CS858585A2 - Animals growth promoting and accelerating means and method of its effective substance production - Google Patents

Description

- /1 - 2 - pj^dluSOTlý J/ynález se týká prostředku kpodpoře a urychlení růstu zvířat, jakož i k lepšímuzhodnocování krmivá zvířaty, který jako účinnou slož-ku obsahuje novou organickou sloučeninu, která je dá-le blíže definována. Dále se vynález týká mikrobiolo-gického způsobu výroby nové organieké chemické slou-čeniny, která má antibiotické vlastnosti a může sepoužívat jako účinná složka k podpoře růstu zvířata k lepšímu zhodnocování krmivá zvířaty. Předmětem předloženého vynálezu je pro-středek k podpoře a urychlení růstu zvířat, jakož ik lepšímu zhodnocování krmivá zvířaty, který spočíváv tom, že jako účinnou složku obsahuje organickou chemickou sloučeninu, která je charakterizována a) IČ absorpčním spektrem (technika KBr) antibiotika obsahujícího sodík s charakteristickými absorpční- mi pásy při následujících vlnových délkách vyjádře ných v em -1 3456 1265 2960 1178 2910 1145 1750 1115 1700 1030 - 3 - 1635 950 1540 930 1395 825 a známorněných na obr. 1, kde na ose úseček jevlnové číslo v cm’^ a na ose pořadnic absorpce; b) ^H-jaderným resonančním spektrem podle obr. 2,udávaným v dílech na jeden milion a kmitech najednu sekundu; 13 c) C-jaderným resonančním spektrem podle obr. 3; d) elementární analýzou (po 2 dnech sušení ve vysokémvakuu při teplotě 30 °C) 61,1-62,3 % C, 5,2-6,4 % H, 27,5-30,0 % 0; e) sumárním vzorcem (C14-16Hl6-20°4-6 >n ’ f) sumárním vzordem sloučeniny, která obsahuje sodík(C29-31H33-37°9-11Ma >n» g) rozpustností, tj. dobrou rozpustností v ethyl-acetátu, chloroformu, methanolu a nižších alko-holech a špatnou rozpustností ve vodě; h) barvitelností, tj. uvedenou sloučeninu lze po chro- matografii na tenké vrstvě silikagelu barvit pomo-cí směsi chloridu železitého a kyseliny sírové. Předmětem předloženého vynálezu je dálezpůsob výroby organické chemické sloučeniny, kteráje charakterizována shora, který spočívá v tom, žese kultura mikroorganismu BA 9, který odpovídá č. 3025v německé sbírce mikroorganismů, a jeho mutanty avarianty kultivují za aerobních podmínek kultivacepři teplotě mezi 16 a 42 °G při pH mezi 6 a 8,5 vevodném kultivačním prostředí, které obsahuje 0,5 až8 % hmotnostních zdroje uhlíku, 0,1 až 5 % hmotnostníchzdroje dusíku, 0,001 až 0,5 % hmotnostního minerálníchsolí a až 0,5 % hmotnostního prostředku proti pěnění.

Hodnoty ^H-jaderného resonančního spektra (b) byly zjišťovány při intenzitě pole 300 MHz za po-užití roztoku antibiotika v deuterovaném methanolu aza použití tetramethylsilanu v deuterovaném methanolujako vnitřního standardu.

Hodnoty JC-jaderného resonančního spektra (c) byly měřeny ve stejném roztoku jako "^H-spektrumpři intenzitě pole 75>48 MHz. - 5 -

Ke stanovení sumárního vzorce (e) nutnopoukázat, že u vyšších molekulárních přírodních látekmůže být rozsah chyb elementární analýzy větší, nežje obecně obvyklé. Přesné stanovení sumárního vzorcenení tudíž možné (srov. R. B. Woodward, Angew. Ghem.62, 50-51 (1957)). K barvitelnosti (h) nutno uvést, že bylopoužito činidla, které bylo připraveno podle obvyklýchpředpisů (srov. Ξ. Stáhl, Dunnschichtchromatogra^hie,2. vydání, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg,

New York 1967).

Antibakteriální účinek sloučeniny podlevynálezu je uveden v tabulce 1.

Obohacení a izolace kmene BA 9 roduStreptomyces se provádí obvyklými metodami izolaceActinomycetes nanesením suspenzí vzorků půdy na plotnyv Petriho miskách, čtyř- až šestitýdenním pěstováníma opakovaným přeočkováním jednotlivých kolonií(Williams, S. T. a Cross, T. (1971))· Actinomycetes.

In Methods in Microbiology 295-334. Booth, C.(vydavatel), London-New Yoxk: Academie Press). - 5a -

Tento nový kmen Streptomyces s labora-torním označením BA. 9 byl registrován 6. srpna 1984pod číslem DSM 3025 u Deutsehen Sammlung von Mikro-organismen, Griesebachstrasse 8, 3400 Gottingen, NSR (Německá sbírka mikroorganismů). Dále bylo zjištěno, že nová shora cha-rakterizovaná sloučenina se získá, jestliže se kulti-vují za aerobních podmínek vhodné mikroorganismyčeledi Streptojpycetaceae v živném prostředí, kteréobsahuje asimilovatelné zdroje uhlíku a zdroje dusí-ku, jakož i minerální soli a poté se uvedená slouče-nina izoluje obvyklými metodami. K provádění postupu podle vynálezu lzepoužít zejména kmene Streptomycetes BA 9, jakož ijeho mutantů a variant.

Tento kmen náleží k bakteriím řáduActinomycetales, Čeledi Streptomyeetaceae a roduStreptomyces. Izolován byl z půdy.

