CZ20021356A3 - Modifikovaný peptid a farmaceutický prostředek - Google Patents

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká modifikovaných peptidu založených na HC gp-39 (263-275), farmaceutických prostředků obsahujících tyto peptidy a použití těchto peptidů pro indukci tolerance u pacientů trpících autoimunitními onemocněními.

Dosavadní stav techniky

Imunitní systém je založen na principu rozlišení mezi cizími io antigeny (jinými než vlastními, non-self antigeny) a autoantigeny (vlastní, šelf antigeny odvozené od vlastního organismu jednotlivce), kterého se dosahuje „vestavěnou“ tolerancí proti autoantigenům.

Imunitní systém chrání jednotlivce proti cizím antigenům a reaguje na expozici cizímu antigenů aktivací specifických buněk jako jsou T- a B-lymfocyty a produkcí rozpustných faktorů jako jsou interleukiny, protilátky a faktory komplementu. Antigen, na který imunitní systém reaguje, je degradován buňkami předkládajícími antigen (antigen presenting celis, APC) a fragment antigenů je exprimován na buněčném povrchu, asociovaný s glykoproteinem hlavního histokompatibilitního komplexu (MHC) třídy II. Komplex MHCglykoprotein-antigen-fragment je předkládán T-buňce, která svým Tbuněčným receptorem rozpoznává komplex fragmentu antigenů spojeného s proteinem MHC třídy II, na který je tento fragment navázán. T-buňka se stane aktivovanou, tj. proliferuje a/nebo produkuje interleukiny, což vede k expanzi aktivovaných lymfocytů zaměřených na zneškodňovaný antigen (Grey a další, Sci. Am, 261: 38 - 46, 1989).

- 2 • · ·

Vlastní antigeny jsou také kontinuálně štěpeny (processing) a ve formě antigenních fragmentů navázaných na glykoproteiny MHC předkládány T-buňkám (Jardetsky a další, Nátuře 353: 326 - 329, 1991). Rozpoznávání těchto antigenů je tedy imunitnímu systému vlastní. Za normálních okolností je imunitní systém ke vlastním antigenům tolerantní a nedochází tak k aktivaci imunitní odpovědi těmito vlastními antigeny.

Jestliže dojde ke ztrátě tolerance k vlastním antigenům, imunitní systém se stane aktivovaným vůči jednomu nebo více vlastním antigenům, což vede k aktivaci autoreaktivních T-buněk a k produkci vlastních protilátek. Tento jev je označován jako autoimunita. Protože imunitní odpověď je obecně destruktivní, tj. směřuje ke zničení invazivního cizího antigenů, autoimunitní odpovědi mohou způsobit destrukci vlastní tkáně těla.

Příspěvek T-buněk k autoimunitním onemocněním byl popisován v několika studiích. U myší je experimentální autoimunitní encefalomyelitida (EAE) zprostředkovaná velmi omezenou skupinou Tbuněk, které mají společnou svou specificitu pro jediný epitop myelinového bazického proteinu (myelin basic protein, MBP) v komplexu s molekulou MHC třídy II. U Lewisových krys, což je druh s vysokou vnímavostí k různým autoimunitním onemocněním, bylo ukázáno, že onemocnění je způsobeno T-buňkami. Předpokládá se, že také u lidí jsou autoimunitní onemocnění asociována s vyvinutím autoagresivních T-buněk.

Destruktivní autoimunitní odpověď se předpokládá u různých onemocnění jako je revmatoidní artritida (RA), u které je zničena integrita kloubní chrupavky chronickým zánětlivým procesem v důsledku přítomnosti velkého počtu aktivovaných lymfocytů a buněk exprimujících MHC třídy II. Pro udržení lokální zánětlivé odpovědi je pravděpodobně nezbytná pouhá přítomnost chrupavky. Byla vyslovena domněnka, že degradace chrupavky je u RA asociována s aktivitou

autoreaktivních T-buněk reagujících na chrupavku (Sigall a další, Clin. Exp. Rheumat. 6: 59, 1988; Glant a další, Biochem. Soc. Trans. 18: 796, 1990; Burmester a další, Rheumatoid arthritis Smolen, Kalden, Maini (ed.) Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 1992). Chirurgické odstranění chrupavky u pacientů s RA navíc vedlo k omezení zánětlivého procesu (R. S. Laskin, J. Bone Joint Surgery (Am) 72: 529, 1990). Proteiny chrupavky jsou tedy považovány za cílové autoantigeny, které mohou stimulovat T-buňky. Aktivace těchto autoreaktivních T-buněk vede k vyvinutí autoimunitního onemocnění. Dosud se však nepodařilo identifikovat autoantigenní složky, které mají úlohu při vzniku revmatoidní artritidy.

Zánětlivá odpověď vedoucí k destrukci chrupavky může být léčena různými léčivy, jako jsou například steroidy. Tato léčiva jsou však často imunosupresivní léky, které jsou nespecifické a mají toxické vedlejší účinky. Nevýhody nespecifické imunosuprese způsobují, že tato metoda je velmi nežádoucí.

Pro nespecifickou imunosupresi tvoří velmi přitažlivou alternativu terapie netoxickou imunosupresi specifickou pro antigen. Tato terapie specifická pro antigen zahrnuje léčení pacientů cílovým autoantigenem nebo se syntetickými peptidy reagujícími s T-buňkami, které jsou odvozené od cílového autoantigenu. Tyto syntetické peptidy odpovídají epitopům T-buněk pro autoantigen a mohou být použity pro indukci specifické tolerance T-buněk jak vůči sobě navzájem, tak vůči autoantigenu. Desenzitizace nebo imunologická tolerance imunitního systému je založena na dlouho pozorovaném jevu, že zvířata krmená antigenem nebo epitopem, nebo zvířata, jimž byl antigen nebo epitop podáván inhalačně,- mají menší schopnost vyvinout systémovou imunitní odpověď vůči tomuto antigenu nebo epitopu, jestliže se tento antigen nebo epitop zavede systémově.

Revmatoidní artritida je autoimunitní onemocnění, které se častěji vyskytuje u HLA-DR4-pozitivních jedinců. Tato souvislost

- 4 • ·· ··· ·· · · ···· ··· ···« • ·· ··«· ·· · • · ··· ······· · · ··· ·· ·· · ·· «··· uvedeného onemocnění ukazuje na to, že molekuly DR4 předkládají (prezentují) autoantigeny T-buňkám. Cílem tohoto autoimunitního onemocnění je kloub, ve kterém artikulární chondrocyt představuje jedinečný typ buněk vytvářející produkty, které jsou organizované v matrici. Předpokládá se, že destrukce kloubu, tak jak se vyskytuje u RA, je zprostředkována pro chrupavku specifickými, autoreaktivními T-buňkami. Jako možný autoantigen u RA byl nedávno identifikován protein odvozený od chrupavky, Human Cartilage gp-39 (HC gp-39). U pacientů s RA byl přednostně rozpoznáván dominantní epitop proteinu HC gp-39, peptid pokrývající sekvenci 263-275, což ukazuje na to, že tento epitop je cílem autoimunitního útoku při revmatoidní artritidě. Na tento peptid reagovalo osm z osmnácti pacientů s RA, přičemž ze skupiny zdravých dárců nereagoval nikdo (Verheijden a další, Arthtritis Rheum. 40: 1115, 1997). Tyto údaje tedy silně ukazují na to, že uvedený peptid nebo protein HC gp-39 je cílem pro imunitní rozpoznávání v kloubu.

Význam proteinu HC gp-39 pro artritické onemocnění byl dále demonstrován jeho artritogenicitou u myší Balb/c. Jediná injekce mikrogramového množství proteinu do oblasti hrudníku ve směsi s IFA indukovala chronický zánět kloubů napodobující RA.

Odpověď na peptid HC gp-39 263-275 byla dále vyšetřována vytvořením sady DRB1 *0401-omezených, pro peptid specifických T-T hybridomů z transgenních myší DRB1*0401 po imunizaci proteinem HC gp-39. Byla definována a porovnávána přesná specificita hybridomů specifických pro peptid 263-275 v kontextu DR4 (DB1*0401). Jako výsledek byly identifikovány tři hybridomy lišící se v rozpoznávání epitopu 263-275 prezentovaného molekulami kódovanými DRB1*0401 (rozdíl mezi těmito třemi použitými hybridomy v rozpoznávání epitopu se stal viditelný, jestliže byly pro stimulaci různých hybridomů použity peptidy zkrácené na N- a C-konci). Bylo zjištěno, že na sekvenci 265-275 optimálně reaguje hybridom 5G11. Naopak rozpoznávání hybridomem 8B12 se soustředilo kolem

sekvence 264-274, zatímco hybridom 14G11 optimálně reagoval na sekvenci 264-275.

Vytvoření tolerance u HC gp-39 (263-275)-reaktivních T-buněk může být pro pacienty s RA prospěšné. Předkládaný vynález poskytuje modifikované deriváty peptidu založené na sekvenci HC gp-39 (263275), která vyniká svou schopností indukovat imunitní odpověď a svou schopností vyvolat toleranci.

Bylo překvapivě zjištěno, že specifické peptidové modifikace založené na HC gp-39 (263-275) mají agonistické účinky na soubor hybridomů T-buněk specifických pro peptid HC gp-39 (263-275) a jsou nejlepší při stimulaci dvou klonů lidských T-buněk vytvořených po stimulaci peptidy obsahujícími sekvenci epitopu 263-275. Navíc tyto modifikované peptidy prokázaly vynikající schopnost vyvolávat toleranci in vivo.

Podstata vynálezu

Podle jednoho provedení vynálezu se tedy poskytuje modifikovaný peptid odvozený od sekvence H-Arg-Ser-Phe-Thr-LeuAla-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH (vzorec I; SEQ ID No. 1) obecného vzorce Q-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-A11-A12-A13Z (vzorec II). V obecném vzorci II odpovídá A1 až A13 aminokyselinám vzorce I, Q odpovídá H a Z odpovídá OH. Modifikace podle předkládaného vynálezu jsou zvoleny ze skupiny zahrnující:

a) substituci 1 až 6, s výhodou 1 až 4 aminokyselin v polohách A1 až A13 za aminokyseliny nevyskytující se v přírodě nebo βaminokyseliny;

b) substituci jedné nebo více amidových vazeb redukovanými amidovými vazbami nebo ethylenovými isostery;

c) substituce v polohách Q a/nebo Z.

- 6 Počet modifikací, které je možno zvolit z jedné nebo více těchto skupin je 1 až 6. Navíc mohou být aminokyseliny substituovány jinými přirozenými aminokyselinami za předpokladu, že celkový počet modifikací nepřesáhne šest.

Modifikované peptidy založené na vzorci I (HC gp-39 (263-275)) mohou být stabilizovány modifikacemi na C-konci a/nebo N-konci, které omezí hydrolýzu katalyzovanou exopeptidázami. Tyto modifikace mohou zahrnovat N-koncovou acylaci (tj. acetylaci = Ac-peptid), Ckoncové zavedení amidu (např. peptid-NH₂), kombinace acylace a io zavedení amidu (např. Ac-peptid-NH₂) a například zavedení Daminokyselin namísto L-aminokyselin. Jiné modifikace jsou zaměřeny na prevenci hydrolýzy endopeptidázami.

Tabulka 1. Peptidové vazby

Struktura Název

Peptid

Redukovaný peptid

Vinylové analogy peptidů

Rq Q

R, O

R₃ O

Peptoid

R, HO

C Rq

OH O Ř, 'N H OH Ó

N-hydroxypeptid

Ο

Η

-Ν.

Oligokarbamáty

Oligomočovina η₂ν^.

?⁴ Η

Hydrazinopeptidy r₂

Ri Ο

R₂ τ

Oligosu Ifon

Η

Η

Peptidosulfonamidy

Ř2

Ethylenový isoster

Příklady těchto modifikací jsou zavedení D-aminokyselin namísto L-aminokyselin, modifikované aminokyseliny, cyklizace uvnitř peptidů, zavedení modifikovaných peptidových vazeb, například redukovaných peptidových vazeb ψ[ΟΗ₂ΝΗ] a peptoidy (N-alkylované deriváty glycinu).

Jiné peptidově analogy mohou být příbuzné peptidům vzorce I nebo obecného vzorce II, ale namísto běžných peptidových vazeb -NH-C(O)- mohou být namísto jednotlivých vazeb -NH-C(O)- použity w vazby ukázané v tabulce 1, nebo jakákoli jejich kombinace. Jestliže

- 8 byla odstraněna aminová skupina na N-konci (ve vzorci II je např. A1 = desaminoarginin), Q ve vzorci II neodpovídá žádnému atomu.

Výhodné peptidy podle předkládaného vynálezu jsou takové peptidy, kde Q je H, (CAj-alkyl, formyl, (Cve-alkylkarbonyl, karboxy-(Ci_₆)-alkyl, (C-i-₆)-alkyloxykarbonyl, (C₂-6)-alkenyloxykarbonyl, (C₆-i₄)-aryl-(Ci_₆)alkyl; (C₆-i4)-aryl-(Ci.₄)-alkyloxykarbonyl, CH₃(OCH₂CH₂)_n-OCH₂-C(O)-, kde n je 1 až 10, HOCH₂-(CHOH)_m-CH₂-, kde m je 3 až 4; 1-methylpyridinium-3-karbonyl, 1-methylpyridinium-4-karbonyl, nebo Lys nebo Q je nepřítomno, jestliže A1 je H₂N-C(=NH)NH-(CH₂)_n-C(O)-, kde n je 2 až 5;

Z je OR, kde R je H, (Ci_₆)-alkyl, (C₂.₆)-alkenyl, (C₆-i₄)-aryl-(Ci. ,₄)-alkyl, (C6-i₄)-(C₄-i3)-heteroaryl-(Ci-6)-alkyl nebo NRiR₂, kde Ri a R₂ jsou nezávisle zvoleny ze skupiny H, (C^-alkyl nebo (C6-i₄)-aryl-(Ci_₆)-alkyl; a popřípadě

Q a Z obsahují navíc až do 10 aminokyselin umístěných v blízkosti polohy A1 a/nebo A13. Substituce A1 až A13 jednou nebo více dalšími v přírodě se vyskytujícími aminokyselinami se s výhodou provádí na ne více než čtyřech, výhodněji ne více než dvou polohách.

