CS251766B2 - Method of interferon production - Google Patents

Description

251766 2

Vynález se týká zdokonaleného způsobu výroby interferonu. '

Interferon je bílkovina; která vykazuje virově nespecifickou antivirovou aktivitualespoň v homologických buňkách buněčnými metabolickými procesy, zahrnujícími syntézuRNK a bílkovin. Interferony jsou zajímavé jako potenciální antivirová a protirakovinováterapeutická činidla. Je známo mnoho typů interferonu, zejména W-(leukocytové,, /J-(fibro-blastové) a gama-(imunní) interferony. Tento vynález se týká výroby gí-interferonů.

Zdrojem oc-interferonů byly primárně lidské leukocyty, ty však nemohou sloučit jakozdroj velkých množství oC-interferonu, požadovaných ke klinickým účelům. V poslední dóběbyly popsány způsoby výroby OC-interferonu z transformovaných lidských buněk, zejménalymfoblastoidních buněk. (Advances in Experimental Medicine and Biology 1978, 110, 61-74; J. Clinical Microbiology 1978, 7,.44-51) a v poslední době bylo docíleno výrobyoC-inter-feronu ve velkém měřítku (Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1979, 15, 420 - 427;

Texas Report. Biol. Med., 1981-82, 41, 175-178).

Způsob výroby oc-interferonu z lidských lymfoblastoidních buněk zahrnuje stupněrůstu lymfoblastoidních buněk ve vhodném médiu, přičemž buňky se indukují pro výrobuinterferohu zavedením induktoru, inkubaci buněk po indukci a izolaci vzniklého interferonu.,

Za účelem zvýšení výtěžku interferonu z takových způsobů byla popsána řada technik.

Podle jedné takové techniky se působí na lymfoblastoidní buňky po určitou dobu předindukcí činidlem předběžné úpravy nebo stimulátorem. Tak například Evropský patentč. 0 000520 popisuje způsob zvyšování výtěžku interferonu předběžnou úpravou karboxylovoukyselinou nebo její solí, zejména sodnou solí kyseliny máselné. Taková předběžná úpravabyla v literatuře popsána s množstvím dalších sloučenin (například Virology, 1979, 99,158-166; Evropský patent č. 0 008 391).

Podle takového způsobu je charakteristické, že se působí na buňky po určitou dobu,například asi po dobu 48 hodin před indukcí, přičemž činidlo předběžné úpravy se odstraňujepřed indukcí. Při alternativní technice se dociluje zvýšení výtěžku interferonu snížením teplotykultivovaných buněk, před, během nebo po indukci (například Proč. Nat. Acad. Sci. USA; 1973, 70, 3909-3913, Japanese J. Microbiology 1974, 18, 217-222; Microbiol. Immunol. 1980, 24, 907-914; J. Gen. Virology, 1981, 56, 163-17-4). V literatuře bylo dříve uvedeno, že přidání "stimulátorů" (uvedených výše) běhemnebo po indukci má negativní vliv na výtěžek interferonu produkovaného buňkami. Je totak zejména v případě karboxylových kyselin (například Virology, 1979, 99, 158-166; Bióčhem.Biophys. Res. Commun., 1981, 103, 806-812).

Nyní bylo nalezeno, že přidání některých sloučenin (dále označovaných jako "potenciačníčinidla", v době indukce nebo krátce po indukci lymfoblastoidních buněk, vede ke zvýšenivýtěžku interfcíxuiiu.

Vynálezem je tedy způsob výroby interferonu zahrnující přidáváni induktoru k lymfo-blastoidním buňkám, které jsou schopné indukce za tvorby interferonu, jehož podstataspočívá v tom, že běh_... xnaun.ce ueoo krátce po indukci se na buňky působí potenciačnímčinidlem vybraným ze skupiny sloučenin, která zahrnuje N-acetyl-p-aminofenol, acetamid,/C^-Cg-alkyl/acetamidy, acetanilid, /C^-Cgalkoxy/acetanilidy, alkylen-bisacetamidy, N,N--dimetyl-hexanamid, dimetylsulfoxid, C^-Cg-alkylamidy, /Cj-Cg-alkyl/benzamidy, ZCj-Cg--alkylZ-2-imidazolidiriony, l-ZC^-Cg-alkylZ-2-pyrrolidony, 2-piperidon, l-ZC^-Cg-alkylZ--2-piperidony, pyridin-N-oxidové a močovinové deriváty, N-acetyl-p-aminofenol, N,N-dimetyl-acetamid, 1,3-dimetyl-2-imidazojidinon, dimetylsulfoxid, p-etoxyacetanilid, hexametylen- 3 251766 -bisacetamid, 1-metylpiperidon a tetrametylmočovinu, přičemž se působí potenciačním činidlemv koncentraci 0,1 až 500 mM. Výhodně se působí potenciačním činidlem v koncetraci 1 až 200 mM, zejména pak 5 až50 mM.

