HU193835B

HU193835B - Microbiological process for preparing organic compounds

Info

Publication number: HU193835B
Application number: HU854558A
Authority: HU
Inventors: Erwin Bischoff; Olga Salcher; Friedrich Berschauer; Martin Scheer; Jong Anno De; Klaus Frobel; Hartwig Mueller
Original assignee: Bayer Ag
Priority date: 1984-11-30
Filing date: 1985-11-28
Publication date: 1987-12-28
Also published as: US4670260A; EP0183214B1; AU584946B2; EP0183214A2; FI854708A0; AU5034585A; DE3443681A1; KR860003783A; HUT41066A; JPS61149096A; FI854708A; ATE46699T1; CS858585A2; DK554185D0; EP0183214A3; PL256535A1; DK554185A

Description

A találmány tárgya mikrobiológiai eljárás új szerves vegyületek, valamint hatóanyagként ezeket tartalmazó antibiotikus és növekedés- és tápanyaghasznosítás-íokozó hatású készítmények előállítására.

A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek a következő tulajdonságokkal és paraméterekkel jellemezhetők:

1. A nátriumtartalmú antibiotikum IR-KBr-abszorpciós spektrumát az 1. ábra mutatja (abszcissza: hullámszám (cm¹), ordináta: abszorpció).

A következő hullámhosszoknál (cm^-1) mutatkoznak jellemző abszorpciós sávok:

3456 1265

2960 1178

2910 1145

1750 1115

1700 1030

1635 950

1540 930

1395 825

2. Ή-magrezonancia spektrumot a 2. ábra mutatja, ppm és rezgés/sec értékekben. A spektrumot 300 MHz térerősségnél, deutcro-mctanolos oldatban, tetrametil-szilán deutero-metanolos oldatával mint belső standarddal vettük fel.

3. A ^l3C-magrezonancia spektrumot a 3. ábra mutatja. Az 'H-magrezonancia spektrumnál használttal azonos oldatban, 75,48 MHz térerősségnél felvéve.

4. Elemanalízis (két napi 30°C-on nagyvákuumban végzett szárítás után): C 61,1 — -62,3%, H 5,2—6,4%, 0 27,5—30,0%/

5. összegképlet: (C₁₄_₁₆H₁₆__2o0₄^)„. Megjegyzendő, hogy nagymolekulájú természetes anyagoknál az elemanalízis hibahatára nagyobb, mint a szokásos, ezért az összegképlet pontos meghatározása nem lehetséges (R. B. Woodward, Angew. Chem. 69, 50-51 /1957/).

6. A nátriumtartalmú vegyüiet összegképlete:

( 29-31 H ₃₃_3₇Ο<[_| ι N a ) „.

7. A vegyület jól oldódik etil-acetátban, kloroformban, metanolban és rövidszénláncú alkoholokban, rosszul oldódik vízben.

8. A vegyület kieselgel vékonyréteg-kromatog· rafiában FeCl₃/H₂SO₄ rendszerrel megfesthető. A reagenst a szokásos előírások szerint készítettük (v.ö. E. Stahl, Dünnschichtchromatographie, 2. kiadás, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, 1967).

9. A vegyület antibakteriális hatását az 1. táblázatban foglaltuk össze.

A találmány kiterjed továbbá új, a Streptomycetaceae családba tartozó mikroorganizmusokra is, amelyek szén- és nitrogénforrást, valamint ásványi anyagokat tartalmazó tápközegen tenyésztve az 1-9. pontok alatt felsorolt tulajdonságokkal és paraméterekkel jellemezhető vegyületet termelnek, ahol a tulajdonságok közül az 1. ábrán bemutatott IR-KBr-abszorpciós spektrum különös jelentőséggel bír.

A találmány szerinti eljárás szempontjából a Streptomyces nemzetségbe tartozó BA9 mikroorganizmus törzs különösen fontos.

A törzs koncentrálását és izolálását a szokásos Actinomyceta-izolálási módszerrel végeztük úgy, hogy talajmintákat Petri-csészékben szélesztettünk, négy_;hat hétig tenyésztettünk, majd az egyes kolóniákat átoltottuk (Williams, S.T. ésGross, T. (1971). Actinomycetes. In Methods in Microbiology 4, 295-334. Booth, C., (szerk.), London-New York, Academic Press).

Az új Streptomyces törzset, laboratóriumi jele BA 9, 1984. augusztus 6-án DSM 3025 számon letétbe helyeztük a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Griesbachstrasse 8., 3400 Göttingen, BRD letéti helyen.

Ügy találtuk, hogy a találmány szerinti vegyületekhez jutunk, ha Streptomycetaceae családba tartozó megfelelő mikroorganizmusokat asszimilálható szén- és nitrogénforrást, valamint ásványi sókat tartalmazó tápközegen aerob körülmények között tenyésztünk, és a vegyületeket szokásos módszerekkel izoláljuk.

A találmány szerinti eljárásban különösen a Streptomycetes BA 9 törzs (valamint mutánsai és variációi) alkalmazhatók.

Ez a törzs az Actinomycetales nemzetségbe tartozó baktériumokhoz, a Streptomycetaceae családhoz, és a Streptomyces nemzetséghez tartozik, a talajból izoláltuk.

A BA 9 törzs taxonómiai meghatározását a Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 8. kiadás (1974), valamint az International Journal of Systematic Bacteriology 16, 313-340 (1966) és a The Prokariotes 2, 2028-2090 (1981) alapján végeztük.

