CZ20004893A3 - Compound similar to N-acyl dipeptide, process of its preparation and pharmaceutical preparation in which it is comprised - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká oboru chemie, zvláště oblasti lékařské chemie. Je zaměřen na sloučeniny podobné dipeptidu odvozené od ;y hydroxy1ováných aminokyselin, jejcihž volné funkční aminosku>

piny se pomocí mastných kyselin převádějí na amidové skupiny.

Podstata vynálezu

Zvláště se vynález týká sloučenin, podobných N-acyldipeptidu, s alespoň jednou hydroxylovou skupinou, která je esterifikována kyselou skupinou v neutrální nebo nabité formě, obecného vzorce I

X - A- ( CH₂) m - CH- ( CH₃) _n -CO-NH-( CH2) _P - CH- C CH₃) q - B - Y í I)

I I

NHRi NHRs kde znamená

Ri a R₂ acylovou skupinu odvozenou od nasycené nebo nenasycené karboxylové kyseliny s přímým nebo s rozvětveným řetězcem se 2 aš 24 atomy uhlíku, který je nesubstituován nebo obsahuje jeden nebo několik substituentů vybraných ze souboru zahrnujícího hydroxylovou skupinu, alkylovou skupinu, alkoxyskupinu, acy1oxyskupi nu, aminoskupinu, acy1aminoskupi nu, acy1thioskupi nu a m, <1 alkylthi oskupi nu s 1 až 24 atomy uhlíku, až

10.

O až

1O, atom vodíku nebo kyselou skupinu vybranou ze souboru zahrnujícího skupinu karboxyalky1ovou s 1 až 5 atomy uhlíku v alkylovém podílu,

-CH[(CH2)_WCOOH1í ( CHaJnCOOHJ, kde znamená m O aě 5 a n O až 5, fosfonoalkylovou s 1 až 5 atomy uhlíku, dihydroxyfosforyloxyalkýlovou s 1 až 5 atomy uhlíku, dimethoxyfosforylovou, fosfono, hydroxysulfony1ovou, hydroxysulfonylalkylovou s 1 až 5 atomy uhlíku, hydroxysulfonyloxyalkylovou s 1 až 5 atomy uhlíku, v neutrální nebo v nabité formě, za předpokladu, že znamená alespoň jeden substituent X a Y kyselou skupinu shora charakterizovanou v neutrální nebo v nabité formě a

A a B na sobě nezávisle atom kyslíku, atom síry nebo iminoskupinu -NH.

Pokud X a/nebo Y znamají kyselou skupinu v neutrální formě, jde o volné karboxylové, sulfonové nebo fosforečné skupiny. Je-li kyselá skupina v nabité formě, jde o karboxylové, sulfonové nebo fosforečné soli, jmenovitě vytvářené adicí organické nebo minerální zásady, s výhodou terapeuticky přijatelné. Pokud zásady nejsou vhodné pro terapeutickému použití, jsou použitelné například pro snadnou identifikaci, pro čištění a pro separaci.

Podobné úvahy platí také pro případy, kdy X a/nebo Y znamenají karboxy1alkylovou, alcenylbiskarboxylovou, hydroxysulfonylovou, hydroxysulfony1 aIkylovou, hydroxysulfonylalkýlovou, hydroxysulfonyloxyalkylovou, fosfonoalkylovou nebo fosforyloxyalkylovou skupinu.

Zásady vytvářející solí určené k terapeut ickckému použití zahrnují hlavně zásady alkalických kovů, jako jsou hydroxid «··* sodný, draselný, nebo lithný, soli amoniové, zásady kovů alkalických zemin, jako hydroxid vápenatý a strontnatý. soli dvoumocného železa, organické 2ásady jako jsou zásady odvozené od primárních, sekundárních a terciárních aminů, jako jsou methylamin, diethylamin, monoethanolamin, diethanolamin, benzylamin, N-isethylbenzylamin, veratrylamin, tr i nethoxybenzy 1 am i n, sásadité aminokyseliny, jako je lysin a ornithin nebo amínocukry.

Příklady zásad nevhodných k terapeutickým účelům jsou bruoin, strychnin. agmatin, homarin, glukosamin, N-methylglukosamin nebo N-methoxymorfo1 in. Jak shora uvedemo, jsou soli od nich odvozené vhodné například k separačním a identifikačním úče1ůrn.

Jestliže znamená m 1 a n 0, je příslušná molekula odvozena od šeřinu. Jestliže znamená m 2 a n 0, je molekula přicházející v úvahu odvozena od homoserinu. Jestliže znamená m 3 a n 0, jde to pelahomoseri nové sloučeniny. Jestliže znamená m 4 a n 0, jde o hexahonoserinovou sloučeninu.

Jeslí že znamená p 3 a g 1, může jít o citrul1 i novou, orriithinovou nebo argininovou sloučeninu. Jesliže znamená p 4 a g 1, jde o homoargini novou nebo lysí novou sloučeninu.

Ze sloučenin podobných dipeptidu se zvlástění pozornost věnuje sloučeninám obecného vzorce I', kterým se běžně dává přednost.

X-O-CCHslm-CH-íCHaln-CO-NH-CCHslp-CH-ÍCHalcí-O-Y < I 1 í í

NHRi NHRs kde znamená

Ri a Rz acylovou skupinu odvozenou od nasycené nebo nenasycerozvětveným né karboxylové kyseliny s přímým

4. • 9 • •	9 9*9 9 999 9 9	9 9 9 9 • 9 9 9	9 • 9 9 •	• 9 9 9 9 9 9 · ·	9 9 9 9 9
»·»·	• ·« 9	• 9 9 9	• *9 9	• 9 9 9	9 9 9 9

nebo s řetězcem se 2 až 24 atomy uhlíku, který je nesubstituován nebo obsahuje jeden nebo několik substituentú vybraných ze souboru zahrnujícího hydroxylovou skupí nu, alkylovou skupinu, alkoxyskupinu, acyloxyskupinu, aminoskupinu, acylaminoskupínu, acylthioskupinu a (alkyl)thioskupinu s 1 až atomy uhlíku, p a q 1 až

10,

O až

10, atom vodíku nebo fosfonou skup i nu a zejména

3-< 3-dodekanoyioxytetradekanoy1amino)-9-(3-hydroxytetradeka-noylamino)-4-oxo-5-azadekan*l,10-diol’l a/nebo ΙΟ-díhydrogen-

- fosfát a jeho adiční solí s organickou nebo s minerílní zásadou,

3-(3-dodekanoy1oxytetradekanoy1aiino)- 9 - (3-hydroxytetradeka-noylami no)-4-oxo-5-azadekan-1, 10-diol-l,10-bis( díhydrogen-

- fosfát) a jeho adiční soli s organickou nebo s minerální zásadou,

3-(3-hydroxytetradekanoylanino)-9-(3-dodekanoyloxytetradeka-noylanino)- 4-oxo-5-azadekan-1,10 diol-l,10-bis(dihydrogen-fosfát) a jeho adiční solí s organickou nebo s minerální zásadou,

3-(3-dodekanoyloxytetradekanoylanino)-9- (3-hydroxytetradeka-noy1ami no-4-oxo-5-azadekan- 1 , 10-diol- 1 -dihydrogenfosfát a jeho adiční solí s organickou nebo s minerální zásadou,

3-(-hydroxytetradekanoylaBino-9- ( 3-dodekanoyloxytetradekano-y1am i no)- 4-oxo-5-azadekan-1,10-diol-l-dihydrogenfosf át a jeho adiční soli s organickou s minerální zásadou,

3* (3-hydroxytetradekanoylami no-9-C 3-dodekanolyoxytetradeka-noy1am i no)- 4-oxo-5-azadekan-1, 10-diol-lO-di hydrogenfosf át a jeho adiční soli s organickou nebo s minerální zásadou.

Symboly Ri a Rs znamenají stejné nebo různé zbytky nasycených nebo nenasycených acylových derivátů s rozvětveným nebo s přímým řetězcem, které mohou obsahovat jeden nebo několik substituemtú volených ze souboru zahrnujícího skupinu alkylovou, aminoskupinu, acylaminoskupinu, hydroxy1ovskupinuou, alkskupinuoxy, acylskupinuoxy, acylthioskupinu a alkylthioskupinu

Příklady takových žbytků acylováných, substituovaných derivátu jsou skupina ricinoleylová, 12-hydroxystearoy1ová, 2-hydroxy-3-methyIbutyroy1ová, 3-hydroxy-2-aminopentanoylová, palmitoylová, elaidylová, eleostearoylová, arachydoylová, arachidonylová, gadoleylová, behenylová, erucylová, 8-methyldekanoylová, 9-methy1dekanoy1ová, dokosohexanoy1ová nebo eikosapentanoy1ová.

Sloučeniny obecného vzorce I a zejména monofosforylované a bisfosforylované sloučeniny označované 0M-294-MP, (MP) a 0M-294-DP (DP), mají zajímavé farmakologické vlastnosti, hlavně se zřetelem na imunomodulaci. Obzvláště přicházejí v úvahu pro léčení chorob souvisejících s nedostatky imunitniho obranného systému nebo s nadměrnou expresí imunitních odezev závislých na použitých dávkách.

Mohou se používat také při léčení rakoviny a jako adjuvanty nebo látky podporující odezvy při formulaci vakcin.

Jiné je použití jako vektoru pro molekuly terapeutického významu pro jejich schopnosti vytvářet nekovalentní komplexy založené na hydrofilních a hydrofobních interakcích. Jejich amfofilní charakter usnadňuje formulaci a transport molekul terapeutického významu do membránových receptorů, stejně jako do buněčných membrán a cytoplasmy. Muže se jich použít samotných nebo spolu s molekulou terapeutického významu při orálním, parenterálním, rektálním, topíckém, subkutánním nebo submukozním podání. Může se jich použít samotných nebo spolu s molekulou terapeutického výnamu prováděním inkubace krevních buněk in vivo k vyvolání tvorby imunokompetentních buněk před jej ich injektováním zpět in vivo parenterální cestou.

Molekuly MP a DP mají podobné vlastnosti, jako adjuvanty pro imunitní systém, jich použito například ve vakcinakombinaci s příslušnými antigeny, proti onemocnění virového.

roždí 1 od toho, vykazují sloučeniny podle vynálezu naprosto odlišné vlastnosti pokud jde o jejich schopnost vyvolávat pro dukci cytokinů, nebo zrání imunokompetentního kmene buněk od vožených od hematopoietických a lymfoidních orgánů.

Sloučenina HP podporuje zrání a diferenciací monocytů uvnitř funkčních dendritických buněk v přítomnosti nebo v nepřítomnosti příslušného antigenu a podporuje humorální a buňkami zprostředkovanou imunity.

Sloučeniny DP naprot i tomu vykazují proti nádorové vlastnosti

Sloučeniny podle vynálezu j sou zaj ímavé hlavně proto. že jsou netoxické.

Použ í vá se j i ch k léčení lidí zvířat v dávkách 0,025 až 100 mg na jednotkovou dávku a O, až 200 mg denně.

Vynález se týká také způsobu přípravy sloučenin obecného vzorce I, podobných dipeptidu, který spočívá v tom, že se blo kuje funkční aminoskupina v poloze (g+1) líny blokujícími činidly, která snadno a omega diaminokysepodléhají acidolýze a nechá se reagovat stále ještě volná funkční karboxylová skupina s redukčním činidlem za získání odpovi daj í čího alkoholu, uvolňuje se funkční aminoskupina v poloze ( q+1) a acyluje se funkčním derivátem karboxylové kyseliny otečného vzorce R²H, kde má R² shora uvedený význam a následně se uvolňuje koncová funkční aminoskupina hydrolýzou za získání diamínoalkoholu obecného vzorce II

H2 N - ( CHa ) p - CH-( CřÍ2) q - OH (II)

I

NHRa kde znamená Ra acylovou skupinu odvozenou od nasycené nebo od nenasycené karboxylové kyseliny s přímým nebo s rozvětveným řetězcem mající 2 až 24 atomu uhlíku, která je nesubstituovaná nebo má jeden nebo několik substituentú shora definovaných, p a q znamená každý celé číslo 1 až 10, přičemž se aminoalkohol kondenzuje v přítomnosti peptidového kondenzačního činidla v inertním rozpouštědle spolu s omega-hydroxysloučeninou, omega-aminosloučeninou nebo omega thiosloučeninou obecného vzorce III

XA-<CHa)m-CH-(CHa)n-C00H (III)

NHRi kde znamená

Rt acylovou skupinu odvozenou od nasycené nebo od nenasycené karboxylové kyseliny s přímým nebo s rozvětveným řetězcem mající 2 až 24 atomů uhlíku, která je nesubstituovaná nebo má jeden nebo několik substituentú. shora definovaných, m číslo 1 až 10, n číslo 0 až 10

X shora definovanou kyselou skupinu, která je popřípadě ve formě esteru, k vytvoření sloučenininy obecného vzorce IV podobné dipeptidu

XA- ( CHs)m-CH-(CHs)n-CONHCCHs)_P-CH(CHs)_q-0H i Í (IV) líHRl NHRs kde Ri, R3, n, m, p a q mají shora uvedený význam, koncová volná funkční alkoholová skupina, kterou může být popřípadě alkylová nebo acylová skupina nebo jinak substituovaná alkylovou nebo acylovou skupinou nebo jiným substituentem, popřípadě v přítomnosti kopuladní ho činidla a podrobí se katalytické hydrogenaci nebo jinému způsobu k odstranění chránící skupiny k získání derivátu obecného vzorce I

X-A-( CH₃ ) _m - CH-( CH-) n - CO-NH- ( CHs) _P - CH-( CH-) - B-Y( I)

NHNH

RiR2 kde A, B, X, Y, Ri, R2, n, m, p a q mají shora uvedený význam.

Vynález se týká také způsobu získání sloučenin podobných fosfodipeptidu obecného vzorce I

X-0-(CH₃)_ffl-CH-(CH₂)n-C0-NH-(CH2)_P-CH-(CH₃)<_q-0-Yď)

NHRi NHR₃ kde znamená Ri a R₃ acylovou skupinu odvozenou od nasycené nebo nenasycené karboxylové kyseliny s přímým nebo rozvětveným řetězcem se 2 až 24 atomy uhlíku, která je nesubstituována nebo obsahuje jeden nebo několik subslituentů volených ze souboru zahrnujícího skupinu hydroxylovou, alkylovou, alkoxyskupinu, acy1oxyskupinu, aminoskupi nu, acy1aminoskupinu, acylthioskupinu a (alkyl)thioskupinu s 1 až 24 atomy uhlíku, m, p a q čísla 1 až 10, n znamená číslo O až 10, X a Y atom vodíku nebo fosfonoskupinu, přičemž se blokují funkční aminoskupiny v poloze (q+1) a omega diamínokyse1 iny vzorce

H₃N(CH2)_pCHNH2(CHs)_q+iCOOH blokujícími reakčními činidly, která snadno podléhají acidolýze a hydrogenolýze, dosud volné karboxylové funkční skupiny redukčním činidlem za získání odpovídajícího alkoholu, uvolňu9

·· ····	• 0 ·	• · 0
• · ·	• · 00	• «00
0 *··	♦ · ·	• 00
	• · · · ·	0 · · ·

jí se funkční skupiny v poloze (q+1) a acylují se funkčními deriváty karboxylové kyseliny obecného vzorce RsOH, kde R2 má shora uvedený význam a následně se uvlolňují koncové funkční aminoskupiny hydrogenolýzou za získání diaminoalkoholu obecného vzorce II

H2N-( CH2) p - CH-( CHa > Cí - OH i (II)

NHRa kde znamená R₂ acylovou skupinu odvozenou 2 nasycené nebo nenasycené karboxylové kyseliny s přímým nebo s rozvětveným řetězcem se 2 až 24 atomy uhlíku, která je nesubstituovaná nebo má jeden nebo několik shora definovaných substituentu, p a q znamená číslo 1 až 10, aminoalkoho1 se kondenzuje v přítomnosti peptidového kondenzačního činidla v inertním rozpouštědle, spolu s funkčním derivátem omega-hydroxyaminokyse1 iny obecného vzorce III‘

X0-<CH2)»-CH-(CH₂)n-C00H ΐ (III)

NHRi kde znamená Ri acylovou skupinu odvozenou od nasycené nebo od nenasycené karboxylové kyseliny s přímým nebo rozvětveným řetězcem, mající 2 až 24 atomů uhlíku, která je nesubstituovaná nebo má jeden nebo několikm substituentu, m znamená číslo 1 až 10, n číslo O až 10 a X dialkyloxyfosforylovou nebo diaryloxyfosforylovou skupinu obecného vzorce (R0)₂P '1 za získání sloučeniny obecného vzorce IV podobné peptidů ···· • · φ ·· ♦··

( RO) 2 PO - ( CH2) m - CH - ( CH2) _n - CONH ( CH2) _P - CH( CH2) <, - OH

I I I (IV')

O NHRi NHR2 kde Ri, R2, n, m, p a q mají shora uvedený· význam a R znamená skupinu, která snadno podléhá hydrogenolýze, přičemž další alkoholová funkční skupina se popřípadě fosforyluje fosforylačním činidlem v přítomnosti kopulačního činidla a popřípadě se podrobuje se katalytické hydrogenaci jednak k uvolnění alkoholové funkční skupiny případně přítomné na acylové skupině R2, a na volné fosfátové funkční skupině a hydrogenolýzou se odstraňuje blokovací skupina ze druhé případně přítomné fosfátové skupině sa sískání derivátu obecného vsorce V (HO)2PO-(CH2)_m-CH-(CHz)n-CONH-(CHz)_P-CH-(CH₂)O-Y (V)

NH NH i i

Ri Rz kde znamená Y atom vodíku nebo fosfonovou skupinu a popřípadě se sískaná sloučenina převádí na svoji sůl reakcí s organickou nebo s minerální zásadou.

Stereochemie chirálních center acy1aminoskupin je dána konfigurací použitých aminokyselin, zatímco stereochemie acyl aminoskupin závisí na konfigurací použitých mastných kyselin. Vycházet je mošno z diaminokyseliny s konfigurací L nebo D nebo s konfigurací racemické povahy. Vycházet je možno z hydroxylované aminokyseliny s konfigurací L, D nebo 2 racemické směsi. Všechny tyto stereoisomery nebo diastereoísomery vynález zahrnuue.

Způsob podle vynálezu je založen na následujících, běžně používaných operacích, které jsou objasněny na reakčních schémateech 1, 2 a 3 (obr. 33, 34 a 35).

1. Blokování funkční aminoskupiny v poloze omega řetězce orniti nového derivátu se provádí N-benzyloxykarbonylovou substitucí po reakci kyselé funkční skupiny se solí mědi, v alkalickém prostředí, reakcí tohoto karboxylátu mědi s benzylchlorformátem a uvolněním karboxylové funkční skupiny chelatací mědi v kyselém prostředí k získání N-benzyloxykarbonyletn substituovaného derivátu způsobem popsaným v literatuře (Organic Preparations and Procedures Internátional, 23, str. 191 až 194, 1992).

2. Blokování funkční aminoskupiny v poloze ct karboxylového podílu ornitinového derivátu se provádí terč.-butoxykarbonylovou substitucí za použití alkylpyrokarbonátu jako terc.buty1pyrokarbonát v alkalickém prostředí. Terč.-butylpyrokarbonát reaguje se sousední funkční aminoskupinou za vzniku omega-benzy loxykarbonylaminokarboxyl ového derivátu a d- terc.benzyloxykarbony1am i nokarboxy1ového der i vátu.

3. Převedení karboxylové funkční skupiny na primární alkoholovou funkční skupinu se provádí způsobem popsaným v literatuře (Tetrahedron Letters 32, str. 923 až 926, 1991); toto převedení je založeno na reakci karboxylového derivátu s alky 1chlorformátem, jako je isobuty1chlorformát, za vzniku směsného anhydridu, který se redukuje borhydridem alkalického kovu nebo kovu alakalické zeminy, čímž se získá odpovídající hydroxylovaný derivát mající primární alkoholovou funkční skupinu.

4. Odstranění terč, -butoxykarbonylové skupiny v poloze ct se provádí pomocí trifluoroctové kyseliny, která současně umožní vytvoření funkční aminoskupiny, jak odpovídá použití tri f1uoracetátu.

5. Acylace takto uvolněné funkční aminoskupiny se provádí z výchozí soli trifluoroctové kyseliny pomocí směsného anhydridu připraveného z kyseliny R2OH a alkylchlorformátu.

6. Uvolnění koncové funkční aminoskupiny se provádí hydrogenolýsou v přítomnosti katalyzátoru na bá2i vzácných kovů, jako je platina, palladium na uhlí nebo na iridiovém nosiči.

7. Peptidová kopulace nebo vazba mezi ami nosíotičeninou obecného vzorce II a fosforylder i vátém obecného vzorce III se provádí v přítomnosti kopulačního Činidla, jako je 1-isobutyloxy-2-isobuty1oxykarbonyl- 1,2-dihydrochinolin, v inertním rozpouštědle, jako je rozpouštědlo obsahující halogen, nebo v přítomnosti karbodiimidu. Získá se tak sloučenina podobná dipeptidu obecného vzorce IV , jejíš hydroxylová funkční skupina případně vzniklá acylovou skupinou R² je blokována.

8. Hydroxylová funkční skupina acylové skupiny R2 se uvolňuje hydrogenolý2ou v přítomnosti vzácného kovu, jako je palladium na vhodném nosiči například na uhlí.

9. Fosforová skupina se uvolňuje katalytickou hydrogenací v přítomnosti oxidu vzácného kovu, jako je oxid platiny.

10. Fosforylace derivátu obecného vzorce IV podobného dipeptidu, se provádí dvoustupňovým způsobem (Helv. Chim. Acta 70, str. 175, 1987). V prvním stupni se nechá sloučenina obecného vzorce IV reagovat s dialky1 -N,N-dialky1fosforoamiditem nebo 5 diaryl-N,N-dialkylfosforoamiditem v přítomnosti kopulačního činidla, jako je [1H1-tetrazol, v polárním rozpouštědle, jako je tetrahydrofuran: takto vytvořený fosfit se oxiduje na fosfát aromatickou peroxykarboxy1ovou kyselinou, jako je například kyselina peroxyfta1ová, m-chlorperbenžoová nebo nit- roperoxybenzoová. Fosforová skupina Y (obecný vzorec V) se uvo1ňuj e katalyt i ckou hydrogenací v přítomnosti vzácného kovu, jako je pal ladí um na .

Fosforylace homoseri nového derivátu se provádí di f enylfosforylhalogenidem v přítomnosti pyridinu a N, N-dialkyla-

minopyridi nu (Helv. Chim. Acta 58, str, 518, 1975) po zablokování funkční aminoskupiny terč.-butoxykarbony1ovou skupinou za použití terč.-butylpyrokarbonátu v alkalickém prostředí a blokováním karboxylové funkční skupiny po vytvoření cesiové soli a benzylaci benzylhalogen idem v dimethyl formám idu nebo dimethy1acetami du.

12. Acylace atomu dusíku homoseri nového derivátu se provádí tak, že se odstraní chránící skupina z funkční aminoskupiny trifluoroctovou kyselinou za získání trif1uoroctové soli aminu a reakcí se směsným anhydridem, který se získá reakcí karboxylové kyseliny RiOH a alky1chlorformátu v přítomnosti reaktivního aminu například N-methylmorfolinu.

Vynález se dále týká meziproduktů obecného vzorce

II, III a III buď ve formě čistého enanciomeru nebo směsi stereoiso meru.

Vynález se také týká farmaceutických prostředků obsahujíc í ch jako účinnou látku nejméně jednu sloučeninu obecného vzorce I v neutrální nebo nabité formě, spolu s přísadou netoxi ckého farmaceuticky přijatelného inertního excipientu nebo nos i če.

Zvláště se vynález týká farmaceutických prostředků obsahujících jako účinnou látku alespoň jednu sůl sloučeniny obecného vzorce I, spolu s organickou nebo minerální zásadou, určených k terapeotickému účelu.

Vynález se týká také farmaceutických prostředků obsahují cích sloučeninu obecného vzorce I ve formě čistého enantiomeru nebo ve formě směsi stereoisomerú, v kombinaci nebo v příměsi farmaceutického excipientu nebo nosiče.