Způsob podle vynálezu se. výhodně provádí tak, že potenciační činidlo se přidáváběhem indukce, a to zvlášt výhodně v době dvou hodin po indukci.

Způsob podle vynálezu lze výhodně provádět tak, že na buňky před indukcí se působístimulátorem.

Jako výhodným stimulátorem se působí alkanovou kyselinou s přímým řetězcem o 1 až6 atomech uhlíku nebo její solí; zvláště výhodnou alkanovou kyselinou je kyselina máselná.

Lymfoblastoidní buňky pro produkci interferonu se volí podle požadavku, zda je interferonurčen k humánnímu použití, potom se obvykle volí buňky lidského typu. Užívané buňky jsous výhodou buňky Namalwa nebo jiné vhodné lymfostoidní buňky. Linie lymfoblastoidníchbuněk, které lze pěstovat sériově v kultuře, jsou snadno získatelné z kultur leukocytů,periferní lidské krve dobře známými způsoby (viz. například J. H. Hope, Μ. K. Horné, W. Svott., Int. J. Cancer 3, str. 857-866 (1978),.J. H. Hope, Μ. K. Horné, W. Scott.,

Int. J. Cancer, 4, str. 255-260 (1969) R. S. Chang, H. D. Golden, Nátuře 234. str. 359-360(1971). -Leukocyty lze získat od normálních i nemocných jedinců a mohou být získány "spon-tánně", jestliže jsou buňky již indikovány virem Epstein-Barr (EBV), nebo je lze získatz kultru leukocytů, které nejsou infikovány EBV, například leukocity umbilikální srdečníkrve, ke kterým byl přidán EBV.

Lymfoblastoidní buněčné linie lze získat snadno z buněk pacientů s Burkittovým lymfomem,když jsou již infikovány RBV. Jedna linie Namalwa byla připravena ve Stockholmu profesoremG. Kleinem (O. Nyormoi, G. Klein, A. Adams, L. Dambos, Int. J. Cancer 12, str. 396-408(1973)) z buněk získaných od africké dívky téhož jména. O buňkách této linie bylo zjištěno,že produkují velká množství interferonu, jsou-li vhodně stimulovány (H. Strander, K. H. Mo-gesen, K. Cantell., J. Clin. Microbiol., 1, str. 116-117, (1975)); G. J. Christophinis, C. M. Steel, N. B. Finter., J. Gen. Virol., 1981, 52, 169-171).

Subkultura této linie byla získána Dr. Ionem Gresserem (Villejuif, Francie) v lednu1975. V této době byla linie adaptována k růstu na médiu RMPl 1 640 s 10 % séra telecíhoplodu. U Wellcome Research Laboratories byly buňky adaptovány k růstu na témže médiudoplněném 5 až 7 % séra získaného od telat starých 6 až 8 měsíců a byly subkultivovány2 až 3x týdně během osmnáctiměsíční periody. V bance byly tyto buňky označeny jako Namal-wa/WRL a byly uloženy v množství ampulek, které jsou uskladněny v tekutém dusíku. Byloprokázáno, že tyto buňky jsou prosté mykoplasmových infekcí a vzorky byly deponoványv American Type Culture Collection (7. července 1978 pod č. CRL 1 432).

Namálwa/WRL buňky byly užity v popisovaných příkladech vynálezu, lze však použíti jiných sublinií Namalwa buněk a.dalších vhodných lymfoblastoidních buněk. Název "potenciační činidlo" zde používaný, se týká kterýchkoli látek, které po přidáníběhem, indukce nebo krátce po indukci vedou k podstatnému zvýšení výtěžku interferonuve srovnání s výtěžkem docíleným bez přidání tohoto činidla.

