0 0 0 0 0

Technology, ed. Mumar Mittal, 1999, kde se popisují chamickofyzikální hlediska.

Použití mikroemulzí typu voda v oleji jako nosných prostředí pro dosažení řízeného uvolňování účinných složek, které jsou hydrofilní nebo jsou upraveny tak, aby měly hydrofilní vlastnosti, je popsáno také v patentové literatuře.

Pro biologicky degradovatelné molekuly, například peptidy, je parenterální podání ve formě mikroemulzí typu voda v oleji uvedeno v publikaci M. R. Gasco a další,

Int. J. Pharm., 62, 119, 1990. Podle této publikace se analog hormonu LHRH uloží do mikroemulze, tvořené složkami, které jsou považovány za biologicky kompatibilní, prostředek obsahuje účinnou složku v množství 500 μρ/ιηΐ a byl podáván jedinou nitrosvalovou injekcí dospělým krysím samcům s hmotností 200 g v dávce 3 mg/kg. V této dávce snižoval tento prostředek koncentraci testosteronu v krevní plasmě po dobu až 30 dnů po jediném injekčním podání. Koncentrace byly přitom nižší, než koncentrace, které bylo možno pozorovat u druhé skupiny krys, jimž byly podávány opakované injekce jednou denně po dobu 28 dnů při dávce 100 μρ/kg účinné látky v roztoku pufru.

Je však nutno uvést, že pokles koncentrace testosteronu nebyl v průběhu celého pozorování homogenní a léčebný účinek bylo možno potvrdit až 8 dnů po podání účinné látky.

Toto opoždění požadovaného léčebného účinku není výhodné zvláště z toho důvodu, že látka se užívá k léčení • 9 • 9 *

9 99 9 • 9 9 « • 9999 · 9

9 9 «99 9 ·99 9

9 9

9999 nádorů prostaty, které vyžadují testosteron ke svému růstu. Čím rychleji se proto zastaví tvorba normálního testosteronu, tím účinnější je léčení.

Svrchu uvedená publikace prokazuje účinnost mikroemulze typu voda v oleji, tvořená 60,5 % ethyloleátu, 10,1 % vody, 18,9 % fosfatidylcholinu a

10,5 % kyseliny kapronové při zpomaleném uvolňování peptidu. Poměr fosfatidylcholinu jako smáčedla a kyseliny kapronové jako pomocného smáčedla je 1,8. Složky uvedené mikroemulze jsou biologicky kompatibilní.

Biokompatibilita mikroemulze jako celku se neuvádí a rovněž se neuvádí vliv mikroemulze na podkožní tkáň.

Podle uvedené literární citace byla připravena mikroemulze typu voda v oleji, obsahující Leuprolidacetát jako účinnou složku s účinností LHRH, 66,9 % ethyloleátu,

9,7 % vody, 19,4 % fosfatidylcholinu a 3,9 % směsi kyseliny kapronové a máselné v poměru 3:1. Podle zmíněné publikace byla použita směs s kyselinou máselnou místo samotné kyseliny kapronové ke snížení poměru smáčedla k pomocnému smáčedlu, který je v tomto případě 4,9 místo

1,8. Zkouška in vivo s podkožním injekčním podáním tohoto produktu krysám potvrdila účinnost mikroemulze, avšak neočekávaně prokázala také nežádoucí účinek na tvorbu místních vředů a přetrvávající tvorbu podkožních granulomů. Tento farmakologicky nepřijatelný výsledek bez ohledu na nižší množství pomocného smáčedla prokázal, že biologická kompatibilita jednotlivých složek mikroemulze nebyla dostatečná pro zajištění biologické kompatibility směsi, tvořící mikroemulzi v případě parenterálního podání.

• Λ tt • · »

9 9

Podobně také směsí, popsané v různých patentových dokumentech, například WO 94/08610 sice poskytovaly stálé mikroemulze a mohly zajistit řízené uvolňování účinné látky v průběhu času, avšak neuvádějí, jak by bylo možno se vyvarovat nežádoucích vedlejších účinků. Tyto mikroemulze jsou obvykle tvořeny vodou, olejovou složkou, smáčedlem, pomocným smáčedlem a popřípadě elektrolytem v různých poměrech. Obvykle není vyhodnocena biologická kompatibilita mikroemulze jako celku, ani není uveden nezbytný poměr složek směsi a účinné složky k dosažení stálosti účinné složky i celé mikroemulze, ani se neuvádí biologická kompatibilita výsledného prostředku.