U peptidů podle předkládaného vynálezu je výhodné preferovat následující substituce obecného vzorce II:

Q je H, (Ci-6)-alkyl, formyl, (Ci_₆)-alkylkarbonyl, karboxy-(Ci-6)-alkyl, (Ci-₆)-alkyloxykarbonyl, (C₂.₆)-alkenyloxykarbonyl, (Cg^j-aryl-(Cvej-alkyl; (C₆-i₄)-aryl-(Ci-₄)-alkyloxykarbonyl, CH₃(OCH₂CH₂)_n-OCH₂-C(O)-, kde n je 1 až 10, HOCH₂-(CHOH)_m-CH₂-, kde m je 3 až 4; 1-methylpyridinium-3-karbonyl, 1-methylpyridinium-4-karbonyl nebo Lys, nebo Q je nepřítomno, jestliže A1 je H₂N-C(=NH)NH-(CH₂)_n-C(O)-, kde n je 2 až 5. Výhodnější jsou substituce, kde Q je H, (C1-6)-alkyl, (Ci .₆)-alkylkarbonyl, karboxy-(Ci.₆)-alkyl, (Ci-6)-alkyloxy-karbonyl, CH₃(OCH₂CH₂)_n-OCH₂-C(O)-, kde n je 1 až 10, HOCH₂-(CHOH)m-CH₂-, kde m je 3 až 4; 1-methylpyridinium-3-karbonyl, 1-methylpyridinium-4-karbonyl nebo Lys, nebo Q je nepřítomno, jestliže

- 9 A1 je H₂N-C(=NH)NH-(CH₂)n-C(O)-, kde n je 2 až 5. Ještě výhodnější jsou peptidy, kde Q je H, methyl; acetyl; karboxymethylen, rnethoxykarbonyl; CH₃(OCH₂CH₂)₃-OCH₂-C(O)-, D-1 -glucityl, 1-methyl-pyridinium-3-karbonyl nebo 1-methylpyridinium-4-karbonyl, nebo Q je nepřítomno, jestliže A1 je H₂N-C(=NH)NH-(CH₂)4-C(O)-.

A1 je L-Arg, D-Arg, L-Lys, D-Lys, L-Ala, D-Ala, H₂N-C(=NH)NH(CH₂)n-C(O)-, kde n je 2 až 5, H₂N-(CH₂)_n-C(O)-, kde n je 2 až 7, (/?)-{NH-CH[(CH₂)_n-NH-C(=NH)-NH₂]-CH₂-C(O)-}, kde n je 2 až 5 nebo (S){-NH-CH[(CH₂)_n-NH-C(=NH)-NH₂]-CH₂-C(O)-}, kde n je 2 až 5 nebo N[(CH₂)_n-NH-C(=NH)-NH₂]CH₂C(O)-, kde n je 2 až 5. S výhodou je A1 l_-Arg, D-Arg, L-Ala, H₂N-C(=NH)NH-(CH₂)_n-C(O)-, kde n je 2 až 5, H₂N-(CH₂)_n-C(O)-, kde n je 2 až 7, (S)-{-NH-CH[(CH₂)_n-NH-C(=NH)NH₂]-CH₂-C(O)-}, kde n je 2 až 5 nebo -N[(CH₂)_n-NHC(=NH)NH₂]CH₂C(O)-, kde n je 2 až 5. Výhodněji A1 je L-Arg, D-Arg, L-Ala, H₂N-C(=NH)NH-(CH₂)₄-C(O)-, H₂N-(CH₂)_n-C(O)-, kde n je 5 až 7, (S)-{-NH-CH[(CH₂)₃-NH-C(=NH)-NH₂]-CH₂-C(O)-} nebo -N[(CH₂)₃NH-C(=NH)-NH₂]-CH₂C(O)-.

A2 je L-Ser, D-Ser, L-hSer, D-hSer, L-Thr, D-Thr, L-Ala, D-Ala, Gly nebo -N[(CH₂)_n-OH]-CH₂-C(O)-, kde n je 2 až 5. S výhodou A2 je L-Ser, L-Ala, D-Ala, Gly nebo N[(CH₂)n-OH]-CH₂-C(O)-, kde n je 2 až

5. Výhodněji A2 je L-Ser, L-Ala nebo N[(CH₂)₂-OH]-CH₂-C(O)-.

A3 je L-Phe, D-Phe, L-Phe(X), D-Phe(X), kde X je nezávisle zvoleno z jedné nebo více skupin (C-i.₄)-alkyl, hydroxy, halo, (Ci_6)-alkylkarbonylamino, amino nebo nitro, L-Hfe, D-Hfe, L-Thi, D-Thi, LCha, D-Cha, L-Pal(3), D-Pal(3), L-1-Nal, D-1-Nal, L-2-Nal, D-2-Nal, LSer(Bzl), D-Ser(Bzl), (/?)-{-NH-CH(CH₂-aryl)-CH₂-} nebo (S)-{-NH-CH-(CH₂-aryl)-CH₂-} ,nebo (R)-{-NH-CH(CH₂-aryl)-CH₂-} nebo (S)-{-NH-CH(CH₂-aryl)CH₂-}. S výhodou A3 je L-Phe, D-Phe, L-Phe(X) nebo DPhe(X), kde X je halo nebo nitro, L-Hfe, L-Thi, L-Cha, L-Pal(3), L-1Nal, L-2-Nal, L-Ser(Bzl) nebo (S)-{-NH-CH(CH₂-aryl)-CH₂-}. Výhodněji

- 10 • ·· ··· ·· ·· ···· ··· «··· • ·· ···· · · · • · · · · ······· · · <···· ·· · ······

A3 je L-Phe, D-Phe, L-Phe(X) kde X je halo nebo nitro, L-Hfe, L-Thi, LCha, L-Pal(3), L-1-Nal, L-2-Nal nebo L-Ser(Bzl).

A4 je L-Thr, D-Thr-L-Ser-, D-Ser, L-hSer, D-hSer, L-Ala, D-Ala nebo Gly. S výhodou A4 je L-Thr nebo L-Ala.

A5 je L-Leu, D-Leu, L-lle, D-lle, L-Val, D-Val-, L-Nva, D-Nva, LAla, D-Ala, Gly, (R)-{-NH-CH(CH₂-CH(CH₃)₂)-CH₂-}, nebo (S)-{-NH-CH(CH₂-CH(CH₃)₂)-CH₂-}. S výhodou A5 je L-Leu, L-Ala, nebo (S)-{-NH-CH(CH₂-CH(CH₃)₂)-CH₂-}.

A6 je L-Ala, D-Ala nebo Gly. S výhodou je A6 L-Ala nebo Gly.

A7 je L-Ser, D-Ser, L-hSer, D-hSer, L-Thr, D-Thr, L-Ala, D-Ala nebo Gly. S výhodou je A7 L-Ser nebo L-Ala.

A8 je L-Ser, D-Ser, L-hSer, D-hSer, L-Thr, D-Thr, L-Ala, D-Ala nebo Gly. S výhodou je A8 L-Ser nebo L-Ala.

A9 je L-Glu, D-Glu, L-Asp, D-Asp, L-Ala, D-Ala nebo Gly.

S výhodou je A9 L-Glu nebo L-Ala.

A10 je L-Thr, D-Thr, L-Ser, D-Ser, L-hSer, D-hSer, L-Ala, D-Ala nebo Gly. S výhodou je A10 L-Thr nebo L-Ala.

A11 je Gly, L-Ala, D-Ala nebo -NH-CH₂-CH₂-. S výhodou A11 je Gly, L-Ala nebo -NH-CH₂-CH₂-.

A12 je L-Val, D-Val, L-Nva, D-Nva, L-Leu, D-Leu, L-lle, D-lle, (/?)-{-NH-CH[CH(CH₃)₂]-CH₂-}, (S)-{-NH-CH[CH(CH₃)₂]-CH₂-}, (/?)-{-NH-CH[CH₂CH₂CH₃]-CH₂-}, (S)-{-NH-CH[CH₂CH₂CH₃]-CH₂-}, (/?)-{-NH-CH[CH₂CH(CH₃)₂]-CH₂-}, (S)-{-NH-CH[CH₂CH(CH₃)₂]-CH₂-}, (/?/?)-{-NH-CH[CH₂(CH(CH₃)-CH₂CH₃]-CH₂-}, (RS)-{-NH-CH[CH₂(CH(CH₃)25 -CH₂CH₃]-CH₂-}, (SR)-{-NH-CH[CH₂(CH(CH₃)-CH₂CH₃]-CH₂-, nebo (SS)-{-NH-CH[CH₂(CH(CH₃)CH₂CH₃]-CH₂-}. S výhodou je A12 L-Val nebo (S)-{-NH-CH[CH(CH₃)₂]-CH₂-}.

A13 je Gly, L-Ala nebo D-Ala. S výhodou je A13 Gly nebo L-Ala.

- 11 Navíc je u peptidů podle vynálezu Z rovno OR, jestliže R je H, (Ci_₆)-alkyl, (C₂.₆)-alkenyl, (Ce-^-aryHC^j-alkyl, (C₄-i₃)-heteroaryl-(Ci_6)-alkyl nebo NR-|R₂, kde R! a R₂ jsou nezávisle zvoleny ze skupiny H, (C_v6)-alkyl nebo (C₆-i₄)-aryl-(Ci-6)-alkyl. S výhodou Z je

OR, jestliže R je H nebo NRiR₂, kde Ri a R₂ jsou nezávisle zvoleny ze skupiny H nebo (Ci.₆)-alkyl. Výhodněji Z je OH, NH₂ nebo NHEt.

Peptidy podle vynálezu mohou být navíc popřípadě prodlouženy na N- a C-konci, tj. v blízkosti A1 a/nebo A13, prostřednictvím několika aminokyselin. S výhodou mohou být prodlouženy až o 10 io aminokyselin. Q a Z tedy mohou obsahovat navíc společně až do deseti aminokyselin umístěných v blízkosti polohy A1 a/nebo A13.

Peptidy se mohou od obecného vzorce I lišit v několika polohách, ale s výhodou jsou modifikovány v jedné až čtyřech polohách, výhodněji ve dvou až třech polohách.

Jak se zde používá, termín (Ci.₆)-alkyl znamená rozvětvenou nebo nerozvětvenou alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, například methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, sek-butyl, terc-butyl a hexyl. Nejvýhodnější jsou alkylové skupiny obsahující 1 až 4 atomy uhlíku.

Termín (Ci-₄)-alkyl znamená rozvětvenou nebo nerozvětvenou alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku.

Termín (C₂_6)-alkenyl znamená rozvětvenou nebo nerozvětvenou alkenylovou skupinu obsahující 2 až 6 atomů uhlíku, jako je ethenyl, 2butenyl atd. Výhodné jsou skupiny (C₁.₄)-alkenyl, nejvýhodnější jsou (C-i-₃)-alkenylové skupiny.

Termín (C-i_6)-alkylkarbonyl znamená rozvětvenou nebo nerozvětvenou alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, navázanou na karbonylovou skupinu, například skupinu acetyl. Nejvýhodnější jsou alkylové skupiny obsahující 1 až 4 atomy uhlíku.

- 12 Termín karboxy-ÍC^j-alkyl znamená karboxylovou skupinu navázanou na rozvětvenou nebo nerozvětvenou alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 atomů uhlíku. Nejvýhodnější jsou alkylové skupiny obsahující 1 až 4 atomy uhlíku.

Termín (C-|.₆)-alkyloxykarbonyl znamená rozvětvenou nebo nerozvětvenou alkylovou skupinu, navázanou na oxykarbonylovou skupinu, například methoxykarbonylovou nebo tercbutyloxykarbonylovou (Boc-) skupinu. Nejvýhodnější jsou alkylové skupiny obsahující 1 až 4 atomy uhlíku.

io Termín (C2-6)-alkenyloxykarbonyl znamená rozvětvenou nebo nerozvětvenou alkenylovou skupinu obsahující 2 až 6 atomů uhlíku jak bylo definováno výše, navázanou na oxykarbonylovou skupinu, například allyloxykarbonylovou skupinu. Výhodné jsou skupiny (C1.4)alkenyl, nejvýhodnější jsou skupiny (Ci.₃)-alkenyl.

Termín (Ci_6)(di)alkylamino znamená (di)alkylaminovou skupinu obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, kde alkylová skupina má stejný význam jak bylo definováno výše. Výhodné jsou alkylové skupiny obsahující 1 až 4 atomy uhlíku.

Termín amino-(Ci.₆)-acyl znamená acylovou skupinu obsahující

2o 1 až 6 atomů uhlíku, na kterou je navázaná aminová funkční skupina, výhodné jsou acylové skupiny obsahující 1 až 4 atomy uhlíku.

Termín (C₆-4)-aryl znamená aromatickou uhlovodíkovou skupinu obsahující 6 až 14 atomů uhlíku, jako je fenyl, naftyl, tetrahydronaftyl, indenyl, anthracyl, která může být popřípadě substituovaná v poloze ortho a/nebo meta jedním nebo více substituenty jako jsou bez omezení skupiny hydroxy, halogen, nitro, kyano, amino ((Ci.₆)acyl) nebo (di)(C₁.₆)-alkylamino, přičemž skupiny acyl a alkyl mají stejný význam jak bylo definováno výše. Výhodné jsou skupiny (C6-io)-aryl, přičemž nejvýhodnější je skupina fenyl.

