SU924101A1

SU924101A1 - Способ получения дезокситимидинтрифосфата1

Info

Publication number: SU924101A1
Application number: SU802973901A
Authority: SU
Inventors: Sergej A Feofanov; Stanislav N Zagrebelnyj; Olga A Ponomareva
Original assignee: Sp Kt B Biolog Aktivnykh Veshc
Priority date: 1980-08-18
Filing date: 1980-08-18
Publication date: 1982-04-30

Description

Изобретение относится к усовершенствованно^ способу получения дезокситимидия-5-трифосфата (дТТФ), который широко используется в биологических исследованштх и в генной инженерии как предшественник биосинтеза ДНК; - ⁵

Известен способ получения дТТФ путем фер⁴ ментативного фосфорилирования дезоксйтимидинмонофосфата в присутствии Му, АТФ, креатинфосфата, креатинкиназы из мышц, буфера трис-НС ί рН 7,5 и ферментного препарата, выделенного из Е, со И по следующей схеме: получение грубого экстракта; автолиз экстракта; осаждение сульфатом аммония в пределах О50% насыщения; термическая обработка и дианализ.

Выход дТТФ составляет 22% [1].

К недостаткам способа следует отнести: низкий выход дТТФ; отсутствие в ферментном препарате системы регенерации АТФ, в результате чего необходимо добавлять креатинкиназу из мышц, что значительно снижает перспективность способа.

2

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения дТТф путем ферментативного фосфорилирования дТМФ в присутствии М|, АТФ, ацетилфосфата, высокоочюценной ацетокиназы из Е.соП, буфера трис.-НС I, при рН 7,5 и ферментного препарата, содержащего .тимидилаткиназу и нуклеозиддифосфаткиназу, выделенного из Е, соII по следующей схеме:'получение грубого экстракта; обработка экстракта етрептомицинсульфатом; фракционирование на геле фосфата кальция; фракционирование на геле алюминия.

Выход дТТФ составлял 75% от внесенного в реакцию дТМФ [2].

Недостатки прототипа - низкий выход целевого продукта; многостадийность и сложность Очистки ферментного препарата, а также необходимость использования труднодоступных реактивов (гель фосфата кальция, гель алюминия), что с точки зрения технологии бесперспективно; отсутствие в ферментном препарате системы регенерации АТФ, в связи с чем необходимо вносить в реакцию еще один фер3 924101 4

мент - ацетокиназу, полученную Отдельно и независимо.

Синтез дТТФ из дТМФ ферментативным путем осуществляется в 2 стадии: на первой ста·, дии происходит фосфорилирование дТМФ до ₅дТДФ с участием фермента тимидилаткиназы, а затем фосфорилирование дТДФ до дТТФ с участием фермента нуклеозиддифосфаткиназы.

В обеих реакциях донором фосфатных групп является АТФ. Для того, чтобы значительно ю сократить расход дорогостоящего АТФ, обычно используют АТФ-регенерирующую систему, где донором фосфатов для регенерации АТФ йвляется АТФ. Для того, чтобы значительно сократить расход дорогостоящего АТФ, обычно * используют АТФ-регенерирующую систему, где донором фосфатов для регенерации АТФ является какой-либо дешевый и доступный субстрат, например, ацетилфосфат. Ферментом, осуществляющим такую регенерацию АТФ из АДФ и ацетилфосфата, является ацетокиназа, присут-, ствующая в значительном количестве в Б.соб Таким образом, для получения дТТФ необходимо присутствие в реакционной смеси трех ферментов, а именно тимидилаткиназы, нуклеозид- ₂$ дифосфаткиназы и ацетокиназы.

Цель изобретения — упрощение способа и повышение выхода целевого продукта.

Для достижения поставленной цели в способе получения дезокситимидинтрифосфата, включающем выделения и очистку ферментов тимидилаткиназы, нуклеозиддифосфаткиназы и ацетокиназы из биомассы Е.соб, фосфорилирование дТМФ с помощью вышеназванных ферментов с добавлением в реакционную-смесь ионов.М|, ацетилфосфата, АТФ и буфера трис-НС^ ³³при рН 7,5, ферменты - тимидилаткиназу, нуклеозиддифосфаткиназу и ацетокиназу используют в виде комплексного препарата, который выделяют из биомассы Ε.οοίί инфицированной фагом Т4 ат82.

Предлагаемый способ получения дТТФ заключается в следующем.

Биомассу Е.соб В, инфицированную мутант- . ным фагом Т4 ат 82, разрушают с помощью *³ультразвука в буфере и получают грубый экстракт. Затем экстракт обрабатывают 1,53%-ным стрептомицинсульфатом для удаления нуклеиновых кислот. Супернатант затем фракционируют сульфатом аммония, сначала осаж- ³⁰дая белки при 70% насыщения сульфатом аммония, а затем растворяя белки доведением концентрации сульфата аммония до 37% насыщения с помощью буфера. Нерастворимые белки отделяют центрифугированием, а полу- ³³ченную фракцию используют как ферментный препарат (подтитровав др рН 7,5).