Bylo zjištěno, že velké množství chemicky odlišných látek je účinné jako potenciačníčinidlo. Mezi tato činidla patří mnoho takových látek, které byly dříve popsány jakostimulátory pro předchozí zpracování buněk před indukci. Avšak výhodné stimulátory, alkan-kyseliny (zejména kyselina máselná), a jejich soli a steroidy (například dexametanson),nejsou potenciační činidla a vedou ke sníženému výtěžku interferonu, jsou-li přítomnyběhem indukce nebo po indukci. 251766 4

Sloučeniny, které byly nalezeny jako efektivní potenciační činidla, jsou účinnéi při diferenciaci Friendových buněk (ačkoli všechny látky odlišující Friendovy buňkynejsou efektivní jako potenciační činidla).

Efektivní potenciační činidla zahrnují: N-acetyl-praminofenol;’

Acetamid a nižší alkyacetamidy (například N-metylacetamid·, N,N-dimetylacetamid,N-etylacetamid, Ν,Ν-dietylacetamid, N-butylacetamid, N-acetyl-6-hydroxyhexylamin): acetanilid a nižší alkoxyacetanilidy (například p-etoxyacetanilid); alkylen-bisacetamidy (zejména C^-Cg alkylenacetamidy, například hexametylen-bisacet-amid, pentametylen-bisacetamid, heptametylen-bisacetamid); N,N-dimetylhexanamid; dimetylsulfoxid; nižší alkylamidy (například propionamid, butyramid); nižší alkybenzamidy (například N-metylbenzamid); nižší alkyl-2-imidazolidinony (například l,3-dimetyl-2-imidazolidinony); ' nižší alkyl-2-pyrrolidóny (například l-metyl-2-pyrrolidon, l-etyl-2-pyrrolidop); 2-piperidon a nižší l-alkyl-2-piperidony (například lrmetyl-2-piperidon) ; pyridin-N-oxid; a deriváty močoviny (například tetrametylthiomočovina; nižší alkysubstituované močoviny,(například 1-metylmočovina, 1-etylmpčovina, 1-propylmočovina, 1,1-dimetylmočovina, 1,3-dietylmočovina).

Obzvláště výhodné sloučeniny zahrnují: N-acetyl-p-aminofenol ; N,N-dimeťylacetamid ·,> 1,3-dimetyl-2-imidazolidinon; dimetylsulfoxid; p-etoxyacetanilid; hexametylen-bi sacetamid; N-metylacetamid; 1-metylpiperidon; 5 251766 l-metyl-2-pyrrolidon, a tetrametylmočovinu.

Nižší alkylové skupiny zde používané se týkají alkylových zbytků obsahujících 1 až6, s výhodou 1 až 4 uhlíkové atomy. S cílem vyrábět interferon, musí vybrané buňky růst za podmínek, které jsou vhodnéa obvyklé pro jednotlivý typ buňky nebo kmen, jak jsou dokumentovány literaturou. Napříkladlidské lymfoblastoidní buňky, jako Namalwa buněčná linie, rostou snadno v suspenzi v kul-'tivačním médiu, na příklad,RPMI .1 640 (G. E. Moore se spol., J. Amer. Med. Assoc. 199,519-524), doplněném sérem například telecím nebo koňským sérem, obvykle 5 až 10 % obj./obj.

Pro výrobu interferonu z lymfoblastoidních buněk, například z Namalwa buněk, rostoubuňky nejprve v'suspenzi až se dosáhne přiměřené koncentrace. Koncentrace, podmínky atd.,požadované pro výrobu interferonu, jsou dobře známé a budou jasné odborníkům z oboru. V tomto stádiu se přidá potenciační činidlo. Ideálně se činidlo přidává v době indukce(tj. když se indukující látka, například virus Sendai, přidává k indukci výroby interferonujinými slovy, stupňující činidlo může být inkorporováno do média pro buněčnou suspenzibezprostředně před indukcí nebo se přidává k buněčné suspenzi bezprostředně po indukci.Avšak výhod vynálezu lze docílit ještě i tehdy, přidá-li se potenciační činidlo někdypo indukci, například až po 2 hodinách.