- 13 • ♦· · ♦ · ·· • · · · · » · · · · · • · · ···· · · * • · · · · ······· * · ····· ·· · ······

Termín (C4-i3)-heteroaryl-(Ci.₆)-alkyl znamená substituovanou nebo nesubstituovanou aromatickou skupinu obsahující 4 až 13 atomů uhlíku, s výhodou 4 až 9 atomů uhlíku, která obsahuje alespoň jeden heteroatom zvolený ze skupiny N, O a/nebo S, navázanou na rozvětvenou nebo nerozvětvenou alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 atomů uhlíku. Substituenty na heteroarylové skupině mohou být zvoleny ze skupiny substituentů uvedených pro arylovou skupinu. Heteroarylové skupiny obsahující dusík mohou být s alkylovou skupinou spojeny buď přes atom uhlíku nebo atom dusíku. Z alkylových skupin jsou výhodné skupiny obsahující 1 až 4 atomy uhlíku.

Termín (Ci.₆)-alkyl-(C6-i4)-aryl znamená rozvětvenou nebo nerozvětvenou alkylovou skupinu jak bylo definováno výše navázanou na arylovou skupinu jak bylo definováno výše. Výhodné jsou skupiny (Ce-1 o)-aryl, nejvýhodnější je fenyl. Z alkylových skupin jsou výhodné skupiny obsahující 1 až 4 atomy uhlíku.

Termín (C6-i4)-aryl-(C₁.₆)-alkyl znamená arylalkylovou skupinu, kde alkylová skupina je (C₃ _₆)-alkylová skupina a arylová skupina znamená (C₆.₄)-aryl jak bylo definováno výše, například skupinu benzyl (Bzl) nebo trifenylmethyl (Trt). Výhodné jsou skupiny (C₆-io)-aryl, nejvýhodnější je fenyl. Z alkylových skupin jsou výhodné skupiny obsahující 1 až 4 atomy uhlíku.

Termín (Ci-6)-alkylkarbonylamino znamená alkylkarbonyl-aminovou skupinu, jejíž alkylová skupina obsahuje 1 až 6 atomů uhlíku a má stejný význam jak bylo definováno výše. Výhodné jsou alkylové skupiny obsahující 1 až 4 atomy uhlíku.

Termín (Ce-uj-aryAC^j-alkyloxykarbonyl znamená (Ce-14)arylovou skupinu navázanou na alkyloxykarbonylovou skupinu, kde alkylovou skupinou je skupina (Ci.₄)-alkyl, a arylová skupina je definována výše, například skupinu benzyloxykarbonyl (Z) nebo

fluorenylmethoxykarbonyl (Fmoc). Výhodné jsou skupiny (C6-io)-aryl, nejvýhodnější je fenyl.

Termín halo znamená F, Cl, Br nebo I.

Aminokyseliny vyskytující se v přírodě jsou označeny pomocí zkratek (třípísmenový kód) následujícím způsobem: alanin (Ala), arginin (Arg), asparagin (Asn), kyselina asparagová (Asp), cystein (Cys), glutamin (Gin), kyselina glutamová (Glu), glycin (Gly), histidin (His), serin (Ser), isoleucin (Ile), leucin (Leu), lysin (Lys), methionin (Met), fenylalanin (Phe), prolin (Pro), threonin (Thr), tryptofan (Trp), tyrosin (Tyr) a valin (Val). U všech aminokyselin je stereochemická konfigurace definována jako L-.

Aminokyselina, která se v přírodě nevyskytuje, je případně Nasubstituovaná, α-aminokyselina s chemickou strukturou, která není identická se strukturou přírodních aminokyselin. Aminokyseliny, které se nevyskytují v přírodě, jsou například Phe(X), kde X je substituent umístěný v poloze para vzhledem k fenylovému kruhu Phe, hSer (kyselina 2-amino-4-hydroxybutanová), norleucin (Nle, kyselina2aminohexanová), norvalin (Nva, kyselina 2-aminopentanová), L-Hfe (Lα-homofenylalanin), D-Hfe (D-a-homofenylalanin), L-Thi (β-thienyl-Lalanin), D-Thi (β-thienyl-D-alanin), L-Cha (β-cyklohexyl-L-alanin), DCha (β-cyklohexyi-D-alanin), L-Pal(3) (β-3-pyridyl-L-alanin), D-Pal(3) (β-3-pyridyl-D-alanin), L-1-Nal (β-1-naftyl-L-alanin), D-1-Nal (β-1naftyl-D-alanin), L-2-Nal (β-2-naftyl-L-alanin), D-2-Nal (β-2-naftyl-Dalanin), L-Ser(Bzl) (O-benzyl-L-serin), D-Ser(Bzl) (O-benzyl-D-serin) a N-alkylglycinové deriváty, jako je NVal (N-isopropylglycin, NArg (N-(3-guanidinopropyl)glyoin) a NhSer (N-(2-hydroxyethyi)glycin). Do této skupiny aminokyselin jsou zařazeny také v přírodě se vyskytující aminokyseliny, jejichž stereochemická konfigurace je definována jako D-.

Je třeba rozumět, že v peptidu obsahujícím redukovanou amidovou vazbu je původní karbonylová skupina aminokyseliny • · · · · ·« • · · · · · • · · · · · · • · · · ···«···

- 15 nahrazena methylenovou skupinou. V peptidu obsahujícím isoster ethylenu byla původní karboxamidová funkční skupina (-C(O)-NR-) nahrazena ethylenovou skupinou (-CH=CR-).

Termín ψ[ΟΗ₂ΝΗ] mezi dvěma aminokyselinovými zbytky v sekvenci znamená, že původní amidová vazba (-C(O)-NH-) mezi těmito aminokyselinovými zbytky byla nahrazena redukovanou amidovou vazbou (-CH₂NH-).

Je výhodné, jestliže několik aminokyselin jak je ukázáno ve vzorci I je fixováno v obecném vzorci 2 v odpovídajících polohách. Výhodné provedení vynálezu je modifikovaný peptid obecného vzorce Q-A1 -A2-A3-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-A11 -A12-Gly-Z (vzorec III), kde Q, A1, A2, A3, A11, A12 a Z jsou jak definováno výše. Nejvýhodnější substituenty v obecném vzorci III jsou pro A1 L-Arg, DArg, H₂N-C(=NH)NH-(CH₂)₄-C(O)-, H₂N-(CH₂)_n-C(O)-, kde n je 5 až 7 nebo -N[(CH₂)₃-NH-C(=NH)-NH₂]CH₂C(O)-, pro A2 L-Ser nebo N[(CH₂)₂-OH]-CH₂-C(O)-, a pro A3 L-Phe, L-Phe(X), kde X je halo, L-1Nal, L-2-Nal, L-Ser(Bzl), L-Thi, L-Cha nebo L-Pal(3).

Výhodnější jsou peptidy obecného vzorce III, kde A1 je Arg, A3 je Phe a A11 je Gly, které poskytují sloučeniny obecného vzorce IV: QArg-A2-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-A12-Gly-Z, kde polohy Q, A2, A12 a Z jsou jak definováno výše.

Nejvýhodnější peptidy jsou zvoleny ze skupiny zahrnující desaminoargininyl-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂, desaminoargininyl-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, CH₃-(OCH₂CH₂)₃-OCH₂-C(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂, D-1-glucityl-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, CH₃O-C(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser^:Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, Ac-Arg-Ser-Phe-ψ-[CH₂NH]-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂, Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-v-[CH₂NH]-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂, Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu~Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-GlyVal-\|/-[CH₂NH]-Gly- 16 -

-NH₂, Ac-Arg-N[(CH₂)₂-OH]-CH₂-C(O)-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂, Ac-Arg-N[(CH₂)₂-OH]-CH₂-C(O)-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-v-[CH₂NH]-Gly-NH₂, H-Arg-Ser-Phe(CI)-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, H₂N-(CH₂)₅-CO)-Ser5 -Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, H₂N-(CH₂)₆-C(O)-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, (N-methyl-nikotinoyl)⁺-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH.

Vhodný postup syntézy modifikovaných peptidů HC gp39 (263io 275) s N-koncovými modifikacemi, jak je znázorněný ve vzorci V, začíná deriváty vzorce VI. Modifikované peptidy se syntetizují běžně používanou metodou syntézy peptidů na pevné fázi (Solid Phase Peptide Synthesis, SPPS) (B. Merrifield, Solid Phase Peptide Synthesis, Peptides 1995, 93 - 169, ed.: B. Gutte, Academie, San

Diego, Caiifornia, USA; P. Lloyd-Williams, F. Albericio, E. Giralt, Tetrahedron 49: 11065 - 11133, 1993). V závislosti na typu spojovací skupiny, která se použije, se peptidový řetězec naváže na nosič buď prostřednictvím esterové (PAC línker) nebo amidové (PAL línker) vazby.

Vzorec V línker polyethylenglykol (PEG)polystyrenový (PS) pevný nosič

Vzorec VI

Po ukotvení Fmoc-C-koncové aminokyseliny na pevný nosič (m = 1, A-B = Fmoc) použitím například vazebných činidel HATU (L. Carpino, A. El-Faham, C. A. Minor, F. Albericio, J. Chem. Soc., Chem. Comm. 201 - 203, 1994) nebo PyBOP (J. Coste, D. Le Nguyen, B. Castro, Tetrahedron Lett. 31: 205 - 208, 1990) a DiPEA, se řetězec prodlužuje (m = 2 -12) postupnou acylací vhodně chráněnými Fmocderiváty aminokyselin a potom se provádí odstranění ochranné skupiny Fmoc pomocí pyridinu (A-B = H) na automatickém syntezátoru peptidů. Alternativně mohou být pro provedení kondenzací použity pentafluorofenylové (Pfp) aktivní estery aminokyselin (A. Dryland, R. C. Sheppard, Tetrahedron 44: 859 - 876, 1988). Potom se zavede použitím stejného protokolu N-koncová aminokyselina B a skupina Fmoc se odstraní. Takto získaný 13-merní peptidový derivát (A = Η, B = N-koncová aminokyselina, m = 12) se potom může opatřit na N-konci funkční skupinou. Zavedení další amidové vazby na N-konci (A = alkylkarbonyl) se může uskutečnit provedením další kondenzace pomocí HATU nebo PyBOP s požadovanou kyselinou (X-OH) nebo vazbou s acylchloridem (X-CI) v přítomnosti pyridinu. Nabitá 1-methylpyridinium-4-karbonylová jednotka nebo 1-methylpyridinium-3-karbonylová jednotka může být zavedena po odštěpení (viz dále) z pryskyřice (tj. vzorec V, A = Η, B = N-koncová aminokyselina, Z = OR nebo R = H, alkyl nebo Z = NR¹R², kde Ri, R₂ = H nebo alkyl) reakcí pomocí DiPEA volného N-konce peptidu s úplně odstraněnou ochrannou skupinou, s N-methyl(iso)nikotiniumhydroxysukcinimidovým aktivním esterem (M. L. Tedjamulia, P. C. Srivastava, F. F. Knapp, J. Med. Chem., 28: 1574 - 1580, 1985) ve vodném médiu (srovnej převedení A = H až A = N-methyl(iso)nikotinium ve vzorci V).

/\/-alkylace může být provedena redukční aminací působením vhodného aldehydu (vzorec VI, konverze A = H na A = alkyl) na imobilizovaný peptid v přítomnosti NaBH(OAc)3 v DMF/HOAc (99/1, obj./obj.). Alternativně je možno získat reakcí imobilizovaného peptidu (A = H) s alkylhalogenidem v přítomnosti DiPEA /V-alkylované peptidy

- 18 »« »' * · · ·· • · · · ··» • · · ♦ ·*·»·»« « · • ·· · · ·· · ···»·· (např. reakcí s terc-butylbromacetátem). Volná skupina NH₂ (A = H ve vzorci VI) může být také opatřena funkční skupinou karbamoyl (např. methoxykarbonyl) reakcí s odpovídajícím karbamoylchloridem v CH₂CI₂/DiPEA (přeměna A = H na A = alkyloxykarbonyl ve vzorci VI). Po odštěpení peptidů z pevného nosiče se současným odstraněním ochranných skupin labilních v kyselém prostředí použitím směsi TFA/EtsSiH/anisol/ROH (R = H, alkyl) se peptidy obecného vzorce V (Z = OR) čistí RP-HPLC. Alternativně může být C-konec opatřen v průběhu odštěpování od pryskyřice amidovou funkční skupinou (Z = NR¹R² s R¹ a R² = H nebo alkyl). V takovém případě se použije odlišné vazebné skupiny (PAL; B. Merrifield, Peptides, 93 - 169, 1995) mezi peptidovým řetězcem (vzorec VI) a pevným nosičem PEG-PS. Jestliže je volná aminová skupina vazebné skupiny PAL alkylována před navázáním první (C-koncové) aminokyseliny, po odštěpení od polymerního nosiče se vytvoří C-koncové alkylamidy.

Použitím stejné strategie Fmoc-SPPS jsou dostupné peptidy, které obsahují takové aminokyseliny, které se nevyskytují v přírodě, ale jsou komerčně dostupné (např. D-aminokyseliny nebo substituované deriváty fenylalaninu). Kromě toho se nejprve v roztoku syntetizují pomocí způsobů známých z literatury N-alkylglycinové deriváty (peptoidní monomery, R_n ¹ = postranní řetězec aminokyseliny, Rn² = H ve vzorcích V a VI) (J. A. Kruijtzer, L. J. F. Hofmeyer, W. Heerma, C. Versluis, R. M. J. Liskamp, Chem. Eur. J., 4; 1570 - 1580, 1998). Před SPSS byla také v roztoku připravena modifikovaná L-koncová aminokyselina β-homo-L-arginin [B = NH-CH(CH2CH₂-CH₂NH-CH(=NH)NH₂)-CH₂-C(O)] podle známých postupů (Η. Μ. M. Bastiaans, A. E. Alewijnse, J. L. van der Baan, H. C. J. Ottenheijm, Tetrahedron Lett. 35: 7659 - 7660, 1994). Po navázání ochranné skupiny Fmoc na volnou skupinu NH₂ v takto získané monomerní aminokyselině mohou být sloučeniny zavedeny do prodlužujícího se peptidů (vzorec VI) použitím protokolu SPPS.