1. Morfológia

Jó spórázódást csak szervetlensó-keményítő-agaron (ISP 4. tápközeg összetételt lásd később) figyeltünk meg. Más tápközegeken (ISP 1 -3, és 5. tápközegek) kevés légmicélium, illetve csak szubsztrátmicélium képződött.

ISP 1. tápközeg 10 g/1 D-mannittal kiegészítve (összetételt lásd később) Légmicéliumok (ISP 4. tápközeg, 28°C, 7 nap)

Szín: 7 nap után szürke

Spóralánc: spirál típusú

Spórák: enyhén érdesek (elektronmikroszkóppal), hengeresek szélesség kb. 1,1-1 pm, hosszúság kb. 1,4-1,6 pm.

Szubsztrátmicéliumok

Szín: vörösbarna, különösen az ISP 3. és 5. tápközegeken.

Sejtfalanalízis

1. sejtfaltípus, fő alkotóelemek LL-diamino-pimelinsav és glicin.

2. Fiziológia

Hőmérsékletoptimum 28°C (ISP 1. tápközeg, 5 nap) ISP 7. tápközegen (tirozin-agar)

-2193835 növekedés nem figyelhető meg. Melanin az ISP 6. tápközegen képződik. A növekedést Chloramphenicol (10 pg), Erytromycin (10 pg), Sulphafurazo! (100 pg), Streptomycin (10 pg) Tetracyclin (10 pg), Cephaloridin (5 pg), Fusidinsav (10 pg), Lincomycin (10 pg), Novobiocin (5 pg) gátolja (ISP 1. tápközeg, 28°C, 2 nap). Jó a növekedés ISP 3., 4 és 5. tápközegen, csekély légmicéliumképződéssel az ISP

3. és 5. tápközegen.

ISP 4. tápközeg (szervetlensó-keményítőagar)

Keményítő (oldható) 10,0 g

K₂HPO₄ (vízmentes) 1,0 g

MgSO₄'7 H₂O 1,0 g

NaCl 1,0 g (NH₄)₂SO₄ 2,0 g

CaCO₃ 2,0 g

Nyomelemoldat 1,0 ml

Ionmentes víz 1000,0 ml

Nyomelemoldat

FeSO₄-7H₂O 0,1 g

MnCl₂-4H₂O 0,1 g

ZnSO₄-7 H₂O 0,1 g

H₂O ionmentes 100,0 ml

ISP t. tápközeg (tripton-élesztőkivonat-agar) mannittal kiegészítve

Bacto-tripton (Difco) 5,0 g

Bacto-élesztőkivonat (Difco) 3,0 g

Bacto-agar (Difco) 15,0 g

D-mannit 10,0 g

Ionmentes víz 1000,0 ml

További tápközeget lásd Int. J. Syst. Bact. 16, 313-340 (1966).

Szénforrás-hasznosítási teszt

A szénforrás-hasznosítást alap agaron az

Int. J. Syst. Bact. 16, 313-340 (1966) helyen ismertetett módszerrel vizsgáltuk. Negativ-kontrollként a növekedést szénforrást nem tartalmazó alap agarral hasonlítottuk össze.

Szénforrás (10 g/l) Növekedés^

Kontroll (szénforrás nélkül) —

D-glükóz +

D-xilóz —

L-arabinóz —

L-ramnóz -jD-fruktóz +

D-galaktóz +

Raffinóz —

D-mannit +

Mezo-inozit —

Szalícin —

Szacharóz —

Ribóz

Mannóz —

Maltóz —

Laktóz ±

Mellobióz —

Cellulóz —

Acetát — *Megjegyzés: -(-= növekedés —= nincs növekedés ±= az eredmény nem egyértelmű

A BA 9 törzset, amelyet egy Izraelből (Jeruzsálemből) származó talajmintából izoláltunk, a morfológiai adatok alapján a Streptomycesek szürke szériájába (Cinereus csoport) sorolhatjuk. A fiziológiai tulajdonságok a Bergey’s Manualban ismertetett törzsek egyikével sem egyezik teljesen.

Taxonómiai jelölés: Streptomyceg sp.

A találmány szerinti vegyületek előállításához a szokásos, szén- és nitrogénforrást, valamint a szükséges sókat tartalmazó tápközeget használjuk.

Alkalmazott szénforrások lehetnek: szénhidrogének, különösen poliszacharidok, mint például keményítő, monoszacharidok, mint például glükóz vagy fruktóz. Használhatók továbbá cukoralkoholok, mint például mannit vagy glicerin, ezenkívül természetes elegyeik, mint például malátakivonat vagy desztillációs maradék, valamint az említett anyagok keverékei.

Nitrogénforrásként alkalmazhatjuk a szokásos nitrogénforrásokat, mint például fehérjéket, fehérje hidrolizátumokat, aminosavakat, ammóniumsókat, természetes komplex anyagokat, mint például szójaliszt, húskivonat, élesztőkivonat, tejpor és az említett anyagok elegye.

A tápközegekben segédanyagként ásványi sókra van szükség, például kálium, nátrium, kalcium, magnézium, vas, cink és mangán foszfátjára vagy kloridjára. Ezeknek az anyagoknak a koncentrációja széles határok között változhat. Az ásványi sók szükséges koncentrációja részben jelen lehet a fent felsorolt szén- és nitrogénforrásként szolgáló anyagokban vagy a vízben mint szennyezés.

