CN100368525C - 猪链球菌菌株及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了猪链球菌(Streptococcus suis)的一种新菌株，微生物保藏号是CGMCC No.1316，保藏日期是2005年2月21日；本发明菌株可作为科研工作者标准的试验用菌株；通过该菌株可以了解该菌的DNA分型、该菌对药物的耐药机制、该菌多重耐药机制及该菌在猪体内的病理复制模型。

Description

猪链球菌菌株及其用途

技术领域

本发明涉及一种链球菌，尤其涉及猪链球菌菌株及其用途。

背景技术

猪链球菌(Streptococcus suis)是条件性致病菌，广泛分布于自然界中，在动物的呼吸道、肠道、生殖道等处常在，可引起猪脑膜炎、关节炎、心内膜炎、败血症、肺炎和突然死亡，严重危害养猪业的发展。链球菌之所以能致病，是因为其可产生多种酶和毒素，如透明质酸酶、链激酶、链道酶、DNA酶和溶血菌素O、溶血菌素S及红斑毒素；根据荚膜多糖抗原的差异，可将其分为35个血清型，即1～34以及1/2型。对猪致病性较强的为猪链球菌1型、2型和9型。以溶血性链球菌引起的败血性链菌病危害最大，脑炎型次之，关节炎型和淋巴结脓肿型危害小，但无乳链球菌是繁殖母猪的大敌。

猪链球菌为革兰氏阳性菌，可在外界环境中存活很长时间，特别是在粪便中及被污染的环境和带菌猪是重要的传染源，超急性死亡没有任何症。不分品种、年龄、性别的猪只一年四季都可感染本病，哺乳和断奶后仔猪发病死亡率高达80％以上，目前把链球菌分为下列五种类型。1、急性败血型：(C群链球菌引起)常发生在肥育猪，表现为体温升高到41-42℃，最高可达到43℃，常有浆液鼻漏、眼结膜潮红、呼吸渐快、呈肺炎状、便秘干硬、腹下有紫红斑，皮肤有毛血点，颈背皮肤呈“刮痧状”出血点或斑，如患猪耐不过，常出现突然死亡(一般耐过12-18小时转为亚急性)。2、脑膜炎型：(C群链球菌引起)多发生在哺乳和断奶仔猪(8周龄仔猪)病初体温可升高到40.5-42.5℃。中猪和母猪，便秘、很快出现神经症状(注意：在出现神经症状之前有一个高热时间，一般很短(4-8小时)不易发现，给以后的确诊带来误区)，出现歪头、跛行、转圈、磨牙、发抖、眼球鼓胀、口角流白沫、不能站立、爬行或后肢麻痹，共济失调，病程1-3天，如不及时控制很快死亡。(注：早期发现可见猪耳朵朝后抿，初步定为本病)。3、关节炎型：多发生于新生仔猪，出现关节肿胀和蹄甲炎，跛行。4、脓肿型：多为E群链球菌感染引起咽部、颈部、腿部淋巴节化脓，C群可引起皮肤形成脓肿，有热疼感影响采食、呼吸和吞咽。5、无乳型：生产母猪临产前发热或不食，产后1-3天出现发热症状40℃左右，造成无乳、回乳和乳房脓肿等。所有链球菌感染无论慢性或急性，多表现为食欲不振，有轻微跛行现象。目前，我们在发病猪肺脏中分离到一株B群链球菌，与上述的C群链球菌、E群链球菌不同。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的猪链球菌菌株，该菌株可作为标准的试验用菌株。

本发明的目的是通过以下技术途径来实现的：

一种猪链球菌菌株(Streptococcus suis)，该微生物的保藏号是CGMCCNo.1316；保藏地址是：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏日期是：2005年2月21日。

本发明菌株的分离方法如下：

将病死猪只，剖开胸腔取出肺脏，肺脏表面消毒后，取无菌剪刀，剪开一个深部切口，将无菌铂金耳深入肺脏切口内部，蘸取内部组织液，划斜线接种在含5％绵羊血PPLO固体培养基上(取灭菌PPLO琼脂培养基100毫升，加热融化，待冷却至50℃时，以无菌手续加入脱纤血5毫升，轻轻摇匀，防止产生气泡，倾注于灭菌的平皿中，经无菌检查后，放在冰箱中保存备用；PPLO固体培养基购于Difco公司)。将平板倒置于37℃恒温培养箱中14-18小时后，将平板取出挑取灰白色、半透明、表面光滑、圆形、隆起的周围有α溶血环小菌落进行革兰氏染色，镜下观察为革兰氏阳性链状小球菌，即为猪链球菌。

兰氏分群：通过法国梅里埃公司提供的兰氏分群试剂盒分群为B群。

形态及染色：细菌菌体为卵圆形，在固体培养基上为短链存在，在液体培养基上呈较长的链状生长，革兰氏染色阳性，无抗酸性。

培养及生化特性：兼性厌氧菌，在5％二氧化碳中生长快于有氧条件，培养最适温度37℃。在固体培养基上培养时，在培养基上加入绵羊血、犊牛血清有助于本菌生长。菌落为灰白色、半透明、表面光滑、圆形、隆起的小菌落，菌落周围有α溶血环。