- 19 Poslední třída modifikovaných peptidů obsahuje peptidy zahrnující jednu nebo více redukovaných amidových vazeb (R_n ³ = H₂ ve vzorci V). Tyto deriváty jsou dostupné (J. J. Wen, A. R. Spatola, J. Pept. Res., 49: 3 - 14, 1997) modifikovaným protokolem SPPS, při kterém se volná N-koncová aminokyselina rostoucího řetězce (1<m<12 ve vzorci VI) alkyluje vstupujícím aldehydem aminokyseliny za redukčních podmínek (NaBH₃CN, DMF/HOAc, 99/1, obj./obj.). Požadované aldehydy aminokyselin chráněné A/-Fmoc jsou buď komerčně dostupné nebo se dají získat způsoby známými z literatury io (J. J. Wen, C. M. Crews, Tetrahedron: Asymmetry 9: 1855 - 1858, 1998). Tímto způsobem prodloužený řeězec (A-B = Fmoc, R_n ¹ = H, Rn² = postranní řetězec aminokyseliny, Rn³ = H₂) obsahuje sekundární aminovou funkční skupinu (R_n+i¹ = H), na kterou se potom naváže ochranná skupina Boc. Po odstranění ochranné skupiny Fmoc může být peptidový řetězec dále prodloužen použitím protokolu SPPS.

Vzorec VII

Alternativně se může dimerní struktura obecného vzorce VII syntetizovat v roztoku před SPPS. Vhodný benzylester aminokyseliny (H₂N-CH(R_n+1 ²)-CO₂Bzi) se redukčně alkyluje (NaBH₃CN, DMF/HOAc, 99/1, obj./obj.) aldehydem aminokyseliny chráněným skupinou Fmoc (Fmoc-NH-CH(R_n ²)C(O)H) za poskytnutí dimerního sekundárního aminu. Po navázání ochranné skupiny Boc na aminovou funkční skupinu (Rn+/ - Boc) a následné hydrolýze benzylesteru se vytvoří sloučenina vzorce VII, která může být začleněna do rostoucího řetězce postupem SPPS.

- 20 • · · · ·»· · · · « • ·· ·*.» · w · » · «toto ·«··«·· · * ***** ·* to ·<··»·

Peptidy podle vynálezu mohou být použity jako terapeutická látka. Mohou být zvláště použity pro indukci specifické tolerance Tbuněk vůči autoantigenu u pacientů, kteří trpí autoimunitními onemocněními, zvláště artritidou.

Selekci modifikovaných peptidů založených na struktuře epitopu T-buněk omezeného MHC třídy II se zvýšenou stimulační aktivitou in vitro a zvýšenou aktivitou in vivo je možno provést známými technologiemi.

Aby se udržely agonistické vlastnosti daného T-buněčného epitopu, považuje se za nezbytné nezasahovat příliš mnoho buď do zbytků, které se účastní vazby na příslušnou molekulu MHC, ani příliš nezasahovat do zbytků, které se účastní vazby na receptor TCR relevantních T-buněk. Selekce agonisticky modifikovaných peptidů by tedy zahrnovala:

1) definici afinity modifikovaného peptidu pro vazbu relevantní molekuly MHC a porovnání s afinitou nemodifikovaného peptidového epitopu standardního typu;

2) definici stimulační aktivity modifikovaného peptidu a porovnání s aktivitou nemodifikovaného peptidu standardního typu použitím testu in vitro (společná inkubace ozářených buněk předkládajících antigen s peptidovým antigenem a specifickými T-buňkami. S výhodou by se měla hodnotit široká skupina pro epitop specifických, MHC třídy II omezených T-buněk s různými klonotypy TCR, ale reagujících se stejným epitopem v kontextu stejné molekuly MHC třídy II. Pro tento účel může být použit soubor specifických T-buněčných hybridomů nebo specifických T-buněčných linií/klonů. Selekce modifikovaného epitopu pro použití' u člověka bude s výhodou vyžadovat použití lidských linií/klonů T-buněk pro zajištění odpovídajících vlastností selektovaných modifikovaných epitopu pro rozpoznávání lidských T-buněk.

- 21 ·* · 4· »· »«« ·

3) definici aktivity modifikovaného peptidů in vivo (v případě potřeby). K tomuto účelu mohou být použita různá experimentální uspořádání:

a) test na hypersenzitivitu opožděného typu,

b) test aktivace T-buněk ex vivo po podání antigenu (s nebo bez adjuvans) in vivo,

c) modulace onemocnění v experimentálních modelech autoimunitního onemocnění podáním modifikovaného peptidového antigenu.

S výhodou je třeba provádět selekci sloučenin se zesílenou agonistickou aktivitou in vitro v porovnání s peptidem standardního typu, nebo se zesílenými účinky in vivo.

Jednotlivé peptidy odvozené od HC gp-39, které jsou rozpoznávány u myší, budou pravděpodobně po podávání nosem modulovat reaktivitu ve smyslu snížení vůči těmto peptidům. Tato reaktivita může být měřena testovacím podáním sledovaného peptidů zvířeti a vyhodnocením otoku tlapky jako důsledku odpovědi DTH. Imunizace peptidy u myší Balb/c vedou k imunologickým odpovědím na peptid HC gp-39 263-275. Myším imunizovaným HC gp-39 může být tedy zkušebně podán peptid HC gp-39 263-275 s cílem detekovat odpověď DTH. Pro vyhodnocení vytvoření tolerance působením modifikovaných peptidů in vivo mohou být myši nosem ošetřovány peptidem HC gp-39 263-275 nebo peptidovými deriváty v různých koncentracích. Očekává se, že modifikované peptidově deriváty s výhodnějším profilem z hlediska indukce tolerance budou při tomto testu in vivo aktivní při nižších koncentracích než původní peptid. Aby bylo možno kvantitativně detekovat účinky indukce tolerance nativním peptidem v porovnání s modifikovanými peptidovými deriváty, mohou být testovány různá aplikační schémata a různé dávky. Nakonec je třeba zjistit, zda jsou v tomto modelu modifikované formy HC gp-39 • · « · · · · • · · · · · • · ··»· ··

263-275 účinnější při vytváření modulace ke snížení odpovědí DTH indukovaných HC gp-39 263-275 účinnější než nativní peptid 263-275.

Tolerance může být dosaženo podáváním vysokých nebo nízkých dávek látky vytvářející toleranci (tolerogenu) nebo peptidů podle vynálezu. Množství tolerogenu nebo peptidu bude záviset na způsobu podávání, době podávání, věku pacienta stejně jako celkovém zdravodním stavu pacienta a výživě.

Obecně se může používat dávek 0,01 do 1000 pg peptidu nebo proteinu na kilogram tělesné hmotnosti, s výhodou 0,05 až 500 pg, io výhodněji 0,1 až 100 pg peptidu nebo proteinu.

Další provedení vynálezu se týká farmaceutických prostředků obsahujících jeden nebo více peptidů podle vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič.

Farmaceuticky přijatelné nosiče jsou odborníkům v oboru dobře 15 známé a zahrnují například sterilní fyziologický roztok, laktózu, sacharózu, fosforečnan vápenatý, želatinu, dextrin, agar, pektin, podzemnicový olej, olivový olej, sezamový olej a vodu. Dalšími nosiči mohou být například molekuly MHO třídy II, v případě potřeby zapouzdřené v liposomech.

Farmaceutický prostředek podle předkládaného vynálezu může navíc obsahovat jedno nebo více adjuvans. Mezi vhodná adjuvans patří mj. hydroxid hlinitý, fosforečnan hlinitý, amfigen, tokoferoly, monofosfenyllipid A, muramyldipeptid a saponiny jako je Quill A. Množství adjuvans závisí na jeho povaze.

Farmaceutický prostředek podle vynálezu může navíc obsahovat jeden nebo více stabilizátorů, jako jsou například uhlohydráty včetně sorbitolu, mannitolu, škrobu, sacharózového dextrinu a glukózy, proteiny jako je albumin nebo kasein, a pufry jako jsou alkalické fosfáty.

Vhodné způsoby podávání jsou intramuskulární injekce, subkutánní injekce, intravenózní injekce nebo intraperitoneální injekce, orální a intranazální podávání. Orální a intranazální podávání jsou výhodné způsoby podávání. Zvláště modulátorové buňky specifické pro antigen by mohly být vytvářeny aplikací antigenu přes sliznici, například přes nosní sliznici. Ukázalo se, že podávání antigenů přes sliznici indukuje imunologickou toleranci k těmto antigenům. Peptidy podle vynálezu jsou také velmi vhodné pro použití při diagnostické metodě pro detekci přítomnosti aktivovaných autoreaktivních T-buněk, které se účastní chronického zánětu kloubní chrupavky.

Diagnostická metoda podle vynálezu zahrnuje následující kroky:

a) izolaci mononukleárních buněk (PBMC) z periferní krve ze vzorku pacienta,

b) kultivaci uvedených PBMC za vhodných podmínek,

c) inkubaci této kultury PBMC v přítomnosti autoantigenu nebo jednoho nebo více od antigenu odvozených peptidů podle vynálezu, a

d) detekci odpovědi T-buněk, například proliferativní odpovědi, která ukazuje na přítomnost aktivovaných autoreaktivních Tbuněk u pacienta.

V případě detekce odpovědi měřením proliferační odpovědi autoreaktivních T-buněk je měřítkem proliferace inkorporace radioisotopu jako je například 3H-thymidin. Odpověď autoreaktivních T-buněk přítomných v PBMC může být také detekována měřením uvolňování cytokinů ELISA specifickou pro cytokin, nebo cytotoxicity pomocí uvolňování ⁵¹chromu. Další metodou detekce je měření exprese aktivovaných markérů analýzou FACS, například II-2R. Diagnostický prostředek obsahující jeden nebo více peptidů podle předkládaného vynálezu a vhodný detekční prostředek tedy tvoří

- 24 součást vynálezu. V závislosti na typu detekce může být detekčním prostředkem radioisotop, enzym nebo protilátky specifické pro buněčný povrch nebo aktivační markéry.

V rámci vynálezu jsou také testovací kity, které obsahují jeden 5 nebo více peptidů podle vynálezu. Tyto testovací kity jsou vhodné pro použití při diagnostické metodě podle vynálezu.

Podle předkládaného vynálezu mohou být tedy modifikované peptidy odvozené od HC gp-39 použity pro modulaci vedoucí k omezení autoimunitního onemocnění.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1

Proliferace klonu 235 po stimulaci úvodním peptidem nebo vybranými modifikovanými peptidy použitím ozářených, autologních

PBMC jako buněk předkládajících antigen (APC) byla měřena podle popisu v příkladu 15. Peptidy byly testovány na svou stimulační aktivitu při koncentracích 0, 0,4, 2,10 a 50 pg/ml. Je ukázána odpověď klonu 235 po stimulaci vedoucím (lead) peptidem H-Arg-Ser-Phe-ThrLeu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH (plné kroužky), stimulace Ac20 Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-v|/-[CH2NH]-Gly-NH₂ (plné čtverečky), stimulace Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-SerGlu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂ (prázdné kroužky) nebo stimulace Ac-ArgNhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-v-[CH₂NH]-Gly-NH₂ (prázdné čtverečky).

Tabulka 2

Test na hybridomech (test první linie): + = sloučenina stimuluje všechny tři hybridomy srovnatelným způsobem nebo lépe než nemodifikovaný peptid 263-275. +* = agonistická aktivita byla ukázána

- 25 pro 1 nebo 2 hybridomy, ale ne pro všechny tři. Reaktivita lidských klonů (proliferace klonu 235 a 243) z hlediska účinnosti (stimulační aktivita anaiogu/stimuiační aktivita vedoucího peptidu; např. HC gp-39 (263-275)). - = účinnost <0,6, + = účinnost 0,6 -12, ++ = účinnost >12 100, +++ = účinnost >100. Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2, Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-v[CH₂NH]-Gly-NH₂, D-1-glucityl-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, CH₃(OCH₂CH₂)₃-OCH₂C(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂ a H-Arg-Ser-Phe(4CI)-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH byly testovány na svou afinitu vázat HLA DRB1*0401 a porovnávány s aktivitou vedoucého peptidu (H-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH). Nejúčinnější sloučeniny (Ac-Arg-NhSerPhe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂ a Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ [CH₂NH]-Gly-NH₂) ukázaly relativní afinitu pro vazbu na HLA-DRB1*0401, která byla porovnatelná s afinitou původního peptidu.