Segédanyagként használhatunk még ezenkívül különféle habzásgátlóanyagokat, mint például poliolokat vagy szilikonokat.

A találmány szerinti vegyületek előállítása a szokásos szilárd, félszilárd vagy folyékony tápközegeken történhet. Előnyösek a vizes folyékony tápközegek.

A tápközegek beoltása a szokásos módszerekkel történhet, például ferde tenyészet vagy kémcsőtenyészet segítségével.

A tenyésztést aero.b körülmények között, a szokásos módon végezhetjük, például rázatott tenyészetben, pl. rázatott csövekben, levegővel'mozgatott tenyészetekben vagy szubmerz tenyészetben. A tenyésztést előnyösen aerob szubmerz eljárással, levegőztetett fermentorban, pl. szokásos szubmerz fermentorban végezzük. A tenyésztést végezhetjük folyamatosan vagy szakaszosan. Előnyösen szakaszosan dolgozunk.

A találmány szerinti vegyületek előállítása, során aerob körülmények között dolgozunk, a tenyésztést a szokásos módszerekkel, így például rázatott tenyésztéssel vagy levegőztetett fermentációval végezhetjük. A tápközeg összetevőinek százalékos aránya széles határok között változhat, a szénforrást általában 0,5—8%, előnyösen 0,6—6%, a nitro3

-3193835 génforrást 0,1—5%, előnyösen 0,5—2%, a sókat szokásos koncentrációban, előnyösen 0,001-0,5% koncentrációban alkalmazzuk, ahol a százalékos értékek tömeg/térfogat értékeket jelölnek. A habzásgátlót 0,5% koncentrációban alkalmazzuk. A tápközeg sterilizálását 100-140°C-on, előnyösen 120-130°C-on végezzük.

A szaporodó tenyészet pH-ját előnyösen mintegy 6 és mintegy 8,5, különösen 6,5 és 8,0 közötti értéken kell tartani. A pH túl erős csökkenését a savas közegben megakadályozhatjuk egy szerves vagy szervetlen bázis, előnyösen kalcium-karbonát adagolásával. Amint az a fermentációs technikában szokásos, automatikus pH-szabályozás is végezhető úgy, hogy steril szerves vagy szervetlen savat, pl. kénsavat vagy steril lúgot, pl. nátrtum-hidroxidot permetezünk időnként a tenyészoldathoz.

Célszerű biztosítani azt, hogy a mikroorganizmusok oxigénnel, valamint a tápanyagokkal megfelelően érintkezésbe kerüljenek. Ez a szokásos módszerekkel, mint például rázással vagy keveréssel elérhető.

A tenyésztési hőmérséklet mintegy 16°C és mintegy 42°C között, előnyösen 24°C és 32°C között, különösen előnyösen 28°C körül van. A tenyésztés ideje széles határok között változhat, ebben például szerepe van a tápközeg összetételének és a tenyésztési hőmérsékletnek. A mindenkori optimális körülményeket mikrobiológiai területen jártas szakember könnyen meghatározhatja.

Ügy találtuk, hogy a tenyészközegben felszaporodó találmány szerinti vegyület maximális koncentrációját a tenyésztés kezdetétől számított mintegy 1 — 7, előnyösen 1—4 nap alatt eléri.

Mint általában a mikrobiológiai eljárásoknál, a tápközeg befertőződését el kell kerülni. Ennek érdekében megtesszük a szokásos intézkedéseket, így a tápközeg, tenyésztő edények, valamint a levegőztetéshez szükséges levegő sterilizálása. A berendezések sterilizálása történhet gőzzel vagy száraz sterilizálással.

Amennyiben a tenyésztés során nem kívánt mennyiségű, hab képződik, a szokásos kémiai habzásgátlók adagolhatok, így például folyékony zsiradékok és olajok, olaj-víz-emulziók, paraffinok, hosszabb szénláncú alkoholok, pl. oktadekanol, szilikonolajok, polioxi-etilén-, illetve polioxi-propilén-származékok. A habzást a szokásos mechanikai berendezések segítségével (amelyek pl. a centrifugális erőt használják ki) is megszüntethetők.

A találmány szerinti vegyületeket a tenyészközegből az általában szokásos fizikai-kémiai módszerekkel lehet elválasztani, így extrakcióval, kicsapással és/vagy kromatográíiával. Az elválasztott vegyületeket az említett módszerekkel tovább lehet tisztítani. Sok esetben a tisztítás nem szükséges, mert az adott esetben jelenlevő szennyezés a vegyület hatékonyságát nem befolyásolja károsan. 4

Annak megállapítását, hogy a fent említett izolálási és tisztítási műveletekkel kapott frakciók melyikében vannak a találmány szerinti vegyületek a legnagyobb koncentrációban jelen, előnyösen az antibiotikus aktivitás meghatározásával végezzük. Tesztorganizmusként előnyösen Staphylococcus aureus 1756, Bac. subtilis ATCC 6633 és Escherichia coli 14 használható.

A találmány szerinti vegyületek izolálása és tisztítása vizes tápközeg esetén úgy végezhető, hogy miután a vegyületeket a tenyésztőközeg maradékában feldúsítottuk, a tenyészközeg szürletét és a micéliumokat a szokásos módszerekkel (pl. centrifugálással) elválasztjuk.