V patentové literatuře rovněž nejsou specificky brány v úvahu problémy, které se týkají místní snášenlivosti, spojené s nitrosvalovým i.m. a podkožním s.c. podání, přičemž běží o nej snadnější a velmi vhodné způsoby parenterálního podání.

Alternativní technologie, která již byla použita v průmyslovém měřítku pro zpomalené uvolňování peptidů je popsána v řadě patentových spisů, například v dokumentu US 3976071, kde se takového uvolňování dosahuje použitím biologicky erodovatelného polymeru, v němž je účinná látka uložena. Jako typické příklady takových polymerů je možno uvést polymery na bázi kyseliny glykolové a kyseliny mléčné. Nevýhoda této technologie spočívá v tom, že je poměrně nákladná a pracná ve srovnání se svrchu popsanými mikroemulzemi a mimoto vyžaduje použití organických, zvláště chlorovaných rozpouštědel v průběhu přípravy, čímž vznikají další problémy, spojené s ochranou životního prostředí a bezpečností práce.

* 9 4 «

4 9 4 4

9 4 4

444 44 9444

9 4 t

4444 ·

4

944 4

9* *4 · 4

Na druhé straně tyto prostředky nevyvolávají tvorbu granulomů ani nepůsobí místní vředy.

Podstata vynálezu

Vynález si klade za úkol navrhnout stálou biologicky kompatibilní mikroemulzi typu voda v oleji pro farmaceutické použití. Mikroemulze by měla být snadno připravitelná, prostá význačných systemických nebo místních vedlejších účinků, vhodná pro parenterální podání, zvláště i.m. nebo s.c., zvláště vhodná pro složky, které jsou hydrofilní nebo se staly hydrofilními tvorbou vhodného derivátu, takže se dosahuje značného technického zlepšení ve srovnání se známým stavem techniky. Mikroemulze obsahuje a) až 20 % vnitřní hydrofilní vodné fáze s obsahem léčebně účinné hydrofilní látky, b) 30 až 98 % externí hydrofobní fáze, c) až 50 % smáčedla jako takového nebo ve směsi s pomocným smáčedlem.

Při klinickém vyšetření a histologickém vyšetření živočichů, léčených touto mikroemulzi post mortem byl nalezen postup, který je vhodný pro vyhodnocení biologické kompatibility jakéhokoliv prostředku s prodlouženým uvolňováním účinné látky.

Podle tohoto postupu se mikroemulze považuje za přijatelnou na základě hledisek, popsaných v publikaci Protein Fromulation and Delivery, F. J. McKelly 2000, s. 245-247. Podle těchto hledisek je mikroemulze přijatelná v případě, že jakýkoliv místní otok, méně nebo více vyjádřený v závislosti na podané dávce, je reverzibílní. Mimoto je zapotřebí prokázat příslušnou • · • · odpověď tkání. Na druhé straně je míkroemulze nepřijatelná v případě, že dochází k projevům místní nesnášenlivosti ve formě přetrvávajících vředů.

Mikroemulze podle vynálezu obsahuje až 20 % vnitřní hydrofilní vodné fáze s obsahem účinné látky, 30 až 98 % hydrofobní externí fáze a až 50 % smáčedla jako takového nebo ve směsi s pomocným smáčedlem. Mikroemulze s výhodou obsahuje 35 % nebo méně smáčedla a pomocného smáčedla, přičemž poměr smáčedla a pomocného smáčedla se pohybuje v rozmezí > až s výhodou > 3,5.

Mikroemulze může obsahovat ještě jiné biologicky kompatibilní pomocné látky, které neovlivní stabilitu mikroemulze.

Vhodná smáčedla pro mikroemulze podle vynálezu se volí z přírodních nebo syntetických glycerofosfolipidů, které obsahují zbytky nasycených nebo nenasycených C4-C20karboxylových kyselin, které mají jako fosfoesterovou skupinu zbytek cholinu, ethanolaminu, šeřinu nebo glycerolu, dále je možno smáčedlo volit ze skupiny cholesterol, estery C12-C20mastných kyselin s cukry, jako je sorbitol, galaktóza, glukóza nebo sacharóza a také estery polyoxyethylensorbitanu s C12-C20mastnými kyselinami.