Taxonomické určení kmene BA 9 bylo pro-váděno podle Bergey*s Manual of DeterminativeBacteriolog5r 8. vydání (1974), jakož i podleInternational Journal of Systematic Bacteriology 16,313-340 (1966) a The Prokaryotes 2, 2028-2090 (1981). 1. Morfologie

Byla pozorována dobrá sporulace jen na škrobovémagaru s obsahem anorganických solí (půda ISP č. 4, - 7 - 3©jí složení je uvedeno dále). Na jiných půdách (půdy ISP δ. 1+ až 3 a 5) se tvořilo málo vzduš- ného mycelia popřípadě vzniklo jen mycelium substrátu. * půda 1SP 8. 1, doplněná 10 g/litr D-mannitolu(složení viz dále).

Vzdušné mycelium (půda ISP 8. 4, 20 °C, 7 dnů): barva: po 7 dnech šedá řetězec spor: typ spira spory: mírně drsné /podle elektronové mikroskopie),válcovité o Šíři asi 1,1 až 1 /um a o délce 1,4 až 1,6 /um.

Mycelium substrátu barva: Servenohaědá, zejména na půdách ISP 8. 3 a 5.

Analýza buněčné stěny

Buněčná stěna typu I, hlavními složkami jsou,Hí-diaminopimelová kyselina a glycin. «** Q **> 2. Fyziologie

Optimální teplota se pohybuj® kolem 28 °G (půdaISP č. 1*,.. 5 dnů). Ha půdě ISP č. 7 (agar sobsahem tyrosinu) nebyl pozorován žádný růst.Iflelanin se tvoří na půdě 1SP č. 6. Kůst byl po-tlačen chloramfenikolem (10/Ug),erythromyčinem(lOyUg), sulfafurazolem (lOOyug), streptomyčinem tetracyklinem (10/Ug), chefaloridinem (5/ug), fusidinovou kyselinou (lO^ug), linco-mycinem (lO^ug), novobiocinem (5^ug) (půda ISPč. 1*». 28 °C> 2 dny). Dobrý růst (mycelium sub-strátu) lze pozorovat na půdách ISP č. 3, 4, 5se sporadickou tvorbou vzdušného mycelia napůdách ISP č. 3 a 5. - 9 -

Složení ISP č. 4 (škrobový agar s anorganický mi solemi) škrob (rozpustný) 10,0 g kyselý fosforečnan draselný (bezvodý) 1,0 s síran hořeěnatý . 7HgO 1,0 •g chlorid sodný 1,0 g síran amonný 2,0 g uhličitan vápenatý 2,0 g roztok stopových prvků 1,0 ml voda (deionisovaná) 1000,0 ml pH 7,0 - 7,4 fioztok stopových prvků síran železnatý . 7 HgO 0,1 g chlorid manganatý . 4 H2Q 0,1 g síran zinečnatý . 7 HgO 0,1 g voda (deionisovaná) 100,0 ml 10 - ISP δ. 1 (agar s tryptonem a extraktem z kvasnic) doplněný mannitolem trypton 5,0 g extrakt z kvasnic 3,0 g agar 15,0 g D-mannitol 10,0 g deionisovaná voda 1000,0 ml

Poznámka:

Trypton, extrakt z kvasnic a agar byly použityz Řady Bacto (výrobek Difco).

Další

Syst. Bact. Μ» 313 - 340 (1966). v Int. J.

Test na zhodnoceni zdrojů oblíku:

Zhodnocování zdrojů uhlíku bylo přezkou-máváno metodou popsanou v Int. J. Syst. Bact. 16« 313 - 340 (1966). Pro účely negativní kontroly bylsrovnáván růst na půdě bez zdroje uhlíku. 11

Zdroj uhlíku (10 g/lltr) kontrola (bez zdroje uhlíku) D-glukosa ©-xylosa L-arabinosa L-rhamnosa D-fruktosa ©-galaktosa raffinosa D-mannitol

Meso-inosit salicin sacharosa ribosa mannosa maltosa 1aktosa malliblosa celulesa acetát 12

Vysvětlivky k tabulce: * + « růst - » žádný růst * « výsledek není jednoznačný

Kmen BA 9 izolovaný ze vzorku půdy z

Israele (Jeruzalém) se dá na základě morfologickýchdat zařadit do šedé série Streptomycetes (skupinaCinereus). fyziologické vlastnosti nesouhlasí s žád-ným z kmenů popsaných v Bergey 's Manual.

Taxonomické označeni: Streptomyces sp.

Pro postup výroby sloučeniny podle vy-nálezu se používá živných půd, které obsahuji obvyk-lé zdroje uhlíku a zdroje dusíku a které obsahujinutné soli. Jako zdroje uhlíku se mohou používat: uhlohydráty, zejména polysacharidy, jako napříkladškroby, monosacharidy, jako například glukosa neboITuktosa. Pále se mohou ještě používat alkoholickécukry, jako například mannitol nebo glycerol .Kroměnich se mohou používat také přirozeně se vyskytujíc!směsi, jako je například sladový extrakt nebo liho-varské výpalky, jakož i směsi ze shora uvedenýchmožnosti. 13 -

Jako zdroje dusíku se mohou používatobvyklé zdroje dusíku, jak© například bílkoviny,hydrolyzáty bílkovin, aminokyseliny, amoniové soli,přirozeně se vyskytující komplexní látky, jakomoučka ze sojových bobů, rybí extrakty, extrakty zkvasnic, práškové mléko a jejích vhodné směsi*

Jako pomocné látky jsou v Živných půdáchnutné minerální soli, jako například fosforečnany,sírany nebo chloridy, draslíku, dědíku, vápníku,hořčíku, železa, zinku a manganu* Koncentrace těchtolátek může kolísat v širokých mezích, přičemž zčástijsou nutné koncentrace minerálních solí obsaženyve shora uvedených zdrojích uhlíku nebo zdrojíchdusíku nebo v používané vodě jako nečistoty* Dále se mohou jako pornoené látky použí-vat také prostředky proti pěnění nejrůznějšího typu,jako například polyoly neb© silikony.

Způsob výroby sloučeniny podle vynálezuse může provádět pomocí obvyklých pevných, polopev-ných nebo tekutých živných půd. Výhodně se používávodných tekutých živných půd. — 14 - Očkování živných půd se přitom provádíobecně obvyklými metodami, například přes šikmé zku-mavky nebo přes kultury pěstované v bankách.

