CS267395B1 - Spósob pripravy kyseliny digalakturónovej - Google Patents

Description

CS 267 395 B1 1

Vynález sa týká spósobu přípravy kyselinydigalakturónovej účinkom imobilizovanej D--galakturonandigalakturonohydrolázy na pek-tan sodný.

Kyselina digalaktorónová sa doteraz prie-myselne nevyrába a pieto nic je dostupná nasvetovom trhu. Bola připravená v niekoFkýchlaboratóriách a to cestou parciálnej kyslej hy-drolýzy: Rexová-Benková L. Chem. Zvěsti 21,58 (1970), alebo enzymovou hydrolýzou D-ga-Iakturonanu účinkom endo-D-galakturonanáz:Demain A. L, Phaff H. J.: Arch. Biochem. Bio-phys. 51, 114 (1967), Hatanaka Ch., Ozawa J.Agr. Chem. Soc. Japan 40, 421 (1968), Nagel C.W., Wilson T. M.: J. Chromatogr. 41, 110 (1968)7Voragen A. G., Pilník W.: Ztsch. Lebensm. Un-tersuch, Forsuch. 142 370 (1970), HeinrichovaK.: Biológia (Bratislava) 38, 335 (1983), Heinri-chová K.: AO 209874 (1982). Ku príprave oligo-galakturónových kyselin sa použili i mobilizo-vané endo-D-galakturonanázy: Van Hounden-hoven E. A., De Vitt I. G., Visser J.: Carbohydr.Res. 34, 233 (1972), Bock W., Krause M., Goe-bel H., Anger H., Schwaller J., Fleming H. A.,Gabert A.: Nahrung 22, 183 (1978), Rexová-Benková L, Omelková J., Kubánek V.: AO218198 (1983). Postup přípravy kyseliny diga-lakturónovej účinkom imobilizovanej D-galak-turonandigalakturonohydrolázy doteraz nebolpopísaný. Všetky doteraz popísané (hoře uve-dené postupy) sa týkajú přípravy viac alebornenej heterogennej zmesi oligogalakturóno-vých kyselin s rozdielným zastúpením kyselinydigalakturónovej. Spoločným rysom uvede-ných postupov je, že vedú k malým výťažkomkyseliny digalaktorónovej, popři výťažku ostat-ných oligogalakturónových kyselin. Izoláciakyseliny digalakturónovej zo zmesi oligogalak-turónových kyselin má mnohé nevýhody, prác-nosť, časovú náročnost’ a viacstupňové deleniena molekulových sitách a biogéloch.

Tieto nedostatky odstraňuje spósob přípravykyseliny digalakturónovej účinkom imobilizo-vanej D-galakturonandigalakturonohydrolázy,ktorého podstata spočívá v tom, že sa na pek-tan sodný pósobí mobilizovaným selektívnedegradujúcim pektolytickým enzýmom - D-ga-lakturonandigalakturonohydrolázou pri teplote30 až 40 "C a pH 6,8 až 7,2, pričom jedinýmproduktom enzýmom katalyzovanej reakcie jekyselina digalakturónová, ktorá sa oddělí nakolóne Sephadexu G-10 a efluent sa odpaří,alebo vysuší mrazovou sublimáciou. Ďalšou vý-hodou tohoto postupu je kontinuálně a viacná-sobné využitie preparátu mobilizovaného en-zýmu v reakcii, čo oproti aplikácii rozpustnéhoenzýmu vedie k značným úsporám na nákla-doch.

Kyselina digalakturónová je látka dóležitáz hladiska teoretického štúdia pektínových lá-tok a pektolytických enzýmov a pre charakteri-záciu v priemysle používaných pektináz. Je do-teraz jediným substrátom na základe ktoréhoje možné identifikovat’ a stanovit’ aktivitu exo--D-galakturonáz v komplexe pektolytickýchenzýmov. 2

Spósob přípravy imobilizovanej D-galaktu-ronandigalakturonohydrolázy je predmetomčs. autorského osvedčenia číslo 263 186 (Hein-richové 1986).

Příklad I 100 ml 0,7 % roztoku pektanu sodného v 0,1molu . I' fosfátovom tlmivom roztoku pH 7,0 saperkoluje temperovanou (30 °C) kolonou imo-bilizovanej D-galakturonandigalakturonohy-drolázy. Prietok kolonou, 10 ml/h je udržiavanýperistaltickou pumpou. Úplná limitovaná kon-verzia substrátu prebehne za 20 hodin. Efluentz kolóny sa zahustí vákuovým odpařováním pri40 °C, alebo vysuší mrazovou sublimáciou. Hy-drolyzát sa nanesie na štipec Sephadexu G-10,kde sa oddělí kyselina digalakturónová od po-lymérneho zvyšku za súčasného odsolenia pro-duktu. Frakcie s kyselinou digalakturónovou saspoja a vysušia mrazovou sublimáciou. Výťažok kyseliny digalakturónovej je 54 %.Příklad 2

Suspenzia kovalentnou vazbou imobilizo-vanej D-galakturonandigalakturonohydrolázyv tlmivom roztoku o pH 6,8 až 7,2 sa naplní dokolóny, ktorou preteká 0,75 % roztok pektanusodného (prietok 20 ml/h) do vtedy kým sa ne-dosiahne 54 % konverzia substrátu. Enzýmomkatalyzovaná reakcia pri 40 °C. Efluent z koló-ny sa odpaří mrazovou sublimáciou a spracujeďalej podFa příkladu 1. Výťažok kyseliny digalakturónovej je 54 %.Příklad 3 50 ml 1 %-ného roztoku pektanu sodnéhov 0,05 molu. I' tlmivom roztoku pH 6,8 sa inku-buje so suspenziou D-galakturonandigalaktu-ronohydrolázy kovalentne viazanej na nosičpolyakrylamidového typu. Enzýmom katalyzo-vaná reakcia prebieha za miešania v tempero-vanej nádobě s dvojitým plášťom pri 35 °C.Reakcia sa ukončí odsátím imobilizovanéhoenzýmu skleněnou fritou. Ďalšie spracovaniehydrolyzátu podFa příkladu 1.

Schopnosť imobilizovaného enzýmu kataly-zovať zmienenú degradáciu pektanu sodnéhoje závislá od obsahu D-galakturonandigalaktu-ronohydrolázy na nosiči a relatívnej aktivitěpreparátu ako i od reakčných podmienok uve-dených v príkladoch 1 až 3. Preparáty použitév príkladoch 1 až 3 pri štiepení glykozidickýchvázieb pektanu sodného vykazovali 23 až 30 %z aktivity volného enzýmu. Okrem uvedenéhovýťažok kyseliny digalakturónovej je závislýi od obsahu neutrálnych sacharidov v reťazcipolygalakturonanu. V naších pokusoch použitýpektan sodný obsahoval 1,8 % ramnózy a preto54 %-ný výťažok kyseliny digalakturónovejpředstavuje úplnú limitovanú degradáciu poly-méru.

Claims (1)

1. CS 267 395 B1 3 4 PREDMET VYNÁLEZU Spósob přípravy kyseliny digalakturónovejvyznačený týni, že sa na pcktan sodný posobíiinobilizovanou D-galakturonandigalakturono- hydrolázou pri pH 6,8 až 7,2 a teplote 30 až40 °C počas 10 až 20 hodin, za vzniku kyselinydigalakturónovej.