Případně přítomná pomocná smáčedla se volí ze skupiny C8-C20mastné kyseliny, C2-C14polyhydroxyalkany, zvláště propylenglykol, hexandiol a glycerol,

C2-C12alkoholy a estery kyseliny mléčné s C2-C8alkoholy.

• ·

Hydrofobní kontinuální fáze se volí z následujících sloučenin jednotlivě nebo ve směsi: estery C8-C20nasycených nebo nenasycených karboxylových kyselin s C2-C8alkoholovým zbytkem, dále může jít o mono-, di- a triglyceridy C8-C20mastných kyselin nebo o rostlinné oleje, vhodné pro parenterální podání, například o sojový, podzemnicový, sezamový olej, olej z bavlníkových semen a slunečnicový olej.

Mikroemulze podle vynálezu je dále charakterizována hodnotou pH 4,5 až 7,5, s výhodou 5 až 7. Této hodnoty pH, která není vlastní složení mikroemulze je možno s výhodou dosáhnout přidáním vhodného množství přírodní aminokyseliny do mikroemulze, aniž by přitom došlo k ovlivnění stability mikroemulze nebo ke změně středního průměru kapiček emulze.

Mikroemulze podle vynálezu typu voda v oleji jsou zvláště vhodné i jako nosiče pro peptidy, zvláště pro analogy LHRH, jako jsou leuprolidacetát, goserelin, triptorelin, nafarelinacetát, histrelin, cetrorelix nebo odpovídající acetáty nebo peptidy, jako somatostatin nebo jeho analogy, jako jsou octreotid a lanreotidacetát.

Mimo to je mikroemulze podle vynálezu zvláště vhodná jako nisič pro polysacharidy, zvláště pro nefrakcionovaný heparin nebo pro hepariny s nízkou molekulovou hmotností.

Mikroemulze podle vynálezu dovoluje přípravu farmaceutických prostředků s prodlouženým uvolňováním hydrofilních účinných látek. Tyto farmaceutické prostředky, které také tvoří součást podstaty vynálezu nevyvolávají tvorbu místních vředů ani tvorbu • · • φ φφφ · přetrvávajících granulomů, které se postupně vstřebávají v průběhu účinnosti prostředku. V případě peptidů typu LHRH, jako jsou zvláště leuprolid, goserelin, triptorelin, nafarelinacetát, histrelin, cetrorelix a odpovídající acetáty je možno dosáhnout prodlouženého uvolňování po dobu nejméně 30 dnů. V případě somatostatinu, octreotidu a lanreotidu je možno dosáhnout prodlouženého uvolňování po dobu alespoň 8 dnů.

Vynález se dále týká použití mikroemulze podle vynálezu s obsahem peptidů ze skupiny leuprolidacetát, goserelin, triptorelin, nafarelinacetát, histrelin, cetrorelix nebo odpovídající acetáty pro výrobu farmaceutického prostředku pro potlačení produkce testosteronu po jediném podání na dobu alespoň 30 dnů, přičemž koncentrace testosteronu klesne již po 48 hodinách po podání prostředku.

Vynález se rovněž týká použití mikroemulze, obsahující octreotid nebo jeho analogy pro výrobu farmaceutického prostředku pro potlačení produkce růstového hormonu na dobu alespoň 8 dnů.

Vynález se týká také použití mikroemulze, obsahující nefrakcionovaný heparin nebo hepariny s nízkou molekulovou hmotností pro výrobu farmaceutického prostředku s prodlouženým uvolňováním účinné látky po jeho jediném podání.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1. Příprava emulze typu voda v oleji s obsahem leuprolídačetátu

a) Příprava vodné fáze

350 mg leuprolidacetátu se rozpustí v 10 ml vody pro injekční podání s přídavkem 200 mg lysinu.

b) Příprava olejové fáze g ethyloleátu, 25 g sojového lecithinu s čistotou vyšší než 95 % a 5 g kyseliny kaprylové se odděleně smísí ve vhodné nádobě, opatřené termostatem, za míchání při teplotě 60 až 70 °C. Výsledný čirý homogenní roztok se zchladí na teplotu místnosti.

c) Příprava mikroemulze

Vodná fáze (roztok a) se přidá k olejové fázi (roztok b) za míchání, čímž se získá opticky průhledná homogenní mikroemulze. Vzhledem k použitému množství lysinu a kyseliny kaprylové, rozpustné ve vodné fázi má tato mikroemulze pH 6.

