CZ160999A3

CZ160999A3 - Nové Knoevenagelovy kondenzační produkty, způsoby jejich výroby a jejich použití

Info

Publication number: CZ160999A3
Application number: CZ991609A
Authority: CZ
Inventors: Andreas Johannes Kesel; Walter Oberthür
Original assignee: Andreas Johannes Kesel; Walter Oberthür
Priority date: 1996-11-07
Filing date: 1997-11-07
Publication date: 1999-09-15
Also published as: AU728345B2; HUP9904289A3; NZ335977A; NO992209D0; BR9712930A; DE19645974C1; IL129826A0; CA2270973A1; EP0937089A1; AU5479898A; SK61799A3; CN1236369A; KR20000053141A; JP2001503752A; TR199901733T2; PL333128A1; NO992209L; HUP9904289A2; WO1998020013A1

Description

Oblast techniky

Vynález se týká nových Knoevenagelových kondenzačních produktů, způsobů jejich výroby a jejich použití, zejména pro farmaceutické a analytické účely. Dále jsou popsány konjugáty Knoevenagelových kondenzátů s biomolekulami.

Dosavadní stav techniky

V publikaci Feigl, Z.Anal.Chem. 74 (1928) , 380-386., je popsáno použití p-dimetylaminobenzylidenrhodaninu k důkazu stříbra. Escobar Godoy a Guiraum Perez, Analyst 111 (1986), 1297-1299, popisují použití analogu pyridoxanu (Z)-pyridoxylidenrhodaninu pro spektroskopické kvantitativní stanovení stříbra.

Evropská patentová přihláška EP 0 693 496 Al popisuje nové cefalosporiny se zajímavými . farmakologickými vlastnostmi. Evropská patentová přihláška EP 0 636 630 Al popisuje N-heteroarylem substituované propanamidderiváty, vhodné pro léčení kardiovaskulárních nemocí. WO93/12124 popisuje substituované benzimidazoly, které potlačují vylučování žaludeční kyseliny savců a navíc neblokují štítné žláze. Žádna z těchto tří nepopisuje řešení, kde je pyridylová zachycování jódu ve patentových přihlášek skupina spojena s heterocyklickým 5'kruhem prostřednictvím

atomu dusíku.

Podstata vynálezu

Úkolem předloženého vynálezu je připravit sloučeniny, použitelné ' zejména pro farmaceutické a analytické účely. Tento úkol je vyřešen syntézou sloučeniny (Z)-5'-0-fosfono-pyridoxylidenrhodaninu (3) , který je derivátem koenzymu vitamínu B6, pyridoxal-5'-fosfátu (1). Výroba sloučeniny (3) se provádí přeměnou (1) pomocí syntetické heterocyklické sloučeniny rhodaninu (2) v Knoevenagelově kondenzaci (srv. také Kesel aj., Tetrahedron 52 (18.11.1996), 14787-14800).

• · ΒΒΒΒ • Β

BBB· ► · * a

ΒΒ «Β / Sloučenina (3) se nazývá (Z)-5-[[5-Hydroxy-6-metyl-3-[(phosphonooxy)metyl]-4-pyridinyl]metylen]-2-thioxo-4-thiazolidinon. Rhodaninová část této molekuly je schopna vázat se na biomolekuly, jako například jednovláknové nukleové kyseliny. Nesené fosfátové skupiny zajišťují dobrou rozpustnost ve vodě.

Sloučenina (3) podléhá (2/E)-stereoizomerii na (E)-izomer (4). Tento přesmyk cis/trans se vyvolá například UV-ozařováním s vlnovými délkami 254 nm nebo/a 366 nm.

V dipolárních-aprotických rozpouštědlech se nachází původně žlutá sloučenina (3) jako červený 3-pyridinolát (5) ve formě volné kyseliny, např. v pyridinu nebo dimetylsulfoxidu (DMSO).

Pyridoxal-S^Phosphat

->~

-H₂0

Rhodanín

(Z)-5 '-<3-Ph o spb on o-pyrid oxy] id enrh od an in

Žlutá sloučenina (3) vytváří tmavočervenou jednosodnou sůl, jejíž struktura byla objasněna rentgenovou strukturní analýzou. Byla krystalizována jako hemiheptadekahydráť (8,5 hydrát), a vyskytuje se jako (Z)-stereoizomer (6). Jednosodná sůl (6) podléhá při UV-ozařování rovněž cis/trans přesmyku na červený (E)-stereoizomer (7).

Deriváty sloučeniny (3) mohou být získány reakcí

9999 9« ·9 ·· 99 • 9 9 · » « 9 9 · 9

999« 9 9··· 9 9 9 9 · · · · « 9 · *·« 9· • ····· · 9

9999999 99 99 99 99 s chloridy mastných kyselin ^ci2”^c18 na OH-skupině.