Kultivace se provádí za aerobních podmí-nek a může se provádět obecně obvyklými metodami,jako za použití třepací kultivace, například v tře-pacích bankách, provzdušňovaných kulturách nebosubmersních kulturách.Výhodně se provádí kultivacepři aerobním submersním postupu v provzdušňovanýchfermantačních nádobách, například v obvyklých sub-mersních fermentaěních tancích. Je také možné prová-dět kultivaci kontinuálně nebo diskontinuálně.Výhodně se pracuje diskontinuálně. Při provádění způsobu výroby se pracujeza aerobních podmínek. Kultivace se může provádětobvyklými metodami, například za použití kultivacetřepáním nebo za fermantaění kultivace za provzkduš-ňování. Podíly složek živného roztoku mohou kolísatv širokých mezích. Zdroje uhlíku jsou obecně pří-tomny v množství 0,5 až 8 výhodně 0,6 až 6zdroje dusíku jsou přítomný obvykle v množství 0,1až 5 %, výhodně 0,5 až 2 %. Soli jsou přítomny vobvyklých koncentracích, výhodně v ro z stahu mezi 15 0,001 až 0,5 % hmotnostního. Prostředky proti pěně-ní jsou přítomny v koncentraci 0,5 %. Teploty používaně při sterilizaci se pohybují mezi 100 až 140 °CVýhodně mezi 120 až 130 °C.

Hodnota pH rostoucích kultur se má vý-hodně udržovat mezi asi 6 a asi 8,5, zejména mezi 6,5 a 8,0. Příliš silnému poklesu pH do kyseléoblasti lze zamezit přidáním organické nebo anorga-nické báze, výhodně uhličitanu vápenatého. Jak jeobvyklé při technologii fermentace, je možno použí-vat také zkrat automatické regulace pH , při kterése do kultivačního roztoku vstřikuje sterilní orga-nická nebo anorganická kyselina, například kyselinasírová, nebo sterilní louh, například hydroxidsodný v potřebných intervalech.

Je áčelné zajistit, aby mikroorganismypřicházely v dostatečné míře ve styk s kyslíkem,jakož i se živnými látkami. Toho lze dosáhnoutobecně obvyklými metodami, jako třepáním a mícháním

Kultivační teplota se může pohybovatmezi asi 16 a asi 42 °G, výhodně mezi 24 a 32 °C,zvláště výhodně pak činí asi 20 °C. Doba kultivacese může značně měnit, přičemž zde hraje důležitou - 16 úlohu složení živné půdy, jakož i tejblota, při které příslušné optimální podmínky může snadno zjistit každý odborník v mikrobiologické oblasti.

Bylo zjištěno, že množství sloučeninypodle vynálezu obohacjeíétf v kultivačním prostředí asiřfls dosáhne obecně svého maximaně/íaž 4 dny od začátku kultivace. 7 dnů, výhod-

Jako obecně při mikrobiologických po-stupech má se zabránit cizí infekci kultivačníhoprostředí. Za tím účelem se používá obvyklých opatře-ní, jako je sterilizace živných půd, kultivačníchnádob, jakož i vzduchu nutného k provzdušňování.

Ke sterilizaci zařízení se může používat napříkladsterilizace párou, jakož i sterilizace za sucha.

Jestliže při kultivaci vzniká v nežá-doucím množství pěna, mohou se přidávat obvykléchemické prostředky zabraňující pěnění, jako jsounapříklad kapalné tuky a oleje, emulze olejů vevodě, parafiny, vyšší alkoholy, jako oktadekanoMl,silikonové oleje, polyoxyethyleaové sloučeniny,popřípadě polyoxypropylenové sloučeniny. Pěnase může potlačit také pomocí obvyklých mechanických 17 zařízení (které například využívají odstředivých sil) nebo se pomocí těchto zařízení může zcela od- stranit.

Sloučenina podle vynálezu se může izolo-vat z kultivačního prostředí podle obecně obvyklýchfyzikálně chemických metod. Izolace se může provádětnapříklad obvyklými extrakčními postupy, srážecímipostupy nebo/a chromatografickými 3ep postupy. XXIzolovaná sloučenina se může také čistit pomocíuvedených metod na vysoce čistou látku. Pro mnohépřípady není však další jemné čištění potřebné,vzhledem k tomu, Že případně přítomné nečistotynikterak nevýhodně neovlivňují účinnost této slou-čeniny.

Aby se při shora zmíněných izolačnícha Čisticích metodách zjistily frakce, ve kterýchje sloučenina podle vynálezu přítomna v nejvyššíkoncentraci popřípadě čistotě, provádí se výhodněstanovení antibiotické účinnosti. Jako pokusnémikroorganismy se pro tento účel hodí zejménagtaphylococcus aureus 1756, Bac. subtilis ATCG 6633a Bscherichia Coli 14. 18

Izolace a čištění sloučeniny podle vy-nálezu se může provádět například v případě, jestli-že se používá kapalného vodného živného prostředí,následujícím způsobem: Po jeho obohacení ve zbytkupo kultivaci se filtrát a mycelium obvyklými metoda-mi rozdělí (například odladěním). Z filtrátu po kultivaci se může slouče-nina podle vynálezu izolovat obvyklými extrakčnímipostupy, srážecími postupy nebo/a ehromatografickýmipostupy a popřípadě se čistí. Chromátografii lzeprovádět formou sloupcová chromatografie. Jakoadsorpční prostředky se mohou používat obvyklé anorganické nebo organické adsorpční prostředky, jakonapříklad oxid hlinitý, silikagel, křemičitan hořeč-natý, aktivní uhlí, celulosa, deriváty eelulosy,syntetické pryskyřice, jako polyamidy, napříkladacetylovaný polyamid a dextraaové gely. Jako elučníčinidla se mohou používat nejrůznější rozpouštědlanebo směsi rozpouštědel, ve kterých je sloučeninapodle vynálezu rozpustná. Výhodně se používá metha-nolu nebo směsi chloroformu a methanolu (napříkladv objemovém poměru 1:1). - 19 K Izolaci sloučeniny podle vynálezu sevýhodně používá chromatografický postup, napří-klad nespecifická adsorpce na hydrofobních sorben-tech nebo jiné difuzní chromatografie na gelech.