Mikroemulze se sterilně zfiltruje přes membránový filtr s průměrem otvorů 0,22 μιη.

Obsah leuprolidacetátu v této mikroemulzi se vyhodnotí pomocí HPLC za následujících podmínek: stacionární fáze: sloupec Vydac C18, 5 μιη (250 x 4 mm) • · mobilní fáze A: H2O + 0,1 % TFA

B: CH3OH + 0,1 % TFA gradient: 100 % A až 100 % B v průběhu 20 minut průtok: 0,8 ml/min.

detektor: UV 214 nm

Byl prokázán obsah leuprolidacetátu 3 mg/ml.

Příklad 2. Příprava mikroemulze typu voda v oleji s obsahem leuprolidacetátu

Postupuje se způsobem podle příkladu 1 s tím rozdílem, že se rozpustí 600 mg leuprolidacetátu v 10 ml vody.

Příklad 3. Příprava mikroemulze typu voda v oleji s obsahem leuprolidacetátu

Postupuje se způsobem podle příkladu 1 s tím rozdílem, že se nepřidává 200 mg lysinu. Vypočítaná hodnota pH je přibližně 3.

Příklad 4. Příprava mikroemulze typu voda v oleji s obsahem leuprolidacetátu

Postupuje se způsobem podle příkladu 1 s tím rozdílem, že se rozpustí 900 mg leuprolidacetátu v 10 ml vody.

Příklad 5. Příprava mikroemulze typu voda v oleji s obsahem leuprolidacetátu

Postupuje se způsobem podle příkladu 1 s tím rozdílem, že se změní množství smáčedla a pomocného smáčedla a užije se 15 g sojového lecithinu a 3 g kyseliny kaprylové. Tímto způsobem se sníží celkové množství směsi smáčedla a pomocného smáčedla ze 30 % na 18 %, přestože poměr mezi oběma složkami zůstává beze změny 5:1.

Příklad 6. Příprava mikroemulze typu voda v oleji s obsahem octreotidu

Opakuje se způsob podle příkladu 1, avšak rozpustí se 3 g octreotidu v 10 ml vody místo 350 mg leuprolidacetátu.

Příklad 7. Příprava mikroemulze typu voda v oleji s obsahem heparinu

Opakuje se způsob podle příkladu 1, avšak místo 350 mg leuprolidacetátu se v 10 ml vody rozpustí 50 mg nefrakcionovaného heparinu ve formě vápenaté nebo sodné soli.

Příklad 8. Příprava mikroemulze typu voda v oleji s obsahem leuprolidacetátu

Postupuje se způsobem podle příkladu 1 s tím rozdílem, že se změní kvalitativní i kvantitativní složení olejové fáze. Užije se 66,9 % ethyloleátu, 19,4 % fosfatidylcholinu a 3,9 % směsi kyseliny kapronové a máselné v poměru 3:1.

Příklad 9. Příprava mikroemulze typu voda v oleji s obsahem leuprolidacetátu • ♦ • · · ··· ··· · * ····

a) Příprava vodné fáze mg leuprolidacetátu se rozpustí v 0,6 ml vody pro injekční podání s přídavkem 8 mg lysinu.

b) Příprava olejové fáze

2.1 g ethyloleátu, 215 mg polyoxyethylensorbitanmonooleátu a 1 g sojového lecithinu se smísí ve vhodné nádobě a směs se za míchání zahřeje na 50 °C. Výsledná čirá homogenní směs se zchladí na teplotu místnosti.

Vodný roztok se pak pomalu po částech přidá k olejové směsi za míchání, čímž se získá opticky čirá mikroemulze, obsahující 1,5 % leuprolidacetátu.