Množství použitého potenciačního činidla je limitováno jeho toxicitou k buňkám,avšak bude přítomno v množství efektivním pro zvýšení produkce interferonu. Optimálníkoncentrace pro rovnováhu mezi toxicitou a zvýšenou produkcí interferonu .se bude lišitu jednotlivých činidel, bude však obecně taková, aby vedla ke konečné* koncentraci od0,1 do 500 mM, s výhodou 1 až 200 mM, obzvláště výhodně asi od 5 do 50 mM.

Podmínky indukce a následující inkubace k výrobě interferonu lze uskutečnit kterýmkoliznámým způsobem pro takový proces. Buňky mohou být například znovu suspendovány v médiuRPMI 1 640, neobsahujícím sérum nebo doplněném až do 5 % obj./obj. sérem, za vzniku konečnébuněčné koncentrace asi od 0,25 až do 6xlOb buněk/ml, s výhodou 0,5 až 3x10 buněk/ml.Vhodný induktor, například virus, zejména Sendai virus (viz. M. D. Johnoston., J. Gen. Viol1981, 56, 175-184), se přidává k buněčné suspenzi za vzniku konečné koncentrace od 5 do2 000 jednotek hemaglutinace v mililitru (HAU/ml), s výhodou 20 až 50 HAU/ml. Po

Po pečlivém promíchání se buněčná suspenze inkubuje po dobu 12 až 48 hodin při teplotěod 34 do 37 °C. Buněčná kultura může být při teplotě, 37 °C výhodně inkubována' přes noc,během kteréžto doby se interferon uvolňuje z buněk do média. Po inkubaci jsou buňky odstra-něny, například odstředěním, přičemž se získává supernatant obsahující surový interferon,který lze, je-li to požadováno, čistit známým způsobem. • Zvýšený výtěžek, kterého lze dosáhnout použitím· potenciačního činidla zde definova-ného, může být podstatný, přičemž se dosahuje až 5x vyššího výtěžku než ve srovnánís výtěžkem bez takového (činidla.

Mechanismus, kterým potenciační činidlo působí, není zatím zcela jasný. Ukazujese však, že míra produkce interferonu roste po delší dobu než v případe nepřítomnostipotenciačního činidla. Předpokládá se, že je to důsledkem prodloužené doby, po kterouje interferon přepisován mRNK, tj. pravé superindukce. Vynález obsahuje alternativníznak, způsob výroby interferonu, vyznačující se přidáním interferonového induktoruk lymfoblastoidním buňkám, které jsou schopné indukce za tvorby interferonu, přičemž .podstata spočívá v tom, že po indukci doba růstu produkce interferonu získávaného obvykleje podstatně prodloužena.. 251766 6 Výrazem "obvykle získávaný" je míněno to, co se získává, když se připravuje interferonz lymfoblastoidijích buněk způsoby dobře známými z oboru a bez jakéhokoli zásahu do změnydoby, po kterou stoupá výtěžnost interferonu.

Prodlouženi doby pro stoupání výtěžnosti interferonu lze docílit prodloužením doby,po kterou je interferon přepisován mRNK, tj. superíndukcí. Prodloužení doby lze docílitvýhodně pomocí potenciačního činidla za podmínek podle vynálezu. Vynález se týká tedyprostředku ke zvyšování doby produkce interferonu nad dobu, po kterou buňky produkujíinterferon za inkubačních podmínek známých z oboru.

Vynález lze výhodně kombinovat se způsoby známými z oboru pro zvyšování výtěžkuinterferonu z lymfoblastoidních buněk. Takže způsoby snižování teploty a předchozíhoošetření stimulátorem před indukcí lze kombinovat se způsoby zde popsanými vedoucímik vyšším výtěžkům interferonu než lze získat pomocí některé techniky samotné.