Dále se předložený vynález týká sloučenin obecného

kde χΐ, X² a X ³ jsou nezávisle vybrány z 0, S a NR⁵*;

Y je 0 nebo S;

Z je CR⁵ nebo N;

R¹, R², R³, r4 _a r5 jsou nezávisle zvoleny z libovolných substítuentů je zvoleno z rovněž substituovaných uhlovodíkových zbytků a 0 a n je 0 nebo 1;

jakož i jejich soli, např. soli s alkalickými kovy, kovy alkalických zemin nebo amoniové soli, hydráty, jejich stereoizomery, přičemž platí, že tato sloučenina není pyridoxylidenrhodanin.

Ve sloučeninách obecného vzorce (8) je X¹ s výhodou 0. X² je s výhodou NR⁵, přičemž R⁵ je vodík nebo C^-C^ alkyl a zvlášť výhodně vodík. X³ je s výhodou S. Y je s výhodou S. Z je s výhodou CR⁵, přičemž R⁵ je vodík nebo ^Cl^_<24 ^alkT^{1 a} zvlášť výhodně vodík.

«φ flflfl· ·· ·· flfl flfl • flfl · · · · · * ···· · fl··· · · · fl

Substituenty R¹ až R⁴ jako takové mohou být libovolné substituenty, pokud jsou kompatibilní s celkovou strukturou. R¹ a R² nebo/a R² a R⁴ mohou být navzájem přemostěny, příklady substituentů R¹ až R⁴ jsou vodík, halogen, hydroxyl, amin a popřípadě substituované alkylové zbytky, např. C^- až Cg-alkyl, aminoalkyl, hydroxyalkyl, alkoxyl atd. Zvlášť výhodně obsahuje alespoň jeden ze substituentů R¹ až R⁴ za fyziologických podmínek negativně nabitou skupinu, např. kyselou skupinu jako například fosfát, karboxylat, sulfonát atd.

Zvlášť výhodné sloučeniny obecného vzorce (8) jsou (Ž)-5-0-fosfonopyridoxylidenrhodanín (3), jakož i jejich soli, hydráty a stereoízomery.

Dalším předmětem předloženého vynálezu je způsob výroby sloučeniny obecného vzorce (8), který se vyznačuje tím, že se sloučenina vzorce (9)

X3 (91 prostřednictvím Knoevenagelovy kondenzace přeměňuje pomocí sloučeniny vzorce (10) fcfc fcfcfcfc • · fc «·· * fcfc fc fcfc • fcfcfcfc • fc fcfc « fcfc « • fcfc « fc fcfc • fc

R^

R³

R2 (10)

R¹

kde X¹, X^, , Y, z, r!-r5 a R® jsou definovány stejně jako pro sloučeniny (8).'Reakce probíhá s výhodou ve v podstatě ekvimolárním poměru 9 k 10 ve vhodném rozpouštědle nebo rozpouštědlové směsi. Teplota je s výhodou teplota prostředí až teplota zpětného toku rozpouštědla.

Sloučeniny obecného vzorce (8) mají překvapující farmaceutickou účinnost. Dalším předmětem vynálezu je farmaceutická kompozice, která obsahuje jako účinnou látku výše uvedenou sloučeninu (s výhodou bez ohledu na disclaimer v nároku 1), jakož i popřípadě farmaceuticky obvyklé přísady, pomocné, nosné a zřeďovací látky.

První důležité použití sloučenin podle vynálezu je léčení infekčních nemocí, například virových infekcí, parazitárních onemocnění, houbových onemocnění nebo bakteriálních onemocnění. Zvláště výhodné je použití k léčení virových infekcí, zejména takových virových infekcí, které jsou způsobovány zapouzdřenými viry, jako například hepadnaviry, herpesviry nebo retroviry, např. HIV. Sloučeniny podle vynálezu se však ukázaly jako vhodné také pro léčení nemocí, které jsou vyvolávány jinými viry, jako například viry chřipky a papilomu. Dále se sloučeniny podle • to «toto· » «· ·· ·· ··· ··· ···· • ··· · to··· · · · to » *to>to ·· ·· ·«*·«* • · · to · · to • •toto toto· 4* ·· ·· «to vynálezu osvědčily jako dobře vhodné pro boj proti parazitům jako leishmanióze, plasmodiím a tripanozomám. Zvláště výhodné jsou tyto sloučeniny nasazovány při terapii HIV, například při kombinované léčbě s jinými prostředky jako je AZT nebo DDI.

Dále jsou sloučeniny podle vynálezu vhodné také pro potlačování nádorových onemocnění, například leukémie, zejména T-buněčné leukémie, nebo kožních nádorů, jako například maligního melanomu nebo Kaposiho sarkomu. Překvapivě projevuje proti maligním buňkám selektivní cytotoxický účinek, který nenastává u normálních buněk.

Sloučeniny (8) mají také imunomodulačni účinky a jsou tak vhodné například pro léčení autoimunitních onemocnění, jako například sklerózy multiplex, Alzheimerovy nemoci, lupus erythematodes, myastenie gravis, chronické artritidy, diabetes melitus typu I atd., a různých neurodegenerativních onemocnění.