Příklad 10. Příprava mikroemulze typu voda v oleji s obsahem leuprolidacetátu

a) Příprava vodné fáze mg leuprolidacetátu se rozpustí v 0,2 ml vody pro injekční podání s přídavkem 4,1 mg lysinu.

b) Příprava olejové fáze

1.2 g ethyloleátu, 0,5 g polyoxyethylensorbitanmonooleátu a 0,1 g kaprylové kyseliny se smísí ve vhodné nádobě a směs se za míchání zahřeje na 50 °C. Výsledná čirá homogenní směs se zchladí na teplotu místnosti.

• * · · ·

Vodný roztok se pomalu po částech přidá za míchání k olejové směsi, čímž se získá opticky čirá mikroemulze s obsahem leuprolidacetátu 3 mg/ml.

Příklad 11. Příprava mikroemulze typu voda v oleji s obsahem octreotidacetátu

a) Příprava vodné fáze g octreotidacetátu se rozpustí v 0,2 ml vody pro injekční podání s obsahem 0,2 g propylenglykolu a 4 mg lysinu.

b) Příprava olejové fáze

0,98 g ethyloleátu, 0,5 g sojového lecithinu a 0,1 g kyseliny kaprylové se smísí ve vhodné nádobě a směs se za míchání zahřeje na 50 °C. Výsledná čirá homogenní směs se zchladí na teplotu místnosti.

Vodný roztok se pomalu po částech přidá za míchání k olejové směsi. Výsledná opticky čirá mikroemulze obsahuje 10 mg/ml octreotridacetátu.

Příklad 12. Příprava mikroemulze typu voda v oleji s obsahem octreotidacetátu

a) Příprava vodné fáze g octreotidacetátu se rozpustí v 0,1 ml vody pro injekční podání s obsahem 2 mg lysinu.

b) Příprava olejové fáze

	•
	9	*» ·	• 0
	9 9	•
	999 9 9	•
	9	•
• «	9	• · ·	0 ·

0,59 g ethyloleátu, 0,25 g sojového lecithinu a 0,05 g kyseliny kaprylové se smísí ve vhodné nádobě a směs se za míchání zahřeje na 50 °C. Výsledná čirá homogenní směs se zchladí na teplotu místnosti.

Vodný roztok se pomalu po částech přidá za míchání k olejové směsi. Výsledná opticky čirá mikroemulze obsahuje 1 % octreotridacetátu.

Příklad 13. Příprava mikroemulze typu voda v oleji s obsahem octreotidacetátu

0,59 g ethyloleátu, 0,25 g sojového lecithinu a 0,05 g kyseliny kaprylové se smísí ve vhodné nádobě a směs se za míchání zahřeje na 50 °C. Výsledná čirá homogenní směs se zchladí na teplotu místnosti. Pak se k olejovému roztoku za míchání postupně přidává 0,1 g vody pro injekční podání s obsahem 2 mg lysinu. K výsledné opticky čiré mikroemulzi se za míchání přidá 10 mg octreotidacetátu. Tato účinná látka se homogenně promísí s mikroemulzi v průběhu několika sekund. Mikroemulze se zfiltruje přes polysulfonový filtr s průměrem otvorů 0,22 μιη. Výsledná opticky čirá emulze obsahuje podle analýzy pomocí HPLC octreotid acetát v množství

6,35 mg/ml.

Příklad 14. Příprava mikroemulze typu voda v oleji s obsahem myoglobinu

a) Příprava vodné fáze • 4

4

444

5,5 mg myoglobinu se rozpustí v 1,5 ml vody pro injekční podání s přídavkem 10 mg lysinu.

b) Příprava olejové fáze g ethyloleátu, 1,2 g sojového lecithínu a 0,25 g kyseliny kaprylové se smísí ve vhodné nádobě a směs se zahřeje na 50 °C. Výsledná čirá homogenní směs se zchladí na teplotu místnosti.

Vodný roztok se po částech za míchání pomalu přidá k olejové směsi. Výsledná opticky čirá mikroemulze obsahuje myoglobin v množství 1,3 mg/ml.

Příklad 15.

Bylo provedeno vyhodnocení účinku mikroemulze s obsahem leuprolidacetátu, připravené způsobem podle příkladů 1 a 2.

Tři skupiny krysích samců kmene Sprague Dawley po 10 v každé skupině byly umístěny na 5 dnů v klecích a krmivo a voda byly podávány podle libosti.