Pro komerční výrobu sloučeniny podlevynálezu je výhodné získávání této látky adsorpcía následující desorpcí na hydrofobní pryskyřicijako nosiči (například Lewapol, což je hydrofobnípryskyřice používaná jako nosič, výrobek firmyBayer AQ). Desorpce se může provádět například pů-sobením alifatických alkoholů s krátkým řetězcem,výhodně methanolem nebo ethanolem.

Takto předčištěnou frakci lze potom opětčistit obvyklými metodami. Výhodně se přitom používádifusní chromatografie na gelech. Úspěšně probíhánapříklad chromatografie na pryskyřici (SephadexLH-2O®). Takto získaný produkt obsahuje obecně50 % čisté látky. Výhodně se k izolaci a čištění slouče-niny podle vynálezu používá dále popsaného způsobu: 20

Mycelium se oddělí z kultivační břečky,výhodně odstředěním a několikrát se extrahuje, vý-hodně dvakrát se extrahuje rozpouštědlem, které jemísitelné s vodou. Jako rozpouštědla se mohou pou-žívat nižší alkanoly s jedním až čtyřmi atomy uhlí-ku, jako ethanol nebo isopropylalkohol, jakož iketony, přičemž zvláště výhodně se používá acetonu.Vodně organický roztok se zahustí ve vakuu napříkladna 1/20 původního objemu kultivační břečky a potomse vysuší vymrazením.

Tento surový produkt se suspenduje vevodě a sloučenina podle vynálezu se extrahuje roz-pouštědlem, které žínění misitelné s vodou, jako na-příklad esterem octové kyseliny nebo ketony. Z to-hoto extraktu lze izolovat žádanou sloučeninu obvyk-lými chroraatografickými metodami, výhodně chromato-grafií na Sephadexu LH 20 a na silikagelu. se .iže izolovat tafcéz filtrátu po filtraci kultivační břečky adsorpcína aktivním uhlí popřípadě na vhodné pryskyřici.

Jako zvláště vhodnou metodou se ukázalo vázánísloučeniny podle vynálezu na nespecifickou adsorpčnípryskyřici na polystyrénové bázi (například Amberlite - 21 - ΧΑΌ, výrobek firmy Roehm and Haas , nebo LewatitOG 1031, výrobek firmy Bayer AG). Desorpce sloučeninypodle vynálezu se provádí frakcionovaně, za použi-tí směsí vody a organických rozpouštědel, zejménasměsí vody a methaaolu. Aktivní frakce zjištěnétestem proti Staphylococeus aurems 1756, se za sní-ženého tlaku zahustí až k úplnému odstraněni orga-nického rozpouštědla a zbytek se suspenduje v asi1/100 objemu filtrátu po kultivaci a vysuší se vy-dražením.

Lyofilizát se nyní suspenduje ve voděa extrahuje se výhodně ethylacetátem nebo jinýmirozpouštědly, která nejsou mísitelná s vodou. Zextraktu lze získat žádanou sloučeninu podle vyná-lezu obvyklými chromatografickými mxkgs metodami,výhodně chromátogaafií na Sephadexu LH 20 a nasilikagelu.

Jak již bylo uvedeno, má sloučeninapodle vynálezu antimikrobiální účinky. Tyto anti-bakteriální účinky je možno prokázat následujícímzpůsobem: 22 Z různých pokusných mikroorganismů se přes noc připraví kultury následujícím způsobem: Vždy za použití 1 ml této násady se na-očkuje sterilizovaná, předem temperovaná živná půda.Potom se pokusné mikroorganismy inkuhují při vhodnéteplotě na otáčející se třepačáe tak dlouho, až buňkydosáhnou logaritmické fáze. Tyto buňky se potom dá-le zřeňují sterilním, předem temperovaným živnýmprostředím, až k dosažení hodnoty (OD » Optical

Bensity « optická hustota) 0,02 až 0,04. K těmtosuspenzím se přidá účinná látka a pomocí zřeďovacíchřad se upraví různé koncentrace účinné látky.

Jestliže kontrolní násada (bez účinné látky) po vhod-né inkubaci vykazuje silné zakalení, zjistí sehodnoty 2QÍK MHK (MHK * minimální inhibiční koncen-trace), které odpovídají nejnižší koncentraci účin-né látky, při které násady nezpůsobí žádné zakalení.

Pokusy se provádějí za použití živné půdy"Antibiotika Medium 3". Inkubační čas až k měření,výchozí hodnota OD a inkubační teplota pro různépokusné mikroorganismy jsou uvedeny v následujícítabulce 1. <*>

CM <ú

r-C Jí £> tó

&amp;C Ό5 ctíJd +» O o •H +343 coΛ3Α0^3 0

OO O· trs

CM

O xť o #» o

CM o

CM

O «*

G

CM

Q ♦»

O «Φ

O ·*

O

CM

O *

G M J4fí

>O>iSJCtí COM •2 _ 43 ctí 0»,MrO>í«d O*»•H-oe

Φ o MM Ctí ,5>§+» 'CO-H OHĚp Φ0 rl ri U·dií PJI•rt £J ΟΊΘ·ΗΜ· Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ trs «* CO trs : M· XÍ* xfr xl· C—

fO O- n cn £— m c-. C~ <n £»·»