A találmány szerinti vegyületek a tenyészközeg szürletéből a szokásos extrakciós, kicsapásos és/vagy kromatográfiás eljárásokkal izolálhatok és adott esetben tisztíthatok. A kromatográfiát oszlopkromatográfia formájában végezhetjük. Adszorpciós szerként a szokásos szervetlen vagy szerves adszorpciós szerek alkalmazhatók, így alumínium-oxid, szilikagél, magnézium-szilíkát, aktívszén, cellulóz, cellulózszármazékok, műgyanták, mint pl. poliamidok, pl. acetilezett poliamidok vagy dextrángélek. Futtatószerként különböző oldószerek vagy oldószerelegyek alkalmazhatók, amelyekben a találmány szerinti vegyületek oldhatók. Előnyösen metanolt vagy kloroform és metanol elegyét (pl. 1:1 térfogatarányban) alkalmazzuk.

A találmány szerinti vegyületek elválasztását előnyösen kromatográfiás eljárással végezzük, pl. nem- specifikus adszorpcióval hidrofób szorbenseken vagy géldiffuziós kromatográfiával, amelyek a vízben rosszul oldódó természetes anyagok tisztításának ismert módszerei.

A találmány szerinti vegyületek kereskedelmi méretekben történő előállítását előnyösen hidrofób hordozógyantán történő adszorpcióval, majd azt követő deszorpcióval végezzük. Hidrofób hordozógyantaként használható például Lewapol, Bayer Ag. gyártmánya. A deszorpciót például rövidszénláncú alifás alkoholokkal végezhetjük, előnyös a metanol vagy az etanol alkalmazása.

-Az így előtisztított frakciót a szokásos módszerekkel tovább tisztítjuk. Ezt előnyösen géldiffuziós eljárással végezzük. A Sephadex LH-20*· felhasználásával végzett kromatográfia megfelelően végbemegy. Az így nyert termék tisztasága általában nagyobb, mint 50%.

A találmány szerinti vegyületeket előnyösen a következőképpen izoláljuk és tisztítjuk:

A micéliumokat a tenyészközegből előnyösen centrifugálással elválasztjuk, és vízzel elegyedő oldószerrel többször előnyösen kétszer extraháljuk. Oldószerként rövidszénláncú alkoholok, például etanol vagy izopropanol, valamint ketonok, ezek közül különösen aceton alkalmazható. A vizes szerves oldószeres oldatot vákuumban, pl. a tenyészközeg mint-4193835 egy huszadrészét kitevő térfogatra betöményítjük, és fagyasztva szárítjuk.

Ezt a nyers terméket vízzel szuszpendáljuk, és a találmány szerinti vegyületeket vízzel nem elegyedő oldószerrel, például ecetsav-észterekkel vagy ketonokkal extraháljuk. Ebből az extraktumból a vegyületeket szokásos kromatográfiás módszerekkel, előnyösen Sephadex LH 20* -en vagy szilikagélen végzett kromatográfiával izolálhatjuk.

A vegyületeket a tenyészközeg szürletéből is izolálható, aktívszénen, illetve alkalmas gyantán történő adszorpcióval. Különösen alkalmas módszernek bizonyult a találmány szerinti vegyületeknek polisztirol-bázisú nem-specifikus adszorbergyantán történő megkötése. Ilyen gyanta például az Amberlite XAD, Roehm und Haas gyártmánya vagy a Lewatit OC 1031, Bayer gyártmánya. A találmány szerinti vegyületek deszorbeálását frakcionáltan, víz és szerves oldószerek keverékével, előnyösen víz-metanol-eleggyel végezzük. A Staphylococcus aureus 1756-tal végzett teszt alapján aktívnak mutatkozó frakciókat csökkentett nyomáson a szerves oldószer teljes eltávolításáig betöményítjük, és a maradékot a tenyészközeg térfogata mintegy századrészének megfelelő térfogatra szuszpendáljuk és fagyasztva szárítjuk.

A liofilizátumot vízzel szuszpendáljuk, és előnyösen ecetsav-etilészterrel vagy más, víz1. táblázat zel nem elegyedő oldószerrel extraháljuk. Az extraktumból a találmány szerinti vegyületeket szokásos kromatográfiás módszerekkel, előnyösen Sephadex LH 20 -en és szilikagélen végzett kromatográfiával nyerhetjük ki.

Ahogyan már említettük, a találmány szerinti vegyületek antibakteriális hatással rendelkeznek. Ezt a következőképpen igazoljuk:

Különböző tesztorganizmusokkal egy éj10 szakás tenyészeteket készítünk: ezekből 1 mlrel steril, előtemperált tápközegeket oltunk be. Ezután a tesztorganizmusokat megfelelő hőmérsékleten, rázógépen addig inkubáljuk, míg a sejtek a log-szakaszt el nem érik. Ezeket az15 után steril, temperált tápközeggel 0,02-0,04 OD₅₇₈ értékig (ÓD=optical density=látható extinkció) hígítjuk. Ezeket a szuszpenziókat adjuk a hatóanyaghoz, és hígítási sorokkal különböző hatóanyagkoncentrációkat állítunk elő. Amikor a kontrollminták (hatóanyag nélkül) megfelelő inkubálás után erős zavarosságot mutatnak, kiértékeljük az MHK értékeket (MHK=minimális gátlókoncentráció), amelyek annak a hatóanyagkoncentrációnak felelnek meg, ahol a minta zavarosságot nem mutat.