Dále jsou sloučeniny (8) vhodné pro léčení onemocnění, která souvisí s poruchami látkové výměny vitamínu B, např. jako látky antagonistické vitamínu B6.

Další využití představují onemocnění, která jsou v souvislosti s poruchami enzymatických reakcí. Sloučeniny podle vynálezu účinkují jako efektory, např. aktivátory, inhibitory nebo modifikátory, na enzymatické reakce Caspasensova systému, a. zejména jako inhibitory syntázy oxidu dusnatého.

Kromě toho bylo ovlivnit sekreci TNFa zjištěno, že sloučeniny (8) mohou v T-lymfocytech. Kromě toho jsou ·· fl··* • · • ··· • fl «fl flfl flfl • flfl · · · fl • flfl*· fl ·· · fl · · · flfl flfl flflfl flflfl • flflflflfl · * • flflflflfl « flfl fl* flfl schopné vázat se na buněčné CD38 receptory, přičemž je dosaženo zbrzdění vázání HIV gp41. Tím způsobem je odpojena cesta přenosu signálu CD38, což vede ke zbrzdění tvorby syncytia, uvolňování NO, zániku T-buněk apoptózou, a rozkladu jednotlivých buněk.

Sloučeniny podle vynálezu mohou být použity pro terapeutické účely jako takové. Mohou však být použity rovněž jako cheláty s vícemocnými kovovými ionty nebo jako nekovalentní a/nebo kóvalentní konjugáty s biomolekulami, např. nukleovými kyselinami, proteiny, lipidy, mastnými kyselinami atd.

Farmaceutické kompozice .podle vynálezu mohou být k dispozici v libovolné formě, např. jako krémy, masti, injikovatelné nebo orálně aplikovatelné kapaliny, liposomální formulace, tablety, dražé, tobolky atd. Aplikace se může provádět např. lokálně nebo systemicky, topicky, orálně nebo injekcí. Dávkování se může měnit v širokých mezích, např. 0,01 gg až 1 mg na kg tělesné hmotnosti, vždy podle druhu onemocnění a aplikace.

Kromě toho jsou sloučeniny podle vynálezu vhodné také jako důkazové reagencie. Mohou být použity ve formě radioaktivních derivátů, například značkovaných pomocí ^H, ¹⁴C, 32p nebo Výhodné je však použití v neznačkované formě, nebof na základě jejich silných zbarvovacích popř. fluorescenčních vlastností je možný jednoduchý důkaz v biologických systémech. Zejména jsou sloučeniny podle vynálezu vhodné k důkazu biomolekul, např. v diagnostických analytických postupech, například k důkazu jednovláknových nukleových kyselin. Také jsou tyto sloučeniny vhodné k objasnění struktury, např. sekvence proteinů nebo ·· ·**· 41 ·« * · 14« ··«· « «Β ♦ · * * » « « · * · ««β ··« «· ·· nukleových kyselin.

Kromě toho mohou být sloučeniny podle vynálezu použity také pro elektrochromatické postupy, např. jako molekulární digitální přepínače nebo indikátory pH, teploty; a rozpouštědla.

Dále jsou sloučeniny podle vynálezu popř. jejich deriváty vhodné jako absorbery pro ionty, organické látky atd., nebo na základě svých intenzivních barev a reverzibilních barevných změn .pro dekorativní účely. Zejména je v této souvislosti třeba uvést soli kovů alkalických zemin, např. soli Mg nebo Ca těchto sloučenin, které existují ve formě gelů.

Další oblastí využití je nanotechnologie, kdy jednotlivé, například pomocí laserového· systému nabuzené, fluoreskující molekuly barevných látek a deriváty biomolekul mohou být zjištěny a lokalizovány prostřednictvím citlivých detekčních systémů, např. CCD-kamery nebo Avalanchovými detektory a optickými technikami na destičkách s tenkou vrstvou, v membránách, celách, kapkách, kapilárách atd. Další možnosti lokalizace jednotlivých molekul jsou optická v blízké oblasti spektra na mikroskopie v polyakrylamidovém nebo vícedimenzionální gelová rastrovací mikroskopie miniplátcích, konfokální gelu, například dvouelektroforéza nukleových kyselin.

Konečně se předložený vynález týká také derivátů sloučenin (8), které vznikají hydrolytickým odbouráváním a mají například obecné vzorce (11), (12) nebo (13).

·« ·*«· · * ·

(12)

YH

(13) kde X¹, X², X³, Y, Z, R—R⁴, R⁵ a R⁶ jsou definovány jako pro sloučeniny (8).

·· 4444 44 9» 44 ·· ··» » 4 * 4 · · ·

4 44 · · ♦ · · · · · · * 4 4 4 · * · * ······ • *···· · * 44*4 444 4* 44 4« 4*

Přehled obrázků na výkresech

Dále bude vynález objasněn prostřednictvím příkladů a vyobrazení, na kterých představuje obr. 1 ochranu buněk proti HIV-infekci poskytovanou sloučeninou (3), obr. 2 schematické znázornění vedlejších produktů hydrolýzy, které vznikají- při syntéze sloučeniny (3) .