CM trs c© CO «η trs cn «* w *» . «* « et CM O 0 «rt CM rrt cn

CO

CO o o Ěl co •rt

co CO 02 •rt ϋ •rt 2 +> S J» Φ ca 02 0) h •2 •rt Í4 Φ íS rrt d .£> o 02 CO 3 CM W) CO 02 C9 xf- to í3 &amp; d r-l *3 0 H t-i rM 0 H H r-1 •rt •rt R •rt •rt •rt «rt rrt Jd O O O O O M cd cd cd O O 0 PQ « cn W ta •rt a U0 3 02 0 Φ

M 2

řM

Ellsworth 10 37 4 h 0,03

CM «*

CM

I O O 00•H +> O·+3 ω iA0,3 0©330

334>N

Oj ©M33 d 34 33 >hS ©X»•ΗΌ 0

W 1

•H

O ·»

O

CM

O «t

O c> 33 Λ 33 IA ·» x|* M· E* E*> f*3 tA f*3 M> M *» *

CM H O

W © o ra © ©

S 0

O +»

W φ +» •rl 15 © © © kO O IA O cn O t- O O © r4 O CM O o o -© o A iH r-1 £ © © > © © 0. © 0. © © © P © +» 3 ω © ta © 25 -

Sloučenina podle vynálezu má dobrý antibakteriální účinek vůči různým grampositivním a gramnegativním mikroorganismům.

Tato látka se dá používat jak v humánní,tak i ve veterinární medicíně jako terapeutikum.Zvláště nutno uvést její vhodnost k zastavení aléčení průjmových onemocnění prasat a ketozyhovězího dobytka.

Sloučenina podle vynálezu se dá používatv antibakteriálně účinných přípravcích. Zvláště vý-hodné jsou takové antibakteriálně účinné přípravky,které obsahují účinnou sloučeninu podle vynálezunebo její soli s alkalickými kovy nebo s kovyalkalických zemin. farmaceutické přípravky obsahujívedle nových sloučenin podle vynálezu obvyklénetoxické, inertní, farmaceuticky vhodné nosnélátky. Takovými farmaeeutieky vhodnými nosnými lát-kami jsou například plnidla a nastavovadla, pojidla,prostředky k udržování vlhkosti, pomocná rozpouš-tědla, urychlovače resorpce, smáčedla, adsorpční 26 - prostředky nebo klUzné látky, které mohou mít konsistenci pevnou, polopevnou nebo kapalnou.

Takovéto farmaceuticky vhodné nosné látky jsou odborníkovi známé.

Jako výhodné farmaceutické přípravkylze uvést tablety, dražé, kapsle, pilulky, granu-le, Šípky, roztoky, suspenze a emulze, pasty,masti, gely, krémy, lotiony, pudry a spraye. vVýroba těchto přípravků se provádí známými metodamiobvyklým způsobem, například smísením nové sloučeni-ny podle vynálezu s obvyklými nosnými látkami a pří-sadami. Účinná látka má být v uvedených farma-ceutických přípravcích přítomna v koncentraciod asi 0,1 do 99,5 % hmotnostního, výhodně odasi 0,5 do 95 % hmotnostních vztaženo nacelkovou hmotnost směsi.

Sloučenina podle vynálezu se může po-užívat ve všech oblastech chovu zvířat jako pro-středek ke stimulaci a urychlení růstu a ke zlep-šenému zhodnocování krmivá zdravými a nemocnýmizvířaty. 21 - Účinnost této účinné látky přitom vpodstatě nezávisí na druhu a pohlaví zvířat. Zvláštěcenná se ukazuje účinná látka při chovu a drženímladýeh zvířat a Žímýeh zvířat.

Jako zvířata, u kterých se může použí-vat účinné látky k4 podpoře a urychlení růstu a klepšímu zhodnocování krmivá, jakož i ke zlepšenípoměru masa a tuku u Matečných zvířat, lze uvéstnapříklad následující užitková a okrasná, zvířata:teplokrevná zvířata, jako hovězí dobytek, prasata,koně, ovce, kozy, kočky, psy, králíky, srstnatá zví-řata, jako je například norek a činčila, drůběž,například slepice, husy, kachny, krozany, holuby,papoušky a kanárky a studenokrevná zvířata, jakoryby, jako jsou například kapři a plazy, jakojsou například hadi.

Množství účinné látky, které se apliku-je zvířatům k dosažení požadovaného efektu, se můževzhledem k příznivým vlastnotem účinné látky měnitv širokém rozmezí. Toto množství činí výhodně asi0,oo5 až 50, zejména 0,1 až 10 mg na 1 kg tělesnéhmotnosti na 1 den. Doba aplikace se může pohybovatod několika hodin nebo dnů až do několika let. 28 - Příslušné množství účinné látky, jakož i odpovídá- ! jící doba aplikace závisí zejména na druhu, stáří,pohlaví, zdravotním stavu a způsobu chování a krme-ní zvířat a odborník je může snadno zjistit. Účinná látka se aplikuje zvířatům ob-vyklými metodami. Způsob aplikace závisí zejménana druhu, chování a na zdravotním stavu zvířat. Takse může aplikace provádět jednou nebo několikrátdenně v pravidelných nebo v nepravidelných interva-lech orálně nebo pařeníerálně. Ve většině případůje účelná orální aplikace, zejména pak výhodně současně s přijímáním potravy nebo/a nápojů zvířaty. Účinná látka se může podávat jako čistásměs látek nebo ve formě prostředků, tj. vé směsis nejedovatými inertními nosnými látkami libovolnéhodruhu, například s nosnými látkami, a v prostřed-cích, které jsou obvyklé u nutričních přípravků. Účinná látka se aplikuje popřípadě veformě prostředků společně s farmaceuticky účinnýmilátkami, minerálními solemi, stopovými prvky, vita-miny, bilkovinami, tuky, barvivý nebo/a chatovýmipřísadami ve vhodné formě. - 29 -

Lze doporučit orální aplikaci společně s krmivém nebo/a pitnou vodou, přičemž vždy podle potřeby se k účinné látce přidává veškeré množství nebo jen část krmivá nebo/a pitné vody. Účinná látka se přidává ke krmivunebo/a k pitné vodě podle obvyklých metod jednodu-chým smícháním ve formě čisté směsi, výhodně v jemnědispergované formě nebo ve formě prostředků vesměsi s poživatelnými nejedovanými nosnýma i látkami,popřípadě ve formě premixu nebo krmného koncentrátu.