Následující příklady jsou uvedeny pro ilustraci vynálezu a nemají být žádným způsobem interpretovány ve smyslu omezení rozsahu vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

H-Arg-Ser-Phe(4CI)-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-QH (1)

Do reakční nádoby syntezátoru peptidů Millipore 9050 PepSynthesizer bylo vloženo 0,5 g Fmoc-Gly-PAC-PEG-PS (komerčně dostupný od PerSeptive Biosystems, 0,20 mmol/g), předem nabobtnalého v N-methylpyrrolidinonu (NMP). Odstraňování skupiny Fmoc v každém vazebném cyklu bylo prováděno směsí piperidin/DMF (1 : 4 obj./obj.). Účinnosti vazby byly zjišťovány spektroskopickou

analýzou odštěpování Fmoc po každém kroku prodloužení. V každém vazebném kroku byly použity 4 ekvivalenty příslušné aminokyseliny s postranním řetězcem chráněným Fmoc, labilním v kyselém prostředí. Na syntezátoru bylo použito metody dvojité stříkačky, přičemž jedna stříkačka obsahuje 0,50M HATU v DMF p.a. a druhá stříkačka obsahuje 1,0M DIPEA v DMF p.a. Hlavní promývací roztok obsahoval N-methylpyrrolidinon s 0,1 % HOBt. Bylo použito protokolu Analog Synthesis. Po odstranění konečné skupiny Fmoc byla pryskyřice s imobilizovaným peptidem vyjmuta z reakčni nádoby a postupně promyta DMF (20 ml), CH2CI2 (20 ml), diethyletherem (20 ml), CH₂CI₂ (20 ml), diethyletherem (20 ml), CH₂CI₂ (20 ml) a diethyletherem (20 ml). Imobilizovaný peptid byl sušen ve vakuu přes noc. Peptid byl potom odštěpen 10 ml směsi TFA/(iPr)₃SiH/anisol/H₂O 88/5/5/2 obj./obj./obj./obj. po dobu 3 hod. Při tomto kroku byly také odstraněny ochranné skupiny postranních řetězců labilní v kyselém prostředí. Po odpaření rozpouštědla byl peptid vysrážen s 200 ml diethyletheru. Etherová vrstva byla dekantována a peptid byl promyt dalším množstvím (2 x 200 ml) etheru. Surový peptid byl potom sušen proudem dusíku a lyofilizován. Čištění peptidu se provádělo chromatografií HPLC na patrone PrepPak 40 - 100 mm Delta-Pak™ C18 15 pm 100Á s reverzními fázemi. Mobilní fáze obsahovala 20 % fosfátového pufru pH 2,1 a gradient acetonitrilu a vody, jak je ukázáno v následující analýze. Peptid byl odsolen na HPLC, použitím 4 °/₀₀ vodné kyseliny octové. Čištěný produkt byl lyofilizován.

Mobilní fáze: A: 0,5 mol/l NaH₂PO4 + H₃PO₄, pH = 2,1

B: H₂0

C: CH3CN/H2O = 3/2 (obj./obj.)

Gradient: A: 20 %; B: 80 % -> 20 %; C: 0 % -> 60 % v 40 min.

Výtěžek: 68 mg; čistota HPLC: 90,1 %; hmotnostní spektrum: molekulová hmotnost = 1346, to je v souladu s molekulárním vzorcem C₅₅H₈9CIN₁₆O₂₁; analýza aminokyselin: všechny aminokyseliny byly

- 27 4 4 ·«· ·» ·· • ·«· ·»·· ·· · » · · · · · 4 4 4 ······· « 4 ····* 44 4 444*44 nalezeny v požadovaných množstvích; obsah peptidů: 74,8 %; iontová chromatografie: fosfát: 0,6 %, acetát: 0,6 %, chlorid: 3,4 % (hmotn./hmotn.).

Příklad 2

H₂N-(CH₂)5-C(O)-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Glv-Val-Gly-OH (2)

Peptid byl syntetizován použitím metody chemické syntézy na pevné fázi, jak je uvedeno v syntéze sloučeniny 1 (viz výše). V tomto io případě byly použity komerčně dostupné pentafluorfenylové (Pfp) aktivní estery Fmoc-aminokyselin namísto volných Fmoc-aminokyselin a HATU/DIPEA. Sloučenina byla připravena použitím 6-Fmocaminohexanové kyseliny jako N-koncové aminokyseliny, získané z kyseliny 6-aminohexanové analogicky s postupem popsaným v literatuře (A. Marston, E. Hecker, Z. Naturforsch. B Anorg. Chem. Org. Chem., 38: 1015 - 1021, 1983). Jako nosič byl použit Fmoc-Gly-PAC-PEG-PS (0,75 g, 0,170 mmol/g) a 3 ekv. příslušných Pfp esterů. Pro vazbu kyseliny 6-Fmoc-aminohexanové byl jako vazebné činidlo použit PyBOP (199 mg). Zpracování provedené standardním postupem (příklad 1) poskytlo 168 mg surového produktu. Ten byl čištěn HPLC (fosfátový systém pH = 2,1, s gradientem CH₃CN-H₂O). Produkt byl odsolen na HPLC s 5 °/₀₀ vodnou kyselinou octovou a lyofilizován, za získání 34 mg požadovaného peptidů.

Čistota HPLC: 99,6 %; hmotnostní spektrum: molekulová hmotnost = 1268, to je v souladu s molekulárním vzorcem C55H₈9N-|₂O₂i; analýza aminokyselin: všechny aminokyseliny byly nalezeny v požadovaných množstvích; obsah peptidů: 67,3 %; iontová chromatografie: fosfát: 10 % (hmotn./hmotn.).

• · «·« · · · 3

··♦ ·· ·· « ·· ·«··

Příklad 3

H₂N-(CH₂)6-C(O)-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Glv-Val-Gly-OH (3)

Peptid 3 byl připraven identickým způsobem jako jeho Nkoncový homolog 2 s použitím 7-Fmoc-aminoheptanové kyseliny (3a, připraveno analogicky jako sloučenina 2a: A. Marston, E. Hecker, Z. Naturforsch. B Anorg. Chem. Org. Chem., 38: 1015 - 1021, 1983) jako N-koncová aminokyselina. Jako nosič byl použit Fmoc-Gly-PAC-PEG-PS (1,0 g, 0,17 mmol/g). Zpracování, čištění HPLC a odsolení jak je popsáno ve standardním postupu (příklad 1) poskytlo 45 mg požadovaného peptidu.

Čistota HPLC: 95,0 %; hmotnostní spektrum: molekulová hmotnost = 1282, to je v souladu s molekulárním vzorcem C₅6H₉₁N₁₃O₂; analýza aminokyselin: všechny aminokyseliny byly nalezeny v požadovaných množstvích; obsah peptidu: 87,4 %; iontová chromatografie: acetát: 0,2 % (hmotn./hmotn.).

Příklad 4 (A/-methylnikotinoyl)⁺-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Glv-Val-Gly-OH (4)

Před přípravou peptidu 4 byl výchozí materiál N-sukcinimidyl (1-methyl-3-pyridinio)formátjodid (4a) syntetizován způsobem známým z literatury (M. L. Tedjamulia, P. C. Srivastava, F. F. Knapp; J. Med. Chem. 28: 1574 - 1580, 1985). Syntéza sloučeniny 4 byla prováděna v roztoku. Peptid H-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH (4b, 26 mg, 0,02 mmol), připravený způsobem SPPS popsaným v' příkladu 1, byl rozpuštěn v DMF/H₂O (1/99 obj./obj., 10 ml) a byla přidávána směs DIPEA/DMF (1/1, obj./obj.), až bylo získáno pH = 9. Potom byl přidán ve dvou částech N-sukcinimidyl(1-methyl-3-pyridinio)formátjodid (4a, 0,056 g, 0,15 mmol). pH bylo

udržováno na pH = 9 přidáním několika kapek DIPEA/DMF (1/1, obj./obj.). Směs byla míchána při teplotě laboratoře 4 hod a potom byla zředěna 10 ml H2O a 5 ml fosfátového pufru pH = 2,1. Produkt byl čištěn ihned HPLC se systémem fosfátového pufru jak bylo ukázáno výše (příklad 1). Odsolení 5 °/₀₀ vodnou kyselinou octovou a lyofilizace poskytly 14 mg požadovaného peptidu 4.

Čistota HPLC: 98,1 %; hmotnostní spektrum: molekulová hmotnost = 1430; analýza aminokyselin: všechny aminokyseliny byly nalezeny v požadovaných množstvích; obsah peptidu: 56,3 %; iontová chromatografie: chlorid: 1,4 %, fosfát: 1,0 %, trifluoracetát: 0,8 %, acetát: 0,3 % (hmotn./hmotn.).

Příklad 5

Desaminoargininyl-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Glv-Val-Gly-OH (5)

Peptid 5 byl syntetizován výše popsaným způsobem pro sloučeninu 1 s použitím Fmoc-chráněných aminokyselin, HATU, DIPEA a 1,0 g pryskyřice Fmoc-Gly-PAC-PEG-PS, při množství naneseném na nosič 0,17 mmol/g. V konečném kroku byl na imobilizovaný peptidový řetězec navázán desamino-Arg(Adoc)2-OH (5a). Karboxylová kyselina 5a byla připravena známým způsobem (R. Presentini, G. Antoni, Int. J. Pept. Protein Res., 27: 123 - 126, 1986). Podmínky zpracování a čištění byly identické s peptidem 1.

Výtěžek: 58 mg; čistota HPLC: 91,1 %; hmotnostní spektrum: molekulová hmotnost = 1296; analýza aminokyselin: všechny aminokyseliny byly nalezeny v požadovaných množstvích; obsah peptidu: 76,2 %; iontová chromatografie: fosfát: 0,4 %, trifluoracetát: 0,6 %, acetát: 0,2 % (hmotn./hmotn.).

Příklad 6

Desaminoargininyl-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Glv-Val-Glv-NH? (6)

Sestavení peptidu 6 bylo provedeno podobným způsobem jako u dříve popsaného peptidu 5, s použitím pryskyřice PAL-PEG-PS (0,17 mmol/g) namísto PAC-PEG-PS jako pevného nosiče. V tomto případě byla odstraněna skupina Fmoc z komerčně dostupné (PerSeptive Biosystems) pryskyřice Fmoc-PAL-PEG-PS a získaný nosič H-PAL-PEG-PS byl kondenzován s Fmoc-Gly-OH pomocí HATU/DIPEA. Po prodloužení peptidového řetězce a následném odštěpení z pryskyřice za stejných podmínek jak bylo popsáno v příkladu 1, byl získán požadovaný karboxamidový C-konec. Podmínky zpracování a čištění byly identické jako u peptidu 1.

Výtěžek: 43 mg; čistota HPLC: 91,3 %; hmotnostní spektrum: molekulová hmotnost = 1295; analýza aminokyselin: všechny aminokyseliny byly nalezeny v požadovaných množstvích; obsah peptidu: 76,5 %; iontová chromatografie: chlorid: 0,5 %, acetát: 4,0 % (hmotn./hmotn.).

Příklad 7

CH3(OCH₂CH₂)3-OCH₂-C(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH? (7)

Pro syntézu peptidu 7 byl nejprve připraven výchozí materiál CH₃(OCH₂CH2)3-OCH2-CO2H (7a), podle postupu známého z literatury A. H. Haines, P. Karntiang, Carbohydr. Res., 78: 205 - 211, 1980). Syntéza chráněného a imobilizovaného peptidu H-Arg(Pmc)-Ser(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Leu-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Gly-Val-Gly-PAL-PEG-PS (7b) byla prováděna jak je ukázáno v příkladu 2, s použitím Pfp esterů aminokyselin. Peptid na pryskyřici (7b) byl nejdříve ponechán nabobtnat v NMP a bylo přidáno 142 mg

(0,64 mmol) CH₃(OCH2CH2)3-OCH₂CO₂H (7a), spolu se 169 mg (0,64 mmol) vazebného činidla TFFH (tetramethylfluoroform-amidiniumhexafluorfosfát). Spojená reakční činidla byla v syntezátoru Pepsynthesizer ponechána cirkulovat 60 min. Odštěpení od pryskyřice a zpracování bylo provedeno jak je popsáno v příkladu 5. Surový peptid byl potom čištěn HPLC se systémem rozpouštědel uvedeným v příkladu 1. Produkt byl odsolen na koloně HPLC s použitím 2,5 °/₀₀ AcOH.

Výtěžek: 120 mg; čistota HPLC: 78 %; hmotnostní spektrum: molekulová hmotnost = 1515; iontová chromatografie: chlorid: 0,1 %, fosfát: 0,3 %, trifluoracetát: 4,0 %, acetát: 0,3 % (hmotn./hmotn.).

Příklad 8

D-1-glucityl-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH <81

Před sestavením peptidu 8 modifikovaného na N-konci byl připraven podle příkladu 1 peptid H-Arg(Pmc)-Ser(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Leu-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Gly-Val-Gly-PAC-PEG-PS (8a), se stejnou sekvencí jako peptid 7b, ale s odlišným typem propojovací skupiny (PAC namísto PAL). Redukční aminace byla prováděna přes noc působením na 6-O-trityl-a/p-D-glukopyranózu (8b, 422 mg, 1,0 mmol, T. Utamura, K. Kuromatsu, K. Suwa, K. Koizumi, T. Shingu, Tetsuro; Chem. Pharm. Bull. 34: 2341 - 2353, 1986) imobilizovaným peptidem 8a (500 mg, 0,2 mmol/g) v DMF/HOAc (99/1, obj./obj., 10 ml) použitím NaBH(Oac)₃ (212 mg, 1,0 mmol) jako redukčního činidla. Následné odštěpení získaného úplně chráněného derivátu (6-O-trityl-D-1-glucityl)-Arg(Pmc)-Ser(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Leu-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Gly-Val-Gly-PAC-PEG-PS z pryskyřice s použitím podmínek uvedených v příkladu 1 se současným odstraněním tritylové skupiny a všech ochranných skupin

aminokyselin, poskytly 38 mg cílového peptidů 8, po vyčištění preparativní HPLC a odsolení 5 °/₀₀ vodnou HOAc.

Čistota HPLC: 84,7 %; hmotnostní spektrum: molekulová hmotnost = 1475; analýza aminokyselin: všechny aminokyseliny byly nalezeny v požadovaných množstvích; Obsah peptidů: 61,0 %; iontová chromatografie: chlorid: 0,1 %, acetát: 1,7 % (hmotn./hmotn.).

Příklad 9

MeO-C(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Glv-Val-Gly-OH (9i

Syntéza peptidů 9 se prováděna suspendováním imobilizovaného peptidů H-Arg(Pmc)-Ser(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Leu-AlaSer(tBu)-Ser (tBu)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Gly-Val-Gly-PAC-PEG-PS (8a) v dioxanu a ochlazením na 0 °C. K této suspenzi bylo přidáno 100 pl 4N vodného NaOH a 100 μΙ methylchloroformátu. Reakční směs byla míchána 16 hod a potom byla pryskyřice promyta EtOH/H₂O, EtOH, CH₂CI₂ a etherem. Po usušení ve vakuu byl produkt odštěpen od pryskyřice a čištěn jak bylo popsáno při výše uvedených syntézách peptidů (příklad 1). Peptid byl nakonec odsolen na HPLC použitím 5°/₀₀ vodné kyseliny octové a potom lyofilizován, za získání peptidů 9.