本发明菌株可作为科研工作者标准的试验用菌株。通过该菌株可以了解该菌的DNA分型、该菌对药物的耐药机制、该菌多重耐药机制及该菌在猪体内的病理复制模型。

[试验例1]本发明菌株生化反应试验

一、试验材料

1、供试菌株：本发明菌株。

2、培养基的配制：

5％牛血清PPLO液体培养基：取21克PPLO肉汤(Difco)加入1000毫升蒸馏水中，121℃15分钟高压灭菌后冷藏备用。在使用时，加入5％牛血清。购于PPLO肉汤Difco公司。

二、试验方法及结果：

挑取单个本发明菌落，接种于5％牛血清PPLO液体培养基中，37℃培养14-18小时，将纯培养的细菌接种于各种生化反应管中，在37℃恒温培养箱中孵育过夜后，取出观察结果。通过生化反应管中指示剂的颜色变化，判定细菌生化反应结果。具体结果如下：葡萄糖(+)、麦芽糖(+)、蔗糖(+)、乳糖(+)、松三糖(-)、核糖(+)、山梨醇(-)、甘露醇(-)、阿拉伯糖(-)、棉子糖(+)、胆汁溶解(-)。

[试验例2]本发明菌株药敏试验

将过夜培养本发明菌液，用灭菌生理盐水稀释至0.5麦氏单位，用无菌棉拭子沾取在PPLO固体培养基(PPLO固体培养基购于Difco)上密集划线接种，三次划线，每次划线旋转60度，保证接种物均匀分布。涂布菌液的平板于室温中干燥3-5分钟，用无菌镊子取药敏纸片(购于上海伊华医学科技有限公司)，贴于平板表面，并用镊子轻压一下纸片使其贴平。每张纸片的间距不小于24mm，纸片的中心距平板的边缘不小于15mm。将贴好纸片的平板置37℃孵育18-24小时后，用标尺量取抑菌圈直径。根据抑菌圈的大小(不同抗生素其抑菌圈大小的标准不一致)，判定为敏感，耐药或中度耐药。

试验结果如下(抑菌环直径)：红霉素19.4mm、青霉素17.0mm、氟哌酸11.2mm、氯霉素18.6mm、氨苄西林17.0mm、四环素0.0mm、复方磺胺0.0mm、先锋V号15.2mm、头孢呋新16.0mm。

根据NCCLS判断标准，本发明菌株对红霉素、头孢呋新、先锋V号中度耐药、对氯霉素敏感、对青霉素、氟哌酸、氨苄西林、四环素、复方磺胺耐药。

试验结果表明，本发明菌株可作为标准的药敏试验用菌株。

[试验例3]本发明菌株对红霉素耐药表型的确定

耐药表型的测定：以改良的双纸片法测定，在涂布本发明菌株菌液的平板上，间隔2Cm贴上红霉素及克林霉素纸片，过夜培养后观察结果。如果对克林霉素敏感，继续做15、16元环大环内酯类药物的敏感性试验。

试验结果如下(抑菌环直径)：红霉素19.4mm(中度耐药)、克林霉素0mm(耐药)，因猪链球菌同时对红霉素、林可霉素耐药，所以本发明菌株对红霉素耐药表型为内在性耐药表型。

[试验例4]本发明菌株对红霉素耐药基因的确定

对红霉素耐药的本发明菌株染色体DNA的提取：纯的细菌菌落或细菌悬液沉淀物溶解在20μl水中，95℃加热5分钟，12,000rpm离心2分钟，上清液储存在-20℃以备用。

ermb/mefA耐药基因的扩增：对红霉素耐药的菌株进行ermb和mefA的PCR。引物均由上海博亚公司合成。ermb所用引物为5′-GAAAAGGTACTCAACCAAATA-3′(上游)和5′-AGTAACGGTACTTAAATTGTTTAC-3′(下游)，扩增片断639bp。反应条件：93℃初始变性5min后，94℃1min，54℃2min，72℃2min，30个循环后72℃延伸10min。mefA耐药基因所用引物5′-AGTATCATTAATCACTAGTGC-3′(上游)和5′-TTCTTCTGGTACTAAAAGTGG-3′(下游)，扩增片断400bp。94℃初始变性4min后，94℃1min，54℃2min，72℃2min，30个循环后72℃延伸10min。

试验结果如下：PCR结束后，扩增到639bp的目的产物，将得到的目的产物在blast上检索，与NCBI GenBank上Streptococcus gallolyticus(AY183117.1)ermb基因同源性达99％；PCR结束后，没有扩增到的mefA耐药基因。

试验结果表明，本发明菌株可用于耐药基因的确定。

Claims (4)

1.一种猪链球菌菌株(Streptococcus suis)，其微生物保藏号是CGMCCNo.1316。

2.权利要求1所述的猪链球菌菌株在作为试验用标准菌株中的用途。

3.按照权利要求2所述的用途，其特征是猪链球菌菌株在药敏试验中的用途。

4.按照权利要求2所述的用途，其特征是猪链球菌菌株在确定耐药基因中的用途。