A kísérleteket antibiotikum 3. tápközeggel végeztük. Az inkubálási időt a mérésig, a kiindulási OD értéket és az inkubálási hőmérsék30 letet a különböző tesztorganizmusok esetén a következő táblázatban foglaljuk össze:

Tesztorganizmus	MHK ( jug/ml)	Inkubálási hőmérséklet (°C)	Inkubálási idő a mérésig (óra)	0D₅ 7 8
Bacillus brevis	2,5	37	6	0,02
Bacillus cereus	0,6	37	5	0,04
Bacillus subtílis	0,6	37	4,5	0,02
ATCC 6633 E. coli 14	1,3	37	4	0,02
E, coli A 261	2,5	37	4	0,02
Proteus vulgáris	1,3	37	4	0,04
Pseudomonas	10	27	4	0,02
aeruginosa Pseudomonas aeru-	10	37	4	0,03
ginosa Ellsworth Serratia mareescens	í 2,5	30	4,5	0,02
Staphylococcus aureus A 1756	1,3	37	4	0,02
Staphylococcus aureus P 209	0,6	37	4	0,02

A találmány szerinti vegyületek jó anti- θθ bakteriális aktivitást mutatnak különböző Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumokkal szemben.

A taTálmány szerinti vegyületek tehát mind humán, mind állatgyógyászatban gyógyszer- _ccként használhatók. Különösen jelentős a ser- ^ö tés-dizentériában és szarvasmarhák ketózisában való alkalmazhatósága.

A találmány szerinti vegyületek tehát antibakteriális hatású gyógyszerkészítmények hatóanyagaként használható. Különösen előnyösek azok az antibakteriális hatású készítmények, amelyek a találmány szerinti vegyü5

-5193835 leteket vagy azok alkáli- vagy alkáliíöldfém-sóit tartalmazzák.

A találmány szerinti gyógyszerkészítmények a találmány szerinti új vegyületek mellett a szokásos nem-toxikus inért gyógyszerészeti hordozóanyagokat tartalmaznak. Ilyen gyógyszerészeti hordozóanyagok például a töltő- és hígítóanyagok, kötőanyagok, nedvesitőszerek, oldódásgátlók, reszorpciógyorsitók, nedvesítőszerek, adszorbeálószerek és sikosítóanyagok, amelyek lehetnek szilárdak, íélszilárdak vagy folyékonyak. Az ilyen alkalmas gyógyszerészeti hordozóanyagok szakember számára ismertek.

Előnyös gyógyszerkészítmények a tabletták, drazsék, kapszulák, pirulák, granulátumok, kúpok, oldatok, szuszpenziók és emulziók, paszták, kenőcsök, zselék, krémek, lemosószerek, púderek és sprayk. Ezeknek a készítményeknek az előállítása ismert módon történik, például úgy, hogy a találmány szerinti új vegyületeket a szokásos hordozó- és egyéb segédanyagokkal összekeverjük. A hatóanyag koncentrációja a készítményben 0,1-99,5 tömeg%, előnyösen 0,5-95 tömeg% a készítmény egészére számítva.

A találmány szerinti új vegyületek az állattenyésztésben növekedésfokozóként és a tápanyag hasznosítását fokozó szerként használható, mind egészséges, mind beteg állatok esetén.

A hatóanyag hatékonysága ebben az esetben független az állatok fajtájától és nemétől. Különösen hasznosnak bizonyulnak a hatóanyagok fiatal és hízzóállatok nevelésénél és tartásánál.

Például a következő állatoknál lehet a hatóanyagokat a növekedés fokozására és gyorsítására, a takarmányhasznosítás javítására, valamint a hús/zsír arány javítására alkalmazni:

Melegvérük, például szarvasmarha, sertés, ló, birka, kecske, macska, kutya, nyúl, prémállatok, például nyérc és csincsilla, szárnyasok, például tyúk, kacsa, liba, pulyka, galamb, papagályés kanári, továbbá hidegvéruek, például halak, pl. ponty, hüllők, például kígyó.

A hatóanyagmennyiség, amelyet az állatoknak adunk a kívánt hatás elérése érdekében, a hatóanyag előnyös tulajdonságai következtében széles határok között változtatható. Előnyösen mintegy 0,005-50, különösen 0,1-10 mg/testsúly-kg naponta. Az adagolás ideje néhány órától vagy naptól több évig tarthat. A hatóanyag megfelelő mennyisége és az adagolás megfelelő ideje függ az állat fajtájától, korától, nemétől, egészségi állapotától, valamint a tartás és takarmányozás formájától, és szakember által könnyen beállítható.

Az állatoknak a hatóanyagot a szokásos módon adjuk. Az adagolás módja különösen az állat fajtájától, viselkedésétől és egészségi állapotától függ. így az adagolás történhet 6 egyszer vagy többször naponta, rendszeres vagy rendszertelen időközökben orálisan vagy parenterálisan.

Célszerűségi okokból a legtöbb esetben előnyös, ha az adagolás az állatok takarmányozási és/vagy itatási ritmusának megfelelően orálisan történik.

A hatóanyagot anyagkeverék formájában vagy formulázott formában, tehát valamely nem-toxikus, inért hordozóanyaggal keverve, a tápkészítmények esetén szokásos formában adagolhatjuk.

A találmány szerinti hatóanyagot adagolhatjuk, adott esetben formulázott alakban, más gyógyszerkészítményekkel, ásványi sókkal, nyomelemekkel, vitaminokkal, fehérjékkel, zsírokkal, színezékekkel és/vagy zamatanyagokkal együtt, alkalmas formában.