Jako farmaceutické prostředky přicházejí v úvahu pro středky vhodné pro mukoznl, transkutanní, topické, parenterál* ní, digestivní nebo inhalační podání, jako jsou povlečené nebo nepovíečené tablety, kapsle, injekční roztoky nebo suspense, spreje, gely, náplasti nebo roztoky k rychlé absorpci.

Především se sloučeniny podle vynálezu, popřípadě neutralizovaných aminem nebo hydroxyalkyaminem, podávají injektováním vodných roztoků nebo susapensí.

Vynález objasňují, nijak však neomezují následující příklady praktického provedení. Vynález objasňují také schémata 1 až 6 a obr. 33 až 38.

Seznam obrázků na výkresech

Obr.l Indukování proliferace buněk kmene kostní dřeně

Na ose x je koncentrace v μΜ, na ose y je OD v AU při 490 nm-AU 490 nm ^— platí pro LPSE coli

-Δ- platí pro 0H-294-DP

Platí pro 0M-294-MP “' platí pro slepou zkoušku

Obr.2 Indukce produkce NO v myších makrofagových buňkách

Na ose x je koncentrace v μΜ, na ose y je nitrit ( μΜ) i® platí pro LPSE coli

-Aplatí pro 0M-294-DP platí pro 0M-294-MP

Obr.3 Indukce konjugátu dextran-FITC. Na ose x jsou stimuly media, LPS, 0M-294-MP, 0M-294-DP

Na ose y je absorpce konjugátu dextran-FITC (%)

Obr.4 Absorpce konjugátu Dextran-FITCNa dávce závislý efekt při nízkých koncentracích. Na dávce závislá odezva

5

vůči LPS & OH-294-HP na absorpci dextranu.

Na ose x je koncentrace v yM, na ose y je inhibice v %. ~ ~’ platí pro LPS ^_B” platí pro 0M-294-MP

Obr.5 Účinek závislý na dávce vyjádřený absorpcí konjugátu dextran-FITC při vysokých koncentracích.

Procento inhibice absorpce konjugátu FITC-dextran

Na ose x je yg/ml, na ose y je % inhibice.

^—O^- platí pro LPS platí pro OM-294-MP

Obr.6 Exprese CD4O společně stimulujícího povrchového markéru Na ose x jsou stimuly media, LPS, 0M-294-MP, 0M-294-DP na ose y je střední fluorescence .

χ p<0,0005 § p<0,001

Obr.7 Exprese CD86 společně stimulujícího povrchového markéru

Na ose x jsou stimuly media, LPS, 0M-294-MP, 0M-294-DP na ose y je střední fluorescence (¾).

x p<0,0005

S p<0,05

Obr . 8 Exprese CD83 společně stimulujícího povrchového markéru

Na ose x jsou stimuly media, LPS, 0M-294-MP, 0M-294-DP na ose y je střední fluorescence (%).

x p<0,0005 § p<0,1

Obr.9 Exprese CD80 společně stimulujícího povrchového markéru

Na ose x jsou stimuly media, LPS, 0M-294-MP, 0M-294-DP na ose y je střední fluorescence (%).

x P<0,0005

S p<0,5

Obr. 10 Účinek produktů 0M-294-MP a OM-294-DP na produkci of-TNF predendritickými buňkami ve stupni DC-6. Na ose x je čas v hodinách, na ose y je αΐ-TNF (pg/ml)

-6-	plat í	pro	prostředí
-Δ-	plat í	pro	LPS
—φ—	plat í	pro	0M-294-DP
	pl at í	pro	Ott-294-MP

Obr.11 Účinek produktů 0M-294-MP a 0M-294-DP na produkci IL-12 p70 predendritickými buňkami ve stupni DC-6 (IFN=gamaIFN) .

IL-12 p70 v supernatantech Na ose x je doba inkubace IL-12p70 (pg/ml).

— O -	plat í	pro	prostředí
- »-	platí	pro	LPS
-Π-	pl at í	pro	LPS+IFN
-X-	plat í	pro	0M-294-MP
-W-	pl at í	pro	0M-294-MP

Obr.12 Účinek produktů OM-294-MP (IFN=gamaIFN).

IL-12 p70 v supernatantech Na ose x je doba inkubace dendritických buněk (DC-6) v hodinách, na ose y je + IFN na produkci IL-12p70 monocyty monocytú v hodinách, na

ose y	je IL-	12p70	* (pg/ml).
-o-	pl at í	pro	prostředí
- ©>-	platí	pro	LPS
	plat í	pro	LPS+IFN
-X -	plat í	pro	0M-294-HP
-	platí	pro	0M-294-MP

+ IFN

Obr.13 ELISA 2 po prvním ímunisačním ošetřen

Zkouška na protilátky specificky zaměřené na PbCS Hise~

242-310, 3 týdny po první injekci (ELISA č.2).

Na ose x je ředění séra, na ose y absorbance při 405 nm.

	platí	pro	Pb CS 242-310,6	His
	pl at í	IFA/Pb CS 242-310,6	His
	Platí	pro	0M-294-MP/Pb CS	242-310,6	His
-o-	pl at í	pro	Oři-294- DP/ Pb CS	242-310,6	His
-x-	platí	pro	0M-294-MP
-4-	platí	pro	OM-294-DP

Obr.14 ELISA 3 po druhém imuni2ačnim ošetření.

Zkouška na protilátky specificky zaměřené na PbCS Hise*

242-310, 4 týdny po druhé injekci (ELISA č.3).

Na ose	x je	ředění séra, na ose γ	ř absorbance při
-	plat i	pro	Pb CS 242-310,6	His
-Λ-	plat í	IFA/Pb CS 242-310,6	His
	pl at í	pro	0M-294-HP/Pb CS	242-310,6	His
	pl at í	pro	OH-294-DP/Pb CS	242-310,6	His
-X-	pl at i	pro	0M-294-MP
• 4 · ·	pl at 1	pro	0M-294-DP

Obr.15 ELISA po třetím imunizačnííi ošetření.

Zkouška na protilátky specificky zaměřené na PbCS Hise242*310, týdny po třetí injekci (ELISA č.4).

Na ose je ředění séra, na ose y absorbance při 405 nm.

Na ose je ředění séra, na ose y absorbance př i 405 nm.

platí pro Pb CS 242-310,6

His

Δpl at í

IFA/Pb CS 242-310,6

His pl at í plat I platí platí pro pro pro pro

0M-294-HP/Pb CS

0M-294-DP/Pb CS

0M-294-MP

0M-294-DP

242-310, 6 His

242-310,6 His

Obr.16 Proti 1átkový titr před a po jednom, dvou a třech imunizačních ošetřeních. Změna ti tru protilátek specificy zaměřených na PbCS H1S&242-31O, po l.,2. a 3. injekci.

Na ose x je ELISA č. , na ose y je reciproká hodnota proti 1átkového ti tru.

i

Na ose x je ředění séra, na ose y absorbance při 405 na.

-Á-	pl at í	pro	Pb CS 242-310,6	His
-Δ-	plat í	IFA/Pb CS 242-310,6	His
	plat í	pro	0M- 294-MP/Pb CS	242-310,6	His
-0-	plat í	pro	0M-294-DP/Pb CS	242-310,6	His
-X-	plat í	pro	0M-294-MP
-E	platí	pro	0M-294-DP

Obr.17 ELISPOT gama IFN produkující lymfocyty tří šlových mízních uzlin stimulovaných PbCS 245-252 jeden týden po druhém imunizačním ošetření.

ELISPOT gama IFN produkující lymfocyty tříslových mízních uzlin jeden týden po druhém imunizačním ošetření.

Na ose x jsou stimulátory na ose y je počet specifických lymfocytů na milion buněk (prázdný obdélník -adjuvant samotný, plný obdélník adjuvant + antigen)

Obr.18 ELISPOT gamalFN produkující lymfocyty sleziny stimulováných PbCS

245-252 jeden týden po druhém imunizačním ošetřen í.

ELISPOT gama

IFN produkující lymfocyty sleziny jeden týimunizaci den po druhé

Na ose x jsou stimulátory na ose y je počet specifických lymfocytů na milion buněk (prázdný obdélník -adjuvant samotný. plný obdélník adjuvant + antigen)

Obr.19 ELISPOTgamalFN produkující lymfocyty sleziny stimulovaných PbCS 245 až 252 jeden týden po druhém imunizačním ošetření.

ELISPOT gama IFN produkující lymfocyty tříslových mízních uzlin jeden týden po třetí imunizaci

Na ose x jsou stimulátory na ose y je počet specifických lymfocytů na milion buněk

(prázdný obdélník -adjuvant samotný, plný obdélník adjuvant· + antigen)

Obr.20 ELISPOTgamalFN produkující lymfocyty sleziny stimulovaných PbCS

ELISPOT gama

245-252 tři týdny po třetím imunizaci.

IFN produkující lymfocyty sleziny jeden tý den po třetí lymfocytú na milion buněk (prázdný obdélník -adjuvant samotný, plný obdélník

Obr.21 Elektroforetogram samotného 0M-294DP, samotného antigenu PbCS HÍS6-242-310 samotného a komplexu

PbCSHise-242-310- Oří-294-DP.

Na ose x je čas (min), na ose y je abs. 1AU1

Obr.22 Specifické protilátky IgGl zaměřené na H1N1

Na ose x jsou studované skupiny, na ose y jsou smluvní jednotky/ml (střed ± směrodatná odchylka) (prázdný obdélník -IgGl 14 dní. plný obdélník IgGl 28 dní, χ* p(se zřetelem na B)

Obr.23 Specifické protilátky 1 gG2 zaměřené na H1N1

Na ose x jsou studované skupiny, na ose y jsou smluvní jednotky/ml (střed ± směrodatná odchylka) (prázdný obdélník - IgG2 i4 dni, plný obdélník - IgG2 28 dní, xx p<se zřetelem na B)

Obr.34 Specifické protilátky igH zaměřené na H1N1

Ha ose x jsou studované skupiny, na ose y jsou smluvní jednotky/ml (střed ± směrodatná odchylka) (prázdný obdélník -IgM 14 dní, plný obdélník dní, χ (0,05 xx p(se zřetelem na B)

I gM

Obr-. 25 Specifické prot i 1 átky IgGl zaměřené na ovalbulin

Na ose x jsou studované skupiny, na ose y jsou smluvní jednotky/ml (střed ± směrodatná odchylka) (prázdný obdélník -IgGl 14 dní, plný obdélník - IgGl 28 dní, xx p<se zřetelem na B)

Obr.26 Specifické protilátky lgG2 zaměřené na ovalbumin

Na ose x jsou studované skupiny, na ose y jsou smluvní jednotky/ml (střed ± měrodatná odchylka) (prázdný obdélník -IgG2 14 dní, plný obdélník - IgG2 28 dní, * <0,05 xx p<se zřetelem na B)

Obr.27 Specifické protilátky lgM zaměřené na ovalbumin

Na ose x jsou studované skupiny, na ose y jsou smluvní jednotky/ml (střed + směrodatná odchylka) (prázdný obdélník -IgM 14 dní, plný obdélník - IgM 28 dní

Obr.28 Specifické protilátky IgGl zaměřené na TT

Na ose x jsou studované skupiny, na ose y jsou smluvní jednotky/ml (střed ± směrodatná odchylka) (prázdný obdélník -IgGl 14 dní, plný obdélník - IgGl 28 dní, xx p<se zřetelem na B)

Obr.29 Specifické protilátky lgG2a zaměřené na TT

Na ose x jsou studované skupiny, na ose y jsou smluvní jednotky/ml (průměrisměrodatná odchylka) (prázdný obdélník -IgG2 14 dní, plný obdélník - IgG2 28 dní, xx p<se zřetelem na B)

0br,30(a) Nárůst imunitní odezvy anti-gp63 vlivem adjuvantu 0Ϊ1-294-ΜΡ: porovnání s BCG,

Na ose x je gp63 wg/ml, na ose y je absorpce ³H-TdR (cpmxl0'³)gp63 ug/ml ~ O platí pro bez adjuvantu ···♦ * platí pro 0H-294-MP ~ ^{41 —} platí pro BCG

Obr.3O(b) Gama IFN a IL-4 bez adjuvantu, s adjuvantem 0M-294-MP a porovnání s BCG.

Na ose x je gp63 yg/ml, na ose y jsou cytokiny pg/ml

Obr.31(a)

Odezva in myší předběžně imunizovaných in vivo antigenem LmCPb

VI i v adj uvantu

0M-294-MP.

Na ose x je Lm

CPb (yg/ml), na ose y je pohlcení ³H-TdR (cpmxlO“³)

- K platí ne i muni zované platí pro bez adjuvantu pl at í pro OH-294-HP

Obr.31(b) Gama IFN a IL-4 , ne imunizováno, bez adjuvantu, s adjuvantem 0M-294-MP

Na ose x je Lm CPb yg/ml, na ose y jsou cytokiny pg/ml

0br.32(a) Nárůst imunitní odezvy anti-LmCPb vlivem adjuvantu

OM - 294 - Ϊ1Ρ ^: porovnání s BCG.

Na ose x je LmCPb yg/ml, na ose y je absorpce ³H-TďR (cpmxlO³)

— o —	plat í	pro	bez adjuvantu
- 0 -	plat í	pro	0H-294-HP
-Λ-	platí	pro	BCG

0br.32(b) Gama IFN a IL-4 bez adjuvantu, s adjuvantem OH-294-HP a porovnání s BCG. Na ose x je LmCPb pg/ml, na ose y jsou cytokiny pg/ml

Obr.33

Schéma syntézy 1

Obr.34 Schéma syntézy 2

Obr.35	Schéma syntézy 3
Obr.36	Schéma syntézy 4
Obr.37	Schéma syntézy 5
ňu.. -~»r> k/kJJL .	—1__£«._____1 -í___jT
Obr.39	Spektrum 1. Difosforylováná sloučenina. Spektra ES-MS (kladný druh) Září zení:Micromass Quatro II (Z-sprej)
Obr.40	Spektrum 2. Monofosforylovaná sloučenina. Spektra ES-MS (kladný druh) Zařízení:Micromass Quatro II (Z-sprej)
Obr.41	Spektrum 3. Difosforylovaná sloučenina. Spektra ES-MS (fragmentace kladného druhu) Zařízení:Hewlett-Packard MSD

Obr.42 Spektrum 4. Monofosforylováná sloučenina. Spektrum ^ÍH-NMR. Rozpouštědlo^:CDCI3 + O, 1% triethanolamin

Zařízení^: Varian Unity INOVA 500 MHz

Obr.43 Spektrum 5. Monofosforylovaná sloučenina. Spektrum *11-NMR. Rozpouštědlo (objemově 3 1) CDCI3 CD3OD

Zařízení: Varian Unity INOVA 500 MHz

Obr.44 Spektrum 6. Monofosforylovaná sloučenina. Spektrum ¹³C-NMR. Rozpouštědl o · CDCI3

Zař í zen í : Bruker DPX 250 MHz

Obr.45 Spektrum 7. Difosforylovaná sloučenina. Spektrum ¹³C-NMR. Rozpouštědlo:CDC13

Zařízení: Bruker DPX 250 MHz

Obr.46 Spektrum 8. Monofosforylováná sloučenina. Spektrum ³¹P-NMR. Rozpouštědlo:CDC13

Zařízení: Bruker DPX 250 MHz

Obr.47 Spektrum 9. Difosforylovaná sloučenina. Spektrum ³*P-NMR. Rozpouštědlo:CDCI3

v í „ €-rU.X. A «ad 1 i.

f\dv Μτι— LJk L^l ϋΐΐώ

V příkladech se používají následující zkratky:

IBCF	i sobuty1ch1or f ormát
IDQ	1 - isobuty1oxy-2-isobuty1oxykarbony1 - 1,2-dihydrochinolin
LPS	1iposacharid
TBAP	tetrabuty1amon i umfosf át
TEoA	tr i ethano1am i n

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

- (Di fenyloxyfosforyloxy)-2-[í R>- 3 -dodekanoy1oxytetradekanoylamino]butanová kyše 1 i na . Ncí-Tetrc . -butyloxykarbonyl - DL-homoser i n

Rozpustí se 2 g homoseri nu (16,78 mmol) ve 20 ml vody a do roztoku se přidá 16,78 ml 1M roztoku hydroxidu sodného a 3,006 g uhličitanu česného (9,23 mmol). Míchá se po dobu pěti minut a roztok se ochladí na lázni ledu a vody. Přidá se 60 ml dioxanu a terč.-buty1pyrokarbonátu. Reakčni směs se udržuje za míchání na lázni ledové vody po dobu jedné hodiny a pak na teplotě místnosti po dobu pěti hodin. Rozpouštědlo se odstraní ve vakuu. Suchý zbytek se použije přímo v následujícím stupni.

2. Neť-Terc. -butyloxykarbonylbenzyl-DL-hofnoseri nát

Do zbytku, ze stupně 1 se přidá 20 ml dimethylformamidu a rozpouštědlo se odpaří k suchu a do reakční směsi se přidá 60 ml dimethylformamidu a 4,5 ml benzylbromidu Í20.13 mmol). Vznikne bílá sraženina. Směs se míchá 16 hodin. Rozpouštědlo se odežene ve vakuu. Zbytek se zkonceritruje nebo extráhujč se dvakrát 20 ml ethylacetátu. Organická vrstva se promyje postupně vodou (20 ml) a solankou (20 ml) a vysuší se bezvodým síranem horečnatým. Rozpouštědlo se odpaří a zbytek se použije v následujícím stupni.

3. Benzy1 - Na-terč. -buty1oxykarbony1 -0 - ( di fenyloxyfosfory1)DL-homoseri nát

Zbytek z předchozího stupně se vysuší ve vysokém vakuu a rozpustí se v methylenchloridu (60 ml). Do roztoku se přidá 4,11 g 4-dimethy1aminopyridinu (33,56 mmol) a reakční směs se míchá 10 minut, načeš se přidá 12 ml pyridinu a 6,95 ml chlorfosfátu (33,56 mmol). Roztok se míchá při teplotě místnosti 18 hodin, promyje se 1N kyselinou chlorovodíkovou (5x20 ml), vodou (30 ml) a solankou (30 ml). Organická vrstva se vysuší bezvodým síranem hořečnatým a rozpouštědlo se odežene ve vakuu. Zbytek se čistí bleskovou chromatografií (hexan/ ethylacetát - 4^:1). Hlavní frakce se zkoncentruje k vykrystalování zbytku. Získá se 7,49 g fosforylováného produktu (82,4% výtěžek). Teplota tání 63,5 až 64,0 C.

4. Benzy1 -0-(di ťenyloxyfosf oryl)- DL-honoseri nát

Fosforylováný produkt z předchozího stupně (7.S8 g, 15,4 mmol) se rozpustí v 15 ml trífluoroctové kyseliny a roztok se udržuje za míchání 2,5 hodiny na teplotě místnosti. Rozpouštědlo se odežene ve vakuu a zbytek se vyčistí bleskovou chromatografií (methano1/dichlormethan = 10:1). Hlavní frakce se

• · · • ··	Φ 9 9 · • ·	• ·	·· • · 9 ·	• 9
• ·	• ·	«	• · ·	•
• ···«··	• » • 9	• ···	• ·	♦ ·· ♦

zkoncentruje a zbytek se místnosti. Získá se 7,17 g 88,9%). Produktu se použije zpracován í.

nechá vykrystalovát při teplotě fosfory1 ováného produktu (výtěžek v následujícím stupni bez dalšího

5. Benzyl 2-{(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-(difeny 1oxyfosforyIoxy)butanoát

4,284 g (10,07 mmol) (R)-dodekanoyloxytetradekanové kyseliny připravené způsobem podle Bull. Chem. Soc. Jpn. 60, str. 2205 až 2214 (1987) se rozpustí ve 30 ml tetrahydrofuranu a roztok se ochladí na teplotu -15 C v ledové solankové lázni. Přidá se 1,108 ml (10,07 mmol) N-methylmorfolinu a 1,31 ml (10,07 mmol) isobutylchlorformátu. V míchání se pokračuje 30 minut. Do reakční směsi se přidá 5,724 g (10,07 mmol) benzyl-0-Cdifeny1oxyfosfory1)- DL-homoserinátu ve směsi 30 ml tetrahydrof uranu a 5 ml triethy1ami nu. Míchání se přes noc při teplotě místností, rozpouštědlo se odžene ve vakuu a do zbytku se přidá 20 ml vody. Směs se extrahuje ethy1acetátem (2x30 ml). Organické vrstvy se spojí, promyjí se postupně vodou (20 ml), solankou (20 ml) a vysuší se síranem hořečnatým. Rozpouštědlo se odpaří a zbytek se čistí bleskovou chromatografií (hexanethylacetát 2=1, Rf = 0,29). Získá se 7,455 g produktu, (87,1% výtěžek). Teplota tání 31,0 až 32,1 C.

¹H-NMR (CDCI3, 250 MHz), δ ppm : 7,4 - 7,1 (m, 15H), 6,90 (2d, 1H, ³J = 7,6 Hz, NH), 5,3 - 5.1 (m, 3H), 4,7 (m, 1H), 4,35 (m, 2H), 2,45 (m, 2H), 2.4 - 2,1 (m, 4H), 1,6 (m, 4H), 1,4 - 1,1 (m, 34H), 0,9 (t, 6H). ¹³C-NMR (CDCI3, 63 MHz), δ . ppm : 173,01, 171,08, 169,66, 150_f18, (d, ²JP.C = 7,1 Hz), 135,01, 129,60, 128,33, 128,14, 127,96, 125,21, 119,80 (d, ³JP>C = 5,0 Hz), 70,69, 67,05, 65,19 (d,²J_P._c =

5.6 Hz), 49,13, 40,97, 40,77 (2 diast.), 34,20, 33,98, 33,82, 31,70, 29,42, 29,34, 29,14, 28,94, 25,01. 24,47, 13,91.

6. 4-(Di feny1oxyfosfory1oxy)-2-[(R)-3-dodekanoy1oxytetra-

-dekanoylami no]butanová kyselina

Připraví se roztok benzylesteru získaného ve stupni 5 (2,23 g, 2,6 mmol) ve 300 ml methanolu čistoty HPLC ve tříhrdlé baňky a přidá se ÍO g 1O% palladia na uhlí. Vzduch se z baňky odsaje ve vakuu a baňka se naplní vodíkem za tlaku okolí. Reakční směs se míchá jednu hodinu při teplotě místnosti, katalyzátor se rychle odfiltruje na membráně a filtrát se zkoncentruje, čímž se získá bezbarvá kapalina. Tento produkt je homogenní podle chromatografie v tenké vrstvě a NMR a použije se bez dalšího čištění v kopulačním stupni. RF=0,75 (dichlormethan/methanol/tri ethylamin 10=1=0,5). ¹H-RMN (CDCI3) 250 MHz), δ ppm : 7,4 - 7.,1 (m, 10H), 6,85 (2d, 1H, NH), 5,15 (m, 1H),

4,6 (m, 1H), 4,35 (m, 2H), 2,45 (m, 2H). 2,4 - 2,15 (m, 4H), 1,6 (m, 4H), 1,4 - 1,1 (m, 34H), 0,9 (t, 6H). ¹³C-NMR (CDCI3, 63 MHz), δ . ppm : 173,35, 171 f30 (2 diast.), 172,75, 170,37, 150,0 (d, ²JP._C = 7,5 Hz), 129,55, 125,28, 119,71 (d, ³JP.C = 4,4 Hz), 70,78, 65.65, (d, ²JP<C = 5,9 Hz), 49,00, 40_z77, 40₍63 (2 diast.), 34,13, 33,86, 33,76, 31,59, 29,31, 29,25, 29,03, 28,82, 24_;88, 24,68,22,36, 13,76.

4-( Di fenyloxyfosforyloxy)-2-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]butanová kyselina se muže připravit podle stejného reakčního schéma náhradou v 5. stupni příkladu 1 (R) -3-dodekanoyloxytetradekanové kyseliny kyselinou ( R)-3-benzyloxytetradekanovou.