Pak byly zvířatům podány 2 mikroemulze, připravené způsobem podle příkladů 1 a 2 s odlišnými koncentracemi leuprolidacetátu 3 mg/ml (příklad 1) a 6 mg/ml (příklad 2). Mikroemulze byla podána v jediné dávce, přičemž dávka účinné látky odpovídala 0,750 mg/kg.

Kontrolním zvířatům (3 ve skupině) byl podán pouze fyziologický roztok chloridu sodného.

• ♦ • ♦ · • * * · · ·

Koncentrace testosteronu v krevní plazmě byla po odběru krevních vzorků vyhodnocena ve dnech 1, 2, 3, 4,

7, 14, 21, 28, 42 a 56. Krevní vzorky byly odstředěny a testosteron byl měřen pomocí zkušebního balíčku EIA.

Koncentrace testosteronu v séru byly vyhodnocovány až do 60 dnů po podání.

Výsledky jsou shrnuty v tabulce 1, která uvádí také hmotnost různých orgánů u pokusných zvířat.

Farmaceutické prostředky podle vynálezu jsou nezávisle na koncentraci účinné látky v mikroemulzi prosté podstatnějších systemických nebo místních vedlejších účinků a současně zajišťují prodloužené uvolňování účinné látky po dobu nejméně 30 dnů a současně léčebný účinek již 48 hodin po injekčním podání.

Účinnost těchto prostředků je srovnatelná s účinností běžně dodávaného depotního prostředku Enanton na bázi biologicky erodovatelných polymerů.

O

CN (O x

i—i b

X

O

H

0 *0 0 * • 0 0 í *·:· ♦ »«· « · ·» ·» <t »«

Hmotnost celého těla a reproduktivních orgánů v g po 28 a 56 dnech	»0 £ X kO LD	semenné váčky	kO CN o +1 kO σι c—1	<—1 o +1 Oh co i—1	l,43±0,22
prostata	LO O o ΟΟ χ X O O +1	0,50 ±0,03#	0, 51 ±0,08#
varlata 1	3,54 ±0,05	2,39 ±0,17*	< t^-{ CN LO K O 04 -H
tělo	631 ±10, 1	O -xT O 40 O rP Ό +\|	626, 6 ±25, 5
28 dnů	semenné váčky	1,95±0,010	-X co O O +1 ΟΊ o	0,25±0,03*
prostata	0,72 ±0,07	0, 33 ±0,03*	0,22 ±0,03*
varlata	3,73 ±0,09	1,84 ±0,11*	xT CO cP LO X O rP +1
tělo	570,0 ±13,2	kO co kO < co lo +1	532 ±4,6
Mikroemulze			Fyz. roztok	Příklad 1	Příklad 2

X tn

Φ

X o

x •H £

O

P

Φ

4-1 c

o ta • to

X o	<
>P	>
	o
>	s
N
LO	X
0	cn Φ
£	X
♦H	—
X 0	0
X	X
tn	o
O	X N
P	o
a	P
o
x	N
íp	>1
X	X
O	-P X
£	o
X	P
P	a
CO X	LO
£	o
tú	X
X	o
cn +1 P >φ	v a P#
£		^x
X	• X	xp
P	1-1	£
Ά	o	X
	K.	0
O	o	>
X		o
fÚ	v	P
-r~l		cn
kP	a	X
C	<	£
Φ		X
>P	X	o
X	i—1	cn
'to	o
•o	o	£
	X	Φ
>	o	0
Φ	v	Ή >
-r—i Π3	a	o
X		P
O	-K	a

.: ; .: .

»· ·· • · · • · · * · · · • · · • * · · · ·

Příklad 16. Vyhodnocení snášenlivosti mikroemulze při podkožním podání

Vyhnodnocení snášenlivosti při podkožním podání bylo provedeno tak, že skupinám po alespoň 9 krysách byla jednorázově podána injekčním způsobem mikroemulze, uvedená v následující tabulce 2.

Klinické vyšetření, vyšetření post mortem a histologické vyšetření bylo provedeno po 48 hodinách, dnech a 14 dnech po podání.

Tabulka 2

Sloučenina	Množství (mg)	Otok(průměrné hodnocení*)	Tvorba vředů
	48h	7 dnů	14 dnů	48h	7 dnů	14 dnů
Mikroemulze A¹	125 μΐ	2	2	1	ne	ne	ne
Mikroemulze A¹	500 μΐ	3	3	2,5	ne	ne	ne
Mikroemulze B²	125 μΐ	3	3	3	ano	ano	ano

'Mikroemulze, připravená podle příkladu 1.