Výtěžek: 11 mg; čistota HPLC: 96,8 %; hmotnostní spektrum: molekulová hmotnost = 1368; analýza aminokyselin: všechny aminokyseliny byly nalezeny v požadovaných množstvích; obsah peptidů: 60,5 %; iontová chromatografie: chlorid: 2,0 %, fosfát: 0,2 %, acetát: 0,4 % (hmotn./hmotn.).

- 33 Příklad 10

Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-yjfCH^NHI-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂ (10)

Před syntézou peptidů 10 byl připraven nezbytný stavební blok Fmoc-Leu-H (10a) ve formě aldehydu aminokyseliny známým způsobem podle (J.-P. Meyer, P. Davis, K. B. Lee, F. Porreca, Η. I. Yamamura, V. Hrubý, J. Med. Chem. 38: 3462 - 3468, 1995). Sloučenina 10a byla použita bez dalšího čištění. Způsobem popsaným v příkladu 1 byla na pryskyřici navázána funkční skupina na aminokyselinu 8 peptidového řetězce za poskytnutí H-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Gly-Val-Gly-PAL-PEG-PS (10b). Tento imobilizovaný derivát (1 g, 0,2 mmol/g) byl suspendován v 5 ml 1% kyseliny octové v DMF. Byly připraveny dva roztoky, a to 148 mg Fmoc-Leu-H (10a) ve 2,5 ml DMF a 30 mg NaCNBH₃ ve 2,5 ml DMF. Oba roztoky byly spojeny a přidány k suspenzi peptidů 10b. Směs byla míchána přes noc při teplotě laboratoře. Potom byl získaný meziprodukt FmocLeu-v[CH₂NH]-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu-(OtBu)-Thr(tBu)-Gly-Val-Gly-PAL-PEG-PS (10c) chráněn na nově zavedené sekundární aminové funkční skupině Boc₂O a pyridinem. Peptid 10c navázaný na pryskyřici byl suspendován v 10 ml suchého CH₂CI₂ a 35 mg (0,16 mmol) Boc₂O a byl přidáno 13 μΙ (0,16 mmol) pyridinu. pH bylo udržováno na pH = 8 pyridinem a směs byla míchána přes noc. Potom bylo provedeno zpracování pryskyřice promytím CH₂CI₂, EtOH, CH₂CI₂, etherem a sušením ve vakuu. Syntéza byla prováděna způsobem SPPS použitím Fmoc aminokyselin a HATU/DIPEA s NMP jako rozpouštědlem (příklad 1). Poslední krok zahrnoval vazbu s 4-nitrofenylacetátem pro zavedení N-koncové acetylové skupiny. Po zpracování, jak je popsáno v příkladu 1, byl surový peptid čištěn HPLC, odsolen 5°/₀₀ kyselinou octovou a lyofilizován za poskytnutí cílového peptidů 10.

• · • ·

- 34 Výtěžek: 28 mg; čistota HPLC: 76,3 %; hmotnostní spektrum: molekulová hmotnost = 1339; iontová chromatografie: trifluoracetát:

1,2 %, acetát; 2,0 % (hmotn./hmotn.).

Příklad 11

Ac-Arg-Ser-Phe-wfCHgNHI-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NHg (11)

Syntéza sloučeniny 11 zahrnovala redukční vazbu Fmoc-Phe-H (11a, J.-P. Meyer, P. Davis, Κ. B. Lee, F. Porreca, Η. I. Yamamura, V. io Hrubý, J. Med. Chem., 38: 3462 - 3468, 1995) na chráněný peptid H-Thr(tBu)-Leu-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Gly-Val-Gly-PAL-PEG-PS (11b) navázaný na pryskyřici, získaný podle protokolu SPPS popsaného v příkladu 1. Peptid 11b (1,0 g, 0,2 mmol/g) a aldehyd 11a (200 mg) byly suspendovány v 5 ml směsi 1% kyselina octová/DMF a ihned bylo přidáno 30 mg (0,48 mmol) NaCNBH₃, rozpuštěného v 5 ml DMF. Směs byla míchána 16 hod za získání Fmoc-Phe-v[CH2NH]-Thr(tBu)-Leu-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Gly-Val-Gly-PAL-PEG-PS. Peptidový řetězec byl potom prodlužován příslušnými Fmoc-aminokyselinami a N-koncovým

2o acetylačním činidlem použitím protokolu HATU/DIPEA SPPS, jak bylo popsáno v příkladu 8. Zpracování, čištění HPLC a odsolení bylo prováděno podle popisu v příkladu 1.

Výtěžek: 52 mg; čistota HPLC: 97,9 %; hmotnostní spektrum: molekulová hmotnost = 1338; analýza aminokyselin: všechny aminokyseliny byly nalezeny v požadovaných množstvích; obsah peptidu: 92,4 .%; iontová chromatografie: acetát: 2,5 % (hmotn./hmotn.).

- 35 Příklad 12

Ac-Arq-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-u/ÍCHgNHI-Gly-NH₂ (12)

Při syntéze této sloučeniny nebylo možné provádět redukční alkylaci Fmoc-Val-H na pryskyřici. Proto byl připraven dipeptidový analog Fmoc-Val-\j/[CH₂NH]-Gly-OH (12d) v roztoku před imobilizací na pryskyřici.

Fmoc-Val-ACI-hNHI-Glv-Obzl (12c)

Fmoc-Vai-H (12a, 3,16 g, 10 mmol, připravený podle T. Moriwake, S.-l. Hamano, S. Saito, S. Torii, S. Kashino, J. Org. Chem, 54: 4114 - 4120, 1989) byl rozpuštěn v EtOH/HOAc (80 ml, 99/1, obj./obj.) a byl přidán HCI.H-Gly-Obzi (12b, 2,02 g, 10 mmol) a potom NaCNBH₃ (0,94 g, 15 mmol). Reakční směs byla míchána při teplotě laboratoře přes noc. Potom byl pro neutralizaci reakční směsi přidán 5% vod. NaHCO₃ (20 ml). Směs byla potom zakoncentrována ve vakuu a zbytek byi extrahován CH2CI2. Spojené organické vrstvy byly promyty nasyceným vodným NaCI, sušeny rychle nad NaaSCh, zfiltrovány, a rozpouštědlo bylo odpařeno za získání žlutého oleje. Po čištění chromatografií na silikagelu (eluent: 0 až 4% methanol v CH₂CI₂) byla izolována sloučenina 12c jako bílá pevná látka. Výtěžek: 1,85 g (39 %).

Analýza: TLC: (oxid křemičitý, CH₂CI₂/MeOH 98/2) Rf = 0,45, hmotnostní spektrum: molekulová hmotnost = 472.

Fmoc-Val-vufCH^N/Bocjl-Glv-Obzl (12d)

Fmoc-Val-v[CH₂NH]-Gly-Obzl (12c, 0,910 g, 1,93 mmol), Boc₂O (0,420 g, 1,93 mmol) a DIPEA (0,336 g, 1,93 mmol) byly rozpuštěny v suchém CH₂CI₂ (20 ml). pH bylo udržováno v alkalické oblasti

J .·*.

- 36 přidáváním DIPEA a směs byla míchána přes noc při teplotě laboratoře. Reakční směs byla potom okyselena přidáním 10% KHSO₄. Byla přidána voda a vodná vrstva byla extrahována CH2CI2. Spojené organické vrstvy byly promyty vodným nasyceným NaCI, rychle usušeny nad MgSCL a rozpouštědlo bylo odpařeno za získání 0,96 g (97 %) sloučeniny 12d.

Analýza; TLC; (oxid křemičitý, Ch^C^/MeOH 98/2) Rf = 0,55; hmotnostní spektrum: molekulová hmotnost = 572.

Fmoc-Val-ipfCHJMfBocjl-Gly-OH (12e)

Fmoc-Val-vy[CH₂N(Boc)]-Gly-Obzl (12d, 0,97 g, 1,70 mmol) byl rozpuštěn ve směsi MeOH/EtOAc (1/1, obj./obj., 100 ml) a hydrogenován za normálního tlaku s 10% Pd/C 2 hod. Paladiový katalyzátor byl odfiltrován a filtrát byl zakoncentrován za poskytnutí karboxylové kyseliny 12e jako lehce žlutého oleje.

Výtěžek; 0,661 g (81 %). Analýza: TLC (oxid křemičitý, CFhCh/MeOH/AcOH 90/9/1) Rf = 0,42; hmotnostní spektrum = 482.

Použitím syntezátoru peptidů v modu s dvojitou stříkačkou 20 HATU/DIPEA a použitím dvojí vazby s HATU/DIPEA byla nanesena sloučenina Fmoc-Val^[CH2N(Boc)]-Gly-OH (12e) (0,661 g,

1,37 mmol) na pryskyřici PAL-PEG-PS (1,5 g, 0,15 mmol/g, 0,225 mmol). Míra substituce byla měřena standardním postupem odštěpování Fmoc, a byla zjištěna jako 0,13 mmol/g nanesené pryskyřice (výtěžek: 87 %). Získaný peptid H-Val-v|/[CH₂N(Boc)]-GlyPAL-PEG-PS (12f) byl dále prodlužován podle protokolu HATU/DIPEA SPPS (příklad 1) s dvojitými kondenzačními kroky v trvání 60 min pro každou Fmoc-aminokyselinu. Podobně byla zavedena do peptidů 9 a 11 N-koncová acetylová skupina použitím 4-nitrofenylacetátu.

• ·

- 37 • ·

Zpracování, čištění a odsolení bylo provedeno podle popisu v příkladu

1.

Výtěžek: 17 mg; čistota HPLC: 80,1 %; hmotnostní spektrum: molekulová hmotnost = 1338; analýza aminokyselin: všechny aminokyseliny byly nalezeny v požadovaných množstvích; obsah peptidu: 63,7 %; iontová chromatografie: chlorid: 1,0 %, fosfát: 0,2 %, acetát: 0,2 % (hmotn./hmotn.).

Příklad 13

Ac-Arq-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2 (13)

Pro syntézu peptidu 13 byl nejprve připraven nezbytný peptoidní monomer Fmoc-NhSer(tBu)-OH (13e).

Z-2-aminoethvl-řerc-butylether (13a)

3,25 g MgSO₄ (27 mmol) bylo suspendováno v 80 ml CH2CI2 (suchého). V atmosféře N₂ bylo přidáno 1,5 ml konc. H₂SO₄ (postup: S. W. Wright, D. L. Hageman, A. S. Wright, L. McCIure, Tetrahedron Lett., 38: 7345 - 7348, 1997). Směs byla míchána 15 min, potom byly přidány terc-BuOH (12,9 ml) a komerčně dostupný Z-2-aminoethanol (5,28 g, 27 mmol), rozpuštěný v CH2CI2 (20 ml). Po míchání 5 dnů bylo přidáno 200 ml 5% vod. NaHCO3 k reakční směsi, která byla míchána až do rozpuštění veškerého MgSO₄. Vrstvy byly odděleny a vrstva CH₂CI₂ byla promyta roztokem soli. Organická vrstva byla sušena nad MgSO₄, zfiltrována a rozpouštědlo bylo odpařeno za získání 5,6 g surového 13a. Produkt byl čištěn chromatografií na koloně (eluent: heptan/EtOAc 3 : 1 obj./obj.).

Výtěžek 5,00 g (78 %). ¹H NMR (CDCI₃) δ: 1,15 (s, 9H, tBu), 3,3 - 3,5 (dt, 4H, 2 x CH₂), 5,1 (bs, 2H, CH₂Bzl), 7,4 (m, 5H, Ar).

• · • · · • · · · ·

- 38 2-Aminoethyl-ferc-butylether.HCI (13b)

K roztoku 5,00 g benzylesteru 13a v ethylacetátu (150 ml) bylo přidáno 225 mg 10% Pd/C a roztokem byl probubláván H₂ 2 hod. Katalyzátor byl odfiltrován a bylo přidáno 15 ml 1M vod. HCI.

Rozpouštědlo bylo odpařeno a bylo přidáno malé množství etheru. Vysrážený produkt 13b byl odfiltrován a usušen ve vakuu.

Výtěžek: 2,35 g (77 %). NMR (CDCI₃) β: 1,20 (s, 9H, tBu), 3,15 (t, 2H, CH₂), 3,65 (t, 2H, CH₂), 8,1 - 8,4 (bs, 2H, NH₂).

io N-(2-terc-butoxvethvl)-glycin (H-NhSer(tBu)-OH) (13c)

K roztoku sloučeniny 13b (2,30 g, 15 mmol) v 25 ml of H₂O bylo přidáno 1,40 g (15,2 mmol) kyseliny glyoxylové. pH bylo nastaveno na pH = 6 1,0M vod. NaOH. K tomuto roztoku bylo přidáno 230 mg Pd/C a reakční směs byla míchána při tlaku H₂ 45 psi (310 kPa) přes noc.

Katalyzátor byl odfiltrován a promyt 5 ml H₂O. Filtrát obsahující látku 13c byl použit bez čištění v dalším kroku.