Az orális adagolást előnyösen a takarmánnyal és/vagy ivóvízzel együtt végezzük, ilyenkor a hatóanyagszükséglettől függően a takarmány és/vagy ivóvíz teljes egészéhez vagy csak egy részletéhez keverjük.

A hatóanyagot a szokásos módszerek szerint a takarmányhoz és/vagy ivóvízhez egyszerűen hozzákeverve mint tiszta anyagkeveréket, előnyösen finoman eloszlatott formában vagy formulázott formában nem-oxikus ehető hordozóanyaggal keverve, adott esetben premix vagy tápkeverék formájában adagoljuk.

A takarmány és/vagy ivóvíz a hatóanyagot például 0,005-50 ppm, előnyösen 0,1-10 ppm mennyiségben tartalmazhatja. A takarmány és/vagy ivóvíz optimális hatóanyagkoncentrációja függ az állatok takarmány és/vagy ivóvíz felvételétől, és szakember által könnyen beállítható.

A takarmány fajtája és összetétele nem játszik szerepet. Bármilyen szokásosan alkalmazott vagy speciális takarmányősszetétel alkalmazható, amelyek előnyösen a szokásos, kiegyensúlyozott tápláláshoz szükséges energia- és építőanyagokat, beleértve a vitaminokat és ásványi anyagokat is, tartalmazzák. A takarmány állhat például növényi anyagokból, pl. széna, répa, gabona, gabonafeldolgozási melléktermékek, állati eredetű anyagokból, pl. hús, zsiradékok, csontliszt, halfeldolgozási termékek, vitaminokból, pl. A-vitamin, D-vitaminkomplex, B-vitaminkomplex, proteinekből, aminosavakból, pl. DL-metionin, és szervetlen anyagokból, pl. mész és konyhasó.

A takarmánykoncentrátumok a hatóanyagot ehető anyagok, pl. rozsliszt, kukoricaliszt, szójababliszt vagy mész, adott esetben további táp- és építőanyagok, valamint proteinek, ásványi anyagok és vitaminok mellett tartalmazzák. Ezek a szokásos keverési módszerekkel előállíthatók.

A premixekben és takarmánykoncentrátumokban a hatóanyagot a levegőtől, fénytől és/vagy nedvességtől adott esetben a felületre felvitt nem-toxikus viaszokkal vagy zselatinokkal megvédhetjük.

-6193835

Példaként bemutatunk egy csirketápszer-összetételt, amely a találmány szerinti hatóanyagot tartalmazza:

200 g búza, 340 g kukorica, 361 g szója hulladék, 6Ö g marhafaggyú, 15 g dikalcium-foszfát, 10 g kalcium-karbonát, 4 g jódozott konyhasó, 7,5 g vitamin-ásványianyag-keverék és 2,5 g hatóanyagtartalmú premix alaposan elkeverve 1 kg takarmányt ad.

kg takarmánykeverék a következő anyagokat tartalmazza:

600 NE A-vitamín, 100 NE D-vitamin, 10 mg E-vitamin, 1 mg K₃-vitamin, 3 mg riboflavin, 2 mg piridoxin, 20 meg B₁₂-vitamin, 5 mg kalcium-pantotenát, 30 mg nikotinsav, 200 mg kolin-klorid, 200 mg MnSO₄-.H₂0, 140 mg ZnSO₄-7H₂O, 100 mg FeSO₄-7H₂O, 20 mg CuSO₄5H₂O.

A hatóanyagtartalmú premix a hatóanyagot a kívánt mennyiségben tartalmazza, pl. 10 mg és 1 g DL-metionin, valamint annyi szójababliszt, hogy 2,5 g prémix keletkezzen.

Példaként bemutatunk egy sertéstápszer-összetételt, amely a találmány szerinti hatóanyagot tartalmazza:

630 g takarmánygabona (összetétel: 200 g kukorica, 150 g árpa, 150 g zab, és 130 g búza hulladék), 80 g halliszt, 60 g szója hulladék, 60 g tapiokaliszt, 38 g sörélesztő, 50 g vitamin-ásványianyag-keverék sertéseknek (öszszetétel: pl. mint a csirketápszernél), 30 g lenmag-pogácsaliszt, 30 g kukorica sikér takarmány, 10 g szójaolaj, 10 g cukornádmelasz, 2 g hatóanyag-premix (összetétel pl. mint a csirketápszernél) alapos összekeveréssel 1 kg takarmányt ad.

A megadott takarmánykeverékek a csirkék, illetve sertések felnevelésére és hizlalására összeállítva, ugyanilyen vagy hasonló összetételű takarmánykeverékek alkalmasak más állatok felnevelésére és hizlalására.

Amint azt már említettük, nem feltétlenül szükséges a tisztított és izolált hatóanyagot alkalmazni. Fel lehet használni a hatóanyag előállításakor keletkező tenyészközeget tisztítás nélkül, adott esetben szárítva. Más célokra alkalmas például a találmány szerinti hatóanyag nyers formában, finom tisztítás nélkül.

A találmány szerinti új hatóanyagok előállítását a következő példákkal szemléltetjük.