Příklady provedení vynálezu

1. Způsob výroby sloučeniny (3)

Výroba surového produktu

Rozpustí se 3,83 g 2-thioxo-4-thiazolidininu (rhodanin) (M=133,18 g/mol; n=28,76 mmol) ve . 150 ml absolutního etanolu v 50ml kulaté baňce se zpětným chladičem a přidá se 7,63 g pyridoxal-5'-fosfát monohydrátu (M=265,16 g/mol; n=28,78 mmol). Pyridoxal-5fosfát monohydrát se za studená téměř'nerozpouští. Vaří se na vodní lázni za míchání pod zpětným tokem. Pyridoxal-5'fosfát monohydrát jen pomalu přechází do roztoku a vzniká nejdříve žlutá, potom oranžová a potom červená suspenze, po 20 min varu se přes chladič přidá 150 ml vody, protože suspenze začíná narážet. Zahřívá se ještě 10 min, přičemž vypadává červený reakční produkt a vede k narážení. Poté se chladí ne více než 2 hodiny v chladícím prostoru při teplotě -18 °C.

• » MM • · · · • · · · * «« · ·

Zpracování surového produktu

Oranžový produkt se odsaje, přejede se matečným louhem a promyje se 100 ml studeného absolutního etanolu. Vakuové sušení v exsikátoru nad bezvodým chloridem vápenatým; výtěžek: 9,85 g oranžově žlutého surového produktu (Z)-5-[[5-hydroxy-6-metyl-3-[fosfonooxy)metyl]-4-pyridinyl] -metylen]-2-thioxo-4-thiazolidinon. Produkt obsahuje adukty, vedlejší produkty a navzdory vakuovému sušení etanol a vodu.

Čištění surového produktu přesrážením iontovou výměnou

9,85 g surového produktu se suspenduje v 610 ml vody ve 2000ml kulaté baňce. Za míchání se v několika dávkách přidá 200 ml při pokojové teplotě (22 °C} nasyceného roztoku [β(NaHCO₃)=100 mg/ml] bezvodého hydrouhličitanu sodného [n(NaHCO^)=238,10 mmol]. Tento, nyní červený, roztok se titruje 238,10 ml (238,10 mmol HCl) l,0M kyseliny solné. Výsledná směs se míchá dalších 15 minut. Na konci titrace (pH 2) se barva mění z červené na žlutou a vypadává kyselina (3). Odsaje se a suší se po dobu 24 h při tlaku 4 mbar a teplotě 70 °C. Potom se suší ještě 24 h při tlaku 0,001 mbar ve vakuu vytvořeném olejovou vývěvou při pokojové teplotě. Výtěžek: 8,70 g (83%, vztaženo na celou syntézu) žlutého, amorfního prášku (Z)-5-[[5-hydroxy-6-metyl-3 - [ (fosfonooxy)metyl]-4-pyridinyl]metylen]-2-thioxo-4-thiazolidinonu, obsah w > 96 % (1 H-NMR).

Analytika sloučeniny (3) zahrnuje ^H-NMR spektroskopii, ¹³C-NMR spektroskopii, ³¹P-NMR spektroskopii, RP-18 HPLC, Fast Atom Bombardement (bombardování rychlými atomy) hmotovou spektrometrii (FAB MS), IR-spektroskopii, UV-spektrofotometrii a fluoroscenční spektrofotometrii.

* 4Λ·· 0000 • 0 « 0 · 0 0 · • 00 «00 00 ·· «· ·

Následují typická analytická data sloučeniny (3) .

^C11^H11^N2°6^{P s}2’ ^M = ³⁶²’³¹ g/^mo1·

b.t. 198 °C - 201 °C (při rozkladu, nekorigováno).

FABMS(MH ⁺ v^pott. (W m/z 362.99): m/z (rel.Int.) 363.0 (12.0%, MH ⁺ ),

227.4 (18.1%), 270.4 (8.7%), 171.2 (8.3%), 282.4 (7.1%), 267.1 (2.8%),

283.4 (2.1%), 265.1 (1.5%).

Ή NMR(TFA-d): 6 2.91 (s, 3 H, 2'-CH₃), 5.42 (d, 1³J(³¹P/H) | =8.0 Hz, 2 H, 5'-CH₂-OPO₃H₂), 7.76 (s, 1 H, 4'-CH), 8.47 (s, 1 H, 6-CH).

Ή NMR (DMSO-d6): 6 2.42 (s, 3 H, 2'-CH₃), 4.89 (d, J³d(³¹P,’H}| = 8.0 Hz, 2 H, 5'-CH₂-OPO₃H₂), 7.55 (s, 1 H, 4'-CH), 7.84 (s, 1 H, 6-CH).