Получение грубого экстракта.

100 г замороженной при -40° С биомассы Ε.οοΙί В. инфицированной фагом Т4 ат 82 (с множественностью заражения 4), измельчают в ступке, заливают 500 мл 0,05 ± 0,01 М трис-НСБрН 7,5 + 0,2, содержащего 1 ± 0,1>«

М 2-меркаптоэтанол, перемешивают при +4(±1)°С до однородной суспензии и озвучивают на ледяной бане с помощью ультразвуко вого дезинтегратора (18кГц, 20 мкм) порциями по 200 мл сеансами по 1 мин, с перерывами в 0,5 мин. Общее время озвучивания 30 мин. Суспензию центрифугируют в течение 60 мин при 1200 об/мин. Супернатант используют как грубый экстракт, осадок отбрасывают.

Обработка экстракта стрептомицинсульфатом.

К 575 мл грубого экстракта приливают по каплям при тщательном перемешивании 65 мл 15%-ного раствора стрептомицинсульфата в буфере до конечной концентрации стреп томицинсульфата 1,5%. После этого смесь перемешивают при 4° С 20 мин, затем центрифугируют 60 мин при 12000 об/мин.

Фракционирование сульфатом аммония.

К 580 мл супернатанта от предыдущей стадии при тщательном перемешивании при 4° С присыпают небольшими порциями тонко растер-тые кристаллы сухого сульфата аммония (273,8 г) до конечной концентрации 70% насыщения по сульфату аммония. Затем раствор тщательно перемешивают 30 мин и центрифугируют 30 мин при 12000 об/мин. Супернатант отбрасывают. Осадок суспендируют в минимальном объеме раствора сульфата аммония, 70% насыщения в буфере. Суспензию (50 мл) разбавляют в 2 раза с буфером, содержащим 2тМ 2-меркаптоэтанол, тщательно перемешивают, подтитровывают с 0.5М-КОН до рН 7,5, затем центрифугируют 30 мин при 12000 об/мин (+2 — 4°С). Осадок отбрасывают, а супернатант хранят при -20° С в полиэтиленовой герметичной посуде в течение 6 мес. без потери активности и используют как ферментный пре- . парат для синтеза цТТФ.

Синтез дТТФ.

Для проведения синтеза дТТФ реакционная смесь имеет следующий состав (все вещества даны в пересчете на 100% чистоты): 20 г дТМФ, 40 г ацетилфосфата, 3 г АТФ ферментный препарат (из расчета 0,5 мг белка на 10 мкмолей дТНФ), 0,05М трис НС£рН 7,5 0,015М МдСС₂.’ Объем реакционной смеси 5 л. После прове- , пения реакции с перемешиванием при 37° С в течение 2 ч 96—98% дТМФ превращается в дТТФ. После хроматографии реакционной смеси известными способами и выделения гото"ого продукта получается 28-29 г дТТФ-и,

5 924101 6

по качеству не уступающего лучшим образцам зарубежных фирм: хроматографическая однородность 98%, содержание основного вещества 96%,

Преимуществом предлагаемого способа по сравнению с прототипом является: повышение 5 выхода целевого продукта до 96-98% от исходного дТНФ в отличие от 7¾% в прототипе; при промышленном производстве это ведет’ к существенному снижению себестоимости продукта, и кроме того, существенно упрощает задачу раз- '10 деления продуктов реакции; все необходимые ферменты выделяются из одного источника биомассы Е.соР В инфицированной мутантным фагом Т4 аш 82 совместно путем грубой очист- , ки; процедура выделения ферментного препа- ,5 рата из грубого экстракта чрезвычайно проста, не требует применения труднодоступных реактивов и состоит из двух стадий: осаждение нуклеиновых кислот и нуклеопротеидов 1,5-3% стрептомицинсульфатом й фракциони- ₂₀рование сульфатом аммония в пределах 70'37% насыщения.

Получение биомассы Е.оо^В, инфицированной мутантным фагом Т4 ат 82, не представляет никаких затруднений практически для лю- 25 бого производства биомассы. Работа с колифагом Т4 допустима для любой микробиологической лаборатории. Предлагаемый способ

получения дТТФ прост в технологическом ис·’ полпенни и может быть применен в промышленном масштабе.

Claims

Формула изобретения

Способ получения дезокситимидинтрифосфата, включающий выделение и очистку ферментов . тимидидаткиназы и нуклеозиддифосфаткинаэы , и ацетокиназы из биомассы Е.соЬ фосфорилирования дТМФ с помощью вышеназванных ферментов с добавлением в реакционную смесь ионов Мд²*ацегилфосфата АТФ и буфера трнс- НС (.при рН 7,5, отличающийся тем, что с целью упрощения способа и повышения выхода целевого продукта, ферментытемидилагкиназу, нуклеозиддифосфаткиназу и ацетокиназу используют в виде комплексного препарата, который выделяют из биомассы Е.ооЙ, инфицированной фатой Т4ат82.