²Mikroemulze, připravená podle příkladu 8.

^hodnocení: 1 slabý otok, 2 mírný otok, 3 závažný otok.

Při tomto testu se bere do úvahy biologická kompatibilita prostředků, které nevyvolávají přetrvávající tvorbu místním vředům, přítomnost otoku je funkcí množství mikroemulze, které byla vstříknuta a rychlosti vylučování ethyloleátu z podkožní tkáně, jak je uvedeno v publikaci Howard a další, Int. J. Pharm. 16, 1983, 31-39.

Příklad 17. Vyhodnocení účinnosti mikroemulze s obsahem octreotidacetátu in vivo

Dávka 6 mg/krysa mikroemulze s obsahem octreotidu, připravené způsobem podle příkladu 11, byla podána 6 krysím samcům s hmotností přibližně 175 až 200 g.

Vzorky plasmy byly odebrány před podáním účinné látky a 0,5 h, 24 h a 4, 6 a 8 dnů po podání.

Octreotid byl extrahován z krevní plasmy a analyzován pomocí kapalinové chromatografie a hmotového spektra proti kalibrační křivce. Koncentrace této látky v plazmě jsou shrnuty v následující tabulce 3.

Tabulka 3.

Doba odběru	0,5 h	24 h	4 dny	6 dnů	8 dnů
Octreotid (ng/ml)	539	40,2	62,5	4,5	7, 6

Je zřejmé, že významné koncentrace octreotidu v krevní plazmě bylo možno prokázat až 8 dnů po podání.

Příklad 18. Vyhodnocení závislosti účinku na dávce pro mikroemulzí s obsahem leuprolidacetátu.

Mikroemulze s obsahem leuprolidacetátu, připravená způsobem podle příkladu 2 byla podána krysám v jediné dávce 2,25 mg/kg. Kontrolním zvířatům byla podána odpovídající dávka fyziologického roztoku chloridu sodného.

• · 9 9 9 * 9 •999 9 9 · 9 · · 9 • · 9 9 9 9 • 9·· ·99 99 9999

Koncentrace testosteronu v krevní plazmě byly vyhodnoceny ve dnech 0, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21, 28, 42 a 56. Krevní vzorky byly odstřeněny a testosteron v krevním séru byl měřen pomocí zkušebního balíčku Elisa. Výsledky jsou shrnuty na obr. 2.

Údaje o hmotnosti orgánů pokusných zvířat jsou shrnuty v následující tabulce 4.

Tabulka 4.

Hmotnost těla a reproduktivních orgánů v g ve dni 56
	tělo	varlata	prostata	semenné váčky
Kontrola	645+34	3,73±0,16	0,82±0,04	1,96±0,09
Pokus	608135	1,94+0,42 (p<0,01)	0,3510,14 (p<0,05)	0,5510,16 (p<0,05)

Snížení hmotnosti reproduktivních orgánů je stejně jako snížení koncentrace testosteronu v krevní plazmě zcela zřejmé 56 dnů po podání mikroemulze.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY φφφφ φ

ΦΦ φφ ♦ φ φ φ φ φ φφφ φφ φφφφ

1. Stálá biologicky kompatibilní mikroemulze typu voda v oleji, dobře snášená, vhodná pro parenterální podání biologicky aktivních sloučenin, které jsou hydrofilní nebo se staly hydrofilními tvorbou vhodného derivátu, přičemž mikroemulze zajistí prodloužené uvolňování obsažených účinných látek, vyznačující se tím, že obsahuje

a) až 20 % vnitřní hydrofilní vodné fáze s obsahem léčebně účinné hydrofilní látky,

b) 30 až 98 % externí hydrofobní fáze,

c) až 50 % smáčedla jako takového nebo ve směsi s pomocným smáčedlem.
2. Mikroemulze podle nároku 1, vyznačuj ící se t i m, že po podání pokusným zvířatům nevyvolává přetrvávající vředy a jakýkoliv otok v místě injekčního podání je reverzibilní.
3. Mikroemulze podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že hydrofilními biologicky aktivními součeninami jsou peptidy, proteiny, oligosacharidy nebo polysacharidy.
4. Mikroemulze podle nároku 3, vyznačuj ící se t i m, že biologicky aktivní látkou je peptid.
5. Mikroemulze podle nároku 4, vyznačuj ící se t i m, že biologicky aktivní látkou je peptidový analog hormonu LHRH.