1H NMR (Pyridin-dg): 6 2.72 (s, 3 H, 2'-CH₃J, 5.62 (d, 1³J(³¹P,¹ Η) I = 7.5 Hz, 2 H, 5'CH₂-OPO₃H₂), 8,36 (s, 1 H, 4'CH), 8,53 (s, 1 H, 6-CH).

¹³C NMR, BB-fvfcpcjeno (TFA-d): δ 16.83 (s, 2'-CH₃), 65.75 (s, 5'-CH_rOPO₃H₂), 121.04, 122.13 (2 s, C-4'), 133.34 (s, C-6), 136.85, 136.91 (2 s, RR'C-SR}, 138,54 (s, C-5), 142.05 (s, C-4), 147.64 (s, C-2), 153.03 (s, C-3), 171.93 (s, C = O), 193.39 (s, C = S).

³¹P NMR (TFA-d): 6-4.24 (s, R-OPO₃H₂).

FT IR (KBr): 3430 (y N-H, zn), 1713 (y HN-C = O, s), 1213 (v P = O in /?O(HO)PO₂-, s), 1046 (y C = S in S-CS-N, s), 1024 (v P = O in /?O(HO)PO/, s). UV/VIS (H₂O): 2_mflX<1 = 232 nm [4(1 %/1 cm) = 373], 4_miX>2 = 308 nm [4 (1 %/1 cm) = 271], 2_mflXi3 = 353 nm [4 (1 %/1 cm) = 413], 2_mex,₄ = 454 nm [4 (1%/1 cm) = 227].

US/VIS (MeOH): <_xJ = 291 nm [4 (1 %/1 cm) = 245], /_mix2 = 347 nm [A (1%/1 cm) = 489],

UV/VIS (DMSO): 2_max =518 nm [4 (1 %/1 cm) = 98).

Fluorescenční excitační spektrum (ex) a emisní spektrum (em) (DMSO):

/«m ^— 575 nm. Λ_{ίχ< mBXi}, — 355 m,/_{ex maXj 2} 597 nm, = 451 nrn, =

467 nm, Λ„, ₅ = 483 nm, Λ_(Χ, _max, ₆ = 493 nm, Λ_βχ> ^,= 518 nm;

= 490 nm: _max = 575 nm.

i ft· ···· * ·* • · « ftftft

Fluorescenční excitační spektrum (ex) a emisní spektrum (em) (pyridin):

- 471 nm, “2. “ Způsob výroby sloučeniny (6)

2.1

Množství

363 mg (Z)-5-[ [5-hydroxy-6-metyl-3-[(fosfonooxy)metyl]-4-pyridinyl]metylen]-2-thioxo-4-thiazolidinonu (3) (1,0 mmol) se smísí s 20,0 ml 0,10 M sodného louhu (2,00 mmol NaOH). Po smísení s 10,0 ml absolutního etanolu se roztok chladí 24 h při teplotě -18 °C. Jemné krystalické jehličky se odsají: Výtěžek: 340 mg (63 %) červené jednosodné soli (Z)-5-[[5-hydroxy-6-metyl-3-[(fosfonooxy)metyl]-4-pyridinyl]metylen]-2-thioxo-4-thiazolidinon hemiheptadeka (8 1/2) hydrátu (6). Před elementární analýzou byl tento produkt dva dny sušen v sušící pistoli při tlaku 0,1 mbar ve vakuu vytvořeném vodní vývěvou při- teplotě 70 °C:tmavočervená jednosodná sůl (Z)-5-[[5-hydroxy-6-metyl-3- [ (fosfonooxy)metyl]-4-pýridinyl]metylen]-2-thioxo-4-thiazolidirion hemipenta (2 1/2) hydrát (6).

2.2

8,70 g suché sloučeniny (3) (24,00 mmol) se smísí s 240,00 ml 0,10 M roztoku hydroxidu sodného (24,00 mmol NaOH) a následně se přisadí 124,00 ml etanolu. Směs se uchovává po dobu 24 h při teplotě -18 °C. Vysrážené červené

4 444 4* 4 4 ·· 4.4 • 44 · 4 · ····

4 44 4 4 · · * · · · · • 4 4 4 · · 4 · ··· 444 • * 4 * · · -·

4444 IM ·* 4· ·« ·· krystaly se zfiltrují. Získá se 7,55 g (73 %) sloučeniny (6) .

b.t. -2.05 °c - 20S °C (při rozkladu, nekorigováno).

\hjpoe-h p_f0 C_n H₁₀ N₂ Na O_B P S₂ o 2 1/2 H₂O, M = 429,33 g/mol; C 30,77% H 3,52% N 6,52 %, ^jí&těno C 30,97% H 3,43% N 6,35%.

FT IF (KBr); 3277 (v 0-H Wasser, m, breit), 1700 (v HN-C = O, w), 1229 (v P = O in RP(HO)PO₂, s), 1198 (v HN-C = S, s), 1090 (v OSin S-CS-N, s), 973 (v P-O-C in P-O-CH2-aryl,2).