Příklad 2 (2R)- 5-Am i no-2-[(R)-3-benzyloxytetradekanoy1ami nolpentan-1 -ol

1. Sůl D-ornithinu s mědí

Do roztoku D-ornithinu (5,25 g, 30 mmol) ve 30 ml 1M roztoku hydroxidu sodného, se přidá 50 ml roztoku pentahyd rátu síranu měďnatého (3.814 g, 15,3 mmol) ve vodě. V míchání se pokračuje dvě hodiny. Reakční směs se odpaří k suchu. Přidá se 60 ml siethanolu. čímž vynikne rudě zbarvená pevná látka, která se oddělí a promyje se postupně dioxanem a methanolem.

2. (2R)- 5-Ami no-5-bensy1oxykarbonylam i no)pentanoát mědi

Rudě zbarvená pevná látka se rozpustí ve 40 ml 1M sodného louhu a 70 ml dioxanu, roztok se ochladí na ledové lázni a přidá se 5, 14 ml (36 mmol) benzylchlorfornátu. V mícháni se pokračuje tři hodiny na ledové lázni a pak 15 hodin při teplotě místnosti. Rudě zbarvená sraženina se shromáždí a promyje se 95% ethanolem (40 ml), vodou (50 ml) a ethanolem (60 ml). Sraženina se vysuší v pícce (T do 45 C, ve vakuu), Dvoustupňovým procesem se získá 8,27 g produktu (93% výtěžek).

3. (2R)- 5-(Benzy1oxykarbony1am i no)- 2- ( tetc. -butyloxykarbony1-am i no)pentanová kyše 1 i na

Sůl mědi, získaná ve stupni 2, se rozpustí ve 2M chlorovodíkové kyselině (400 ml) a přidá se ethylendiamintetraoctová kyseliny (8,15 g, 27,8 mmol). Směs se míchá 2,5 hodiny a neutralizuje se přidáním sodného louhu (přibližně 160 ml) do hodnoty pH 7. Vytvoří se bílá sraženina. Směs se míchá 2,5 hodiny na ledové lázni. Sraženina se odfiltruje, promývá se studenou vodou až do získání bezbarvého odtoku, vysuší se v pícce při teplotě 60 C. Pevná látka se rozpustí ve 156 ml 1M roztoku hydroxidu sodného a roztok se ochladí na ledové lázni. Do roztoku se přidá 7,7 g (35,2 mmol) terč.-butylpyrokarbonátu v dioxanu (160 ml). Směs se míchá 45 minut při teplotě 0 C a 16 hodin při teplotě místností. Organické rozpouštědlo se odpaří a do zbytku se přidá 70 ml ethylacetátu. Vodná vrstva se okyselí 2N kyselinou chlorovodíkovou na hodnotu pH přibližně 3. Vodná vrstva se opět extrahuje 100 ml ethylacetátu. Organické vrstvy se spojí a promyjí se vodou (30 ml) a solankou (30 ml) .

2¾. odežene ve vakuu a vzniklý bezbarvý olej se i» • ·

Rozpouštědlo se čistí bleskovou chromatografií (získá se 8,42 g produktu ve rivoij sf.tjpnính (76,7% výtěžek) . Rf ~ 0, 19, dich1orethan-metha nol 20=1).

4. (2R)- 5-(Benzyloxykarbony1am i no)- 2 - (terč.-buty1oxykarbony1

-amino)pentan-i-ol o

Do studeného roztoku (-15 C) derivátu diaminopentanové kyše 1 i ny z í skané ve stupni 3 (5,45 g, 14,8 mmol) v 60 ml tetrahydrofuranu se př i dá

1,654 ml (14,8 mmol)

N-methylmor£olinu a 9, 6 ml (14,8 mmol) míchá při teplotě - 15 i sobutylchlorformátu o

C 1 minutu a přidá (IBCF). Roztok se se borhydr i d sodný (5,104 g,

44,6 mmol) v ml vody. V míchání se pokračuje po dobu dalších 10 minut, načež se přidá 400 ml vody k ukončení reakce. Roztok se extrahuje ethylacetátem (100 ml 2x). Organické vrstvy se spojí, promyjí se postupně vodou (50 ml), so1ankou ( 60 ml) a vysuší se síranem hořečnatým. Rozpouštědlo se odstraní a zbytek se překrystaluje ze směsi ethylacetátu. Získá se 4, 95

O

c.

g produktu (94,9% výtěžek) o teplotě tání 47,5 až

5.

Odstraněn í chránící skupiny z derivátu 2,5-diaminopentanRozpust í am i no)- 2-(terč.

ve stupni 4, v se 6,32 g (18 mmol) (2R)- 5-(benzyloxykarbony1 -buty1oxykarbonylam i no)pentan-1 -olu, z í skaného ml trifluoroctové kyseliny a směs se míchá teplotě místnosti. Rozpouštědlo se odpaří a zbytek se čistí bleskovgou chromatografií (methanol/dichlor methan 10=1). Získá se bezbarvý sklovitý produkt tající při fluoroctové kyseliny (výtěžek 82,7%). Hydrochloridová sloučeo nina má teplotu tání 133,0 až 134,3 C (překrystalizace z methanolu).

6. (2R)-5-(Benzy1oxykarbony1ami no)- 2-[ ( R)-3-benzy1oxytetrade- kanoiyam i no]pentan- 1 -ol

Do roztoku předem vychlazeného na teplotu -15 C 5,27 g (15,8 mmol) (R)-3-benzyloxytetradekanové kyseliny (Bull. Chem. Soc. Jpn., str. 2197 až 2204,1987) ve 30 ml tetrahydrofuranu se přidá 1,89 mi (15,8 mmol) N-methyInorfolinu a 2,21 ml IBCF (15,8 mmol). Reakční směs se udržuje za míchání 30 minut na a teplotě -15 C. Do roztoku se přidá 5,25 g soli trif1uoroctové kyseliny podle odstavce 5 (14,4 mmol) ve 30 ml tetrahydrofuranu a 1,44 ml triethylaminu. V míchání se pokračuje při teplotě místnosti 16 hodin, načeš se přidá 30 ml vody a 60 ml ethylacetátu. Organická vrstva se oddělí a vodná vrstva se znovu extrahuje ethylacetátem (60 ml). Organické vrstvy se spojí, promyjí se postupně vodou (30 ml), solankou (30 ml) a vysuší se síranem horečnatým. Rozpouštědlo se odpaří a zbytek se překrystaluje ze směsi acetát/hexan. Získá se 5,842 g produktu (výtěžek 71,2%). Teplota tání = 117,5 až 118 °C. Rf = 0,32, ethylacetát-petroleumether 3^;1. ¹H-NMR (CDCI3, 250 MHz) δ ppm : 7,4 - 7,2 (m, 10H), 6,5 (2d, 1H, NH), 5,1 (s. 2H), 4,9 (m, 1H, NH), 4,5 (2d, AB, 2H), 3,8 (m, 2H), 3,5 (m, 2H), 3,1 (m, 2H), 2,4 (m, 2H), 2,4 (m, 2H), 1,6-1,4 (m, 6H), 1,4-1,2 (m, 18H), 0,9 (t, 3H). ^,3CNMR (CDCI3, 63 MHz), δ ppm : 172,24,156,49, 138,06, 136,53, 128,46, 128,04, 127,87, 76,76, 71,39, 66,60, 65,44, 51,54, 41,43, 40,65, 33,76, 31,87, 29,61,29,30, 28,01,26,47, 25,05, 22,65, 14,09.

7.(2R>- 5-Am i no-2-[ ( R)- 3-benzy1oxytetradekanolyam i no]pentan-1 -ol

Do tříhrdlé baňky se vnese 150 mg 20% palladia na uhlí do roztoku (2R)-5-(benzy1oxykarbony1ami no)-2- [ (R)-3-benzyloxytetradekanolyaminolpentan-1-olu (3,0 g, 5,27 mmol) a 6 ml triethylaminu ve 300 ml ethanolu Čistoty HPLC. Vzduch se z baňky vypudí při jejím plnění vodíkem. Reakční směs se míchá dvě ho- diny při teplotě místnosti, katalyzátor se odfiltruje přes membránu a filtrát se zkoncentruje, čímž se získá homogenní bílá pevná hmota podle chromatografie TLC a použije se v následujícím stupni bez dalšího čištění. Rf =0,2, dichlormethanmethanol/triethy1amin 5=10=5, teplota tání 47 až 48 C.

¹H-NMR (CDC!₃₁ 250 MHz), δ - ppm : 7,4 . 7,2 (m, 5H), 6.75 (d. 1H, NH)4,5 (2d, AB, 2H), 3,9 (m, 2H), 3,5 (m, 2H), 2,3 - 2,6 (m, 7H), 1,7 -

1,2 (m, 24H), 0,9 (t, 3H). ¹³C-NMR (CDCI_3l 63 MHz), δ ppm : 171,86, 138,13, 128,37, 127,87, 127,75, 76,81, 71,50, 64,57, 51,38, 41,51, 41,17, 33,89, 31,82, 29,26, 28,57, 28,03, 25,07, 22,60, 14,04.

(2R)-5-Amino-2-[(R)-3-dodekanoy1oxytetradekano1yaminoJpentan-l-ol lze získat stejným postupem nahrazením (R)-3-benzyloxytetradekanové kyseliny ve stupni 6 příkladu 2 (R)-3-dodekanoyloxytetradekanovou kyselinou.

Příklad 3

3-C(R)- 3-Dodekanoy1oxytetradekanoy1ami nol- 4-oxo-5-aza-9 -[(R) 3-hydroxytetraděkanoy1am inolděkan-1 , 10-diol- 1-di hydrogenfosfát

1. Peptidová kopulace

V roztoku <2RS)-4-(difeny1oxyfosforyloxy)-2-[ ( R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylaBiinolbutanové kyše 1 i ny (1,0 mmol), získané podle příkladu 1, rozpuštěné ve 20 ml methy1enchloridu, se suspenduje 363,6 mg (1,2 mmol) 1 - isobutyloxy-2-isobutyloxy- karbony 1 - 1,2-dihydrochinolinu (IDQ) . Míchá se po dobu 15 minut, přidá se í,0 mmol (2R)- 5-ami no-2-í ( R)-benzy1oxytetradekanoylaminolpentan-1-olu podle příkladu 2, rozpuštěného v 10 ml methy1enchloridu a reakční směs se míchá čtyři hodiny.

Roztok se zkoncentruje a zbytek se čistí bleskovou chro31

matografií (dichlormethan/aceton = 5=2, Rf 0,23). Rozpouštědlo se odstraní, čímž se získá 0,620 g bezbarvé husté kapaliny (výtěžek 52,7%), kterou je fosforylováná sloučenina podobná dipeptidu. Rf=0,49 dichlormethan/methanol/triethy1amin 10:1=0,5.

¹H-NMR (CDCI_3i 250 MHz), δ ppm :

7,40 - 7,15 (m, 15), 7,00 (m, 1H), 6,90 a 6,80 (2d, 2 diast., 1H), 6,65 (d,

1H) (3 x NH), 5,15 (m, 1H), 4,50 (m, 3H), 4,30 (m, 2H), 3,85 (m, 2H), 3,45 (m, 2H), 3,15 (m, 2H), 2,41 - 2,14 (m, 8H), 1,6 - 1,4 (m, 8H), 1,4 - 1,1 (m,

54H), 0,9 (t, 9H, 3CH₃). ¹³C-NMR (CDCI₃, 63 MHz), δ ppm: 173,11, 171,68, 170,52 (2 diast.), 169,94 (2 diast), 150,0 (d, J_PC = 7,2 Hz), 138,0 (2 diast.), 129,58, 127,99, 127,49, 127,26, 125,24, 119,73 (t, J_PC = 5,0 Hz), 76,48, 71,12, 70.71, 65,86 (broad spin), 64,22, 50,96, 49,71 (broad spin), 41,46, 41,05, 39.07, 34,13, 34,00, 32.70, 31,61,29,34, 29,06, 28.87, 27,98, 25,25, 24,92, 24.72, 22,38, 13,80.

2.

-(D i f enyloxyfosforyloxy)- 3 - [ ( R)- 3-dodekano1yoxytetra

-dekanoy1am i no]- 4-oxo- 5 -aza- 9-[(R)- 3-hydroxytetradekanoylami no1děkan-10-ol

Roztok fosforylováné sloučeniny podobné dipeptidu (488 mg, 0,42 mmol) shora získané a kyseliny octové (1,9 ml) v 65 ml ethanolu čistoty HPLC se zavede do tříhrdlé kulaté baňky a přidá se 200 mg 10% palladia na uhlí. Vzduch se vytěsní ve vakuu a baňka se naplní vodíkem. Reakční směs se míchá dvě hodiny při teplotě místnosti, načež se katalyzátor odfiltruje membránovou filtrací a rozpouštědlo se odežene ve vakuu, čímž se získá surový produkt (92% výtěžek). Vzorek produktu se čistí bleskovou chromatografií (dichlormethan/aceton 5:4, Rf= 0,24). Získá se sklovitá pevná látka. Rf = 0,68, 5=2 methylenchlorid/ methanol. (¹³C-NMR (CDC13.63 MHz) 3 v ppm (objeví se několik signálů ve tvaru dubletu v důsledku přítomnosti diastereomerů)

173,60, 173,15, 170,67, 170,60, 170,27, 170,07, 150,24 (d), 129,92, 125,66, 120,05, 119,90 (2d), 71,11, 71,05, 68,83; 66,21 (broad spin), 64,71, 51,38; 50,32, 50,12,43,25, 43,12, 41,66, 41,57, 39,30, 37,26, 34,45, 32,84, 31,86, 29,62, 29,5, 29,29, 29,13, 28,08, 25,57, 25,19, 24,97,22,62, 14,03.

3. 3-[(R)-3-Dodekanoy1oxyteLradekanoy1ami no-4-oxo-5-aza]-9- L ( R) - 3'hydroxyletraděkanoylain ,no]děkan 1 , 10-diol- 1 -dihydrogenfosfát

V tříhrdlé kulaté baňce se předběžně 10 minut aktivuje oxid platiny (137 mg) vodíkem v absolutním ethanolu (5 ml). Přidá se roztok i-(difeny1oxyfosfory1oxy)-3-[(R)-3-dodekanoy1 -oxytetradekanoy1amino]- 4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytetradekanoylaminoídekan-10-olu (411 mg, 0,38 mmol) v absolutním ethanolu (20 ml). Vzduch se vytěsní ve vysokém vakuu a baňka se naplní vodíkem. Reakční směs se míchá dvě až tři hodiny při teplotě místností, katalyzátor se odfiltruje membránovou filtrací a rozpouštědlo se odežene ve vakuu, čímž se získá surový produkt v podobě bílé pevné látky (98% výtěžek). Rf = 0,50, chloroform/methanol/voda 64'O,6.

3-[(R)-3-Hydroxytetradekanoy1am ino-4-oxo-5-aza]-9-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylaminoldekan-1, 10-diol 1-dihydrogenfosfát je možno získat stejným postupem (schéma 3, obr. 35) použ i t í m 4 - ( d i feny1oxyfosforyloxy)-2-[ (R)-3-benzy1oxytetrade-kanoylaminolbutanové kyseliny a (2R)-5-amino-2-L(R)-3-dodeka-noy1oxytetradekanoylam i noJpentan-1-olu.

Nebo se 3-[(R)-3-dodekanoyloxytelradekanoylamino-4-oxo

-5-aza]-9-[(R)- 3-hydroxytetradekanoylam i no]děkan-1, 10-diol- 1 -di hydrogenfosf át způspbem (reakční ním volné funkční získá z asparagové kyseliny následujícím schema 1, 5 a 6, obr, 33, 37 a 38): chráně hydroxylové skupiny (2R)- 5- ( benzy1oxykarbo nylam i no)- 2-[(R)-3-benzy1oxytetradekanoy1am i nolpentan-1 -olu benzy1oxymethylovou skupinou, uvolněním fukční 5-aminoskupiny ♦ 9 99 •••••·· ** · · · · * t * této sloučeniny hydrogenolýzou, uskutečněním peptidové vazby tohoto aminu s inonoesteri f ikovaným derivátem D- nebo L-asparagové kyseliny uchováním jeho funkční aminoskupiny buď chránící skupinou nebo skupinou (R)- 3-dodekanolyoxytetradekanoy1ovou, uvolněním a redukcí koncové karboxylové funkční skupiny směsným anhydridem, popppřípadě odstraněním chránící skupiny z fukční aminoskupiny odvozené od asparagové kyseliny, N-acylací derivátem (R)- 3-dodekanolyoxytetradekanové kyseliny, fosfory lácí fukční hydroxyskupiny na Ci a nakonec odblokováním fosfátové a hydroxylové funkční skupiny hydrogenolysou.

Příklad 4

Příprava 3-t(R)-3-dodekanoy1oxytetradekanoy1am i no]-4-oxo-5-aza-9 - E ( R)-3-hydroxytetradekanoy1am i no]děkan- 1, lO-diol-1, 10-bis-(di hydrogenfosfátu)

- ( D i feny 1oxyfosforyloxy)- 3 - [ ( R)-3-dodekanoyloxytetradeka-noylamino]-4-oxo-5-aza-9-t (R)-3-benzyloxytetradekanoylami no]-děkan-lO-ol (985 mg, 0,84 mmol) se nechá reagovat 30 minut s diben2yl-N,N -diethylfosforamiditem (0,58 ml, 85% čistoty) v přítomnosti E1H]-tetrazolu (182 mg) v tetrahydrofuranu (35 ml) při teplotě místnosti, Fosfitový meziprodukt se oxiduje přísadou roztoku m-chlorperoxybenzoové kyseliny (535 mg) ve 25 a ml methylenchloridu při teplotě 0 až -20 C. Po 20 minutách se přidá roztok thíosíranu sodného (20 ml) k neutralizaci veškerého přebytečného oxidantu, načež se organická vrstva zředí etherem, Organická vrstva se oddělí, promyje se postupně vodným roztokem thíosíranu sodného (5x20 ml), roztokem hydrogenuhličitanu sodného (2x20 ml), vodnou kyselinou chlorovodíkovou (20 ml), vysuší se síranem horečnatým a ^koncentruje se. Surový produkt se čistí bleskovou chromatografií na silikagelu ( d i chl ormethari/aceton = 10 ^: 3) . Takto získaný chráněný difosforylovaný derivát (900 mg, 75% výtěžek) (Rf 0,64, 5^:2 dichlormethan/ aceton) se katalyticky hydrogenuje po dobu čtyř hodin v methanolu čistoty HPLC (1OOO ml) v přítomnosti 10% palladia na uhlí (300 mg) sa tlaku a teplotě okolí. Katalyzátor se odfiltruje membránovou filtrací a filtrát se zkoncentruje za sníženého tlaku, čímž se získá surový 10-(dihydroxyfosforyloxy)-1 -(di fenyloxyfosforyloxy)-3-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylami no]- 4-oxo-5-aza-[(R)-3- hydroxytetradekanoylam i no]děkan (Rí = 0,63, chloroform/methanol/vuda 6^;4^:0,6) s 39% výtěžkem. Tento produkt se podrobí katalytické hydrogenaci na oxidu platiny (380 mg) v ethanolu čistotyHPLC (130 ml) 24 hodin při teplotě a tlaku místnosti. Katalyzítor se odfiltrtuje membránovou filtraci a filtrát se zkoncentruje, čímž se získá volná bisdihydrogenfosfátová sloučenina (Rf=0.20, chloroform/methano 1 Z voda, 6 · 4 ·’ 0, 6) .

3- [ (. R) - 3-hydroxytetradekanoylami no] - 4 - oxo - 5- aza-9- [ ( R) -3-dodekanoyIoxytetradekanoyIam i no]děkan-1, 10-diol-l. 10-bis(di hydrogenfosfát) je možno získat tím, že se vychá2í ze 4-(difenyloxyfosforyloxy)- 2-[(R)-benzy1oxytetradekanoy1am i no]butanové kyseliny a z í2R)-5-amino-2-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanol-y1ami no]pentan-1 -o1u stejným postupem (schéma 3, obr. 35).

Nebo lze získat 3-[ ( R)-3-dodekanoyloxytetradekanolylaminol- 4-oxo-5-aza-9-£ (R)- 3-hydroxytetradekanoylami no]děkan-1.10-diol-1, 10-bis(dihydrogenfosfát) z asparagové kyseliny následujícím způsobem (reakční schéma 1, 4 a 6)uvolněním fukční 5-aminoskupiny (2R)- 5-(benzy1oxykarbony1amino)- 2-[ ( R)- 3-hen zy]oxytetradekanoy1ami no]Ipentan-1-olu hydrogenolyzou, převedením peptidové vazby tohoto aminu monoesterifi kovaným derivátem D- nebo L-asparagové kyseliny, majícím na fukční aninoskupině buď chránící skupinu nebo (R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylovou skupinu, uvolněním a redukováním koncové karboxylové funkční skup i my pomocí směsného anhydridu, případně odstraněním chránící skupiny z fukční aminoskupiny odvozené od asparagové kyseliny, pak H-acylací derivátem (R)-3-dodekanoyloxytetradekanové kyseliny, fosforylací hydroxylové funkční skupiny v Ci a Cio a nakonec odblokováním fosfátových a hydroxy1ových funkčních skupin hydrogenolysou.

Příklad 5

Čištění a analýza sloučenin podle vynálezu

1, Čištění monofosforylováných a difosfory1 ováných sloučenin

Monofosforylováné a difosfory1 ováné syntetické produkty se rozpustí ve směsi vody a isopropanolu (objemově 1:1) s O,1 % triethylaaminu k nastavení hodnoty pH na 8 až 9. Postupně se přidá potřebné množství 2M hydrogenuhliči tanu amonného k dosažení koncentrace 25 mM.

Čištění se provede preparát ivní reverzní fázovou chromatograf i í HPLC za následujících podmínek:

Sloupec: Bondapack C18 Prep Pak, 40x200 mm, 15-20 um, 30 nm Haters

Mob i 1n í f áze:

A^; isopropano1/voda (objemově 1'1), 50 mM hydrogenuhliči tanu amonného

B^: isopropano1/voda (objemově 2 = 8), 50 mM hydrogenuhliči tanu amonného

Průtočná rychlost ' 40 ml/min

Eluce:isokratická adsorpce na sloupci^:40 % B (60 % A), 10 minut

Gradient Α:β: 40 - 80 % B během 10 minut

Isokratická eluce: 80 % B, 30 minut

Promývání: 1OO % b, 10 minut

Detekce·' UV, 210 run (vlnová délka)

Za uvedených elučních podmínek je retenční doba roonofosforylované sloučeniny 25 až 30 minut, zatímco difosforylované sloučeniny 18 až 25 minut. Zjistí-li se přítomnost monofenylových produktů (neúplné zbavení chránícíé skupiny při defenyla-

ci), je nutný jemnější stupeň čištění. Toto další čištění probíhá za následujících podmínek:

Sloupec; Kromasil C18, 21x250 mm, 5 ym, 10 nm, Kacherey-Nage1 Mob i 1n í f áze:

A^; isopropanol/voda (objemově 1:1), 50 mM hydrogenuhliči tanu amonného

B: i sopropano I / voda (objemově 2-8), 50 mři hydrogenuhl ič i tanu amonného

Průtočná rychlost: 10 ml/min

Eluce: isokratická adsorpce na sloupci:40 % B (60 % A), 10 minut

Isokratická eluce: monofosforylovaná sloučenina: 80 % B, 30 minut, difosforylovaná sloučenina: 74 % B, 30 minut

Promývání: 100 % B, 10 minut

Detekce: UV, 210 a 254 nm (vlnová délka)

Frakce obsahující monofosforylováné a difosforylováné sloučeniny ve formě amoniových solí se shromáždí a skončentruj í se adsorpcí C 18 fá2í Bondapack, 15-20 μιη, 30 nm, Waters. Sodná sůl monofosforylováných a difosforylováných sloučenin se získá promytím roztokem 10 g/l chloridu sodného ve směsi voda/isopropanol (objemově 9=1). Po odstranění přebytku chloridu sodného protečením 5 objemů směsi voda/isopropanol (objemově 9^:1), se sloučenina eluuje čistým isopropanolem. Toto rozpouštědlo se odpaří k suchu na rotační odparce. Konečné rozpuštění se provede požadovaným množstvím vody (v případě monofosforylováné sloučeniny s přísadou 0,1 % triethanolaminu) k zísání cílové koncentrace 2 mg/ml. Provede se sterilní fil-

trace	f i 1 trém	0,2 pm Express	Membrane,	Milí ipóre	(je-li	objem
menší	než	50	ml, doporučuje	se sysém	Ster i f1ip,	je-li	objem
větš í	než	50	ml, doporučuje	se systém	Ster i top) .