Fmoc-NhSer(tBu)-OH (13d)

Reakční produkt 13c, stále ještě rozpuštěný ve vodě, byl 20 upraven na pH = 9,5 1N HaOH. Alkalický roztok byl zředěn 25 ml acetonu a po kapkách bylo přidáno 5,40 g (16 mmol) Fmoc-Osu, rozpuštěného v 25 ml acetonu. pH bylo udržováno na pH = 9,5 1N NaOH. Po míchání přes noc byla reakční směs zakoncentrována na 150 ml a promyta 2 x 50 ml směsi ether/heptan (1/1, obj./obj.). Vrstva

H₂O byla okyselena na pH = 2,5 20% kyselinou citrónovou a 3 x extrahována 100 ml ethylacetátu. Organické vrstvy byly spojeny a sušeny nad Na₂SO₄. Rozpouštědlo bylo odpařeno a produkt byl čištěn chromatografií na koloně (oxid křemičitý, CH₂CI₂/MeOH 5/1, obj./obj.) a lyofilizován.

- 39 • · · · · • · · « · •« · ♦ » · « · · · ··«·

Výtěžek: 5,44 g (91 %). ¹H NMR (CDCI₃) δ: 1,20 (s, 9H, tBu), 3,2 (dt, 2H, CH₂), 3,6 - 3,7, (dt, 2H, CH₂), 4,05 (s, 2H, CH₂CO₂H), 4,2 (b, 1H, Fmoc), 4,4 - 4,6 (2H, 2 x d, Fmoc), 7,3 - 7,8 (m, 8H, ArH, Fmoc).

Syntéza peptidu 13 byla prováděna na syntezátoru Pepsynthesizer použitím technologie dvojité stříkačky jak je popsáno výše (příklad 1). Jako nosič byl použit Fmoc-PAL-PEG-PS (1,0 g, 0,15 mmol/g) s NMP jako rozpouštědlem. Dvojité vazby (doba vazby 60 min) byly použity pro všechny aminokyseliny, včetně FmocNhSer(tBu)-OH (13d). N-koncová acetylová skupina byla zavedena použitím 4-nitrofenylacetátu. Zpracování a odštěpení pryskřice a ochranných skupin bylo provedeno standardním způsobem (příklad 1). Surový peptid byl čištěn HPLC a odsolen 5°/₀₀ vodnou kyselinou octovou.

Výtěžek: 50 mg; čistota HPLC: 98,6 %; hmotnostní spektrum: molekulová hmotnost = 1366; analýza aminokyselin: všechny aminokyseliny byly nalezeny v požadovaných množstvích; obsah peptidu: 82,1 %; iontová chromatografie: chlorid: 0,3 %, acetát: 1,3 % (hmotn./hmotn.).

Příklad 14

Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-w[CH₂NHl-GIv-NH₂ (14)

Syntéza byla prováděna podle protokolu HATU/DIPEA na zařízení Pepsynthesizer (příklad 1). Dříve popsaná funkcionalizovaná pryskyřice H-Val-v|/[CH₂N(Boc)]-Gly-PAL-PEG-PS (12f) a chráněný peptoid Fmoc-NhSer(tBu)-OH (13d) byly použity jako stavební bloky. Jak bylo popsáno výše, bylo použito technologie dvojité stříkačky a dvojitých reakcí v trvání 60 min na reakci. Prodlužování peptidového řetězce na syntezátoru bylo nastaveno před navázáním Fmoc-NhSer(tBu)-OH (13d) a tato aminokyselina byla rozpuštěna v DMSO

se sonikací před vazbou na imobilizovaná peptidový řetězec (H-Phe-Thr(tBu)-Leu-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Gly-Val-\y[CH2NH]-Gly-PAL-PEG-PS). Syntéza byla ukončena kondenzací zbývající aminokyseliny (Arg) a acetylací s použitím 4nitrofenylacetátu. Zpracování, čištění a odsolení peptidu bylo standardní, jak je uvedeno v příkladu 1. Lyofilizace poskytla 47 mg peptidu 14.

Čistota HPLC: 72,9 %; hmotnostní spektrum: molekulová hmotnost = 1352; iontová chromatografie: trifluoracetát: 5,5 % (hmotn./hmotn.).

Příklad 15

Předběžná selekce agonistickych peptidů použitím T-buněčných hybridomů specifických pro antigen (test první linie)

Pro testování agonistické aktivity modifikovaného peptidu byly použity tři různé hybridomové buněčné linie specifické pro HC gp-39 (263-275) (5G11, 8B12 a 14G11). 5 x 10⁴ hybridomových buněk a 2 x 10⁵ ozářených (12000 rad), EBV transformovaných B-buněk nesoucích specificitu DRB1*0401 bylo inkubováno ve 150 pl objemech v jamkách mikrotitračních destiček s kulatými dny. Peptidový antigen (HC gp-39 (263-275) a modifikované peptidy) byl přidán v 50 μΙ objemech, čímž se získala opakování jamek. O 48 hod později bylo testováno 100 μΙ kultivačního supernatantu na produkci IL-2 specifického pro antigen použitím metody sendvičové ELISA s protilátkami Pharmingen specifickými pro myší IL-2.

Selekce agonistickych peptidů použitím klonů T-buněk specifických pro antigen (test druhé linie)

Klon T-buněk 243 byl izolován z linie T-buněk specifické pro peptid získané z pacienta s RA reagujícího na peptid 263-275 (pacient • ·

- 41 s RA č. 243). Klony byly získány po čtyřech opakovaných stimulacích peptidem HC gp-39 (263-275) v přítomnosti PBMC se souhlasným DRB1*0401. Klon T-buněk H235 byl izolován z linie T-buněk stimulovaných peptidem z HLA-DRB1*0401-pozitivního dárce. Po dvou stimulacích peptidem HC gp-39 (261-275) v přítomnosti PBMC s odpovídajícím DRB1*0401 byly získány klony PHA klonováním. Bylo zjištěno, že oba klony 243 a 235 jsou při rozpoznávání peptidového antigenu omezené na HLA-DRB1*0401. Buňky byly ve všech experimentech použity v den 10 až 14 po stimulaci.

Proliferační odpovědi klonu 243 nebo 235 byly měřeny inkubací 2 x 10⁴ T-buněk a 10⁵ PBMC s odpovídajícím DRB1*0401 (ozáření 3000 rad) ve 150 μΙ objemech média s 10% lidským sérem z normálního odběru (NHS, CLB, Amsterdam, Nizozemí) v mikrotitračních destičkách s plochým dnem. 50 μΙ roztoku antigenu (obsahujícího sekvenci 263-275 nebo uvedené modifikace) bylo rozplněno vždy do tří jamek. Ve dnech 2 nebo 3 inkubace byl přidán ³H-thymidin. Buňky byly sklizeny na filtry ze skleněných vláken a byla měřena inkorporovaná radioaktivita.

Výsledky

Větřina modifikovaných peptidů uvedených v tabulce 2 byla schopna stimulovat všechny tři hybridomy T-buněk způsobem srovnatelným s vedoucím peptidem H-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH. Některé peptidy však nestimulovaly všechny tři hybridomy, což ukazuje na rozdíly ve specificitě použitých hybridomů. Jestliže byly tyto agonistické peptidy testovány na svou schopnost stimulovat dva klony lidských T-buněk, ukázal se jasný rozdíl v účinnosti testovaných sloučenin (tabulka 2). Většina modifikovaných sloučenin indukovala odpověd klonu 235 a klonu 243. Jedna sloučenina (Ac-Narg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2) neindukovala proliferační odpověď u žádného klonu. Tři

sloučeniny (Η-β-homoargininyl-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, Ac-Arg-Ser-Phe-_V[CH₂NH]-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂ a Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-v4CH₂NH]-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂) měly aktivitu pouze u jednoho klonu (buď klon 243 nebo 235). Tři sloučeniny (H-Arg-Ser-Phe(4CI)-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, H-D-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH a CH₃OC(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH) indukovaly proliferační odpověď u obou klonů, která byla stejného řádu jako odpověď indukovaná io vedoucím peptidem H-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH. Sedm sloučenin (Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Giu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, CH₃(OCH₂CH₂)₃-OCH₂C(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂, D-1-glucityl-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, (N15 -methylnikotinoyl)⁺-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-SerGIu-Thr-Gly-Val-<y[CH₂NH]-Gly-NH₂, Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂ a Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-\y[CH₂NH]-Gly-NH₂) mělo lepší výsledky při indukci proliferační odpovědi u jednoho nebo obou klonů. Jako nejsilnější se ukázaly sloučeniny Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-\|/[CH₂NH]-Gly-NH₂, Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂ a Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr25 -Gly-Val-i(/[CH₂NH]-Gly-NH2 (tabulka 2 a obr. 1).

Příklad 16

Samice myší Balb/c stáří přibližně 8 až 10 týdnů (Charles River Germany nebo Charles River France) byly imunizovány v den 0 100 pl

3o antigenního preparátu (50 pg HC gp-39 263-275) v nekompletním Freundovu adjuvans (IFA; Sigma Chemicals, St. Louis, USA). Antigen

- 43 «· ··· ·« *« • ··· ·«*· • · · · » * · t » byl podáván subkutánně ve dvou částech do oblasti hrudníku myši. V den 7 byla myším podána testovací dávka antigenního preparátu (HC gp-39 (263-275)) zředěného v 0,9% NaCI (NPBI, Emmer Compascuum, Nizozemí) v objemu 50 pl při koncentraci 1 mg/ml hydroxidu hlinitého (Pharmacy Donkers-Peterse, Oss, Nizozemí) jednostranně do tlapky (levá tlapka); do druhé (pravé) tlapky bylo nastříknuto 50 pl roztoku hydroxidu hlinitého v 0,9% NaCI jako kontroly. Hypersenzitivitní odpovědi (střední procento specifického otoku) opožděného typu byly určovány v den 8 měřením zvýšení tloušťky tlapky na levé straně ve srovnání s pravou stranou (levý otok (mm) - pravý otok (mm)/pravý otok (mm) x 100 %), s použitím mikrometru navrženého ve vlastní laboratoři.

Aplikace antigenního preparátu nosem (50, 10, 2 nebo 0,4 pg (nebo nižší koncentrace)) HC gp-39 (263-275) nebo derivátů modifikovaného peptidu byla prováděna v isofluranové (Forene® Abbott BV, Amstelveen, Nizozemí) anestézii jednou (den -5) před imunizací v den 0 100 μΙ antigenního preparátu obsahujícího 50 pg HC gp-39 263-275 v IFA. Při těchto experimentech byly myši imunizovány a testovány HC gp-39 263-275 a odpovědi DTH byly zjišťovány metodou popsanou výše.

Použitím výše popsaného testovacího systému, ve kterém myši Balb/c imunizované HC gp39 (263-275) v IFA reagovaly na HC gp-39 (263-275), bylo možné studovat potenciální vliv indukce tolerance nosní aplikací HC gp-39 (263-275) v porovnání s účinky modifikovaných peptidových derivátů. Předběžné ošetření HC gp-39 (263-275) snížilo reakci DTH specifickou pro HC gp-39 (263-275); tento účinek závisel na dávce peptidu, která byla použita při předběžném ošetření. Použitím relativně vysoké koncentrace peptidu (50 pg/myš) nosní aplikace jedné dávky HC gp-39 (263-275) zcela odstranila reakci DTH, zatímco dávka 2 pg/myš byla neúčinná. Byl tedy vytvořen protokol pro rozlišení mezi účinnými (tolerogenními) a neúčinnými dávkami peptidu v testovacím systému DTH specifickém • · * «· · · · ♦♦ • ♦ » · ··« » · · « pro HC gp-39 (263-275). Za předpokladu, že modifikované peptidové deriváty založené na HC gp-39 (263-275) mohou být aktivní při nižších koncentracích než původní peptid se očekává, že tyto peptidy budou indukovat toleranci při relativně nízkých koncentracích peptidů.Za tohoto předpokladu byla testována řada modifikovaných peptidů tímto protokolem indukce tolerance. V tomto experimentu (ve kterém byla indukována spolehlivá odpověď HC gp-39 (263-275), která mohla být snížena předběžným ošetřením 50 pg, ale nikoli 2 pg HC gp-39 (263275)) bylo ukázáno, že určité modifikace peptidů byly při indukci io tolerance vysoce aktivní, zatímco jiné nebyly (viz tabulka 3).