Krmivo nebo/a pitná voda může obsahovatúčinnou látku například v hmotnostní koncentraci odasi 0,005 do 50, zejména 0,1 až 10 ppm. Optimálnívýše koncentrace účinných látek v krmivu nebo/a vpitné vodě je závislá zejména na množství přijíma-ného krmivá nebo/a pitné vody zvířetem a odborníkji může snadno zjistit.

Druh krmivá a jeho složeni má přitomnepodatatný význam. Mohou se používat všechny běžněpoužívané nebo speciální krmné prostředky, které ob-sahují výhodně obvyklou rovnováhu nutnou pro vyváže-nou výživu z látek energetických a stavebních včetněvitaminů a minerálních látek. Toto krmivo může obsa- - 30 - hovat například rostlinné látky, jako je napříkladseno, řepa, obilí, vedlejší produkty z obilí, dáleživočišné látky, jako je například maso, tuk, kostnímoučka, produkty z ryb, dále vitaminy, jako je na-příklad vitamin A, D-komplex a B-komplex, bílkoviny,aminokyseliny, jako je například DL-methionin aanorganické látky, jako je například vápno a kuchyň-ská sůl.

Krmné koncentráty obsahují účinnou lát-ku vedle poživatelných látek, jako je napříkladžitná mouka, kukuřičná mouka, sojová mouka nebovápno, popřípadě spolu s dalšími látkami sloužícímik výživě a výstavbě, jakož i společně s bílkovinami,minerálními solemi a vitaminy. Mohou se připravo-vat obvyklými metodami smícháním. V premixech a krmných koncentrátech lzevýhodně účinnou látku popřípadě chránit také vhodný-mi prostředky kryjícími jejich povrch, napříkladnejedovatými vosky nebo želatinou před vzduchem,světlem nebo/a vlhkostí. Příklad složení krmivá pro pěstováníkuřat, které obsahuje účinnou látku podle vynálezu: - 31 - 200 g pšenice, 340 g kukuřice, 361 g sojového šrotu,60 g hovězího loje, 15 g dikalciumfosfátu, 10 g uhli-čitanu vápenatého, 4 g jodované kuchyňské soli, 7,5 g směsi vitaminů a minerálních látek a 2,5 gpremixu účinných látek skýtá p© pečlivém promísení1 kg krmivá. V 1 kg krmné směsi je obsaženo: 600 m. j. vitaminu A, 100 m. j. vitaminu D, 10 mgvitaminu 33, 1 mg vitaminu Kj, 3 mg riboflavinu, 2 mg pyridoxinu, 20 mcg vitaminu B^2, P&amp;nto- thenátu vápenatého, 30 mg nikotinové kyseliny, 200 mg cholinchloridú, 200 mg MnSO^ . HgO, 140 mg>xSO4 . 7 H20, 100 mg PeS04 . 7 H20 a 20 mgCuS04 . 5 H20.

Premix účinné látky obsaháme účinnoulátku v požadovaném množství, například 10 mg a na-víc 1 g DL-methioninu a tolik moučky ze sojovýchbobů, aby vzniklo 2,5 g premixu. 32 Příklad složaní krmivá pro pěstování prasat, které obsahuje účinnou látku podle vynálezu: 630 g šrotu z krmného obilí (sestávajícího z 200 gkukuřice, 150 g ječného šrotu, 150 g ovesného šrotua 130 g pšeničného šrotu), 80 g rybí moučky, 60 gsojového šrotu, 60 g moučky z tapioky, 38 g pivníchkvasnic, 50 g směsi vitaminů a minerálních látekurčené pro prasata (složení například stejného jakov případě krmivá pro kuřata), 30 g moučky z lněnýchpokrutin, 30 g krmného kukuřičného mazu, 1© g sojové-ho oleje, 10 g melasy z cukrové třtiny a 2 g premixus obsahem účinných látek (složení například stejnéhojako v případě krmivá pro zvířata) skýtá po pečlivémsmísení 1 kg krmivá.

Uvedené krmné směsi jsou určeny výhodněpro pěstování kuřat popřípadě prasat, popřípadě kekrmení na žír, avšak mohou se ve stejném nebo podob-ném složení používat také při pěstování popřípadě přivýkrmu na žír jiných zvířat. 33

Jak již byl® uvedeno, není bezpodmínečněnutné používat čistou a izolovanou účinnou látku.

Je také možné používat bez čištění, popřípadě po vy-sušení kulturu vzniklou při její yýrobějkultivací.

Pro mnohé účely je také dostačující surová formaúčinné látky podle vynálezu bez dalšího jemnéhočištění. Výrobu nové sloučeniny podle vynálezublíže ilustrují následující příklady, které všakrozsah vynálezu v žádném směru neomezují. Příklad 1 Živný roztok, ve kterém se kultivujeprodukční kmen Streptomyces sp. BA 9, sestává ze3 % sojové moučky shxzxBBá zbavené tuku, 3 f gly-cerinu (87 %), 0,2 % uhličitanu vápenatého ve váděz vodovodu. Sterilišace živného roztoku se provádípo dobu 40 minut při teplotě 121 GC. Erlenmeyerovabaňka o obsahu 1000 ml, která obsahuje 150 mltohoto živného roztoku, se naočkuje produkčnímkmenem a obsah baňky se inkubuje 5 dnů při 28 °Gna otáčejícím se třepacím stroji při 280 otáčkách/min. 34