Při zpracovávání monofosforylováné sloučeniny je výhodné prozvučet roztok (3x10 sekund) při teplotě místnosti před sterilní f i 1trac í.

2. Sledování a výtěžek čištění

Po ukončení každého stupně se frakce analyzují reverzní fázovou chromatografií HPLC za těchto podmínek¹

Sloupec:

Supe 1 cos i 1 C18,

4,6x150 mm,

1O nm, Supělco

Mobilni fáze

A: voda/aceton itri 1 (obj emově

1) , 5 mM TBAP

B^; voda/isopropanol (objemově mM TBAP

TBAP: tetrabuty1amoniumfosfát

Průtočná rychlost¹ 1 ml/min

Eluce^: gradient A^;B (75-25 -0=100) během 37,5 minuty

Detekce: UV, 210 a 254 nm (vlnová délka).

Při takto provedené chromatografií jsou pozorované retenční doby monofosforylovaných sloučenin 25,5 t 0,5 minut a difosforylovaných sloučenin 20,8 ±0,5 minut. Výtěžek čištění monofosforylováných sloučenin je 57 až 94% a difosfory1 ováných sloučenin 71 až 92%. Získá se 311 mg monofosforylovaných sloučenin a 189 mg difosforylovaných sloučenin.

2. Zkouška a analýza stupně čistoty konečného produktu

Kvantitativní zkoušky a analýzy stupně čistoty produktů se provádějí pomocí HPLC/UV za shora popsaných provozních podmínek chromatografie. Podle těchto zkoušek jsou stupně čistoty získané u jednotlivých monofosforylovaných a difosforylovaných zkušebních vzorků 99 až 100 %. K odhalení přítomnosti neaktivních nečistot v UV oblasti se provádějí analýzy LC/ES-MS (pozitivní způsob e1ektrosprejové ionizace). K tomu se nahradí (5mM) tetrabutylamoniumfosfátu (25 mM) acetátu amonného k vyhovění požadavkům ionizace na eIektrosprejovém rozhraní.

Ke zkoušení konečných produktu se používá alternativních způsobů. Například kvantitativní analýzy celkových fosfátů

	·♦··	• ·
• ·	•	• *
•	♦ · ·	• ♦
*	• ·	• ♦
•	•	·
• · ♦ ·	···	• ·

(podle Ames B.N., Methods in Enzymology VII, str. 115 až 117, 1966), aminokyselin (poodle Hughes a kol. J. Chromatography 389, str. 327 až 333, 1987) a acylových řetězců (podlo Miller

L.T., Hewlett Packard Application Notě str. 228 až 237, 1984).

4. Spektrální analýza

4.1 Hmotová spektrometrie

Vynesou se spektra ES-MS (negativní a pozitivní druhy) monofosforylováných a difosfory1 ováných sloučenin za použití tří typů hmotových spektrometrů (Finnigan LCQ, ion trap, Micromass Quattro II, tripletový stav guadrupol, Hewlett Packard MSD, singlet quadrupol). Jako doplněk se provádějí také analýzy MS/MS. Spektra dokládající identitu a čistotu uvedených produktů jsou v dodatku.

ES-MS spektra (pozitivní druh)

Di fosforylovaná sloučenina:

(Micromass Quattro II: spektrum 1, HP-MSD: Spektrum 3) (obr. 39 & 41).

V oblasti nízkých energií lze pozorovat hlavní pseudomolekulární ionty při poměru m/z 1014,6 [M+H]⁺. Sodné příměsi při poměru m/z 1036,6 [M+Na]⁺, 1058,6 ÍM+H⁺2Nal⁺ a při 1080,5 [M+2H+3NaJ* jsou také viditelné.

V závislosti na stupni fragmentace lze pozorovat dva 916,5 [M-9S+H1⁺ a 818,6 [M-98-H]⁺ fragmenty m/z. což dokládá přítomnost dvou fosfory1ových skupin na molekule. Jak je vyznačeno spektrem 3 (obr. 41), kolísá relativní intenzita pozorovaných iontů v závislosti na použité úrovni energie.

Monofosfory1 ováná sloučenina‘ (Micromass Quattro II^: spektrum 2) (obr.40)

Poněkud odlišný ionizační diagram se získá pro monofosfo-

• B B	·· • ·	• BB	«· • ·	• φ φ
• ···	•	•	•	B ·	φ
* · 0	•	•	•	• · ♦	B
♦ B ··«··Β0	B 0 0 ·	• ♦ ··	• 8 • B	• • 0 ·

ryl ovanou sloučeninu v důsledku přítomnosti triethanolami nu (TEoA) v analyzovaném roztoku. Hlavní pseudoiolekulární iont lze pozorovat při poměru m/z 934,4 [M+H]⁺, stejně jako adukty sodné 956,3 [M + H] ⁺ a draselné EM+K1* při poměru m/z 956,3 a 972,3. Patrná je i druhá slupina aduktů při poměru m/z 1083,4 [M+TEA+H]⁺ a při poměru m/z 1105,3 [M+TeOH+Na]⁺ a při poměru m/z 1121,3 [M+TeOH+Kl*. Přítomnost tosforylové skupiny uvnitř molekuly je pátrá z fragmentu zjištěném při vysoké úrovni energie odpovídající poměru m/z 836,4 [M-98+H]*.

Spektra ES-ΜΞ (negativní druh)

Iontové druhy pozorované v negativním druhu spekter ES-MS monofosforylováných sloučenin a difosfory1 ováných sloučenin dosti souhlasí s výsledky získanými v pozitivní formě.

Provádějí se také FAB ionizační analýzy (pozitivní forma). Při nízké rozlišovací úrovni vykazují monofosforylované sloučeniny sodné adukty při poměru 956,5 [M+Na]⁺ a difosforylované sloučeniny při poměru m/z 1036,5 [M+Na]⁺.

Při vysoké rozlišovací úrovni ( 3-nitrobeny1 alkoholová matrice) je pozorovaný vrchol při poměru m/z 956,667 pro monofosfátovou sloučeninu odpovídající očekávanému molekulovému vzorci C49H69O11NaFNa (předpověděná hmotnost¹ 956,668 amu) ,

Pro difosforylovanou sloučeninu je zaznamenán vrchol při poměru m/z 1036,635, coě odpovídá molekulovému vzorci C49H97014N3p2Na (vypočtená hmotnost¹ 1036,634 amu).

Ze všech provedených analýz MS vyplývá vysoký stupeň čistoty získaných produktů.

4.2 nukleární magnetická resonance

Spektra Hi-NMR a ¹³C-NMR monofosforylovaných a difosforylovaných sloučenin se zjišťují přístrojem DPX Brucker, pracují cím při frekvencích 250,13 a 62,39 MHz a systémem Varian Unity lnová pracujícím při frekvencích 500 až 499,87 a 125,7 MHz. Spektra ³¹P-RMN se zaznamenávají při 121,6 MHz (DPX Brucker). Spektra, dokládající identitu a čistotu těchto produktů jsou uvedena v dodatku.

Spektra ¹H-NMR (spektra 4 & 5) (obr. 42 & 43)

Monofosforylováná sloučenina: Na spektrech zaznamenaných v CDCI3 + O, 1 % triethanolami nu (TEoA) (spektrum A) jsou patrny signály odpovídající třem protonům pocházejícím od atomů dusíku N(5), N(2a) a N(2b) mezi 7 až 9,5 ppm (zvětšený pohled spektrálního okna). Signály připisované H-N(2a) H-N(2b) jsou patrny ve formě dvou dubletů, které dokládají přítomnost směsi stereo isomerů. Ukazuje se, že jeden diastereoisomer převládá (jako důsledek různých stupňů vyčištění).

Difosforylováná sloučenina: Na spektrech zaznamenaných v CDCI3-CD3OD (objemově 3:1) (spektrum 5) nejsou již signály odpovídající H-N(5), H-N(2a a H-N(2b) patrné v důsledku výměny druhů v přítomnosti CD3OD.

Dodatečné informace, týkající se významu různých signálů, se získají pokusy homonukleární a heteronuk1eární korelace (íHCTH-NMR- COSY, *Η-^í3C-NMR=HSQC & HMBC).

Spektra ¹³C-NMR (spektra 6 & 7) (obr. 44 & 45)

Zaznamenávání spekter ¹³C-NMR je neobyčejně obtížné pro dosti nízkou rozpustnost monofosforylováných a difosforylovaných sloučenin.

Spektra ³¹P-NMR (spektra 8 & 9) (obr. 46 & 47)

Pro monofosforylováné a difosforylované sloučeniny je patrný jediný vrchol.@LH 4

Příklad 5

Farmakologické studie sloučenin podle vynálezu í . Stanovení endotoxici ty L*mulovým chromogenickým testem

Endotoxicita se zjišťuje chromogenovvým Limuls Amoeobocyte Lysáte testem (Chromogenic LAL of Charles River Endosafe, šarže ít EK412 E, Charleston, USA) . Tento test se zakládá na aktivaci 1 ipopolysachari den (LPS) nebo strukturálně analogickými produkty enzymatické kaskády obsazené v LAL. Tato enzymatická aktivace se projevuje rozštěpením chromogenu vázaného na peptid za působení proteázy v konečném stádiu této enzymatické kaskády podle následujícího reakčniho schéma:

LPS nebo PRODUKT

LAL aktivace proteázy a hydrolysá peptid/chromogenové molekuly

I

Ac-11e-G1u-Ala-Arg-ρ-nitroani 1 in Ac-Ile-Glu-Ala-Arg+ p-n i troani1 i n (bezbarvý) zbarvený (405 nm) o Enzymatická reakce se provádí při teplotě 37 C a časové vytváření chromogenu se měří při 405 nm. V konečném stavu této zkoušky stanovící časový průběh se zaznamenává doba potřebná k dosažení OD 0,2 jednotek a endotoxická aktivita se vypočítává na základě standardu LPS (standardní křivky).

Výsledky jsou vyjádřeny v EU (endotoxi nových jednotkách) ve vztahu k standardizované přípravě 1 iposacharidů E.coli. Pro tyto soubory zkoušek odpovídá 1 EU 0,08 mg ekvivalenu LPS.

Výsledky ukazují poměrně vysoký stupeň variability, ačkoli Lo je normální u kvantitativních zkoušek takového druhu, které poskytují v zásadě náznak magnitudy. Testování LAL se provádí hlavně k důkazu nepřítomnosti pyrogenů (horní meze né je porovnat kvantitativní zkoušku obsahu pyrogenů s danými dobře standardizovanými jednotlivými seriemi pokusů.

Výsledky

Výsledky (průměr ± směrodatná odchylka) získané u produktů podle vynálezu jsou uvedeny v tabulce (A)

Tabulka CA)

Aktivace limulus amoebocyt lysátu (LAL)

produkty	akt i vace	LAL v EU/mg	aktivita LAL v ekvivalentech ng eg.LPS/mg
ΟϊΙ-294-DP	56 ±	48	6, 2
0M-294-HP	13 ±	2	1,4
E.coli LPS	7,7*	1,6x106	0,85 x 10Ď
< re f erenčn i)

Sloučeniny podle vynálezu jsou 1 0^e krát méně aktivní než LPS v testu LAL. 0M-294-DF a 0M-294-MP jsou proto zajímavými produkty vzhledem ke své nízké toxicitě, ve spojení se svou schopností zprostředkovávat biologické aktivity a působí jako imunomodulátory (jak in vivo, tak in vitro).

2. Stanovení proliferace kmene buněk myší kostní dřeně v odezvě na stimulaci LPS nebo sloučenin podle vynálezu

Způsob

Vdechováním oxidu uhličitého se usmrtí dva myší šest neděl staří samci C57/BL6 a následuje krční dislokace. Myši se pro_ τ_ _ Έί. — 1 - — — ~ ,'> — Ί X IéSŮWJXí 1 1S.CJ1 ΐνθ * Π £3«?

rušením kloubů se vyjmou pánevní, stehenní a holenní kosti. Skalpelem se odstraní maso. Kosti se očistí a konce kostí se ustřihnou nůžkami. Kostní dřeň se extrahuje z dříků kostí trojnásobným injektováním modifikovaného prostředí Dulbeco

Eagle (DH-medium) z vnějších částí odstřižených nůžkami. Buňky se suspendují v DH mediu a odstřeďujií se 5 minut při 300 x g. Supernatant se vyhodí a kmenové buňky se suspendují v DH mediu doplněném 20 % zárodečného telecího séra (FCS). Koncentrace buněk se upraví na 500 000 buněk/ml.

Sériově se zředí produkty předem rozpuštěné v DH mediu doplněném FCS, aminokyselinami a antibiotiky a vnesou se přímo do 96-důlkových mikrotitrových destiček. Za použití součinitele 3,16 se připraví 9 zředění. Produkty se testují v sériích po šesti a každá mikrotitrové destička zahrnuje negativní kontrolu obsahující plné medium. Konečný objem v každém důlku je 100 μΐ. Mikrotitrové destičky se inkubují jednu hodinu v inku« bátoru při teplotě 37 C v prostředí s 8 % oxidu uhličitého při 100% relativní vlhkosti k pufrování media. Po jedné hodině se do produktu přidá 100 μΐ buněčné suspense a v inkubaci se pokračuje sedm dní.

Proliferace se zjišťuje měřením oxidace chroiBogenového substrátu (XTT) v mitochondri i živých buněk.

Po sedmi dnech se mikrotitrové destičky odstředí 5 minut při 400 x g a 10O μΐ supernatantní kapaliny se odsaje a vyhodí. Do každého důlku se přidá 50 ju 1 1 mg/ml XTT 3-[ 1 - f eny 1 ami 44 nokarbony1)-3,4-tetrazo1 i umIbisi ( 4-metboxy-6-ni tro)benzensul fonátul sodného a 0.008 mg/ml PMS (N-methyldibenzopyrazin, methyl sulfátu) v mediu RPM1 . Po osmihodinové inkubaci v inkubátoru při teplotě 37 C v prostředí s 8 % oxidu uhličitého při 100% relativní vlhkosti se mikrotítrové destičky odeřečtou spekrofofometrem při 480 nm oproti standardu 690 nm.

Výsledky se vyjádří jako průměrné hodnoty (± směrodatná odchylka) vynesením dávky oproti křivce odezvy. Graficky se znázorní také hodnoty negativní kontroly složené z DH media (průměr ± směrodatná odchylka všech experimentálních dat).

V tomto pokusu vyvolávají sloučeniny podle vynálezu vý znamnou proliferací kmenových buněk myší kostní dřeně. Míra takové odezvy je téměř stejná s mírou vyvolanou E.coli LPS, avšak minimální koncentrace potřebná k vyvolání významné odezvy j e vyšš í.

Monofosforylováný produkt vyvolává mírnější odezvu než difosforylováný produkt. Obr.

znázorňuje reprezentat i vn í pokus odvozený ze souboru tří nezávislých studií provedených na odlišných buněčných přípravcích.

3. Stanovení produkce oxidu dusíku v supernatantních kapali nách itakrofagových kultur.

Způsob

Vdechováním oxidu uhličitého se usmrtí dva myší šest neděl staří samci C57/BL6 a následuje krční dislokace. Myši se promyjí alkoholem a kůže zadních končetin se úplně odstraní. Přerušením kloubů se vyjmou pánevní, stehenní a holenní kosti. Skalpelem se odstraní maso. Kosti se očistí a konce kostí se ustřihnou nůžkami. Kostní dřeň se extrahuje z dříků kostí trojnásobným i afektováním ml modifikovaného media Dulbecco

Eagle (DH-medium) do dříku kostí. Buňky se resuspenduj í v DH mediu a odstřeďují se 5 minut při 300 x g. Supernatant se vy • tik hodí a kmenové buňky se resuspendují v DH mediu doplněném 20 % koňského séra (HS) a 30 % L929 supernatantu kultury při husto tě 40 000 bunek/ml. L929 je fibroblaslová myší buněčná linie, jejíž supernatantová kapalina je bohatá na makrofág (M-CSF) růstového faktoru. Buněčná suspense se rozdělí na podíly po 12 ml v Petři miskách, které se inkubují osm dní v inkubátoru při tepiobě

C v prostředí _ ů> _ . _ j _j . . ..t_ ___ čir 4 —

O /0 U/í ÍUU U1U lUi LCliU p£ 1 1 V'9 L &

1at i vn í vlhkosti. Po osmi dnech se kmenové buňky rozdělí na dospě1é makrofágové buňky.

Makrofágové buňky se seškrabou po inkubací 45 minut při teplotě 4 C do studeného pufru ΡΒΞ.

Po odstředění a odstranění supernatantu se buňky resusependuji v DH mediu doplněni 5 % zárodečného telecího séra (FCS), glu taminem, asparaginem, argininem, kyselinou folovou, merkapto ethanolem a antibiotiky (pěnici 11inem a streptoiycinem) . Kmenové buňky se shromáždí a jejich hustota se upraví na 700 000 buněk/m1.

Produkty, rozpuštěné napřed v DH mediu doplněném FCS, aminokyselinami a antibiotiky, se sériově nářečí přímo v 96-důlkových mikrotitračních destičkách. Za použití součinitele zředění 3,16 se připraví 9 až 10 zředění v závislosti na produktech. Produkty se testují třikrát a každá mikrotitrační destička obsahuje negativní kontrolu obsahující plné medium. Konečný objem v každém důlku je 100 pl. Mikrotitrační destičky se inkubují 1 hodinu v inkubátoru při teplotě 37 C v prostředí s 8 % oxidu uhličitého při 100% relativní vlhkosti k pufrování media. Po jedné hodině se do produktu přidá 100 ju 1 buněčné suspense a inkubace se prodlouží na 22 hodin.

Po 22 hodinách se mikrotitrové destičky odstředí 5 minut při 400 x g a odsaje se 100 til supernatantové kapaliny a převede se do mikrotitrové destičky. Do každého důlu se přidá ÍOO til Griessova činidla [5 mg/ml sulfani 1amidu + 0,5 mg/ml N-Cl-naftyIethy1endiamin)hydrochloridu ve 2,5% vodné fosforečné kyselině], Mikrotitrové destičky se odečtou spektrofotometrem • · ·· při vlnové délce 562 nm oproti referenční vlnové délce 690 nm. Koncentrace nitritu je úměrná obsahu oxidu dusíku. Obsah nitritu se stanoví pomocí standardní křivky, která vyjadřuje lineární závislost v rozsahu 1 až 25 μΜ.

Výsledky jsou vyjádřeny jako průměr ± směrodatná odchylka i___i______ _ x z. „ í ί-’Ο utsii á i v Z ii^yativiii ΛυηυΓνίι/

Při tomto pokusu vyvolávají sloučeniny podle vynálezu produkci oxidu dusíku myšími makrofagovým i buňkami způsobem konsistentním s křivkou závislosti dávky na odezvě. Difosfory1 ováný produkt vyvolává proliferaci ve značně větší míře než odezvy odezvu duktem

LPS, avšak koncentrace potřebná k vyvolání významné je ve vyšší. Monofosforylovaný produkt vyvolává srovnání s

E coli LPS.

pokus odvozený ze 3 m í mě j š í odezvou vyvolávanou difosforylovaným proNa obr. 2 nezávi s1ých je znázorněn reprezentativní měření na různých buněčných př í pravc i ch.

4. Stanovení schopnosti sloučenin podle vynálezu vyvolat produkci cř-TNF lidskými alveolovými makrofágovými buňkami

Způsob

Příprava alveolových makrofagových buněk Lidské alveolové makrofágové buňky se získají bronchoalveolovým proplachem <BAL) plic pacientů trpících rakovinou plic. BAL se provádí bezprostředně po chirurgickém zákroku plicní tkáně včetně zdravé části plicního laloku. Proplachuje se 0,8¾ roztokem chloridu sodného pomocí 50 ml injekční stříkačky. Získané buňky tvoři z 85¾ makrofágové buňky a většinou ostatních buněk

jsou lymfocyty. Po	odstředění se buňky suspendují v mediu RPMI
a červené krvinky	se odstraní odstředěním na zařízení Fi co 11
Pack (pro výzkum).	Makrofágové buňky se promyjí třikrát HBSS a

naočkují se do 24-důlkových mikroti Irových destiček v množství 1 ml na důlek obsahující celkem 1 000 000 buněk. Po jed0 nohhodinové inkubaci při teplotě 37 C výsledné makrofagové buňky ulpějí a důlky se promyjí třikrát 1 ml HBSS k odstranění neulpělých buněk. Po promývací operaci se do každého důlku, obsahujícího makrofágové buňky, přidá 1 ml RPMI.

Inkubace produkty a zkouška c-TNF: Alveolové makrofágové buňo ky se inkubují při teplotě 37 C v prostředí obsahujícím 5 % oxidu uhličitého v přítomnosti 0,1 jug/ml, 1 yg/ml a 10 lug/ral následujících produktů^:

- negativní kontroly: RPMI,

- positivní kontroly: E.coli LPS (serotyp 05:B5,Difco,Detroit, USA) ,

- monofosfory1ováné sloučeniny podle vynálezu (0M-294-MP),

- difosforylované sloučeniny podle vynálezu (OM-294-DP).

Kultivační supernatanty se získají po 24 hodinách a analyzují se na obsah α-TNF (BioSource CyLoscreen Kit, Camarillo, CA, USA) s citlivostí 1 pg/ml.

Výsledky

Monofosforylované a difosforylované deriváty podle vynálezu vyvolávají mírnou produkci o(-TNF v koncentracích tak malých, jako je 10 jug/ml . Monofosfory 1 ováné deriváty podle vynálezu vyvolávají produkci cí-TNF ve větší míře než difosforylované. Positivní kontrola LPS vyvolává ve všech třech testovaných koncentracích vysokou produkci of-TNF. Výsledky jsou v babul ce (a).

Tabulka (a) Vyvolávání produkce d-TNF sloučeninami 0M-294-MP a 0M-294-DP v lidských alveolových makrofágových buňkách tf-TNF [pg/ml] průměr ± směrodatná odchylka ze 3 nezávislých pokusů

Produkt 0 jig/ml	0, 1 jjg/ml	1 jig/ml	10 jjg/ml
negativní kontrola RPMI 195+70
pozitivní kontrol a ' E. col i LPS	7667+115	9858+2148	10390+3415
0Ϊ1-294-ΜΡ-1	246±38	353+75	1049±295
0M-294-MP-2	205+62	291+70	1124+406
0M-294-DP-1	156+66	117+85	329+141
0M-294-DP-2	17 + 79	88 + 61
5. Stanovení kapacity sloučenin podle	vynmálezu	k inhíb i c i

produkce ot-TNF v lidských alveolových makrofágových buňkách.

v odezvě na E.coli Lipopo1ysacharidu (LPS)

Způsob

Příprava alveolových makrofágových buněk: Lidské alveo lově Bakrofágové buňky se získají bronchoalveolovým proplachem (BAL) plic pacientů trpících rakovinou plic. BAL se provádí bezprostředně po chirurgickém zákroku plicní tkáně včetně zdravé části plicního laloku. Proplachuje se 0,8% roztokem chloridu sodného pomocí 50 ml injekční stříkačky. Získané buň49

ky tvoří z 85 K makrofágové buňky a většinou ostatních buněk jsou lyafocyty. Po odstředění se buňky suspendují v mediu RPMI a červené krvinky se odstraní odstředěním na zařízení Ficoll Pack (pro výzkum). Hakrofágové buňky se promyjí třikrát HBSS a naočkují se do 24-dálkových mikrotitračních destiček v míře 1 ml na důlek obsahující celkem 1 000000 buněk. Inkubuje se po a dotiLl j čr dné hudí iiZ j-'i. i vtf fl-jtě 37 C, výsledné makrufáyuvé buňky ulpějí a důlky se promyjí třikrát 1 ml HBSS k odstranění neulpělých buněk. Po promývací operací se do každého důlku, obsahujícího makrofagové buňky, přidá 1 ml RPMI.