3. Postup důkazu jednovláknových nukleových kyselin

Sloučeniny (3) a (6) mohou být použity v radioaktivně značkované formě, např. značkované pomocí ³H, ¹⁴C, ³²P nebo ³⁵S jako sondy pro důkaz jednovláknových nukleových kyselin.

Sloučeniny (3)/(6) kromě toho mohou být použity pro fluorescenční zjišťování jednovláknové DNA.

(E)-stereoizomer (4) fluoreskuje v DSMO, (Z)-stereoizomer ve vodě značně méně. Při vázání (E)-stereoizomeru (4) na jednovláknovou DNA může být jednovláknová DNA dokázána vznikem fluorescence po extrakci DMSO. Vlnové délky použité k nabuzení leží v oblasti 420 až 500 nm, emise v DMSO nebo v pyridin leží v 575 nm.

Sloučeniny (3), (4) a (6) jeví nekovalentní asociaci na jednovláknovou DNA. Tato nekovalentní vazba může být fotochemicky fixována ozářením UV-světlem vlnové délky 254 a/nebo 366 nm. Přitom reagují (3) a (4) s metylskupinou thyminové nukleobáze fotochemicky za odštěpení I^S.

4. Inhibice izoforem enzymu syntézy oxidu dusnatého

9« ·** 9# «9 *9 ·* ,

9 · 9 · · «99«

9 99 9 9999 9 99 9

9 9 9 ·9 ·9 99« «9«

99999 9 9

9999 999 99 ·· ·· ··

Sloučenina (6) inhibuje neuronální, endoteliální a imunologicky indukovatelné izoformy syntázy oxidu dusnatého (NOS). Koeficient inhibice (IC₅₀) pro nNOS je 61,25 μπι. Pro eNOS a iNOS je koeficient inhibice (IC^q) 50 gm. Tyto hodnoty byly stanoveny měřením přeměny (³H) argininu na (^H) citrulin za použití rekombinačních lidských izoforem NOS, izolovaných z buněk CHO.

5. Dvoudimenzionální elektroforéza nukléových kyselin

Latka (3) se muže použít v radioaktivně značkované nebo neznačkované formě pro dvoudimenzionální elektroforetické rozdělování jednovláknových nukléových kyselin. V první dimenzi náboje a ve druhé dimenzi Sloučenina (3) muže být asociativně nebo kovalentně se může provádět dělení podle dělení podle velikosti molekul, spojena s nukleovou kyselinou

6. Terapeutické použití

Sloučenina (3) a její deriváty jsou účinné jako terapeutické prostředky zejména pro svůj vliv na množení původců infekce, např. těch, které se v hostiteli vyskytují s mezistupni jako jednovláknová DNA, jako retroviry, herpesviry nebo hepadnaviry.

6.1 Inhibice HIV

Myeloidní v nepřítomnosti sloučeniny (3). antigenů p24. Z podle vynálezu

HUT78-buňky se vystaví infekci HIV popř. v přítomnosti 1,87 mM nebo 0,187 mM Důkaz HIV se provádí fotometrickým určením obr. 1 je zřejmé, že v buňkách ošetřených nebyl žádný zjistitelný p24, zatímco • fc ···· ·· ·· ·· *·.

« · · · · · · · · · ♦ fc·· · · ··· · * ♦ · • ··· ·· »· ······ • ····· · ···· ··· ·· ·* *· ·* v kontrolním vzorku byl test p24 od sedmého dne pozitivní.

6.2 Léčení herpesu

Pacient (17 let, muž) byl ošetřován emulzí sloučeniny (3) v olivovém oleji a vodě (asi 1 mg/ml). Několik hodin po lokální aplikaci na napadené části kůže byla zjištěna úplná remise.

6.3. Léčení chřipky

Pacient (51 let, muž) s virovou chřipkou byl ošetřen několika kapkami roztoku sloučeniny (3) v I^O/DNSO (asi 1 gg/ml). Symptomy nemoci přes noc zmizely.

7. Indikátor teploty/rozpouštědla (Z/E)-stereóizomerie sloučeniny (3) je závislá na teplotě (termochromie) a na rozpouštědle (solvatochromie). Může tak být sloučenina (3) použita jako indikátor teploty a/nebo rozpouštědla.

8. -Digitální přepínací funkce- ......

(Z/E)-stereoizomerie sloučeniny (3) je závislá na přiložení elektrického pole (elektrochromie). Sloučenina (3) tak může být použita jako digitální přepínací prvek na základě rozdílných fluorescenčních spektroskopických vlastností oproti sloučenině (4) při nabuzení laserovým světlem s vlnovou délkou 480 mm. Přitom nastává po přiložení elektrického pole na sloučeninu (3) přesmyk na (4) a tím fluorescenční emise až 575 nm po nabuzení při 480 nm.

4. f *··· • * • ··· ·· ΦΦ « · Φ· * • · · Φ Φ * · · * «· ·* *· ··

9. Antagonismus vitamínu B6

Sloučenina (3) může při látkové výměně účinkovat jako látka antagonistická koenzymu pyridoxal-5fosfátu tím, že se váže na enzymy potřebující tento koenzym, a má tak vlastnosti potlačující nádor.