Takto získanou předběžnou kulturou se naočkuje20 litrů shora popsaného živného roztoku, kterýnavíc obsahuje 0,05 % silikonu ve fewaentátoru oobsahu 40 litrů, a obsah fermentátoru se inkubujepři 200 otáčkách/min (listové míchadlo), za přívodu10 litrů vzduchu/min, 0,1 IPa přetlaku a při teplotě28 °C po dobu 2 dnů. Obsahem tohoto fermentátoruse potom naočkuje obsah produkčního fermentátoru(obsah 600 litrů), který obsahuje 400 litrů shorauvedeného živného roztoku a navíc 0,03 $ silikonu.Inkubace této produkční kultury probíhá po dobu65 hodin při teplotě 28 °C, při přetlaku 0,1 MPa,za míchání při 60 otáČkách/min (listové míchadlo) apři provzdušňování 160 litry vzďuchu/min. Příklad 2

Suspenze kultury, která byla získánapostupem podle příkladu 1 při fermentaci 400 litrůživného roztoku, se rozdělí v separátoru (Westfalia)rychlostí 200 - 250 litrů/h. Oddělený podíl se pře-nese na sloupec 50 litrů íewatitu 00 1031 (Bayer AG)o průměru 30 cm. Postupně se promývá 500 litrydemineralizované vody, 300 litry 30$ vodného methanolu a desorbuje se 300 litry methanolu. Desorbát sezahustí za sníženého tlaku až k suchu, poté se zby-tek suspenduje ve 20 litrech vody a vysuší se vymra-zením, přičemž se získá 137 g surové sloučeninypodle vynálezu (obsah účinné látky 1,5 %). Příklad 3 Příprava čisté sloučeniny podle vynálezu filtracína gelech a chromatografií na silikagelu 50 g surového produktu získaného podlepříkladu 2 se suspenduje ve 2 litrech vody a hodnota pH suspenze se upraví oncentrované octové kyseliny na 5,0. Tato suspenze se dvakrát extrahujevždy 2 litry směsi ethylacetátu a ethanolu v obje-movém poměru 9 : 1 v dílící nálevce. Spojené organic-ké fáze se zahustí za sníženého tlaku až k suchu,zbytek se rozpustí ve 100 ml methanolu a roztok sefiltruje (filtrace na gelu) na Sephadexu LH 20v methanolu. Používá se přitom sloupce zp o průměru 7,5 cm a o délce 1,25 m. Průtočné množství činí720 ml/h. Odebírají se frakce o obsahu 200 ml. Frakceúčinné proti Staphylococcus aureus 1756 se spojí,zahustí se za sníženého tlaku, suspendují se ve - 36 vodě a vysuší se vymrazením. Výtěžek: 2,94 g 2V produktu. 600 mg takto získaného produktu se roz-pustí ve 100 ml chloroformu za přídavku 6Cyul kon-centrované octové kyseliny. Hotový sloupec Lobar v 'LiChroprep 60 (40 - 63 /um, Merck, typ B) se ekvi-libruje chloroformem za přídavku 0,1 % koncentrovanéoctové kyseliny (objem/objem) a shora získaný roztokse přenese na tento sloupec. Po eluci 400 ml shorauvedeného rozpouštědla se látka eluuje směsí chlo-roformu, methanolu a octové kyseliny v poměru 98:2:0,1Množství elučního činidla činí 400 ml/h. Odebírajíse frakce o obsahu 10 ml.

Tyto frakce se analyzují chromatografiína tenké vrstvě na silikagelových destičkách (Merck5729). EgQ&amp;XSg Biologicky aktivní jednotné frakce,které se zbarvují směsí chloridu železitého a kyseli-ny sírové se zahustí až k suchu, tento zbytek se sus-penduje v malém množství vody a vysuší ee vymrazením. Výtěžek: 76,2 mg 98&amp; produktu. 37

Příklad A

Skopei, který denně dostává 650 ghrubě mletého krmivá pro ovce a 250 g selenýchsušených kukuřičných palic, se pomocí baehorovépištěle odebírá kapalina z bachonu. Hotové krmivose pomocí automatu podává ve dvanácti stejných čás-tech ve dvouhodinovém intervalu a kukuřičné palicese podávají ve dvou stejných částech v 8,30 až16,15 h. Kapalina z bachoru se bezfctrostředně pozískání podrobuje následující proceduře. 2,5 mlinokula z bachoru se předloží do zkumavky o obsahu13 ml propláchnuté oxidem uhličitým, která kromětoho obsahuje následující přísady: 100 mg jemně rozemletého hotového krmivá pro ovce 7,5 ml roztoku pufru 0,5 ml roztoku se sloučeninou podle vynáezu popřípadě bez sloučeniny podle vynálezu.

Složení roztoku pufru, který byl předzahájením pokusu nasycen oxidem uhličitým, bylonásledující: 38 - hydrogenfosforečnan sodný (Na2HP04) 4,61 g na hydřogehuhličitan sodný 12,25 g na chlorid sodný 0,59 g na chlorit draselný Q*71 g na chlorid horečnatý 0,32 g na chlorid vápenatý 0,13 g na K dosažení potřebného množství