• · φ · ♦ · φ

ΦΦΦΦ φ φ · φ · · · • · φ φ · · • ΦΦ · φ*· φφφ ·· ΦΦΦΦ

β. Mikroemulze podle nároku 5, vyznačuj ící se t í m, že biologicky aktivní látkou je leuprolidacetát, goserelin, triptorelin, nafarelin, histrelin, cetrorelix nebo odpovídající acetáty.
7. Mikroemulze podle nároku 5 nebo 6, vyznačující se tím, že zajistí prodloužené uvolňování aktivní látky po dobu alespoň

30 dnů.
8. Mikroemulze podle nároku 4, vyznačuj ící se t í m, že biologicky aktivní látkou je somatostatin, octreotid nebo lanreotid.
9. Mikroemulze podle nároku 8, vyznačuj ící se t í m, že zajistí prodloužené uvolňování peptidů po dobu alespoň 8 dnů.
10. Mikroemulze podle nároku 3, vyznačuj ící se t í m, že biologicky aktivní látkou je oligosacharid nebo polysacharid.
11. Mikroemulze podle nároku 10, vyznačuj ící se t í m, že biologicky aktivní látkou je nefrakcionovaný heparin nebo heparin s nízkou molekulovou hmotností.
12. Mikroemulze podle nároku 1, vyznačuj ící se t í m, že se smáčedlo volí ze skupiny

a) přírodní nebo syntetické glycerofosfolipidy, obsahující zbytky C4-C20karboxylových kyselin, nasycených nebo nenasycených, přičemž fosfoesterovou skupinou je zbytek cholinu, ethanolaminu, šeřinu nebo glycerolu, * · ·

99 9 99 9

9 9 9 9

9 9999 9 9 • · 9 9 9 9 9 ··* · ··· 999 99 9999

b) cholesterol,

c) estery cukrů s C12-C20 mastnými kyselinami,

d) estery polyoxyethylensorbitanu s C12-C20mastnými kyselinami.
13. Mikroemulze podle nároku 11, vyznačuj ící se t í m, že se hydrofobní fáze volí z následujících sloučenin jednotlivě nebo ve směsi: estery nasycených nebo nenasycených C8-C20karboxylových kyselin s C2-C8alkoholy, mono-, di- a triglyceridy C8-C20mastných kyselin nebo rostlinné oleje, vhodné pro parenterální podání.
14. Mikroemulze podle nároku 12, vyznačuj ící se t í m, že vodná fáze, obsahující biologicky aktivní látku má pH v rozmezí 4,5 až 7,5, s výhodou 5 až 7.
15. Mikroemulze podle nároku 14, vyznačuj ící se t í m, že se hodnota pH upravuje přidáním přírodní aminokyseliny.
16. Použití mikroemulze podle některého z nároků 1 až 15 s obsahem leuprolidu, goserelinu, triptorelinu, nafarelinacetátu, histrelinu, cetrorelixu nebo odpovídajících acetátů nebo jiných analogů LHRH pro výrobu farmaceutického prostředku pro potlačení tvorby testosteronu po jediném podání po dobu alespoň 30 dnů, přičemž koncentrace testosteronu se snižuje již 48 hodin po podání.
17. Použití mikroemulze podle některého z nároků 1 až 15 s obsahem octreotidu nebo jeho analogů pro výrobu

9· «β

4 · 4

4 · · • · · 4 • 44 • · 9 4 · ·

4 · • 4 « • · ·

4 ···· * 4

4·4 · farmaceutického prostředku pro potlačení produkce růstového hormonu po dobu alespoň 8 dnů.
18. Použití mikroemulze podle některého z nároků 1 až 15 s obsahem nefrakcionovaného heparinu nebo heparinu s nízkou molekulovou hmotností pro výrobu farmaceutického prostředku pro prodloužené uvolňování těchto látek po jediném podání.

1/2 ~ /T/xL·

Vliv mikroemulzí z příkladu 1 a -2 na koncentraci testosteronu v séru krys