10. Kontrola proliferace

Sloučenina může být použita ke kontrole proliferace/ chemoterapii/cytostatické terapii maligních nádorů v lokální aplikaci na kožní nádor (maligní melanom, Kaposiho sarkom} popřípadě ve spojení s UV ozařováním a/nebo pro kontrolu proliferace při jiných kožních nemocích se zvýšenou rychlostí dělení buněk (např. psoriáze). Vazba sloučeniny (3) na replikačně aktivní oblasti jednovláknové DNA může být fotochemicky fixována UV-ozařováním a vede k lokálně ohraničené cytotoxicitě.

11. Objasňování struktury

Sloučenina (3) může být použita na základě jejích barevných a fluorescenčních vlastností jakož i její schopnosti spojování s biomolekulami, např. proteiny, pro objasnění struktury, např. pro určení sekvence aminokyselin proteinů nebo sekvence DNA.

12. Důkaz vedlejších produktů hydrolýzy

Vedlejší produkty hydrolýzykteré vznikají při syntéze sloučeniny (3), se vyšetřují hmotovou spektroskopií.

Příslušné sloučeniny jsou uvedeny na obr. 2.

Claims

00 0000 • 0 0 0 00 0« 0» • 0 0 • ·*·· enzymatických reakcí. 18. Použití podle nároku 17 jako efektoru enzymatické aktivity syntázy oxidu dusnatého. 19. Použití sloučenin podle některého z nároků 1 až 8, jako důkazových reagencií. -f 20. Použití sloučenin obecného vzorce (8), kde X , X2, χ3, γ, 2, a jsou definovány stejně jako v nároku 1, s výhodou jako v některém z nároků 2 až 8, k důkazu biomolekul. 21. Použití podle nároku 20 k důkazu jednovláknových nukleových kyselin. 22. Použití sloučenin obecného vzorce (8), kde X1, X2, X3, Y, Z, R1-R5 a R6 jsou definovány stejně jako v nároku 1, s výhodou jako v některém z nároků 2 až 8, pro elektrochromické aplikace. 23. Konjugáty sloučenin obecného vzorce. (8), kde X1, X2, X3,' Y, Z, R^-rS a jsou definovány stejně jako v nároku 1, s výhodou jako v některém z nároků 2 až 8, s biomolekulami. 24» Deriváty sloučenin podle některého z předcházejících nároků obecného 'vzorce (11), (12) nebo (13): v nároku 1. jsou definovány jako • fe «··· fefe • fe ** . fe* * * ♦ * • • • fe fe · • · fefe • ' « • fefe1 fe ·' ·< · • ·.* · --· 4« ·. · 4 4 fe • 4 4 · PATENT OVÉ NÁROKY

1/3

Obr. 1

Extinkce 490

Dny kultivace —♦— 1,87 mM sloučeniny (3) 0,187 mM sloučeniny (3)

HIV test toto- 9 9 v ·

9 to to · · to • to toto·· ·· ·· to toto to · »··' • «to · >to toto • to toto 2/3

Obr. 2

Vedlejší produkty hydrolýzy při syntéze B6PR H

IZ)-5'-0-Phosphonopyridoxytidenrhodanin

HO-P-O

HO

O^OH

H y d r o t h i o k y a π á t kysel i n y i 1 )--5 ' - 0--'ťos ion o.....

o v r i d o v 1 i d e n t h i o q 1 y k o I o v é +h₂o -hscn -h₂s

FeíSCN]₃ <

SH

0 ^COOH

HO-P-O^CV^

HO scnoH® ^CH3

Hydře;th,1.okyanát kyseliny <EJ-5 .....O-fosfono- p y i·' i d oy 1 i d e n t h i o g 1 y koloví + FeCta

-SCN®

-H₃0®

O^.OH ‘N^CH₃Kyselina 5-0-fosfono-pyridoxylglyoxylová

FAB MS -řhPOí,

SH 0 HO-P-O^ I 1 HO

205.23 g/mol [MH+] vypočt. m/z 206,0276 [MH+] zjišť. m/z 206,2 (4,5 fc)

C10O10W FAB MS Λ/-303.23 g/mol [MH+] vypočt. m/z 304,0045 ,[MH+] zjistí. m/z 304,1 (1,7

3-Mercapto-8-methyj-5-l(pho5phonooxy) methyl)-2H-pyranol2₁3-clpyrÍdin-2-on

99 9999

9 9

4 4*9

99 99 99 9«

4 9« «99«

9 9 4·« 9 44 * .