1. példa

A Streptomyces sp. BA 9 termelő törzs tenyésztésére használt tápközeg összetétele a következő: 3% zsírtalanított szójaliszt, 3% glicerin (87%-os), 0,2% CaCO₃ csapvízben oldva. A tápoldatot 121°C-on 40 percig sterilizáljuk. Egy 1000 ml-es Erlenmeyer lombikot, amely a fenti oldatból 150 ml-t tartalmaz, a termelő törzzsel beoltjuk, és 5 napig 28°C-on 280 ford/perc sebességű rázóasztalon inkubáljuk. Az így kapott előtenyészettel beoltunk egy 40 1-es fermentort, amely 20 1 fenti tápoldatot, 0,05% szilikonnal kiegészítve, tartalmaz, és 200 ford/perc sebességgel kever12 ve (lapkeverő), 10 l/perc sebességgel levegőztetve, 1,0- 10⁵ Pa nyomáson, 28°C-on 2 napig inkubáijuk. Ezzel az előfermentorral beoltjuk a 600 1-es termelő fermentort, amely 400 1 fenti tápoldatot és 0,03% szilikont tartalmaz. A termelő fermentort 65 óra hoszszat, 28°C-on, 1,0- 10⁵ bar túlnyomáson, ford/perc sebességgel keverve (Lapátkeverő) és 160 1/perc sebességgel levegőztetve inkubáljuk.

2. példa

Az 1. példa szerint kapott tenyészközeget (400 1) egy 200-250 1/óra teljesítményű Westfalia-szeparátorral elválasztjuk. Az elválasztott anyagot egy 50 1-es, Lewatit OC 1031 (Bayer) töltettel ellátott, 30 cm átmérőjű oszlopon vezetjük át. Egymás után 500 1 ionmentesített vízzel, 300 1 30%-os vizes metanollal mossuk, és 300 I metanollal deszorbeáljuk. A deszorbeált anyagot csökkentett nyomáson szárazra pároljuk, 20 1 vízzel szuszpendáliuk, és fagyasztva szárítjuk, így 137 g nyers, találmány szerinti vegyületet kapunk (hatóanyagtartalma 1,5%).

3. példa

A találmány szerinti vegyület előállítása tisztán, gélszűréssel és kromatográfiával szilikagélen g, 2. példa szerint kapott nyers terméket 2 1 vízben szuszpendálunk, és a pH-t koncentrált ecetsavval 5,0-ra állítjuk. Ezt a szuszpenziót választótölcsérben kétszer 2 1 etil-acetát/etanol 9:1 térfogatarányú eleggyel extraháljuk. Az egyesített szerves fázisokat csökkentett nyomáson szárazra pároljuk, 100 ml metanolban oldjuk, és Sephadex LH 20^R -en metanolban gélszűrjük. 7,5 cm átmérőjű és 1,25 m hosszú oszlopot használunk. Az átfolyási arány 720 ml/óra. 200 ml-es frakciókat gyűjtünk. Az antibiográfiában Staphylococcus aureus 1756 ellen hatásos frakciókat egyesítjük, csökkentett nyomáson betöményítjük, vízben szuszpendáljuk, és fagyasztva szárítjuk.

Kitermelés: 2,94 g, 26%-os termék.

600 mg így kapott anyagot feloldunk 100 ml kloroformban 60 μΙ koncentrált ecetsav adagolása mellett. Egy LiChropre 60 töltetű (40-63 pm, Merck, B típus) Lobar^R oszlopot 3,1 térfogat% koncentrált ecetsavat tartalmazó kloroformmal kiegyenlítünk, és erre felviszszük az oldatot. 400 ml fenti oldószereleggyel végzett eluálás után az anyagot kloroform (metanol)ecetsav 98:2:0,1 térfogatarányú elegyével eluáljuk. Az átfolyási sebesség 400 ml/ /óra. 10 ml-es frakciókat gyűjtünk.

Ezeket vékonyréteg-kromatográfiával sziiikagél lapokon (Merck 5729) analizáljuk. A biológiailag aktív, FeCl₃/H₂SO₄ reagenssel megszínezhető, egynemű frakciókat szárazra pároljuk, kevés vízzel szuszpendáljuk, és fagyasztva szárítjuk.

Kitermelés: 76,2 mg, 98%-os tisztaság.

-7193835

A. példa

Egy ürütől, amely naponta 650 g durvára őrölt birkatápot és 250 g száraz zöldtakarmányt kapott, egy bendőfisztulán keresztül bendőfolyadékot vettünk. A kész tápot egy takarmányadagoló automatán 12 egyenlő részletben kétóránként, és a száraz zöldtakarmányt két egyenlő részletben, 8.30-kor és 16.15kor adagoltuk. A bendőfolyadékot a vétel után közvetlenül a következőképpen kezeltük: 2,5 ml bendőfolyadékot egy 13 ml-es előzőleg széndioxiddal átöblített reakciócsőbe öntöttünk, amely ezenkívül még a következő anyagokat tartalmazta:

100 mg finomra őrölt birkatáp,

7,5 ml puffer-oldat

0,5 ml a találmány szerinti vegyületet tartalmazó vagy nem tartalmazó oldat.