Složení roztoku pufru, který byl před započetím pokusu nasycen oxidem uhličitým* je ná- sledující: litr vody litr vody litr vody litr vody litr vody litr vody sloučeni- ny podle vynálezu, tj. 10, 20, JO nebo 40/Ug na jed-nu dávku, se uvedené množství rozpustí v 0,25 mlethanolu a potom se přidá 4,7$ ml vody. Z tohotoroztoku se pomocí pipety odměří 0,5 ml roztoku dozkumavky. Potom činí celkový objem fermantační směsi 10,5 ml. Negativní kontrolní vzorky (tj. násady beztestované látky) byly získány rovněž přidáním 0,5 ml5% roztoku ethanolu. Pro každou jednotlivou dávkubyl pokus vždy čtyřikrát opakován. Každá zkumavka seuzavře Bunsenovou zátkou a obsah zkumavky se kultivu-je při teplotě 39 °C. Po damt 2, 4, 6 a 8 hodináchse násady vždy ručně protřepají. Po 24 hodinové kul- - 39 - •tivaci se z násad odebere 1,0 ml fermentační kapali-ny a odměří se do Eppendorfovy nádoby, která obsahu-je 0,2 ml 10$ fosforečné kyseliny (s obsahem 5,7 yumol2-methylvaleřové kyseliny). Vzorky se odstředí při10 000 g a ze zbytku se plynovou chromatografií sta-noví koncentrace těkavých mastných kyselin. Výsledky analýzy jsou shrnuty v dáleuvedené tabulce a. Uvedená data (poměr octové kyseli-ny a propionové kyseliny a celková produkce mastnýchkyselin) jsou vyjádřena jako procento negativní kon-troly. T a 1 sulka a množství účinné poměr octové celkový obsah sloučenina kyseliny a pro- mastných ky- (yug/násada) pionové kyseliny selin ($) ($) 10 20 99,7 7M 103,3 107,9 30 78,8 W,7 40 79,9 96,0 40 - Z tabulky a je patrno, že poměr acetátuku propionátu se podstatně sníží a tím se zlepšíjzvýšenou tvorbou propionátu z uhlohydrátů docházíke zlepšenému zhodnocování krmivá. Zvýšená účinnostkvašení jde jen v nepatrné míře na úkor celkové pro-dukce mastných kyselin, jak je rovněž patrno ze sho-ra uvedené tabulky a.

Příklad B

Kohoutci pěstovaní na žír (brojleři)

Pro pokus se použije zvířat chovaných vklecích o stáří 3 až 5 dnů. Pokus trvá po dobu 14 dnů. Během této deby dostávají zvířata krmivo,ke kterému byla přimíchána sloučenina podle vynálezuv dávce 10 popřípadě 25 ppm. Současně se provádí negativní kontrola (zvířata dostávají krmivo bez přímě-si úiinné sloučeniny podle vynálezu). Ha začátkupokusu mají všechna zvířata jedné pokusné skupinystejnou výchozí hmotnost.

Jako kritérií pro hodnocení pokusu se pou-žívá hodnot hmotnostního přírůstku, spotřeby krmiváa zhodnocení krmivá. - 41 Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce b.

Charakteristika zvířat a krmivá tříděné hybridy na žír, samci 24 zvířat/pokus (4 x 6) hmotnost 50 až 65 g krmivo: jednotné krmivo pro kuřata Hoveler KÁ 57bez přísad antibiotik a kokcidiostatiknásleduj i čího složení:

Složky určující hodnotu krmivá 18 ^surového proteinu 7 % ^surové vlákniny 8 %ypopele / 1 %|draslíku0,7 % fosforu

Složení 54 % Šrotu z krmného obilí (40 % kukuřice, 12 % pšenice) 17,5 % sojového Šrotu5,2 % zmašovatělého kukuřičného škrobu - 42 - 5,2 % pšeničné krmné mouky 3,1 % rybí moučky 3,1 % tapiokové moučky 3,1 % mleté zelené vo«jtěšky 3 2,1 % pšeničných klíčků (rozmělněných)1,7 % rybí kostní moučky1,6 % syrovátky 1,4 % uhličitanu vápenatého pro krmivá1,0 % fosforečnanu vápenatého pro krmivá1,0 % melasy přídavek účinné sloučenina ppm

Tabulka B hmotnostní spotřebapřírůstek krmivá zhodnoceni krmivá 10 108 % 97 % 108 % 83 % 90 % 86 %

Claims (2)

1. - 43 - PŘEDMĚT VYNÁLEZU ADVOKÁTNÍ PORADNA č. W115 104 PRAHA 1, ŽHná 25

   1. Prostředek k podpoře a urychlenírůstu zvířat, jakož i k lepšímu zhodnocování krmivázvířaty, vyznačující se tím, že jako účinnou složkuobsahuje organickou chemickou sloučeninu, která jecharakterizována a) IČ absorpčním spektrem Ýtaehnika~KBr| antibiotikaobsahujícího sodík s charakteristickými absorpčními pásy při následují!ch vlnových číslech vyjádřených v cm”1 3456 1265 2960 11782910 1145 1750 1115 * 1700 1030

   - 44 - b) ^H-jaderným resonaněním spektrem ^odle udávaným v dílech na jeden milion a kmitech najednu sekundu; e) “o-daderným resonaníním spektrem-^edEWArv-^ d) elementární analýzou /po 2 dnech suSení ve vysokémvakuu při teplotě 30 °C> 61,1 až 62,3 % C, 5,2-6,4 % H, 27,5-30,0 % 0; e) sumárním vzorcem (C14-16H16-20°4-6}n5 f) sumárním vzorcem sloučeniny, která obsahuje sodík (C29-31H33-37°9-llNa)n} g) rozpustností^ 4*3» "dobrou rozpustnost^ v ethyl-acetátu, chloroformu, methanolu a nižších alko-holech a Špatnou rozpustností ve vodě; h) barvitelností uvedenou sloučeninu lze po chromátografii na tenké vrstvě silikagelu barvitpomocí směsi chloridu želežitého a kyseliny sírové. - 45 -
2. 2. Způsob výroby organické chemické slou-čeniny charakterizované v bodě 1 a účinné podle bodu 1,vyznačující se tím, že se kultura mikroorganismu BA 9,který odpovídá č. 3025 v německé sbírce mikroorganismů,a jeho mutanty a varianty kultivují za aerobních pod-mínek kultivace při teplotě mezi 16 a 42 °G při pHmezi 6 a 8,5 ve vodném kultivačním prostředí, kteréobsahuje 0,5 až 8 % hmotnostních zdroje uhlíku, 0,1 až5 % hmotnostních zdroje dusíku, 0,001 až 0,5 % hmot-nostního minerálních solí a až 0,5 % hmotnostníhoprostředku proti pěnění. Zastupuj JUDr. MMVŠETEČKA AdvokáM/yo^dia č. 10115 04 RaHA 1, Žitná 2S 55 747/Vš