Inkubace s produkty a zkouška ot-TNF^: Alveolové makrofagové a

buňky se inkubují při teplotě 37 C v prostředí obsahujícím 5 % oxidu uhličitého v přítomností E.coli LPS (05 = B5 serotyp Difco, Detroit, Sp. st. a.), při 1 mg/ml, do kterého se současně přidají následující produkty o koncentraci 10 jjg/ml:

- negativní kontrola^: RPMI,

- monofosforylovaná sloučenina podle vynálezu í 0M-294-Γ1Ρ) ,

- di fosfory1 ováná sloučenina podle vynálezu (0M-294-DP) .

Kultivační supernatanty se získají po 24 hodinách a analyzují se na obsah tí-TNF (BioSource Cytoscresn Kit, Camarillo, CA, Sp. st. a.) s citlivosti 1 pg/ml.

Výs1edky

Di fosfory1ováný derivát <r-TNF normálně vyvolávanou částečně inhibuje produkci podle vynálezu inhibuje produkci

LPS. Monofosforylováný derivát oí-TNF vyvolávanou LPS. Výsledky testu jsou uvedeny v tabulce (a).

- 50 ·· ♦··· ·· • · · · • ·♦♦ · · • · · · ·	• ·· • · · · ·« • · · « • · * · · • · ♦ ·· · · · ami 0M-294-MP a buňkách
Tabulka ( a) Inhibice produkce ct-TNF vyvolané OM-294-DP v lidských alveolových	LPS sloučenin makrof ágových
Produkt	oí-TNF [pg/ml]	% i nh ibi ce
RPMI (negativní kontrola)	73	-
E.coli LPS (lOjjg/ml) (positivní kontrola)	8470	0
OM-294-MP-1 (lOpg/ml) E.coli LPS (l/ag/ml)	4577	44
0M-294-MP-2 (lOjug/ml) E.coli LPS i mg/ ml)	4789	41
0M-294-DP-Í (lOjug/ml) E.coli LPS (lpg/ml)	1267	84
0M-294-DP-2 (10yg/ml) E.coli LPS tlyg/ml)	1280	84

6. Účinek produktů OH-294-HP a 0M-294-DP na denritické zrání molekul

Vyhodnocuje se schopnost produktů 0M-294-MP a 0M294-DP vyvolávat zrání predendritických buněk na dendritické buňky. Měří se následující parametry: Začleňování konjugátu FITC-Dextranu a exprese povrchových markérů CD40, CD80, CD83, CD86.

Způsob

Buňky: Isolují se mononuk1eované buňky periferální krve z povlaku bílých krvinek šesti zdravých dárců krve. Dárci ne-

prodělávají žádné ošetření před odběrem krve.

Příprava buněk;

Monocyty vyčištěné ulpivací selekcí se resuspenduj í v mediu RPMI-1640 ( S i gaia-Aldr ich St. Loui s, HO, Sp. st. a.) obsahujícím 10 % zárodečného telecího séra, GM-CSF (10 ng/íil, IM-HGMI, Iramungenex Cor-p., Los Angeles, CA, Sp. st. a.) a IL-4 (1O ng/ml, č. 204 IL, R&D Systém, říinneapolis, MN, Sp. st. a.) při hustotě lxl0^& buněk/ml a rozdělí se do Petriho misek o průměru 10 cm (P1O, Falcon, Becton, Dickinson, Plymouth, UK) (10xl0⁶ buněk na misku P10) a kultivují se 6 dní (s výměnou čerstvého media po třech dnech). TyLo buňky se označují jako predendritické buňky (DC-6). Zrání predendritických buněk na dendritické se dosahuje inkubací buněk 0M-294-MP a OM-294-DP a LPS po tři další dny při koncentracích nastavených pod Product section. Devátého dne (DC-9) se buňky shromáždí a analyzují se za použití různých indikátorů zralosti dendritických buněk^: posuzují se povrchové markéry CD40, CD8O, CD83, CD86 i z hlediska jejich schopnosti odstraňovat konjugát F1TC-Dextran. Všechny tyto parametry se analyzují za použití přístroje EPICS-XL-MCL model FACS (Counter Immunology, Hialeah. Finsko) (Lanzavecchi a a kol., J. Exp. Med. 179, str. 1109, (1994), Lanzavecchia a kol., J. Exp. Med. 182, str. 389 (1995).

Analysa dat;

Exprese povrchových markérů se vyjadřuje procentem střední fluorescence buněk stimulovaných LPS (pozitivní kontrola). Odstranění konjugátu FITC-Dextran se vypočítá s ohledem na rychlost odstranění buněk udržovaných v zásaditém prostředí a vyjadřuje se v procentech. Statistická analýza Studentovým t- testem zahrnuje porovnání dat získaných z různých testů s daty pozitivní kontroly. Míra významnosti dat je stanovena př i p < O, 05.

Produkty

Zásobní roztoky 0M-294-MP a 0M-294-DP se připraví v koncentrací 1 mg/ml v 0,9% vodném roztoku chloridu sodného, v případě 0M-294-MP s přísadou O, 1 % tríethylaminu. Roztoky se ínkubují 20 minut při teplotě 37 C za intenzivního míchání po dobu tří minut, zředí se na 100 ug/ml v kultivačním mediu RPMI-1Ó4O a používají se buď v koncentraci 10 mg? ml (obr. 3, 6, 7, 8) nebo v koncentracích od 0,02 do 25 pg/ml (obr. 4, 5) .

Referenční produkt:

Lipopolysacharid E.coli (LPS, DIFCO, Detroit, MI, Sp. st. a.) jako zásobní roztok 5 mg/ml v PBS. Připraví se jako meziprodukt roztok 100 pg/ml v kultivačním mediu RPMI 1640. Koncentrace k testování jsou buď 10 pg/ml (obr. 3, 6, 7, 8) nebo v koncentracích 0,02 až 10 jig/ml (obr. 4, 5) .

Výsledky

Nedozrálé dendritické buňky (DC-6) pocházející z diferenciace monocytů, spojovacím působením GM-CSF a IL-4, jsou schopny začleňovat konjugát FIFC-Dextran. Během zrání buňky ztrácejí schopnost začleňovat konjugát FIFC-Dextran. Analýzy se provádějí po dosažení diferenciačního stavu DC-9.

Výsledky se vyjadřují v procentech začlenění konjugátu FITC-Dextran pozorovaného v nést i mul ováných buňkách (základní medium) (obr. 3). Buňky zpracované LPS nebo 0M 294-MP si uchovají pouze 10 % nebo 0M-294-MP pouze 19% své fagocytové kapacity, zatímco buňky stimulované 0M-294-DP si uchovají plně svou schopnost začleňovat konjugát FITC-Dextran (98 až 99 %). Křivka závislosti odezvy na dávce naznačuje, že 0M-294-MP má vynikající kapacitu k vyvolávání diferenciace buněk DC-6 do DC-9 pří koncentracích od 0,02 ug/ml do 25 jjg/ml (obr. 4), přičemž byly testovány nízké koncentrace a obr. 5 pro testová- 53 ·· *··· · · • · · · · · ·>>

• ··· · · ·· ♦

Φ Φ ΦΦ ·

ΦΦ ··««Φ ní vyšší koncentrace.

Jiným kritériem k posouzení zralosti DC je exprese spolu stimulujících povrchových markérů. Testuje se exprese CD40, CD 30, CD83 a CD36. Výsledky jsou vyjádřeny v procentech průměrné fluorescence založené na expresi těchto markérů vyvolané LPS.

OM-294-MP zvyšuje expresi všech testovaných povrchových markérů: CD40(39%), CD80(62%), CD83(60%), CD86(77%) (obr. 6, 7, 8, 9) .

0M-294-DP vykonává podobný účinek jako základní kultivační medium na expresi zkoumaných markérů. Tento efekt nepřesahuje 20 % účinku LPS.

7. Účinek produktů 0M-294-MP a 0M-294-DP na produkci oc-TNF a IL-12p70 monocytů a predendritických buněk při stavu DC-6

Buňky DC-6 (5x10^/500 μΐ media) se stimulují během 4 hodin, 6 hodin a 24 hodin buď LPS (10 jjg/ml) nebo 0M-294-MP (10 ug/ml) a nebo 0M-294-DP (10yg/ml).

Způsob

Podmínky experimentů in vivo^; Získají se mononuk1eové buňky periferní krve z povlaku bílých krvinek šesti zdravých dárců krve (před odběren krve dárci neprodělali žádné léčení). Monocyty se izolují na gradientu Ficoll, načež se čistí ulpívací selekcí. Volně ulpělé buňky se shromáždí a jedna frakce buněk se uloží jako monocyty. Vyčištěné monocyty se resuspenduj í do media DPMI-1640 obsahujícího 10 % FCS v míře IxlO⁶ buněk/ml a rozdělí se do Petři misek o průměru 10 cm (P10, Falcon, Becton, Dickinson,

PÍymouth,

UK) měrou

10x10⁶ buněk na misku P10. Buňky se kultivují šest dní v plném mediu RPMI 1640 obsahujícím GM-CSF (10 ng/ml) a XL-4 (10 ng/ml)

Šestého dne

se buňky shromáždí, promyji se HBSS a naočkují se do 24-důlkové destičky v hustotě 5x10⁵ buněk/důlek v 500 jjl plného media RPMI a stimulují se LPS (10 ng/ml), 0M-294-MP (10 ng/ml) nebo 0M-294-DP (10 ng/ml). Postupem ELISA se zkoumají jak ď-TNF tak IL-12p70 v supernatantech kultury, jež se zpětně získají po 4, 6a 24 hodinách.

Produkty:

Produkty 0M-294-MP a 0M-294-DP (1 mg/ml zásobního roztoku

D ve sterilní vodě) se inkubují 20 minut při teplotě 37 C a mícha j í se intenzivně 3 minuty, načež se zředí na 100 mg/ml a použijí se v konečné koncentraci 10 pg/ml v kultivačním mediu RPMI 1640.

Referenční produkt^:

Lipopolysacharidy E.coli (LPS, DIFCO, Detroit, MI, Sp. st. a.), zásobní ro2tok 5 mg/ml v PBS, jako meziprodukt, roztok 100 ng/ml v kultivačním mediu^: 100 n9/ml, použitý v konečné koncentraci 10 ng/fól.

Test cí-TNF a IL-12p70=

Podle dodavatelovy instrukční příručky se soupravou oí-TNF KHC3012 kit společnosti Biosource, batch # PP003-J061703 (Biosource Internát ional , Camarillo, CA, Sp. st. a.) ELISA se provede zkouška IL12p70 v kultivačních supernatantech způsobem ELISA za pomoci lidské OL-12 kit <č. Dl200, dávka 990 6232,R&D Systém, Minneapolis, MN, Sp. st. a.).

Výs1edky oí-TNF

0M-294-MP stimuluje produkci αί-THF buňkami DC-6 podobným způsobem jako LPS, jak z hlediska časového průběhu produkce tak z hlediska koncentrace oí-TNF (obr. 10) . U obou produktů je vrchol ot-TNF mezi 6 až 24 hodinami. 0M-294-DP má pouze malý

stimulační účinek na produkci ct-TNF buňkami DC-6.

IL-12p70

Obecně platí, že IL-12 se vyvolá v přítomnosti gafflalFN (LPS + gama INF, 0M-294-MP + gama IFN) v monocytech (obr. 12) a v buňkách DC-6 (obr. 11). Nástup produkce cytokinu je dřívější v DC než v monocytech.

8. Vyhodnocení vlastností adjuvantů 0M-294-Í1P a 0M-294-DP v myším imunizačním modelu se syntetickým peptidem (Pb CS Hisa -242-310) C-terminálové oblasti cirkumsporozoitového povrchového proteinu Plasmodium berghei

Způsob

Ant i gen^:

Peptid Pb CS (HHHHHHGGMN NKNNNNDDSY IPSAEKILEFVKQIRDSITE EWSQCNVTCG SGIRVRKRKRG SNKKAEDLTL EDIDTEI dále nazývaný Dise>-242-310 odpovídající sekvenci aminokyselin 242-310 cirkumsporozoitového kmene ANKA povrchového proteinu Plasmodiua berghei plus N-terminálový úsek 6-histidinu, 2-cyklinu a jednoho methioninového zbytku se získá způsobem, který popsali Merrifield a Athenon (Athenon a kol., Bioorg. Chem. 8, str. 350 až 351, 1979). Polypeptid se připraví na p-alkoxybenzylalkoholové pryskyřici (Wangova pryskyřice) mající stupeň substituce 0,4 mmol/g. Při době kopulace 30 minut se použije 10-násobného molárního přebytku derivátů F-moc aminokyselin. Peptid se čistí chromatografii vylučující velikost (Sephadex G25, Pharmacia, Sveden), pak reversní fázovou chromatografii (W-Porex 5 C-4,

250x10 mm, Phenomenex, Torrance. CA, Sp. st. a.) za použití 40-min gradientu směsi objemově 10 až 50 % aceton itri 1/0, 1 % trif1uoroctové kyseliny při průtočné rychlosti 3 ml/min.

Složení aminokyselin peptidu se určí způsobem Knecht a Chang tAnnal. Chem. 58, str. 2373 až 2379, 1986) a molekulová

hmotnost se určí hmotovou spektrometrií za použití přístroje model Voyager DE ÍPerspective Biosystem, Framingham, MA, Sp. st. a.). Zásobní roztok antigenu se připraví o koncentraci 0,4 mg/ml v systému 0,9 % chloridu sodného/voda při hodnotě pH 8,0.

Adj uvanty:

Zásobní roztoky 0H-294-ĎP a 0ií-294-říP se připraví o kon centrací 1 mg/ml v 0,9% vodném roztoku chloridu sodného se začleněním 0.1 % triethylaminu pro 0M-294-MP. Pozitivní kontrolou je neúplný Freundův adjuvant ( IFA od Difco, Detroit, MI, Sp. st. a.), negativní kontrolou je 0,9% roztok chloridu sodného .

Směs antigen-adjuvant:

Jeden objem antigenu a jeden objem adjuvantu se tři minuty vířivě míchá.

Imunizačni režimy;

týdnů staré myší samice BALB/c (6 myší ve skupině) se imunizují třikrát, subkutánním injektováním do konce ocasu 0,1 ml následujících směsí:

Skupina Adjuvant Antigen Počet myší

0,05 mg/injekce 0,02 mg/injekce

-	1	-	PbCS Hi se, - 242-310	6
	2	IFA	PbCS Hise-242-310	6
1*	3	0Μ-294-Ϊ1Ρ	PbCS Hise-242-310	6
	4	011-294-DP	PbCS Hise-242-310	6
	5	0Μ-294-Ϊ1Ρ	-	6
	6	0H-294-DP	-	6

Imunizační a odběrová tabulka

Týdny 0	3	4	7	9
Imunizace f	t		t
Specifická odezva na protilátky γ	t		Ť	Ť
Odezva CTL		4 1		4 t

Odběr vzorku oymfoidniho orgánu a krve:

Odběr séra^:

Odběr krve se koná v týdnech O, 3, 7a 9. Krev se nechá c

ustát šest minut při teplotě 37 C a pak se nechá stát přes o ° noc při teplotě 4 C. Sérum se zmrazí na teplotu -80 C až do zkoušky prot i 1átky.

Získání tříselných lymfatických U21in a sleziny:

Část z každé skupiny zvířat se po 4 nebo 9 týdnech usmrtí a chirurgicky se odejmou lymfatické uzliny z třísel a slezina.

Stanovení proti 1átkového ti tru anti -PbCSHis&242- 310

Zkouška protilátek, specificky zaměřená na antigen PbCSHiS6242-310, se provádí způsobem ELISA. Vazba antigenu se provádí v mikrotitračnich 96-dulkových destičkách (Maxisorp F96, Nunc, DK) inkubací přes noc ve vlhké komoře při teplotě 4 ’c v každém důlku obsahujícím 0,1 ml PBS (fosfátem pufrovaná solanka) obsahujícím 0,001 mg/ml antigenu PbCSHi se.242-310 . Blokování mikrotitrační destičky se provádí PBS obsahujícím 1 % albuminu hovězího séra (ESA, Fluka, Švýcarsko). Destičky se omyjí PBS obsahujícím 0,05 % Tweenu 20 (Sigma, St. Louis, M0, Sp. st. a.). Vzorky séra, shromážděné v týdnu 0, 3, 7 a 9, se sériově zředí ředicím pufrem <PBS obsahující 2,5 % prášku sbíraného mléka a 0,05 % Tweenu 20) a přenesou se do mikrotitrační destičky a nechají se stát jednu hodinu při teplotě místnosti. Destičky se pak omyjí PBS a vnese se do nich zředěný roztok obsahující myší polyklonální aniimunoglobulin napojený

na alkalickou fosfabázu (Sigma, St. Louis, MO, Sp. st , a.) a inkubují se jednu hodinu při teplotě místnosti. Destičky se omyjí PBS a specifické protilátky se vyvolají barevnou reakcí přidáním substrátu alkalické fosfatázy, p-nitrofenylfosfátu (Sigma, St. Louis, MO, Sp. st. a.). Absorbance při 405 nm se odečte čítačem mikrotitrační destičky (Dynatech 25000 ELISA reader, Asnford, Middlesex, UK), každý vzorek séra se měří dvakrát. Výsledky jsou průměrem měření se zřetelem na myši každé skupiny. Proti látkový titr je dán nej vyšším zředěním dávajícím významně pozitivní odezvu, tedy OD větší než je úroveň šumu ±3D.

Zkouška ELISPOT

Protilátky, specificky zaměřené na myší gama-interferon c

(O1E703B2), jsou vázány inkubací přes noc při teplotě 4 C ve vlhké komoře, přidáním proti Iátkového roztoku při 50 Lig/ml v mikrotitrační destičce ELISPOT, kde dno důlku je pokryto nitrorocelulózou (Millipore, Molsheim, Francie). Blokování se provede přidáním media DMEM (Life Technologies, Grand Island, NY, Sp. st. a.) obsahujícího 10 % zárodečného telecího séra (FCS, Fakola, Švýcarsko) a dvouhodinovým ustátím při teplotě 37 C. Buňky, získané z lymfatických orgánů (z tříseln>>ch lymfatických uzlin a ze sleziny) se kultivují v mikrotitračních destičkách při hustotě 200 000 buněk/důlek, se společně kultivují se 100 OOO buněk P815 po dobu 24 hodin při teplotě 37 C popřípadě v soutěži s krátkým peptídem PbCS 245 až 252. Po inkubaci se buňky vyjmou a po promytí se přidá druhý myší anti-gamalFN proti 1átkový-bioti nový komplex (ANI, 2 Mg/ml v PBS s 1 % BSA) a inkubuje se dvě hodiny. Přidá se streptavidin alkalický fosfatázový kcmjugát (Boehringer Mannheim, Mannheim, Německo) a inkubuje se jednu hodinu při teplotě 37 C, provede se trojí promytí PBS obsahujícím 0,05 % Tweenu 20, následované trojím promytím PBS. Přátomnost anti-gama IFN imunitních komplexů se demonstruje přidáním substrátu BCIP/NBT (Sigma, St. Louis, M0, Sp. st. a.). Tato reakce se ukončí promytím vo-

dou z vodovodu. Místa, která jsou pozitivní na gama IFN, se pod stereomikroskopem odečtou. Specifický počet skvrn je rozdílem mezi skvranmi odečtenými v přítomnosati buněk soutěžících s peptidem a skvrnami odečtenými v nepřitomnosati peptidu. Výsledky jsou střední hodnoty měření, zaznamenané pro myši každé skupiny. Jsou vyjádřeny jako počet skvrn na milion kultivovanych krevních buněk.

Výsledky

Proti látková odezva^:

Produkce protilátek, specificky zaměřených na PbCSHis&-242-310, zjištěná způsobem ELISA, je graficky znázorněna pro myši, kterým byly podány jedna, dvě a tři imunizační dávky. Kontrola zahrnuje jedinou dávku samotného antigenu a výsledky velmi slabého proti 1 útkového Litru. Proti 1átkový titr s jednou samotnou dávkou antigenu ve směsi s 0M-294-MP nebo případně 0M-294-DP je téměř tak vysoký jako odezva pozorovaná při neúplném Freundově Adjuvantu ( IFA) ve směsi s týmž antigenem (obr. 13). Po dvou dávkách 0M-294-MP a 0M-294-DP jsou adjuvanty schopny vyvolat šerologickou odezvu, která je případně větší než odezva IFA (obr. 14). Po třech dávkách jsou schopny adjuvanty 0M-294-MP a 0M-294-DP vyvolat serologíckou odezvu, která je vyšší ež odezva IFA (obr. 15).

Obr. 13 ELISA 3 týdny po první imunizační dávce.

Obr. 14 ELISA 4 týdny po druhé imunizační dávce.

Obr. 15 ELISA 2 týdny po třetí imunizační dávce.

Obr. 16 Proti látkový Litr naměřený před a po první, po druhé a po třetí imunizační dávce.

Proti látkové Litry zvířat v každé skupině před imunizační dávkou a po jedné, dvou a třech imunizačních dávkách jsou uvedeny jako průměrné hodnoty (obr. 16).

Odezva CTL ^:

Zjištění epitopu T-buněk PbCS 245-252 obsaženého

v PbCSHisó- 242- 310 shora použitého pro imunizaci je dobře předvedeno testem ELISPOT, Odezva T-lymfocytů zaznamenaná u imunizovaných zvířat (tříselné lymfatické uzliny a slezina, získané jeden týden po druhé dávce a popřípadě dva týdny po třetí dávce) je doložena nárůstem pozitivního počtu dávek pro gama interferon (gama IFN). Výsledky uvedené na obr. 17, 18, 19 a 20 jsou vypočteny jako prumemá hodnota měření , dosažena každým zředěním a pro myši každé skupiny. Jsou vyjádřeny počtem dávek na milion buněk v kultuře.

Výsledky obou adjuvantů 0M-294-MP a 0M-294-DP znamenají velmi významný nárůst odezvy CTL lymfocytů odvozených ze sleziny a tříselných lymfatických uzlin. Odezvy sleziny jsou vyšší než odezvy tříselných lymfatických uzlin. Aktivita CTL, vyvolaná adjuvanty 0M-294-MP a OM-294-DP je zřetelně nadřazena aktivitě vyvolané IFA.

9. Důkaz neková 1entních komplexů antigenu 0M-294 kapilární elektroforézou

K prokázání nekovalentního vytváření komplexu 0M-294-DP a peptidu PbCSHise-242-310 během přípravy vakciny se použije kapilární e1ektroforézy.

Způsob

Arialysa^: Pufr 20 mM borátu sodného (di sod iumtetraborátdekahydrát, Měrek, č. 6306) se nastaví na hodnotu pH 7,4 IN roztokem hydroxidu sodného (Fluka č. 72072).

Kapilární (neroubovaná) trubice, rozdělená po zónách, délka 30 cía, průměr 50 pm. Detekce se provádí při 200 nm ze použití přístroje Beckman PÁCE MDQ (Beckinan, Brea, CA, Sp. st . a . ) .

Podmínky separace:

Čas [min.1	Proces	Tlak	Rozpouštědlo
0, 00	kapilární proplach	138 kPa	voda
3,00	kapilární proplach	138 kPa	IN NaOH
6,00	injektáž vzorku	3,45 kPa	borátový pufr
6, 08	separace	30,0 KV	borátový pufr

ftntigeny: PbCSHisa-242-310 syntetický peptid při 1 mg/ml HaO Adjuvant; 0M-294-DP při 1 mg/ml v H2O

Směs antigenu a adj uvantu: 250 Lig/ml + 250 pg/ml

VýsIedky

Vytváření komplexu antigen-adjuvant je patrno při přípravě tohoto vakcinového prostředku na diagramu elektroforézy vymizením adjuvantového vrcholu a posunem antigenového vrcholu za vzniku nového vrcholu, který je specifický pro nově vytvořený komplex (obr. 21).

10. Ošetřování peritoneální rakoviny vyvolané inkjekcí buněk odvozených ze syngenické nádorové linie PROb krys BDIX

Tento experiment má dokázat proti nádorové působení 0M-294-DP, podávaného v sériích, například injektováním krysám majícím makroskopické nádory o velikosti několik milimetrů.