* ·* » · · ·* ·» »♦»· · « * ·»·« > · * · * * · fe · • · · · · «·····« ř » * · · ·« to · «

9 · · fc · · · « · * · ·

Tabulka 2

• ·« «· · · · • ·* · ·» · « · · · ··· »· · ·

Tabulka 2 - pokračování

·· ·· ·· « · « ·

CO (Π

Ξ3

-Ω ω

Η

• · · · • · · · · • · · • · *

Tabulka 3 - pokračování

nd: nebylo stanoveno

Claims (16)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   Modifikovaný peptid odvozený od sekvence H-Arg-Ser-Phe-ThrLeu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, vzorec I, obecného vzorce Q-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-A11 -A12-A13-Z, vzorec II, kde A1 až A13 odpovídá aminokyselinám vzorce I, Q odpovídá H a Z odpovídá OH, který se vyznačuje tím, že 1 až 6 modifikací je zvoleno ze skupin a, b nebo c, zahrnujících:

   a) substituci 1 až 6, s výhodou 1 až 4 aminokyselin v polohách A1 až A13 za aminokyseliny nevyskytující se v přírodě nebo β-aminokyseliny;

   b) substituci jedné nebo více amidových vazeb redukovanými amidovými vazbami nebo ethylenovými isostery;

   c) substituci v polohách Q a/nebo Z; a popřípadě

   d) substituci aminokyselinami, které se vyskytují v přírodě, až do celkového počtu šesti modifikací.
2. 2. Peptid podle nároku 1, kde Q je H, (Ci_6)-alkyl, formyl, (C1-620 -alkylkarbonyl, karboxy-(Ci-₆)-alkyl, (Ci.₆)-alkyloxykarbonyl, (C₂-6)-alkenyloxykarbonyl, (C₆-i4)-aryl-(Ci_₆)alkyl; (C₆-i4)-aryl-(C-i.₄)-alkyloxykarbonyl, CH₃(OCH₂CH₂)n-OCH2-C(O)-, kde n je 1 až 10, HOCH₂-(CHOH)_m-CH₂-, kde m je 3 až 4; 1-methylpyridinium-3karbonyl, 1-methylpyridinium-4-karbonyl nebo Lys, nebo Q je

   25 nepřítomno, jestliže A1 je H₂N-C(=NH)NH-(CH₂)n-C(O)-, kde n je

   2 až 5; Z je OR, kde R je H, (Ci-6>-alkyl, (C₂.6)-alkenyl, aryl-(Ci.₄)-alkyl, (C₄_i₃)-heteroaryl-(C-i_₆)-alkyl nebo NR^, kde Ri a R₂ jsou

   - 50 nezávisle zvoleny ze skupiny H, (Ci.₆)-alkyl nebo (C₆-i4)-aryl-(C-i_₆)-alkyl; a popřípadě

   Q a Z obsahují navíc až do 10 aminokyselin umístěných v blízkosti polohy A1 a/nebo A13.
3. 3. Peptid podle nároku 1 nebo 2, kde substituce v přírodě se vyskytujícími aminokyselinami v A1 až A13 se vyskytuje v ne více než čtyřech, výhodněji ne více než dvou polohách.
4. 4. Peptid podle některého z nároků 1 až 3, kde

   Q je H, (Ci.₆)-alkyl, formyl, (Ci.₆)-alkylkarbonyl, karboxy-(Ci-₆)-alkyl, (Ci_6)-alkyloxykarbonyl, (C₂-6)-alkenyloxykarbonyl, aryl-(Ci. .₆)-alkyl; (C₆-i4)-aryl-(Ci-₄)-alkyloxykarbonyl, CH₃(OCH₂CH₂)_n-OCH₂-C(O)-, kde n je 1 až 10, HOCH₂-(CHOH)_m-CH₂-, kde m je 3 až 4; 1-methylpyridinium-3-karbonyl, 1-methylpyridinium-4karbonyl nebo Lys, nebo Q je nepřítomno, jestliže A1 je H₂N-C(=NH)NH-(CH₂)_n-C(O)-, kde n je 2 až 5;

   A1 je L-Arg, D-Arg, L-Lys, D-Lys, L-Ala, D-Ala, H₂N-C(=NH)NH-(CH₂)_n-C(O)-, kde n je 2 až 5, H₂N-(CH₂)_n-C(O)-, kde n je 2 až 7, (R)-{-NH-CH[(CH₂)_n-NH-C(=NH)-NH₂]-CH2-C(O)-}, kde n je 2 až 5 nebo (S)-{-NH-CH[(CH₂)_n-NH-C(=NH)-NH₂]-CH₂-C(O)-}, kde n je 2 až 5 nebo -N[(CH₂)n-NH-C(=NH)-NH₂]CH₂C(O)-, kde n je 2 až 5;

   A2 je L-Ser, D-Ser, L-hSer, D-hSer, L-Thr, D-Thr, L-Ala, D-Ala, Gly nebo -N[(CH₂)_n-OH]-CH₂-C(O)-, kde n je 2 až 5;

   A3 je L-Phe, D-Phe, L-Phe(X), D-Phe(X), kde X je nezávisle zvoleno z jedné nebo více skupin (Ci.₄)-alkyl, hydroxy, halo, (Cv .₆)-alkylkarbonylamino, amino nebo nitro, L-Hfe, D-Hfe, L-Thi, DThi, L-Cha, D-Cha, L-Pal(3), D-Pal(3), L-1-Nal, D-1-Nal, L-2-Nal, D-2-Nal, L-Ser(Bzl), D-Ser(Bzl), (R)-{-NH-CH(CH₂-aryl)-CH₂-}

   - 51 • ·· · · · · · · · ···· ··· ·*·· • ·· ···· · * · • · ··· ···«··· · · • » « · · ·· · ······ nebo (S)-{-NH-CH-(CH₂-aryl)-CH₂-} nebo (/?)-{-NH-CH(CH₂-aryl)-CH₂-} nebo (S)-{-NH-CH(CH₂-aryl)CH₂-};

   A4 je L-Thr, D-Thr-, L-Ser-, D-Ser, L-hSer, D-hSer, L-Ala, D-Ala nebo Gly;

   A5 je L-Leu, D-Leu, L-lle, D-lle, L-Val, D-Val-, L-Nva, D-Nva, L-Ala, D-Ala, Gly, (R)-{-NH-CH(CH₂-CH(CH₃)₂)-CH₂-}, nebo (S)-{-NH-CH(CH₂-CH(CH₃)₂)-CH₂-};

   A6 je L-Ala, D-Ala nebo Gly;

   A7 je L-Ser, D-Ser, L-hSer, D-hSer, L-Thr, D-Thr, L-Ala, D-Ala nebo Gly;

   A8 je L-Ser, D-Ser, L-hSer, D-hSer, L-Thr, D-Thr, L-Ala, D-Ala nebo Gly;

   A9 je L-Glu, D-Glu, L-Asp, D-Asp, L-Ala, D-Ala nebo Gly;

   A10 je L-Thr, D-Thr, L-Ser, D-Ser, L-hSer, D-hSer, L-Ala, D-Ala nebo Gly;

   A11 je Gly, L-Ala, D-Ala nebo -NH-CH₂-CH₂-;

   A12 je L-Val, D-Val, L-Nva, D-Nva, L-Leu, D-Leu, L-lle, D-lle, (R)-{-NH-CH[CH(CH₃)₂]-CH₂-}, (S)-{-NH-CH[CH(CH₃)₂]-CH₂-}, (R)-{-NH-CH[CH₂CH₂CH₃]-CH₂-}, (S)-{-NH-CH[CH₂CH₂CH₃]-CH₂-}, (R)-{-NH-CH[CH₂CH(CH₃)₂]-CH₂-}, (S)-{-NH-CH[CH₂CH(CH₃)₂j-CH₂-}, (R/?)-{-NH-CH[CH₂(CH(CH₃)-CH₂CH₃]-CH₂-}, (RSH-NH-CH[CH₂(CH(CH₃)-CH₂CH₃]-CH₂-}, (SR)-{-NH-CH[CH₂(CH(CH₃)-CH₂CH₃]-CH₂-, nebo (SS)-{-NH-CH[CH₂(CH(CH₃)CH₂CH₃]-CH₂-}; A13 je Gly, L-Ala nebo D-Ala a

   Z je OR, jestliže R je H, (C₁.₆)-alkyl, (C₂_₆)-alkenyl, (C6-i4)-aryl-(Ci. _₄)-alkyl/(C4-i₃)-heteroaryl-(Ci.e)-alkyl nebo NRiR₂, kde Ri a R₂ jsou nezávisle zvoleny ze skupiny H, (Ci-6)-alkyl nebo (C₆-i₄)-aryl-(Cv₆)-alkyl, a popřípadě

   Q a Z navíc obsahují společně až do deseti aminokyselin umístěných v blízkosti polohy A1 a/nebo A13.
5. 5. Peptid podle některého z nároků 1 až 4, kde

   5 Q je H, (Ci.₆)-alkyl, (Cvej-alkylkarbonyl, karboxy-(Ci.₆)-alkyl, (Ci,₆)-alkyloxykarbonyl, CH₃(OCH₂CH2)_n-OCH2-C(O)-, kde n je 1 až 10, HOCH₂-(CHOH)_m-CH₂-, kde m je 3 až 4; 1-methylpyridinium-3-karbonyl, 1-methylpyridinium-4-karbonyl nebo Lys, nebo Q je nepřítomno, jestliže A1 je H₂N-C(=NH)NH-(CH₂)_n-C(O)-, kde n je io 2 až 5;

   A1 je L-Arg, D-Arg, L-Ala, H₂N-C(=NH)NH-(CH₂)_n-C(O)-, kde n je 2 až 5, H₂N-(CH₂)_n-C(O)-, kde n je 2 až 7, (S)-{-NH-CH[(CH₂)_n-NH-C(=NH)-NH₂]-CH₂-C(O)-}, kde n je 2 až 5 nebo -N[(CH₂)_n-NH-C(=NH)NH₂]CH₂C(O)-, kde n je 2 až 5;

   15 A2 je L-Ser, L-Ala, D-Ala, Gly nebo -N[(CH₂)_n-OH]-CH₂-C(O)-, kde n je 2 až 5;

   A3 je L-Phe, D-Phe, L-Phe(X) nebo D-Phe(X), kde X je halo nebo nitro, L-Hfe, L-Thi, L-Cha, L-Pal(3), L-1-Nal, L-2-Nal, L-Ser(Bzl) nebo (S)-{-NH-CH(CH₂-aryl)-CH₂-};

   20 A4 je L-Thr nebo L-Ala;

   A5 je L-Leu, L-Ala, nebo (S)-{-NH-CH(CH₂-CH(CH₃)₂)-CH₂-};

   A6 je L-Ala nebo Gly;

   A7 je L-Ser nebo L-Ala;

   A8 je L-Ser nebo L-Ala;

   25 A9 je L-Glu nebo L-Ala;

   A10 je L-Thr nebo L-Ala;

   A11 je Gly, L-Ala nebo -NH-CH₂-CH₂-;

   A12 je L-Val nebo (S)-{-NH-CH[CH(CH₃)₂]-CH₂-};

   - 53 • · ♦ · · · · · ··«· ··· ·· • ·· · · · · · · • · ··· ·····»· · • · · · 9 ·· · ··

   A13 je Gly nebo L-Ala; a

   Z je OR, jestliže R je H nebo NRiR₂, kde Ri a R₂ jsou nezávisle zvoleny ze skupiny H nebo (Ci_6)-alkyl, a popřípadě

   Q a Z navíc obsahují společně až do deseti aminokyselin 5 umístěných v blízkosti polohy A1 a/nebo A13.
6. 6. Peptid podle některého z nároků 1 až 5, kde

   Q je H, methyl; acetyl; karboxymethylen, methoxykarbonyl;

   CH₃(OCH₂CH₂)₃-OCH₂-C(O)-, D-1 -glucityl, 1-methylpyridinium-3io -karbonyl nebo 1-methylpyridinium-4-karbonyl, nebo Q je nepřítomno, jestliže A1 je H₂N-C(=NH)NH-(CH₂)4-C(O)-;

   A1 je L-Arg, D-Arg, L-Ala, H₂N-C(=NH)NH-(CH₂)₄-C(O)-, H₂N-(CH₂)_n-C(O)-, kde n je 5 až 7, (S)-{-NH-CH[(CH₂)₃-NH-C(=NH)-NH₂]-CH₂-C(O)-} nebo -N[(CH₂)₃-NH-C(=NH)-NH₂]-CH₂C(O)-;

   15 A2 je L-Ser, L-Ala nebo N[(CH₂)₂-OH]-CH₂-C(O)-;

   A3 je L-Phe, D-Phe, L-Phe(X) kde X je halo nebo nitro, L-Hfe, LThi, L-Cha, L-Pal(3), L-1-Nal, L-2-Nal nebo L-Ser(Bzl) a

   Z je OH, NH₂ nebo NHEt, a popřípadě

   Q a Z navíc obsahují společně až do deseti aminokyselin 20 umístěných v blízkosti polohy A1 a/nebo A13.
7. 7. Peptid podle některého z nároků 1 až 6 obecného vzorce Q-A1-A2-A3-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-A11-A12-Gly-Z, vzorec III.
8. 8. Peptid podle některého z nároků 1 až 7 obsahující jednu až čtyři modifikace.
9. 9. Peptid podle nároku 8 obsahující dvě až tři modifikace.
10. 10. Peptid podle nároku 7, kde

    A1 je L-Arg, D-Arg, H₂N-C(=NH)NH-(CH₂)4-C(O)-, H₂N-(CH₂)_{n 5} -C(O)-, kde n je 5 až 7 nebo -N[(CH₂)₃-NH-C(=NH)-NH₂]CH₂C(O)-,

    A2 L-Ser nebo -N[(CH₂)₂-OH]-CH₂-C(O)-,

    A3 je L-Phe, L-Phe(X), kde X je halo, L-1-Nal, L-2-Nal, L-Ser(Bzl), L-Thi, L-Cha nebo L-Pal(3).

    io
11. 11. Peptid podle nároku 9 nebo 10, obecného vzorce Q-Arg-A2-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-A12-Gly-Z (vzorec IV).
12. 12. Peptid zvolený ze skupiny zahrnující desaminoargininyl-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂, desaminoargini15 -nyl-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, CH₃-(OCH₂CH₂)₃-OCH₂-C(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-GluThr-Gly-Val-Gly-NH₂, D-1-glucityl-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, CH₃O-C(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, Ac-Arg-Ser-Phe-ψ2o -[CH₂NH]-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂, Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-\y-[CH₂NH]-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂, Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ-[CH₂NH]-Gly-NH₂, Ac-Arg-N[(CH₂)₂-OH]-CH₂-C(O)-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂, Ac-Arg-N[(CH₂)₂-OH]-CH₂25 -C(O)-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-\g-[CH₂NH]-Gly-NH₂, H-Arg-Ser-Phe(CI)-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, H₂N-(CH₂)₅-CO)-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, H₂N-(CH₂)₆-C(O)-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser• ·

    - 55 • · · · · · • · · ····· • « » · · • · · · · ·

    -Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, (N-methylnikotinoyl)⁺-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH.
13. 13. Peptid podle některého z nároků 1 až 12 pro použití jako léčebná

    5 látka.
14. 14. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, ž e obsahuje jeden nebo více peptidů podle některého z nároků 1 až 12 a farmaceuticky přijatelný nosič.

    o
15. 15. Použití jednoho nebo více peptidů podle některého z nároků 1 až 12 pro výrobu farmaceutického prostředku pro indukce specifické tolerance T-buněk na autoantigen u pacientů trpících autoimunitními onemocněními, zvláště artritidou.

    I5
16. 16. Diagnostický prostředek, vyznačující se tím, ž e obsahuje jeden nebo více peptidů podle některého z nároků 1 až 12, a prostředek pro detekci.