A kísérlet elejétől szén-dioxiddal telített pufíer-o-ldat összetétele a következő volt (1 liter vízben):

Na₂HPO₄	4,61 g
NaHCO₃	12,25 g
NaCl	0,59 g
KCI	0,71 g
MgCl₂	0,32 g
CaCl,	0,13 g
Az anyagkeverékenkénti 10, 20, 30, illetve

pg találmány szerinti vegyületet először 0,25 ml etanolban oldottuk, majd hozzáadtunk 4,75 ml vizet. Ebből az oldatból 0,5 ml-t a reagenscsőbe pipettáztunk. Ezután a fermentációs elegy térfogata 10,5 ml volt. A negatív kontrolihoz (azaz tesztvegyület nélküli anyagkeverék) szintén adagoltunk 0,5 ml 5%-os etanol oldatot. Dózisonként 4 ismétlést végez! tünk. A reagenscsöveket Bunsen-dugóval lezártuk, és 39°C-on tenyésztettük. 2, 4, 6 és 8 óra múlva a mintákat kézzel összeráztuk. 24 óra hosszat végzett tenyésztés után minden mintából kivettünk 1,0 mí-t, és egy Eppendorf-edénybe pipettáztuk, amely 0,2 ml 10%-os foszforsavat (amely 5,7 pmol metil-valeriánsavat tartalmazott) tartalmazott. A mintákat 10 000 g-vel centrifugáltuk, és a felüluszóból az illékony zsírsavkoncentrációt gázkromatográfiásán meghatároztuk.

Az elemzési eredményeket a következő táblázatban foglaljuk össze. Az adatokat (ecetsav/propionsav arány és a teljes- zsírsavtermelés) a negatív kontroll százalékában adtuk meg:

A táblázat

Kezelés	Ecetsav-	Összes
( jjg/minta)	-propionsav-	zsírsav
	-arány (%)	(%)
10	99,7	103,3
20	75,5	107,9
30	78,8	96,7
40	75,9	96,0

A táblázatból látható, hogy a propionátrá számított acetát arány lényegesen csökken és így azzal, hogy a szénhidrátokból több propionát képződik, javul a takarmány-hasznosítás. Az erjedés megnövekedett hatékonysága csak kismértékben megy a teljes zsírsav-termelés rovására, ahogyan ez a táblázatból látható.

B példa

Hízócsírke (broiler)

Ketrecben tartott, 3-5 napos állatokat egy 14 napig tartó kísérletnek vetettünk alá.

Az állatok ezalatt 10 ppm, illetve 25 ppm találmány szerinti vegyületet tartalmazó takarmányt kaptak. Negatív kontrollt is végeztünk, találmány szerinti vegyület nélkül. A kísérlet elején az állatokat olyan csoportokba osztottuk, ahol minden állat súlya azonos volt. A kiértékelést a testsúlynövekedés, takarmányhasznosítás és takarmányfelvétel alapján végeztük. Az eredményeket a B táblázat tartalmazza.

Az állatok és a takarmány jellemzői:

Válogatott hím hizóhibridek állat/kísérlet (4x6)

Súly: 50-65 g

Takarmány: Höveler csirketápszer KA 57 antibiotikum és kokcidiosztatikus adalék nélkül, összetétel a következő:

Értékmeghatározó alkotóelemek:

18% nyers protein

7% nyers rost 8% hamu 1% kalcium 0,7% foszfor Összetétel:

54% takarmánygabona (40% kukorica, 12% búza)

17,5% szójahulladék

5,2% kukorica sikér takarmány

5,2% búzakorpa

3,1% halliszt

3,1% tapiokaliszt

3,1% lucernazöld liszt

2,1% búzacsíra (aprított)

1,7% csontliszt 1,6% tejpor

1,4% szénsavas takarmány mész 1,0% foszforsavas takarmány mész 1,0% melasz.

B, táblázat

Kezelés Testsúly- Takarmány- Takarppm növekedés felhaszná- mánylás hasznosítás

108% 97% 90%

108% 93% 86%

-8193835

Claims

1. Eljárás szerves vegyületek előállítására, amelyeknek jellemzői a következők:

a) a nátriumtartalmú szerves vegyület IR-KBr-abszorpciós spektrumában jellemző abszorpciós sávok jelentkeznek a következő hullámhosszoknál (cm'¹ értékekben kifejezve) :

3456 1265

2960 1178

2910 1145

1750 1115

1700 1030

1635 950

1540 930

1395 825 (1. ábra, abszcissza: hullámszám (cm^-1), ordináta: abszorpció);

b) ‘H-magrezonancia-spektrum a 2. ábra szerint, ppm és rezgés/sec értékekben;

c) ¹³C-magrezonancia-spektrum a 3. ábra szerint;

d) elemanalízis (nagyvákuumban, 30°C-on két napig tartó szárítás után): C 61,1-62,3%, H 5,2-6,4%. 0 27,5-30,0%;

e) összegképlet: (C_l4_₁₆, H₁₆_₂₀, O₄+„;

f) a nátriumtartalmú vegyület összegképlete:

(^29-31,1833,37,09..] !,Na)„;

g) oldhatóság: a vegyületek jól oldódnak etil-acetátban kloroformban, metanolban és

5 rövidszénláncú alkoholokban, rosszul oldódnak vízben;

h) színezhetőség: a vegyületek vékonyrétegkromatográfiában szilikagél lemezen FeCl₃/H₂SO₄ reagenssel színezhetó'k, azzal jelle10 mezve, hogy Streptomyces BA 9 jelű törzset (DSM 3025 számon letétbe helyezve) asszimilálható szén- és nitrogénforrást, valamint ásványi sókat tartalmazó tápközegen aerob körülmények között tenyésztünk, és a vegyülete15 két kívánt esetben a tápközegből elválasztjuk.

2. Eljárás antibiotikus hatású gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, az 1. igénypont szerinti eljárással előállított vegyületet a gyógyszerké20 szítésben szokásos hordozó-, hígító- és/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakítunk.

3. Eljárás premixek és takarmányadalékok előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, az 1. igénypont szerinti eljárással előállított vegyületet a premix- és takarmányelőállításban szokásos tápanyagokkal összekeverünk.