Způsob

Zvi fata

Kmen In-bred krys ΒΏΙΧ ustavil H. Druckrey v roce 1937. Párek krys z Max Planckova Institutu ve Fribourgu. ( FRA) byl počátečním zdrojem této kolonie, která byla udržována od roku 1971 systémem jediné linie v domove laboratorních zvířat. Pod

Ie tohoto systému se vyčlení jediný pár sestra-bratr ke k získání potomstva následující generace. Krysy použité při této práci jsou z ústavu Experimental Animal Breeding Center v Iffa-Credo ÍArbresle, Francie), který pokračoval v chovu za pomoci přihlasovate1ovy laboratoře. Použitými krysami jsou samci staří 3 měsíce ± 1 týden.

Vyvolání nádoru injektováním PROb

Původ buněk PROb

Napřed se odvodila buněčná linie DHD/K12z roubu kare i nomového fragmentu tlustého střeva v kryse in-bred BDIX ošetřením 1,2-dimethyIhydrazinem. Tato linie ulpělých buněk se rozdělila do dvou podskupin podle jejich citlivosti na ošetření trypsinem a buňky, které nebylo možno snadno oddělit, se nazvaly DHD/K12-TR. Když byly buňky DHD7K12-TR injektovány do syngenických DBIX krys, vyvolaly trvale se vyvíjející nádory. Tato linie byla klonována a v tomto výzkumu bylo použito pouze klonu DHD/K-12-TRb, nazvaného PROb.

Kultivační podmínky; Ulpělé buňky PROb se pěstovaly v uzavřených lahvích (Falcon, Becton, Dickinson, New Jersey, e

Sp. st. a.) pří teplotě 37 C v plném mediu pocházejícím z Hamova media F10 CBio-Whittaker, Walkersvi1le, Sp. st. a.), do kterého bylo přidáno 10 % zárodečného telecího séra (FCS, Anval, Betton, Francie). Kultivační medium se vyměňovalo každé tři dny. Po slinutí, se buňky uvolnily nebo seškrabaly během tří až pěti minut z podložky 2 ml roztokem EDTA/trypsin, následovaly tři oplaďny 2 ml téhož roztoku během dvou až tří minut, buňky se resuspendovaly do plného media s přísadou FCS k ukončení trypsinové reakce. Nepřítomnost znečištění v buňkách mykoplasmovéhc a bakteriálního původu se kontrolovala v pravidelných intervalech vybarvením DNA Hoechstovým fluorochromem 33258 (Aldrich Chimíe, SLeiheim, Německo).

Zavedení per itoneálni ho karcinomu:

Objem shluků a změna hmotnosti zvířat^:

Objem shluků se měří dvojnásobným vážením zvířat. Skupina kontrolních neléčených krys, kterým byl injektován pouze 0,9% roztok chloridu sodného, umožňuje posuzovat normální vývoj karcinomu a sledovat léčbu.

Posuzování účinnosti léčby^:

Míra přežití krys v léčené skupině se porovnává s mírou přežit í kontrolních skupin.

Objemy karcinomů a shluků léčených krys se porovnává)í s měřeními krys v kontrolní skupině.

Statistická analýza:

Statistická významnost účinků imunoterapie se stanoví pomocí Kruska11 -Wa11 i sova testu ke klasifikování karcinomů. Podobně se provádí variační analyzový test pro data objemu shluků a dlouhodobý test se provádí u přeživších krys.

Výsledky

Karcinomy: v tomto modelu prokázal 0M-294-DF pozoruhodnou proti nádorovou aktivitu. Tato aktivita je podrobněji vyjádřena počtem zvířat bez nádoru (třída 0) a dále je rozdíl oproti

kontrole s ru. Dopad (P<0,05).	chloridem sodným léčení 0M-294-DP	významný Cp<O,O5)	pro objem nádo také významný
Ud	objem shluků je
Léčba Počsi krys s	rakovinou Účinek pro- Objel	shluku	Účinek
pal říci dli do	třídy středku íx) v íl/krysu	produktu i™)

C 1 2 3 4	rozsah průlěr to
ílaCl*»* 10 10 7	0-84 38*29
0Κ-294·0Ρί2! 41212	p(íl,05 0-?3 £+23 p<0,05

( * ) ^;Kruskal1 -Wa11 i sův test, ( χ χ) Varlační ana1ýza

C¹)^ až 10 krys uhynulo na rakovinu před zabitím, 1 krysa při

D34 vykázala uzliny a žloutenku, nebylo však možná přesné stanovení tříd (kanibalismus), 1 krysa při D37 patřila do třídy 4, 2 krysy při D38 patřily do třídy 4, jedna při D39 patřila do třídy 4, dvě při D40 patřily do třídy 4a 1 při

D41 patřila do třídy 4. Jedna krysa třídy 0 vykázala po rozpárání podkožní nádor, je pravděpodobné, še selhala injekce nádorových buněk.

(²) Jedna krysa při DÍ4 pošla v době první léčebné injekce, další rakovinou netrpěla. Jedna z krys usmrcených v tídě 0 vykázala podkožní nádor (selhala injekce nádorových buněk)

Přež i t í

Zvířata byla usmrcena v den D42. Přežití bylo zjištěno v den 42 po injekci nádorových buněk, 90 % zvířat ošetřených 0M-294-DP přežilo, zatímco u neošetřené skupiny zůstalo naživu pouze 20 % zvířat. Míra přežití krys je významně působením 0M-284-DP rozšířena íp<0,001).

Hmotnost^:

0M-294-DP nemá významný vliv na změny hmotnosti v porovnání se zvířaty ošetřenými pouze samotným roztokem chloridu sodného podle dat uvedených v tabulce (b).

Tabulka (b) Hmotnostní změny krys (střed isměrodatná odchylka)

Dny	NaC 1	OM-294
0	314+19	277±19
13	337+18	310±21
20	342+20	304±23
29	361+23	317+24
41	314+38	327+26

ě>3 *·

Buňky PROb se uvolní ze svého podkladu způsobem popsaným ve statí kultivační podmínky a buňky se odečtou v roztoku trypanové modře jakožto barvicího činidla jako prostředku k posouzení životaschopnosti buněk. Buňky se suspenduj í v Hamově mediu F10. Pod etherovou anestesí se vyvolají pobřišnicové karcinomy intraperitoneální injekcí 10^& buněk PROb u synge niokých krys BDIX, Injekce nádorových buněk se provede desátého dne. Za těchto podmínek se u všech krys vyvine periVoneální karcinom s produkcí krvavých shluků v útrobách a krysy hynou mezí 6. až 12. dnem po injektování buněk.

Léčení per itoneálního karcinomu¹

Ξ léčením se započne 13. dne po injektování nádorových buněk, když se vytvoří karcinomová hmota v uzlinách o průměru několika milimetrů. Léčení spočívá v injektování 1O i.v. injekcí 0M-294-DP v množství 1 mg/kg tělesné hmotnosti a v dáv kách 0,6 mg/ml v 0,9% roztoku chloridu sodného.

Injekce se podávají třikrát za týden (v pondělí, ve středu a v pátek) do pěnilové žíly.

Kontroln í skupina je ošetřována samotným 0,9% roztokem chloridu sodného.

Posouzení účinnosti léčby¹

Dne D42, 6 týdnů po inkjektování nádorových buněk, se krysy usmrtí, rozpářou a rozvoj karcinomu se posuzuje slepou studií. Měření objemu karcinomu není proveditelné, místo toho je možno karcinomy klasifikovat do 4 různých typů.

Podle počtu a průměru kare inomových uzlin se definuje 5 tříd¹ třída O¹ uzliny jsou viditelné třída 1^: uzliny o průměru 0,1 až 0,2 cm lze snadno spočítat třída 2¹ jsou patrny nesčetné uzliny o průměru 0,1 až 0,5 cm třída 3¹ břišní dutina je zamořena uzlinami, z nichž některé mají průměr 1 cm.

třída 4¹ dutina je úplně zamořena nádory o velikosti několika cent i metrů.

11. Vyhodnocení vlastností adjuvantu 0M-294-DP podle úmrtnosti myšího imunizačního modelu nosním podáním podjednotky ureasy B Heliobacter pylori

Ukázalo se, že myši mohou být ochráněny před infekcí

Heliobacter pylori, jsou-li imunizovány podjednotkou ureázy B

Heliobacter pylori ústním adjuvantu na bází cholera nebo nosním podáním v přítomnosti toxinu (CT) (Corthésy-Teulaz I. a kol., Gastroenterology

109, str. 115, 1995); Michetti P

Gastroentero1ogy 116, str.

Gastroentero1ogy 115,

891, 1998). Tato humorální odezva na anti-Ure B, měřená pu lgGl (odezva Th2) .

v séru imunizovaných myší, je hlavně tyHodnoceni adjuvantu 0M-294-DP se provádí u myší BALB/c (n = 6) imunizovaných Čtyřikrát v týdenních inter valech nosním podáním ureázy B podjednotky (UreB) rekombinant ního Heliobacter pylori v přítomnosti 0M-294-DP. BALB/c kon trolní myši byly imunizovány samotným adjuvantem 0M-249-DP. Dva týdny po poslední dávce se od každé myši odebere krev ke stanovení anti-UreB imunog1obul inů způsobem ELISA (totální lgG, lgGl a lgG2a).

Způsob

Zv i řata;

Myši BALB/c/Ola/HsD (Harlarid, Horst, Nizozemsko) 24 myší.

Ant i gen·

HpUreB 1-569, expresovaný jako rekombinantní protein E. coli (kmen M15. Qiagen, Hilden, Německo) shora popsaným způsobem (Michetti P a kol. Gastroenterology 107, str. 1002, 1994).

Adj uvant¹

0M-294-DP (zásobní roztok 2,2 mg/ml).

67*

Imun i zační	řeži my
Čtyř i	skupiny po 6 myších·'
Skupí na A '	6 myší BALB/c se imunizuje čtyřikrát nosním podáním

Mg samotného 0M-294-DP ¢25 μ1 na dávku) jednou týdně po 4 po sobě následující týdny.

Skup i na B:

6 myší BALB/a se imunizuje čtyřikrát nosním podáním

Mg UreB 1-569 + 25 M9 0M-294-DP (25 m! na dávku) jednou

týdně po 4

po sobě následující týdny.

Dva týdny po poslední imunizaci nosem se odebere krev z ocasu každé myši skupiny A a B.

Zkouška na IgG v séru:

Povlékací pufr ( pH 9,6): na 1 litr uhličitanu sodného (15 mM, 1,59 g) . hydrogenuhliČtan sodný (34,8 mM, 2,93 g) , Thimerosal (0,01 %) , pufr PBS-Tween, hodnota pH 7,4^: na 1 litr, chlorid sodný (137 mM, 8,0 g) , dihydrogenfosforečnan draselný (1,5 mM, 0,2 g), hydrogennatri umíosforečnan (8,0 mM, 1,15 g), chlorid draselný (2,7 mM, 0,2 g), Tween 20 (0,1% 1 ml), citrát/ f osf átový pufr, hodnota pH. 5,0^: na 1 litr kyseliny citrónové (44,4 mM, 9,32 g), hydrogendinatriumfosforečnan (103 mM,

14.6 g). roztok substrátu 10x (0-fenyldiamin = OPD) lO-násobná koncentrace)^: (10 mg/ml v citrátovém pufru): roztok azidu sodného: 1%, ukončovací roztok: 0,01 % azidu sodného v citrát/ fosfátovém pufru 0,1 M, pH 5,0.

Způsob:

Př i prav i	se roztok antigenu (zásobní roztok UreB 1-569 při-
pravený 26.	května 1999. 0,5 mg/ml zásobního roztoku) v kon-
cenLraci 5	Mg/ml v povlékacím pufru pH 9,6 (500 m1 roztoku
UreB na 50	ml pufru). Do každého důlku ve třech 96-důlkových
desti čkách	s kulatým dnem se pipetou nakape 100 m! (0,5 yg

UreB na důlek). Destičky se inkubují dvě hodiny při teplotě 37

O

C, Supernatant se z destiček odstraní. Důlky se blokují pří sadou 100 jj.1 systému PBS/0, 1 % roztoku Tween + 5 % práškového

mléka na důlek. Destičky se inkubují 30 minut při teplotě 37 o

C. Blokovací roztok se vyhodí a důlky se promyjí třikrát 100 μΐ roztoku PBS/Tween. Supernantanty se vyhodí. Připraví se roztok 1^200 každého testovaného myšího séra v systému PBS/ 0,1% Tween pufru (5 μ 1 séra v 1 ml PBS/Tween). Séra ( 1 OO μΐ) se rozdělí po dvou do třech destiček (1 destička k detekci celého IgG, 1 destička k detekci lgGl , 1 destička k detekci

O lgG2a). Inkubace proběhne přes noc při teplotě 4 C. Destičky se promyjí třikrát 100 μΐ pufru FBS-Tween. Jednotlivě se připraví roztoky 1:500 na biotin vázané protilátky celkového an ti-lgG ( ňmersham, CattIRPN 1177), protilátky anti-lgGl (Amers ham, CatflRPN 1180) a protilátky anti-IgG2a (Pharmingen Cattt přibližně 02012D) v pufru PBS/Tween. 100 μ 1 roztoku protilátky celkového anti-lgG se přidá do destičky č.l, 100 μΐ roztoku protilátky anti-lgGl se přidá do destičky č.2 a 100 μΐ roztoku protilátky anti-lgG2a se přidá do destičky č. 3. Provede se jednohodinová inkubace při teplotě 37 C. V pufru PBS-Tween se připraví roztok 1 = 1000 streptavidinu-HRP ( Dako , CatíipO397) a 100 μΐ roztoku se přidá do každého důlku. Provede se jednohoa dinová inkubace při teplotě 37 C. Důlky se promyjí třikrát pufrem PBS/Tween. Roztok substrátu se připraví 10-násobným zředěním roztoku OPD (lOx) v 0,1 M citrát/fosfátovém pufru.

Do zředěného roztoku OPD se přidá 1 μΐ peroxidu vodíku. Do každého důlku se přidá 50 μΐ roztoku substrátu. Po dobu 10 až 20 minut se nechá vyvinou zbarvení. Reakce se ukončí přidáním 50 μΐ ukončovacího pufru. Pomocí negativní kontroly jako slepé zkoušky se odečte absorbance při 492 nm (přičemž standardní odečtení je při 620 nm).

Statistická analysa:

Data pro střed ± směrodatná odchylka (n=6) se odvodí ze Studentova t-testu. Úroveň významnosti je při p<0.05.

Výsledky

U předem imunizovaných myší UreB- 1-569 + Ofí-294-DP podaném

nosem se vyvinula anti-UreE humorální imunita :anti-UreB- 1 -569 lgGl je obsažen v krvi.

Přítomnost protilátek specificky zaměřených proti UreB Hp v myším séru se měří způsobem ELISA. UreB (0,5 jj 1 /důlek) se rozdělí do 96-důlkových destiček s kulatým dnem spolu s uhličitanovým pufrem s hodnotou pH 9,6. Specifické protilátky se zjistí pomocí králičích protilátek anti-lgG jako celku, anti-lgGl a anti-lgG2a. Výsledky se udávají jako odečtení optické hustoty (OD) při 492 nm. Hodnoty OD 3x vetší než naměřené hodnoty v séru naivních myší se považují za pozitivní. Žádné protilátky anti-UreB se nenacházejí v séru myší ironizovaných samotným 0M-294-DP. U myší, které byly imunizovány Ure+OM-294•DF se také vyvinuly protilátky celkového UreB 1 gG (OD = 0,274 ± 0,130, p<0,05) a anti-UreB lgGl (OD = 0,212 ± 0,128, p<0,O5) nevyvinuly se však protilátky anti-UreB lgG2a (OD = 0,008 +

0,005, nevýznamné).

U myší BALB/c imunizovaných podjednotkou ureázy B Helíobacter pylori nosním podáním (UreB)+0M-294-DP se vyvinula humorální odezva anti-UreB hlavně typu lgGl. 0M-294-DP může proto působit jako adjuvant při podáváni nosní cestou a podporovat vývoj humorální imunity typu Th2.

12. 0M-294-M a 0M-294-DP v kombinaci s anti genem H1N1 Určení specifických protilátek vypěstovaných v myších po jednom nebo po dvou subkutánních podání

Způsob

Účelem této studie je demonstrovat	adiuvantní úč i nek
0M-294-M a 0M-294-DP na chřipkový antigen	Hltil (262195 A/B
Beíjing haemagglutmin, Solva Duphar, Weesp,	Nizozemsko). Sku-
pí na 60 myší BALB/c (samice staré 8 týdnů na	začátku ošetřová-

ní) se rozdělí do 6 skupin takto:

··

- 70· «

···· »··

Skup i na	1 Antigen konečná koncentrace 2,5 pg na myš/i nj ekci	Adj uvanty konečná koncentrace 50 pg na myš/i njekci	NaCI (0.9%)	Inj ekto~ vaný objem
A : NaCI	-		150 μΙ	150 μΙ
Β:H1N1	H1N1 (100 yl)	-	50 μΙ	150 μΙ
C : H1N1+OM-294-MP	H1N1 (100 yl)	OM-294-MP (50 μΙ)	-	150 μΙ
D: H1N1+OM-294-DP	H1N1 (100 yl)	OM-294-MP (50 μΙ)	100 μΙ	150 μΙ
E : OM-294-MP	-	OM-284-MP (50 μΙ)	100 μΙ	150 μΙ
F: OM-294-DP	-	OM-284-DP (50 μΙ)	100 μΙ	150 μ!

Ant igen^:

Zásobní roztok H1N1 se připraví v koncentraci 25 pg/ml v 0,9% roztoku chloridu sodného

Adjuvanty:

Zásobní roztoky 0M-294-DP a 0M-294-MF se připraví v koncentraci 1 mg/ml ve vodě k injektování s přísadou O, 1 % triethanolamínu do 0M-294-MP. Negativní kontrolou je 0,9% roztok chloridu sodného bez antigenu.

Směs antigen-adjuvant;

Před tříminutovým vířivým mícháním se adjuvanty udržují 20

O minut při teplotě 37 C. Přidá se antigen a roztok chloridu sodného (0,9%) jak uvedeno v tabulce a směs antigenu a adjuvantu se krátce vířivě míchá, načež se vnese do rotačního mísiče na 15 minut při teplotě místnosti, a nakonec se směs jako celek vířivě míchá tři minuty.

Imunizačni režiffl^:

Injekce se podají v den O a 14. Směsi uvedené v předchozí tabulce se podávají subkutánně (75 y I na místě a celkově 150 yl pro zvíře). Vzorky krve se odeb í raji

14. a 18.

den (očn i cové vpichy).

Test imunoglobulinů anti-HlNl^:

Duplicitně se způsobem ELISA zkoušejí následující imunoglobul i ny v séru, které jsou specificky zaměřeny na HlNl:lgGl, gG2a a IgM.

de, Dánsko)

Mikrotitracní destičky ( NUNC Immunoplate, RoskilP se inkubují (povlak přes noc) při teplotě 4 C se

100 yl H1N1 (0,5 yg) v natriumhydrogenuhličitanovém pufru o hodnotě pH 9,6. Po promyti

0,5% Tveen-20 (Měrek Hohenbrunn,

Německo) se séra zředí 5Ox, tem pufrovaná solanka (PBS) % albuminu hovězího sera (BSA

Sigma, St.Louis, M0, Sp. st.

se vnese 100 y 1 teplotě 37 C každého vzorku trvá 45

Po druhém promyt í se 1gG1, né na H1N1 i nkubuj i 30 prot i 1átek rozředěného

IgG2a a IgM minut při teplotě 37 anti-lgGl (kongugát ant i séra. Inkubace při

-myší krysí protilátka-pe(Serotex, Oxford, konjugát 1gG2a-peroxydízy (Pharmingen, San Diego, CA, Sp.

a.) a korigugát lgM-biotin íPharmingen, San Diego, CA.Sp.

pufrem

PBS/BSA/Tveen (250-, 1OOO-, 500-násobné zředění). Pro gM j e po mimořádném promytí potřebná třetí inkubace (30 min.

C) 1:100 zředěným roztokem př i 37 konjugátu streptavidin-peroxydáza (Dako, Glostrup, Dánsko).

Po promyti se přidá

100 yl roztoku fenylen-1,2-diaminu (OPD, Měrek,

Darmstadt,

Německo) k detekci sekundárních s peroxidázou kopulovaných prot i 1átek anti-lgGl a anti-lgG2, zatímco pro IgM je použitým reakčním činidlem 3 , 3 .5 .5

-tetramethylbenzidin (TBM, Sigma, St. Louis, M0, Sp. st. a.).

Po 20 minutové inkubační prodlevě při teplotě místnosti se reakce ukončí přísadou ÍOO μΐ 2N kyseliny sírové. Hodnoty absorbance se odečtou při 490 nm destičkovým čtecím zařízením Bio-Rad 3550.

Výsledky

Výsledky každého odečtení při 490 nmjsou udány ve smluvních jednotkách (A.U.) na ml. Každý vzorek se porovnává se standardem připraveným z proměnných zředění lázně vzorku shromážděné ze skupiny B (zvířata injektovaná pouze H1N1) 28. dne. Lázní vzorku je 50-násobný roztok o koncentraci 1000 A.U./ml. Jednotlivé výsledky se pak korigují na odpovídající násobek zředění (50 200 nebo 800x). Uvádějí se pouze střední hodnoty každé skupiny a směrodatná odchylka (SD).

Tabulka (a)

Imunoglobuliny specificky zvýšené oproti H1N1 podtřídy lgGl (dohodnuté jednotky/ml+ směrodatná odchylka, χχ p<0,01 (Anova & Dunnettovy testy).

Skupiny	Den 14	Den 28
A: NaCl	3+5	0+0
Β:H1N1	11161±5755	53950+23403
C : H1N1 + OM-294-MP	34411+13719	228467**+109123
D:H1N1 + OM-294-DP	30101+19061	382325**+201314
E : OM-294-MP	69+34	59+31
F: OM-294-DP	59+21	38+25

Tabulka (b)

Imunoglobuliny specificky zvýšené oproti H1N1 podtřídy lgG2a (dohodnuté jednotky/ml± směrodatná odchylka, χχ p<0,01 (Anova & Dunnettovy testy).

• · · ·

Skupiny	Den 14	!Den 28
A: NaCÍ	0+0	0+0 __
B’H1N1	26883+20779	50352+30846
C ' H1N1 + OM-294-MP	179344**+139781	1622722**+986195
D:H1N1+ OM-294-DP	103630+96257	681441+1072710
F OM-294-MP	1619+743	1767+1034
F : OM-294-DP	452+584	782+857

Tabulka ( c)

ImunogJobuliny specificky zvýšené oproti H1N1 podtřídy IgM (dohodnuté jednotky/ml± směrodatná odchylka, χχ p<0,01 (Anova & Dunnettovy testy).

Skupiny	I Den 14	Den 28
A: NaCI	22102+5862	21531+3693
B:H1N1	37787+15001	57306+26886
C:H1N1 + OM-294-MP	67936**+21334	95108+38669
D : H1N1 +OM-294-DP	598100*+18324	92920+26971
Ε : OM-294-MP	19065+4069	18018+1016
F : OM-294-DP	20756+7160	20944+9065

Tyto výsledky ukazují, že adjuvanty 011-294-I1P a 0M-294-DP jsou aktivní ve zkoumaném modelu, jelikož významně zvyšují titr protilátek, specificky zvýšený oproti H1N1 u myší po jedné nebo dvou injekcích (obr. 22, 23, 24) nezávisle na uvažovaných podtřídách (lgGla, lgG2a a lgM),

13. OM-294-ΓίΡ a 0M-294-DP v kombinaci s ova lbům i novým antigenem: Určení specifických protilátek vzniklých v myších po jednom nebo po dvou subkutánnich podáních

Způsob

Tato studie má ukázat účinek adjuvantů 01Í-294-MP a 011-294DP na ovalbuminový antigen (Fluka Chemie, Buchs, Švýcarsko). Rozdělí se 50 myší BAKB/c (samice staré 8 týdnů na začátku ošetřování) do 5 následujících skupin:

Skupina	Ant igen konečná koncentrace 5tJ yg na myš/i nj ekc i	Adjuvanty konečná koncentrace 50 jjg na myš/injekci	NaCI	Injektovaný ob j em
A: NaCI			150 pl	150 pl
B: Ova	Ova (100 pl)	-	50 pl	150 pl
C: Ova + OM-294-MP	Ova (100 pl)	OM-294-MP (50 pl)		150 pl
D : Ova + OM-294-DP	Ova (100 pl)	OM-294-DP (50 pl)	-	150 pl
E: OM-294-MP	-	OM-294-MP (50 pl)	100 pl	150 pl

Ant i gen:

Připraví se zásobní roztok ovalbuminu v koncentraci 0,5 mg/ml v 0,9¾ roztoku chloridu sodného.