• 994 >9 99 Τ·9 994'

9 499 ·. 9 9 9 •444 ·· 4* · » ··

1. Sloučeniny obecného vzorce (8) iK kde X·¹·, X² a X ² j_SOu nezávisle vybrány z 0, S a NR*;

Y je 0 nebo S;

Z je Cr5 nebo N;

R¹, R², R², R⁴ a R⁵ jsou nezávisle zvoleny z libovolných substituentů;

R^ je zvoleno z rovněž substituovaných uhlovodíkových zbytků a 0 a n je 0 nebo 1; ........

jakož i jejich soli, hydráty, a stereoizomery, přičemž platí, ze tato sloučenina není pyridoxylidenrhodanin.

-2.0• fl ** • flfl fl. fl, flfl· • flfl · • fl flfl • · flfl flfl t?

(91 prostřednictvím Knoevenagelovy kondenzace přeměňuje pomocí sloučeniny vzorce (10) kde X¹, X², X², Y, Z, R-^-R⁵ a jsou definovány stejně jako v nároku 1.

10. Způsob výroby sloučeniny podle nároku 8, vyznačující se tím, že se pyridoxal-5fosfát přeměňuje Knoevenagelovou kondenzací pomocí rhodaninu. ¹¹

11. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje jako účinnou látku sloučeninu obecného vzorce (8), kde X¹, X², X², Y, Z, R¹-R^ a R® jsou definovány stejně jako v nároku 1, s výhodou jako v některém z nároků 2 až 8, nebo její soli, hydráty a stereoizomery, jakož i popřípadě farmaceuticky obvyklé přísady, pomocné, nosné a zřeďovací látky.

-21 flfl flflfl· flfl ·* flfl flfl • flfl flflfl flflfl· «flflfl fl ·· flflfl fl flfl fl fl flflfl flfl ·· ··· ··· • flflflflfl · fl fl···.*·· flfl flfl flfl flfl η

12. Použití sloučeniny obecného vzorce (8), kde X , X², X², Y, Z, R¹-R⁵ a R⁶ jsou definovány stejně jako v nároku 1, s výhodou jako v některém z nároků 2 až 8, nebo jejích solí, hydrátů a stereoizomerů k výrobě farmaceutické kompozice pro léčení infekčních nemocí, nádorů a autoimunitních nemocí.

13. Použití podle nároku 12 k výrobě antivirálního prostředku.

14. Použití podle nároku 13 k výrobě prostředku pro léčení virových infekcí způsobených hepadnaviry, herpesviry nebo retroviry.

15. Použití sloučeniny obecného vzorce (8), kde X¹, X², X², Y, Z, r!-R⁵ a R⁶ jsou definovány stejně jako v nároku 1, s výhodou jako v některém z nároků 2 až 8,.nebo jejích solí, hydrátů a stereoizomerů k výrobě farmaceutické kompozice pro léčení .onemocnění souvisejících s poruchami látkové výměny vitamínu B.

16. Použití sloučeniny obecného vzorce (8), kde X¹, X², X², Y; Z, R-L-R⁵* a' R⁶ jsou' definovány stejně jako v nároku 1, s výhodou jako v některém z nároků 2 až 8, nebo jejích solí, hydrátů a stereoizomerů k výrobě farmaceutické kompozice pro léčení onemocnění souvisejících s poruchami imunitního systému.

17. Použití sloučeniny obecného vzorce (8) , kde X¹, X², X², Y, Z, R^-R^ a R⁶ jsou definovány stejně jako v nároku 1, s výhodou jako v některém z nároků 2 až 8, nebo jejích solí, hydrátů a stereoizomerů k výrobě farmaceutické kompozice pro léčení onemocnění souvisejících s poruchami ·· ♦*

0 · 0ι 0

0 · 0 0

2. Sloučeniny podle nároku 1, vyznačující setím, že X¹ je 0.

3. Sloučeniny podle některého z nároků 1 nebo 2,

W rf rf v O C vyznačující se tím, že X je NR³.

Ή · fcfc fcfcfc· fcfc „ fcfcfc * ·' · ·· · • ' fcfc fcfc »· fc* • · fcfcfcfc • «fcfc fc fcfc · • · fc · · fc ·· fcfc fcfc 4 Sloučeniny podle některého z předcházej ících nároků, vyznačující se tím, že X³ je S. 5 Sloučeniny podle některého z předcházej ících nároků, vyznačující se tím, že Y je S. 6 Sloučeniny podle některého z předcházej ících nároků, vyznačující se tím, že Z je CR⁵. 7 Sloučeniny podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že některý ze substituentů R¹-R⁴ obsahuje za fyziologických podmínek negativně nabitou skupinu. 8. Sloučeniny podle některého z předcházej ících

nároků vybrané z (Z) -5-[[5-Hydroxy-6-metyl-3- [ (phosphonooxy)metyl]-4-pyridinyl] metylen]-2-thioxo-4-thiazolidinon vzorce (3) jakož i jejich soli, hydráty a stereoizomery.

9. Způsob výroby sloučeniny obecného vzorce (8), vyznačující se tím, že se sloučenina vzorce (9) • fl flfl • flfl · fl flfl · • fl. flflflfl • ·' • flflfl

3/3

Obr. 3