Ad j uvanty:

Zásobní roztoky 0M-294-DP a 0M-294-HP se připraví v koncentraci 1 mg/ml ve vodě k injektování s přísadou 0, 1 % triethanolaminu do 011-294-1-1?. Negativní kontrolou je 0,9¾ roztok chloridu sodného bez antigenu.

Směs anti gen-adjuvant:

Před tříminutovým vířivým mícháním se adjuvanty udržují 20 minut pri teplotě 37 C. Přidá se antígen a roztok chloridu sodného (0,9¾) jak uvedeno v tabulce a směs antigenu a adjuvantu se krátce vířivě míchá, načež se vnese do rotačního mísíce na 15 minut při teplotě místnosti, a nakonec se směs jako celek vířivě míchá tři minuty.

Imunizační režim;

Injekce se podají v dert 0 a 14. Směsi uvedené v předchozí tabulce se podávají subkutánně (75 jjl na místě a celkově 150 jj! pro zvíře) . Vzorky krve se odebírají 14. a 18. den (očnicové vpi chy) .

7<β ♦

*♦

Test imunog1 obul inů anti -ovalbům i nu:

Duplicitně se způsobem ELISA zkoušejí následující imunoglobuliny v séru, které jsou specificky zaměřeny na ovlabumin^:

IgGl, lgG2a a 1 gM. Mikrotitrační destičky (NUNC Immunoplate,

Rosk i 1de, ’c se 100

Dánsko) se ínkubují (povlak přes noc) při teplotě 4 μΐ ovalbuminu (0,5 jjg) v hydrogenuhl i č i Lanovém pufru ο hodnotě pH 9,6. Po promytí 0,5% Tween-20 (Měrek Hohenbrunn,

Německo) se séra zředí 50x,

200x a SOOx (ředicí roztok^: fosfátem pufrovaná solanka (PBS) + 1 % albuminu hovězího sera (BSA

Sigma, St.Louis, M0, Sp. st.

a.) + 0,02% Tveen-20)). Do důlků se vnese 100 μΐ každého vzorku rozředěného séra. Inkubace při teplotě 37 °C trvá 45 minut.

Po druhém promytí se IgGl, 1 gG2a a lgM specificky zaměřené

O ínkubují 30 minut při teplotě 37 C spolu se 100 μΐ na albumin prot i 1átek anti-lgGl (konjugát anti-myší krysí protilátka-perox i dáza) (Serotex, Oxford, konjugát 1gG2a~peroxydí2y (Pharmingen, San Diego, CA, Sp.

st. a.) a konjugát IgM-biotin (Fharmingen, San Diego, CA.Sp.

st. a.), zředěný předem pufrem

PBS/BSAZTween (250-, 1000-, 500-násobné zředění). Pro gM j e po mimořádném promytí potřebná třetí inkubace (30 min.

př i 37

C) 1 ' 100 zředěným roztokem konjugátu streptavidi n-peroxydása (Dako, Glostrup, Dánsko).

Po promytí se přidá

1OO pl roztoku fenylen-1,2-diaminu (OPD, Měrek, Darmstadt,

Německo) k detekci sekundárních s peroxidázou kopulovaných prot i 1átek anti-lgGl a anti-lgG2, činidlem 3 , 3 ,5 ,5 -tetramethylbenzidin (TBM, Sigma, St. Louis, M0, Sp. st. a.).

Po 20 minutové inkubační prodlevě při teplotě místnosti se re akce ukončí přísadou 100 μϊ 2N kyseliny sírové. Hodnoty absorbance se odečtou při 490 nm destičkovým čtecím zařízením Bio- Rad 3550.

Výsledky

Výsledky každého odečtení při 490 nm jsou udány ve smluvních jednotkách CA.U.) na ml. Každý vzorek se porovnává se standardem připraveným z proměnných zředění lázně vzorku shromážděné ze skupiny B (zvířata injektovaná pouze ovalbuminem) 28. dne. Lázní vzorku je 50-násobný roztok o koncentraci 1000 A.U./ml. Jednotlivé výsledky se pak korigují na odpovídající násobek zředění (50 200 nebo SOOx). Uvádějí se pouze střední hodnoty každé skupiny a směrodatná odchylka (SD).

Tabulka (a)

Imunoglobuliny specificky zvýšené oproti ovalbuminu podtřídy lgGl (dohodnuté jednotky/'ml ± směrodatná odchylka, χχ p<0,01 (Anova & Dunnettovy testy).

Skupiny	Den 14	Den 28
A: NaCI	6+6	16+12
B : ova	728+589	47743+46294
C : ova + OM-294-MP	4361 **+2513	284121 **+164822
D : ova + OM-294-DP	3240**+1794	277025**±173737
E : OM-294-MP	19+8	40+69

Tabulka (b)

Imunoglobuiiny specificky zvýšené oproti ovalbuminu podtřídy lgG2a (dohodnuté jednotky/ ml± směrodatná odchylka, χχ p<0,01 (Anova & Dunnettovy testy).

Skupí ny	Den 14	Den 28
A: NaCI	2996+898	5414+1554
B : ova	5201+1880	73162+107954
C : ova + OM-294-MP	9524+6809	625663*+681232
D : ova + OM-294-DP	18108**+14958	601434*+624166
E : OM-294-MP	11253+12169	4192+2104

Tabulka ( c)

Inunoglobuliny specificky zvýšené oproti ovalbuminu podtřídy lgM (dohodnuté jednotky/ml+ směrodatná odchylka, ** p<0,01 (Anova & Dunnettovy testy).

-‘Skupiny	Den 14	Den 28
A: NaCI	14009+6158	12288+7136
B: ova	19423+13778	47998+34035
C : ova + OM-294-MP	21652+9524	38240+8822
D:ova + OM-294-DP	25762+10975	74399+119781
E : OM-294-MP	19742+5667	9827+2021

Tyto výsledky ukazují, že adjuvanty 0M-294-MP a 0M-294-DP jsou aktivní ve zkoumaném modelu, jelikož významně zvyšují titr protilátek, specificky zvýšený oproti ovalbuminu u myší po jedné nebo dvou injekcích (obr. 25, 26. 27) nezávisle na uvažovaných podtřídách (lgGla, 1 gG2a a lgM).

14. 0M-294-MP a OM-294-DP v kombinaci s antigenem TT (Tetanox toxoid): Určení specifických protilátek vzniklých v myších po jednom nebo dvou subkutánních podáních

Způsob

Tato studie má ukázat účinek adjuvantů 0Π-294-ΜΡ a 0M-294DP na TT antigen (Fluka Chemie, Buchs, Švýcarsko). Rozdělí se 50 myší BAKB/c (samice staré 8 týdnů na začátku ošetřování) do 5 následujících skupin;

Skupina	Ant i gen konečná koncentrace 50 jjg na myš/injekci	Adjuvanty konečná koncentrace 50 tag na myš/injekci	NaCI (0,9%)	Injektováný ob j e®
A: NaCI		-	150 pl	150 μΙ
B : TT	TT(100 μΙ)	-	50 μΙ	150 μΙ
C : TT + OM-294-MP	TT(100 μί)	OM-294-MP (50 μΙ)	-	150 μΙ
D : TT + OM-294-MP	TT(100 μΙ)	OM-294-DP (50 μί)	-	150 μΙ

Ant i gen;

Připraví se zásobní roztok TT . v koncentraci 0.2 mg/ml v 0,9% roztoku chloridu sodného,

Adjuvanty;

Zásobní roztoky 011-294-DP a 0M-294-MP se připraví v koncentraci 1 mg/ml ve vodě k injektování s přísadou 0,1% triethanolaminu do 0M-294-MP. Negativní kontrolou je 0,9% roztok chloridu sodného bez antigenu.

Směs antigen-adjuvant '

Před tříminutovým vířivým mícháním se adjuvanty udržují 20 minut při teplotě 37 C. Přidá se antigen a roztok chloridu sodného (0,9%) jak uvedeno v tabulce a směs antigenu a adjuvantu se krátce vířivě míchá, načež se vnese do rotačního mísíce na 15 minut při teplotě místnosti, a nakonec se směs jako celek vířivě míchá tři minuty.

Imunizační režim:

Injekce se podají v den 0 a 14. Směsi uvedené v předchozí tabulce se podáváj í subkutánně (75 μ! na místě a celkově 150 odebírají 14. a 1S.

den (očn i cové vpichy).

Test anti-TT imunog1 obul inů =

Duplicitně se způsobem ELISA zkoušejí následující i munogI obul i ny v séru, které jsou specificky zaměřeny na TT

IgGl, lgG2a a IgM.

Mikrotitrační destičky ( NUNC Immunoplate, se inkubují (povlak přes noc) při teplotě

Rosk i 1 4 C se

100 μΐ

TT (0,5 Mg) v hydrogenuhličitanovém pufru o hodnotě pH 9,6. Po promytí

0,5% Tveen-20 (Měrek Hohenbrunn,

Německo) se séra zředí 50x,

200x a 800x (ředicí roztok: fosfá-

• φ • φ φ φ φ tem pufrovaná solanka (PBS) + 1 % albuminu hovězího sera (BSA Sigma, St.Louis, FÍO, Sp. st. a.) + 0,02% Tween-20)). Do důlků se vnese 100 jul každého vzorku rozředěného séra. Inkubace při teplotě 37 C trvá 45 minut.

Po druhém promytí se lgGl, 1gG2a a

IgM, specificky zaměřené na TT, i nkubu j i minut při teplotě

C spolu se 100 jul prot i 1átek ant i - 1gGl (konjugát ant i - myš í krysí proti Iátka-perox i dáza) (Serotex,

Oxford,

UK) , konjugát 1gG2a-peroxydízy

a.) a konjugát IgM-biotin (Pharmingen, San Diego, CA.Sp, st.

a), zředěný předem pufrem

PBS/BSA/Tween (250-, 1000-, 500-násobné zředění). Pro lgM je po mimořádném promytí potřebná třetí inkubace (30 min.

o

C) 1:100 zředěným roztokem př i 37 konjugátu streptav i din-peroxydáza (Dako, Glostrup, Dánsko).

Po promytí se přidá

1OO jj 1 roztoku f eny 1 en- 1,2 - di ant i nu (OPD, Herek, Darmstadt,

Německo) k detekci sekundárních s peroxidázou kopul ováných prot i 1átek anti-lgGl a anti-lgG2, zatímco pro lgM je použitým reakčním činidlem 3 ,

3,5,5-tetramethylbenzidin (TBM, Sigma, St. Louis, M0, Sp. st. a.). Po 20 minutové inkubační prodlevě při teplotě místností se reakce ukončí přísadou 100 jlíI 2N kyseliny sírové. Hodnoty absor bance se odečtou při 490 nm destičkovým čtecím zařízením Bio-Rad 3550.

*

Výs1edky

Výsledky každého odečteni při 490 nm jsou udány ve smluvních jednotkách (A.U.) na. ml. Každý vzorek se porovnává se standardem připraveným z proměnných zředění lázně vzorku shromážděné ze skupiny B (zvířata injektovaná pouze TT) 28. dne. Lázní vzorku je 50-násobný roztok o koncentrací 1000 A.U./ml. Jednotlivé výsledky se pak korigují na odpovídající násobek zředění (50 200 nebo SOOx). Uvádějí se pouze střední hodnoty _·····* · · · · ·

R<> · · · * ·· »··» · · ·· ·· ··· · • « w · · « · · ·* • *······ ······· ·· ··· ·· ··· každé skupiny a směrodatná odchylka (SD).

Tabulka (a)

Imunoglobuliny specificky zvýšené oproti TT podtřídy lgGl (dohodnuté jednotky/ml ± směrodatná odchylka, xx P<0,01 (Anova & Dunnettovy testy).

Skupiny	Den 14	Den 28
A: NaCI	1+2	0+1
B : TT	2871+1633	34367+15018
C : TT + OM-294-MP	8502**+2020	78506**+21660
D : TT + OM-294-DP	11620**+2348	136463**+41025

Tabulka (b)

Imunoglobuliny specificky zvýšené oproti TT podtřídy lgG2a (dohodnuté jednotky/ ml± směrodatná odchylka, χχ p<0,01 (Anova & Dunnettovy testy)

Skupiny ‘ - __________	Den 14	' Den 28
A: NaCI	351+506	536+1046
B : TT	2547+2539	61387+82269
C : TT + OM-294-MP	8869+6979	65881+46635
D : TT + OM-294-DP	21969**+25067	148365+134196

Tabulka (c)

Imunoglobuliny specificky zvýšené oproti TT podtřídy 1gM (dohodnuté jednotky/ml± směrodatná odchylka, ** p<0,01 (Anova & Dunnettovy testy).

Skup i ny

Den 14

Den 28

A	NaCl	standard	standard
B	TT		9	zvířat <25	1O zvířat <25
			1	zvíře <50
C	TT +	OM-294-MP	9	zvířat <25	7 zvířat <25
			1	zvíře >1600	1 zví ře <100
					2 zvířata >1600
D	TT +	0M-294-DP	7	zvířat <25	1O zvířat <25
			1	zvíře <200
			2	zvířata >1600

Tyto výsledky ukazuji, že adjuvanty OM-294-MP a 0M-294-DP jsou aktivní ve zkoumaném modelu, jelikož významně zvyšují t i tr protilátek, specificky zvýšený oproti TT u myší po jedné nebo dvou injekcích (obr. 28, 29). Na rozdíl od toho pouze několik zvířat produkovalo IgM specifický pro TT.

15. Vyhodnocení adjuvantnich vlastností 0M-248-MF v imunizačním modelu myší CBA subkutánním podáváním anti genu Leishmania gp63

Myším CBA se podává gp63 dvěma subkutánními injekcemi do ocasu v dávce 2 ttg v 8 denních intervalech. Ad j uvant 0M-248-MP se smísí s oběma dávkami ani i genu. BCG se smísí pouze s první dávkou.

Každé myši se podá 2x 50 jug 0M-248-MP nebo 200 iug BCG.

Kontrolní skupina se injektuje antigenem samotným (bez adjuvantu). Deset dní po druhé injekci se buňky inguinálníeh a pe•X Λ í cti uzlin (skupiny po 3 myších) kultivují a na vyčištěný anti gen gp63 se zkoumá měřeníffi absorpce jako gama IFN a IL-4 sekretovaného lymfocyty lymfatické uzliny vyvolaná in vitro gp63 antigenem se také stanovuje způsobem

ELISA (MIF 100 IFN a ki ty M4000 IL-4, R&D Systems, Europe Ltd..

Abíngdon, UK) v každém vzorku supernatantu lymfocytové kultury

* *

í ι ·:

* * · * * · o* *« · míšní uzliny před, přidáním ³H-TdK.

Hodnoty uvedené v tabulkách pro absorpci ³H-TdR jsou aritmetickým středem ± směrodatná odchylka (trojmo) vyjádřeným v cpm a hodnoty týkající se cytokinů v supernatantech odpovídají aritmetickému průměru ± směrodatná odchylka (trojmo) vyjádřenému v pg/ml.

Ant i gen

Připraví se zásobní roztok gp63 v koncentraci 40 mg/ml v 0,9% roztoku chloridu sodného.

Adjuvanty^:

Zásobní roztok Oři - 294-MP se připraví v koncentraci 1 mg/ml ve vodě k injektování s přísadou 0,1 % triethano1ami nu do 0M-294-MP. Negativní kontrolou je PBS roztok bez antigenu.

Směs anti gen-adjuvant:

Před třím1 autovým vířivým mícháním se adjuvanty udržují 20 minut při teplotě 37 C. Přidá se antígen (1 objem) a adjuvant (1 objem), vířivě se krátce míchá před inkubací 20 minut při teplotě 37 C a nakonec se směs jako celek vířivě míchá tři mi nuty.

Výsledky

V myších imunizovaných anti genem gp63 vyvolává adjuvant 0M-249-MP lepší odezvu lymfocytové proliferace (tabulka (a) a obr. 30 (a)). Skutečně vzhledem ke kulturám ze zvířat, která byla imunizována bez adjuvantu, je nárůst míry proliferace 3,1 až 6--násobek pro produkt 0M-249-MP, zatímco nepřesahuje 3.5násobku pro BGG (2,6 až 3,5) .

V takových lymfocytových kulturách se produkce cytokinů měří v supenatantu (tabulka (b) a obr. 3OÍb)). Je patrno, že antígen gp63 vyvolává sekreci gama IFN v množstvích ekviva-

lentních u myší ošetřených 0Í1-249-MP nebo BSG jako adjuvanten. Na rozdíl od toho je zřrejmé, že adjuvant 0M-249-MP podporuje sekreci podstatných množství IL-4 imunitními lymfocyty (anti -gp63), zatímco lymfocyty myší ošetřených BCG vylučují menší nebo dokonce nezjistitelná množství uvedeného cytokínu.

Tabulka (a)

Účinek adjuvantu 0M-249-MP na imunitní odezvu proti antigenu gp63, měřený prolíferací myšího lymfocitu T jako odezvy na antigen gp63 in vitro

gp63 in vitro (pg/ml)	Bez adjuvantu (cpm x 10‘3/ml)	OM-294-MP (cpm x 10'3/ml)	BCG (cpm x 10'3/ml)
0	1,4+0,4	2,8+0,7	5,3+1,1
0,16	18+5	65+11	47+9
0.31	17+5	92+11	57+17
0,62	16+4	93+13	54+13
1,25	13+2	39+7	44+9

Hodnoty uvedené v tabulce (a) jsou aritmetickým střede ± směrodatná odchylka (trojité kultury).

Tabulka (b)

Účinek adjuvantu 011-249-HP podávaného in vitro společně s antigenem gp63 na produkci in vitro cytokínu lymfocyty lymfatických uzlin

γ |FN koncentrace (pg/ml)
gp63 in vitro	bez adjuvantu	294-MP	BCG
0	<9	<9	27
0,3	78	135	200
0,6	38	120	105
IL-4 koncentrace(pg/ml)
gp63 in vitro	Bez adjuvantu	294-MP	BCG
0	<8	<8	<8
0.3	< 15	125	15
0,6	<8	83	<8

♦ ♦ *φφφ φ« •8« :.* ι / ι * ί

Φφφ*φφ* **

Adjuvant ΟΜ- 249 -MF zvyšuje specifickou odezvu Τ i η vitro v myších CBA, které byly imunizovány gp63 (amfofiIním antigenem parazitu Leishnmanía) jak zjištěno proliferací lymfocytu a antigenem vyvolené produkce gama IFN a IL-4.

16. Účinnost adjuvantu 0M-249MP během anti-LmCPb T-primární odezvy v imunizačním modelu založeném na myších CBA při subkutánním podáni antigenu Leishmania Mexičana LmCPb.

Způsob

Myším CBA se podává jedinou injekcí do ocasu LmCVPb v dávce 2 jjg buď v kombinaci s 50 ug adjuvantu 0M-249-MP nebo bez ní. Kontrolní skupině se podá jedna injekce fyziologického kultivují a vyhodnocuje se odezva vůči vyčištěnému ant i genu

LmCPb, vůči přípravě úplných amastigotů Leishmania mex i cana a vůči concanvalinu váného thymidinu (³H-TdR).

Rovněž se způsobe® ELISA stanoví produkce cytok i nu gama IFN a

IL-4 lymfocyty lymfatických uzlin vyvolaná in vitro antigenem LmCPb Leishmania mexicana nebo aBastigoty ( k i ty MIFPP gamalFN 8- M4000 OL-4, R&D Systems Europe

Ltd, Abington, OK) za použití vzorku supernatantu Jymfocytú lymfatických uzlin každé kultury před přidáním ³H-TdR.

absorpci ³H-TdR. jsou v cpm a hodnoty týkající se cytokinů v supernatantu odpoví daj í mu v pg/ml pro produkci cytokinů v supernalantech.

Ant i geri

Připraví se zásobní roztok LmCPb v koncentraci 40 mg/ml v PBS (2X)

8& *

Adj uvanty =

Zásobní roztok 011-294-HP se připraví v koncentraci 1 mg/ml ve vodě k injektování s přísadou 0,1 % triethanolaminu do Ort-294-HP. Negativní kontrolou je PBS roztok bez antigenu.

Směs antigen-adjuvant=

Před tříminutovým vířivým mícháním se adjuvanty udržují 10 minut při teplotě 37 C. Přidá se antígen (1 objem) a adjuvant (I objem), vířivě se krátce míchá před inkubaci 20 minut pri teplotě 37 c a nakonec se směs jako celek vířivě míchá tři m i nuty.

Výsledky

V nepřítomnosti jakéhokoli stimulu v kultivačním mediu podporuje adjuvant 0M-249-HP vývoj lymfocytů, který podléhá spontánní proliferací (tabulka (a) a obr. 31(a)) a sekretuje stopová íincžstv í gama IFN (tabulka (b) , obr . 31 ( b) ) . Tato reak ce se silně podpoří přidáním do kultur vyčištěného antigenu LmCPb nebo extrakt plného parazitu. V tomto pokusu je patrné, že adjuvant vykonává zřetelný vliv na indukci sensibi1izovaných lymfocytů (antí-LmCPb) schopných sekrece podstatných množství IL.-4 (Tabulka (b) a pbr. 31(b)),

Tabulka (a) Proliferativní odezva buněk lymfatických uzlin in vitro, imunizovaných in vivo působením LmVP: účinek adjuvantu OH- 249-HP

	3H-TdR : .(cpm x 10’3/ml)
Antigen in vitro	Ne i mun i izovaný	Bez adj uvantu	OM-294-MP
&.?. stimulantu	0,9+0,3	2,2+0,7	11+2
LmCPb 0,6 pg/ml	0,8+0.4	1,7+0,1	19+4
LmCPb 1,7 pg/ml	0,9+0,1	4,6+1,6	40+4
LmCPb 5 pg/ml	1,3+0,8	7,2+0,6	80+5
LmCPb 15 pg/ml	2,6±0,4	16,2+2,1	140+10
Amastigoty 1,9 x 10'6 /ml	0,8+0,2	1,7+0,1	44+7
Amastigoty 6 x 10'6 /ml	1,5+0,2	4,6+0,6	79+6
Amastigoty: 17 x 10’6 /ml	2,9+0,6	7,2+0,6	119+4
Con A 5 pg/ml	123+33	193+17	196+10

* ·

Tabul ka ( b)

Sekrece in vitro cytokinů lymfocyty lymfatických uzlin iicun; zovaných in vivo LmCPb. Účinek adjuvantu OM-249-MP na primární odezvu

Produkce gama IFN	(pg/ml)
Stimulant in vitro	Ne i mun i zovaný	Bez adjuvantu	0M-249-MP
žádný stimulant	<9		<9	25
LmCPb 15 jjg/ml	<9		46	48C
amastigoty 17 x 1O	/ m 1 <9		95	320
Con ň 5 jLtg/ml	>1800		>1800	>1800
	Produkce IL-4	(pg/ml)
Stimulant in vitro	Ne i mun i zovaný	Bez adjuvantu	0M-249-MP
žádná konkurence	<8		< O	<8
LmCPb 15 jjg/ml	<8		< 8	130
amasti góly 17 x 10	57 m 1 < S		<8	65
Con A 5 jug/ml	92		190	360

Adjuvant 0M-249-MP je také velmi účinný během primární odezvy T (po jediné injekci vakciny). Vlastnosti účinku adjuvantu na tuto odezvu (zvýšení proliferace lymfocytů, indukce produlkce cytokinů) jsou podobné vlastnostem pozorovaným během odezvy na injekce vakciny.

17.

Vyhodnocení vlastností adjuvantů ΟΓ1-249-ΜΡ a OM-249-DP v myším CBA imunizačním modelu subkutáním podáním antigenu LmCPb Leishmania mexicana= porovnání s BCG

Způsob

Myším CBA (8 myší ve skupině) se podává 2 subkutánném injekcemi do ocasu 3 až 5 jjg LmCVPb v 8-denních intervalech. Adjuvanty 0M-249-MP a 0M-249-DP se smísí s oběma dávkami antigenu, zatímco BCG se smísí póze s první dávkou. Každá myš dostane 2x50 yg adjuvantu 0M nebo 200 yg BCG. 8 dní po poslední injekci se inguinální a periaortické lymfatické uzliny (skupiny po třech myších) odejmou a buňky se kultivují ke zkoumání proliferativní odezvy na vyčištěný antigen LmCPb, nebo popřípadě na proliferativní odezvy vůči prostředku amastigotů Leishmania mexicana jsko celku nebo Concanavalinu A (Con A) . Proli £erativní odezva se vyhodnocuje měřením absorpce triti ováného thymidinu (³H-TdR) .Produkce cytokinu gama IFN a IL-4 lymfocyty lymfatických uzlin vyvolaná in vitro antigenem LmCPb Leishmania mexicana nebo amastigoty se stanoví způsobem ELISA (kity MIFPF gamalFN & M4000 OL-4, R&D Systems Europe Ltd. Abirsgton, UK) za použití vzorku supernatantu lymfocytů lymfatických uzlin každé kultury před přidáním ³H-TdR.

Hodnoty uvedené v tabulkách jsou aritmetickým středem ± směrodatná odchylka vyjádřeným v procentech standardu vůči proti 1átkovému ti tru, aritmetickým středem + směrodatná odchylka (trojmo) vyádřené v cpm pro absorpci ³H-TdR a aritmetickým středem+směrodainá odchylka (trojmo) vyjádřeným v pg/ml pro produkci cytokinu.

Ant i gen^:

Připraví se zásobní roztok LmCPb v koncentraci 60 až

100 jug/ml v 0,9% roztoku chloridu sodného.

Ad j uvanty

Zásobní roztoky 0M-249-MP a 0M-249-DP se připraví v koncentraci 1 mg/ml ve vodě k injektování přísadou 0,1 % triethano1ami nu pro 0M-249-MP. Negativní kontro1ou je roztok

PBS bez antigenu.

Směs antigen-adjuvant^:

Před tříminutovým vířivým mícháním se a

minut při teplotě 37 C. Přidá se antigen adj uvanty udržuj ί 10 (1 objem) a adjuvant (1 objem), vířivě se krátce míchá před inkubací 20 minut při teplotě 37

C a nakonec se směs jako celek vířivě míchá tři mi nuty,

Výsledky

V myších imunizovaných antigenem LmCPb (tabulka ( obr. 32 (a) a (b)) vyvolávají produkty 0M-249-MP a

OH-249-DP vyv íjejí i muní tn í odezvu vůči gp63. Proto v přítomnosti LmCPb ( pg/ml ) je míra byly imunizovány antigenem plus adjuvantem 0M-249-MP 23x vyšší a antigenem plus adjuvantem 01Í-249-DP je 28x vyšší než myší, kterým byl podáván antigen samotný (bez adjuvantu). Dopad BCG v těchto podmínkách je menší, jelikož nárůst pro1 i f 2 ace je pouze 11-násobný. Obdobné jevy jsou patrny u kultur nabuzených vyčištěným antigenem nebo úplným extraktem

Leishmania a pro všechny testované koncentrace antigenu.

Produkce gamalFN jako odezva na antigen LmCPb má sklon být o málo vyšší s produktem 0M-249-DP než s BCG (tabulka (b) cyty proliferují a sekretu)í podstatná množství gama IFN i když antigen nemusel být přidán do kultivačního media. V tomto případě, se adluvant

0M-249-DP jeví jako poněkud účinnější nes

BCG. Zřetelný roždí mezi adjuvanty

0M-249-MP, 0M-249-DP a BCG o,

schopných produkovat IL-4. Množství produkovaného IL-4 vlivem působení adjuvantů 0M-249-MP a 0M-249-DP je významné, jelikož souvisí s množstvím sekretovaným lymfocyty vystavenými účinku Con A, což je mocný, nespecifický stimulant lymfocytů (tabulka (a) a (b) ) .

Froliferativní zených z myší ných adjuvantů odezva in vitro buněk lymfatických uzlin odvoimunizovaných in vivo působením LmVP: vliv růz-

	3H-	TdR .	(cpm x 10’3/ml)
in vitro stimulant	Bez •adjuvantů	OM-294-DP	OM-294-MP	BCG
stimulant u	1,7+0,6	21,8+2,2	17,1+2,5	18,6+4,8
LmCPb 0,6 yg/ml	0,8+0,3	40,9+12,7	22,9+2,8	19,0+7,4
LmCPb 1,7 yg/ml	2,4+0,1	57,2±10,9	34,1+4,1	39,8+5,7
LmCPb 5 yg/ml	2,8+0,6	70,2+9,2	70,3+6,4	44,0+10,4
LmCPb 15 yg/ml	4.3±0,1	100,0+6,5	124,2+1 £.0	46,2+0,3
Amastigott 2x10* /ml	2,4+0,6	61,0+1,7	28,4+8,3	24,4+4,3
Amastigot, 6x10* /ml	2,3+0,7	81,5+5,5	66,1+4,5	23,6+2,5
Amastigot 17x10*/ml	1,7+0,4	78,2+7,8	68,7+2,3	23,4+4,0
Con A 5 yg/ml	188.1+21.0	135,9+3,7	151,4+3,7	119,7+28,5

Hodnoty uveené v tabulce jsou aritmetickým středem ± směrodatná odchylka vyjádřeným absorpcí indikátoru (trojité kultury)

Tabulka (b)

Produkce in vitro cytokinů lymfocyty lymfatických uzlin imunizovaných in vivo LmCPb antigenem^; vliv různých adjuvantů odezvu

• ·

Koncentrace gama IFN (pg/ml)

Stimulant in vitro	Bez adjuvantu	0M-249-MP	OM-249-MP	BCG
žádný stimulant	<9	460	240	280
LmCPb 15 Mg/ml	44	520	360	460
amastigoty 17xlO~5.	/ml 14	>600	>600	480
Con A 5 ug/ml	1200	1200	1900	>3000
	Koncentrace IL	- 4 < pg/ ml)
Stimulant in vitro	Bez adjuvantu	0M-249-MP	0M-249-HP	BCG

žádný stimulant <15	<8	<8	<8
LmCPb 15 Mg/ml <15		1 10	88	26
amastigoíy 17xl0~5/ml <8		130	1 10	29
Con A 5 Mg/ml 40		230	85	1 05
ftdjuvanty OH-249-MP a Oři-249-	DP	působ i	účinně na imunitní
odezvu proti rozpustnému antigenu	peoteázy	Leishmania	mCPb.
Projevuje se to in vitro nárůstem	proli ferat	ivní odezvy	násle-
dováné indukcí produkce gamalFH	a	IL-4 ve	významných	množ-

stv i ch.

• · *

• · ·

Př i k1 ad 6

Vodný roztok k injektování

Sloučenina příkladu III 1.0 g

Polysorbát 80 0,2 g cHl ⁿr i H s^dný Q _t O cr destilovaná voda k injektování 1000 ml

Hodnota pH roztoku se nastaví na 7,5 0, 1M kyselinou chlorovodíkovou a roztok se sterilizuje membránovou filtrací na membráně 0,22 μι» Ster i top Express 1000 (membrána PES, 90 mM, SCGP T10 RE, líillipore Corporation. Bedford, MA, Sp. st . a.). Sterilním roztokem se plní ampule po 1 ml.

Lyof i 1 i zovaný produkt

sloučenina příkladu 4	2, 0	g
Polysorbát 80	O, 2	g
chlorid sodný	9, 0	g
manni tol	10,0	g
kyselina askorbová	0, 1	9
destilovaná voda k injektování	1000 ml

Hodnota pH roztoku se nastaví na 7,4 0, 1M kyselinou chlof i 1 trac1 na PES. 90 mm,

Sp. st. a.).

nožstvi 1 ml rovoaikovou a rostou se sterilizuje membránovou membráně 0,22 μΐη Steritop Express 1000 (membrána SCGP TI0 RE, Millipore Corporation, Bedford, MA, Sterilním roztokem se plní vícedávkové lélpvly v na lěkovku a suší se v/íiraxuván í ňi .

Průmyslová využitelnost ο loučen i na podobná N-acy1 -dipeptidu vhodná pro výrobu zejména proti nádorovým onemocněním.

Claims (15)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Sloučenina podobná N-acy1dipeptidu obecného vzorce I

   X-A-(CH2)_ra-CH-(CHa)n-C0-NH-<CH2)p-CH-CCH2)g-E-Y ( I)

   NHRi

   NHRz kde znamená

   Ri a Rs acylovou skupinu odvozenou od nasycené nebo nenasycené karboxylové kyseliny s přímým nebo s rozvětveným řetězcem se 2 až 24 atomy uhlíku, který je nesubstituován nebo obsahuje jeden nebo několik substituentú vybraných ze souboru zahrnujícího hydroxylovou skupinu, alkylovou skupinu, alkoxyskupinu, acyloxyskupinu, aminoskupi nu. acy1aminoskupinu, acylthioskupinu a alkylthioskupinu s 1 až 24 atomy uhlíku.

   m, p a q 1 až 10, n O až 10,

   X a Y atom vodíku nebo kyselou skupinu vybranou ze souboru zahrnujícího skupinu karboxya1ky1ovou s 1 až 5 atomy uhlíku v alkylovém podí1u,

   -CHE(CHalmCOOHJ[(CHsJnCOOH], kde znamená m 0 až 5 a n 0 až 5, fosfonoalkylovou s 1 až 5 atomy di hydroxyfosfory1oxya1kylovou

   1 až 5 atomy uhlíku.

   d i methoxyf osfory1ovou, f os f ono, hydroxysulfony1 a Iky1ovou s 1 az hydroxysulfony1oxya1kylovou s 1 v neutrální nebo v nabité formě za předpokladu, že znamená alespoň jeden substituent

   X a Y kyselou skupinu shora charaktex i zovanůu v uěUv rální nebo v nabitá formě a na sobě nezávisle atom kyslíku, atom síry nebo iminoskupinu -NH.
2. 2. Soli sloučeniny podobné N-acyldipeptidu podle nároku. 1 obecného vzorce I, kde znamená X a/nebo Y kyselou skupinu a s1 y nisij í v nároku - υινθοίθη^ ί*οΐΡΠϊ.0 ξο·Ι í
3. 3 minerální nebo s organickou zásadou, s výhodou přijatelnou pro terapeutické účely.

   3. Sloučenina podobná N-acyldipeptidu podle nároku 1 nebo 2 obecného vzorce I' (Τ’)

   NHRi

   UHRO kue znamená

   Ri a

   Rz acylovou skupinu odvozenou od nasycené nebo nenasyceně karboxylové kyseliny s přímým nebo s rozvětveným řetězceni se 2 až 24 atomy uhlíku.

   který je nesubstítuován nebo obsahuje jeden nebo několik substituentú vybraných ze souboru zahrnujícího hydroxylovou skupinu. alkylovou acylami noskupi nu.

   acylthioskupinu a nu

   1 až

   10,

   10, atom vodíku nebo ťosfonovou skupinu.

   loučen i na podobná

   N-acyldipeptidu podle nároku 1 až kterou je (3-dodekanoy1oxytetradekanoy1am i no)- 9-í 3 -hydroxy-tetradekanoy1ami no)-
4. 4-oxo-5-azadekan-1 , 10-díol- 1 a/nebo 10 nerálninii zásadami.
5. 5. Sloučenina podobná N-acyldipeptidu podle nároku 1 až 3, kterou je 3-(3·dodekanoy1oxytetradekanoy1ami no) - 9-í3-hydroxy-tetradekanoy1am i no)- 4-oxo-5 -azadekan-1, 10-diol-l, 10-b i s-(d i hydrogenfosfát a jeho ad i ční soli s organickými nebo s mine rářními zásadami.
6. 6. Sloučenina podobná N-acyldipeptidu podle nároku 1 až 3, kterou je 3-(3-hydroxytetradekanoy1ami no)- 9-( 3-dodekanoy!oxy-tetradekanoylam i no)- 4-oxo-5-azadekan-1, 10-diol-l, 10-bis-ídi hydrogenfosfát a jeho adičrií solí s organickými nebo s minerálními zásadami.
7. 7. Sloučenina podobná N-acyldipeptidu podle nároku 1 až 3, kterou je 3-í3·dodekanoy1oxytetradekanoy1amino) -9-( 3-hydroxy-tetradekanoy1am i no)- 4-oxo-5-azadekan-1 , 10-diol-mono-1 - d i hyd rogenfosfát a jeho adični soli s organickými nebo s minerální m i zásadám i.

   3. Sloučenina podobná N-acyldipeptidu podle nároku 1 až 3, kterou je 3-(3-hydroxytetradekanoy1amino) - 9-( 3-dodekanoyloxy-tetradekanoy1am i no)- 4-oxo- 5-azadekan-1, 10-diol-mono-1 -d i hyd rogenfosfát a jeho adični soli s organickými nebo s minerální m í zásada®i.
8. 9. Sloučenina podobná N-acyldipeptidu podle nároku i obecného vzorce I. kde jednotlivé symboly mají v nároku 1 uvedený význam, obsahující prvky s ίϊ nebo S konfigurací nebe racemické povahy.
9. 10. Způsob přípravy sloučeniny podle nároku 1 podobné

   N-acyldipeptidu obecného vzorce I

   X-A- C CHz)»-CH-(CH2>n-C0-NH-íCH_S)_P-CH-CCH_a)q-Β-Y (I)

   I i

   NHR1

   NHRa kde znamená

   Ri

   Rz acyloxyacylovou skupinu g 1 až

   10,

   0 až

   10.

   atom vodíku nebo kyselou skupinu vybranou ze souboru zahrnu jící ho skupi nu podí1u,

   -CHÍ(CHslmCOOHlí(CHz)nCOOH], kde znamená m O až 5 a n O až 5, fosfonoa1kylovou s 1 až 5 atomy uhli ku, dihydroxyfosfory1oxya1kylovou s

   1 až 5 atomy uhlíku.

   d i methoxyfosfory1ovou.

   f Os í ono, hydroxysulfonyIovou, hydroxysulfonylalkýlovou s 1 až

   5 atomy uhlíku, hydroxysulfony1oxya1ky1ovou s 1 až 5 atomy uhlíku, v neutrální nebo v nabité formě, kyselou skupinu v neutrální nebo v nabité formě maj L v nároku

   1 uvedený význam, t í m, ze se funkční aminoskupiny v poloze (q+1) a omega diaminokyseliny obecného vzorce

   Hz N - CCH2)p-CHNHa ( CHz)₊iCOOH blokují blokovacím činidlem, které snadno podléhá acidolýze a hydrogenolýze, karboxylová funkční skupina vždy ve volné formě se nechává reagovat s redukčním činidlem k získání odpovídajícího alkoholu, funkční aftinoskupina v poloze (<pl) se volhuje a pak se substituuje acyleni prostřednictvím derivátu funkční karboxylová kyseliny obecného vzorce RzOH, kde Rz má shora uvedený význam, koncová funkční aminoskupína se následně uvolňuje hydrogenolýzou za získání dialinoalkoholu obecného vzorce

   II

   Ha N - ( CHa) p - CH- í CHa ) _qOH í

   NHRa ( II) kde znamená Ra acylovou skupinu odvozenou od nasycené nebo nenasycené karboxylové kyseliny s přímým nebo s rozvětveným ře tězcem se 2 až 24 atomy uhlíku, který je nesubstituován nebo obsahuje jeden nebo několik substituentů shora uvedených a p a g znamená celé číslo 1 až 10, d i am i rioa 1 koho 1 se kondenzuje v přítomnosti peptidového konden mertním rozpouštědle s omega-hydrozyamino s omega-hydroxythioaminokyselinou obecného vzorce III

   X.A - ( C'Ha ) m - CH( CHa ) n COOH í

   NHRi (III) kde znamená Rj acylovou skupinu odvozenou od nasycené nebo nenasycené karboxylové kyseliny s přímým nebo s rozvětveným řetězcem se 2 až 24 atomy uhlíku, který je nesubstituován nebo

   obsahuj e j eden nebo několik substi tuentů shora uvedených a kde znamená Hi celé číslo 1 až 10, Π ce 1 é číslo 0 až 10, A atom kyslíku, síry nebo i m inoskupi nu NH a

   kyselou skupinu shora charakterizovanou, která je popřípadě v ester ifi kované formě, za získání sloučeniny podobné N-acyldipeptldu obecného vzorce

   IV

   X-A

   CHa)n-C0-NH-í CHa)P-CH-(CHa) <, - OH ( IV)

   NHRi

   NHRa kde Ri, Ra, n. m, p a g mají shora uvedený význam, alkoholová •· ···· «*7 · Λ ·* · ^{_ <} φ · · ·* * • · · ♦ · • ♦ ·♦ funkční skupina, která je popřípadě substituována alkylovou nebo acylovou skupinou alkylovým nebo acylovým nebo jiným substitučním činidlem popřípadě v přítomnosti kopulačního činidla, a podrobuje se katalytické hydrogenaci nebo jinému způsobu k odstranění blokující skupiny za získání sloučeniny podobné M-acy1dipeptidu obecného vzorce I

   X - A - C CH₂ ) tn - CH - ( CH₂ ) n - CO - NH - < CH₂)_P-CH-í CH₂) _Ή - B - Y ( I)

   HHRi NHR₂ kde A, B, X, Y, Ri, R₂, n, m, p a q mají shora uvedený význam.

   Způsob přípravy sloučeniny podle nároku 1 nebo 2 podobné fosfodipeptidu obecného vzorce I’

   X-0-(CHalm-CH-(CH₂)_n-CO-NH-(CHzJp-CH-(CHzlq-O-Y

   NHRi nhr₂ kde znamená

   Ri a R₂ acylovou skupinu odvozenou od nasycené nebo nenasycené karbonylově kyseliny s přímým nebo s rozvětveným řetězcem se 2 až 24 atomy uhlíku, který je nesubstiLuován nebo obsahuje jeden nebo několik substituentů vybraných ze souboru zahrnujícího hydroxylovou skupinu, alkylovou skupinu, alkoxyskupinu, acy1oxyskupinu, aainoskupinu, acy1aminoskupi nu, acylthioskupinu a a 1ky1thioskupínu s 1 aá 24 atomy uhlíku.

   ϊίϊ , p ci. 1 0.^2 l xJ 1

   Γ; O až 10,

   X a Y atom vodíku nebo fosfonovou skupinu v neutrální nebo v nabité formě, vyznačující se tím, že se funkční amincskupiny v poloze ( q +· 1 ) a omega diam1noky^e1 ny ohíOcrséHo vsctc©

   Ha N-(CHz)p * CHNHz(CHz)q +iCOOH blokují blokovacím činidlem, které snadno podléhá acidolýze a hydrogenoiýze, karboxylové funkční skupina vždy ve volné formě se nechává reagovat s redukčním činidlem k získání odpovídajícího alkoholu, funkční aminoskupina v poloze (q+1) se volňuje sc t> i t*líu j o 3.1 θni prost-cln í ct v í rn Hθϊγ i v<?.t·u. Fij.nRr^n í karboxy1 ové kyseliny obecného vzorce RzOH, kde Rz má shora uvedený význam, koncová funkční aminoskupina se následně uvolňuje hydrogenolýzou za získání aminoalkoholu obecného vzorce

   II

   Hz N - (. CHz) p - CH( CHz ) q OH i

   NHRz ( II) kde znamená Rz acylovou skupinu odvozenou od nasycené nebo ne nasycené karboxylové kyseliny s přímým nebo tězcem se 2 až 24 atomy uhlíku, který je nesubstituován nebo obsahuje jeden nebo několik substituentu shora uvedených a p a q znamená celé číslo 1 až 10, aminoalkohol se kondenzuje v přítomnosti peptidového kondenzačního činidla v inertním rozpouštědle s derivátem omega-hydroxyaminokyse1 iny obecného vzorece III’

   X0-(CHz)_m-CH(CHz)nC00H (III’)

   NHR i kde znamená Ri acylovou skupinu odvozenou od nasycené nebo nenasycené karboxylové kyseliny s přímým nebo s rozvětveným řetězcem se 2 až 24 atomy uhlíku, který je nesubst i tuován nebe-

   obsahuje jeden nebo několik substituentu shora uvedených a kde znamená m celé číslo 1 až 10, n ce 1 é číslo G až 10,

   • ·<♦

   X d i al kyl oxy f osf ory 1 ovou nebo di aryloxyf osforylovou. skupinu obecného vzorce (RO)zP í

   za získání sloučeniny podobné N-acyl dipeptidu obecného vzorce

   IV (RO)₂P0-(CHz)»-CH-(CH2)n-C0-NH-(CHs)p-CH-(CH₂)q-OH (IV ) ί 1 !

   O NHR i NHRs ft IQ kde Ri , Rz, n, ni, p a q maj i shora uvedený význam, a skupina R odléhá snadno hydrogenolýze, jejíž alkoholová funkční skupina e popřípadě může fosforylovat fosfory’ačníia činidlem popřípadě v přítomnosti kopulačního činidla a podrobovat se dvoustupňové katalytické hydrogenaci k odstranění skupiny blokující alkoholovou funkční skupinu na acylové skupině Rz a fosfátová funkční skupina a druhá popřípadě obsažená fosfátová funkční skupina se mohou následně zbavoval blokující skupiny hýdrogederivátu obecného vzorce V i ί i

   l

   NHRz

   O s organickou zásadou přijatelnou pro terapeut c í nebo • φφφ φφ φ φφ • φφφφ φφφφ φ φφφφ · φ
10. 14. Způsob podle nároku 10 nebo 11. vyznačuj i o i se tím, že se jako karboxylové kyseliny RiOH používá 3-dodekanoyloxyletradekanové kyselíny.
11. 15. Způsob podle nároku 10 nebo 11, vyznačuj í c í se t í m , že se jako karboxylové kyseliny R2OH používá 3-hydroxytetradekanové kyseliny.
12. 16. Farmaceutický prostředek, vyznačující se t í nt, že obsahuje jako účinnou látku alespoň jednu sloučeninu podobnou N-acy1dipeptidu podle nároku 1 obecného vzorce I

    X- A- ( CHz)n> -CH-( CHz>n-C0-NH-í CH2)_P’CH-(CHz)ei-B-Y ( I)

    NHRi NHRz kde znamená

    Ri a Rs acylovou skupinu odvozenou od nasycené nebo nenasycené karboxylové kyseliny s přímým nebo s rozvětveným řetězcem se 2 až 24 atomy uhlíku, který je nesubsti tuován nebo obsahuje jeden nebo několik substituentů vybraných ze souboru zahrnujícího hydroxylovou skupinu, alkylovou skupinu, alkoxyskupinu, acyloxyskupinu, anínoskupinu, acy1am1noskupi nu, acy1thioskupi nu a alkylthioskupinu s 1 až 24 atomy uhlíku, m, ρ a cj 1 a z 10,

    0 až 10, atom vodíku nebo kyselou skupinu v neutrální nebo v nabi té f ořme, na sobě nezávisle avom kyslíku, atom siry nebo iminuskupinu -NH, spolu nebo ve směsi s netoxickým, farmaceuticky přijatelným i nertnim nosičem nebo excipientem.
13. 17.

    Farmaceutický prostředek podle nároku 16. vyzná č u j ící tím sloučeninu obecného vzorce skupinu, A a B atom kys1í ku ··· « - že obsahuje jako účinnou, látku

    I, kde znamená X a/nebo Y fosfonoa ostatní symboly mají v nároku 1 uvedený význam.
14. 18. Farmaceutický prostředek podle nároku 17, vyznačující se tím, že obsahuje účinnou látku ve formě soli s organickou nebo s minerální zásadou přijatelnou pro terapeutické účely.
15. 19. Farmaceutický prostředek podle nároku 16 až 1S, vyznačující se tím, že obsahuje účinnou látku ve formě čistého enantiomeru nebo ve formě směsi stereo i soíierů.