Zejména použití stimulátoru k předchozímu ošetření buněk před indukcí (jak je topopsáno v evropském pat. spise 0 000 391 a 0 008 391, které jsou zde citovány) bylo nale-zeno výhodným. V případech, kdy stimulátor působí jako potenciačni činidlo lze k oběma funkcímpoužít stejné látky. Je však výhodné provádět předchozí působení podle evropského patentovéhospisu č. 0 000 520, tj. pomocí alkankyseliny nebo její soli, zejména kyseliny máselnénebo sodné soli kyseliny máselné.

Vynález se týká v dalším znaku způsobu výroby interferonu, zahrnující přidání induktoruk lymfoblastoidním buňkám, které jsou schopné po indukci vytvářet interferon, přičemžbuňky byly inkubovány v médiu obsahujícím účinné netoxické množství stimulátoru předindukcí a kde vpředu definované potenciačni činidlo se přidává simultánně nebo krjitcepo indukci. V alternativním provedeni se vynález týká i způsobu výroby interferonu, zahrnujícího,přidání induktoru k lymfoblastoidním buňkám schopným vytvářet po indukci interferon,přičemž buňky jsou inkubovány před indukcí v médiu obsahujícím efektivní netoxické množstvístimulátoru a kde doba po indukci, během níž se zvyšuje produkce interferonu, se podstatněprodlouží.

Vynález je ilustrován následujícími příklady, které neomezují rozsah vynálezu. Přikladl ' '

Vliv potenciačního činidla na výtěžek interferonu V sériích pokusů rostly buňky Namalwa/WRL v suspenzi v RPMI 1 640 médiu obsahujícím 5 %hovězího séra, polymyxin a neomycin a hydrogenuhličitan sodný pro kontrolu hodnoty pH.

Když počet buněk dosáhl koncentrace 2x10® buněk/ml, byla část kultury odebrána a zředěnave stejném prostředí na 1x10® buněk/ml. Byla přidána sodná sůl kyseliny máselné na koncen-traci 1 mM a buňky byly za míchání při teplotě 37 °C inkubovány po dobu 48 hodin.

Po této inkubační periodě byly buňky odstředěny při 800 x.g. Buněčné pelety bylysuspendovány znovu v médiu RPMI 1 640 obsahujícím 2 % hovězího séra a upraveny na 3x10® bu-něk/ml. Byl přidán virus Sendai na 10 hemaglutinačních jednotek/ml k indukcí tvorby-inter- 2 feronu. Indukované buňky byly rozděleny v objemech po 10 ml do 25 cm tkáňových kultivačníchbaněk z plastu. Do každé baňky bylo přidáno jiné potenciačni činidlo, jak je uvedenov tabulce 1 v udané koncetraci. U dvou baněk bylo přidání vynecháno. 7 251766

Interferon b.yl izolován po uplynutí doby 24 hodin odstředěním buněk při 800 x gpo dobu 5 minut. Čirý supernatant obsahující interferon byl okyselen na hodnotu pH 2a udržován při teplotě 4 °C po dobu 24 hodin před analýzou interferonu. Zvýšeni interferonového titru proti standardu (kde nebylo přidáno žádné 'potenciační činidlo) bylo stanovenopro každé potenciační činidlo. Výsledky jsou uvedeny v tabulce I níže.

Tabulkal

Potenciální činidlo přidané ' Konečná koncentrace poten- Zvýšení interferonového k indukované kultuře ciačního činidla titru ve srovnání (mM) s kontrolou acetamid acetanilid N-acety1-6-hydroxyhexylamin N-butylacetamid butyramid N,N-dietylacetamid 1.3- dietylmočovinaN,N-dimetylacetamidN,N-dimetylhexanamid 1.3- dimetyl-2-imidazolidindimetylsulfoxid 1,1-dimetylmočovina 1.3- dimetylmočovinap-etoxyacetánilidN-etylacetamidN-etylpyrrolidinonetylmočovinahexametylenbisacetamidp-hydroxyacetanilidN-metylacetamidN-metylbenzamidN-metyl-2-piperidonN-metyl-2-pyrrolidinonmetylmočovina2-piperidonpropionamidpropylmočovina pyridin-N-oxid tetrametylthiomočovina tetrametylmočovina Příklad 2 20 2 2 2 5 3 5 . 5 10 ' 3 10 4 5 3 5 2 3 2 2 3 140 4 10 2 5 3 2 2 10 3 5 3 20 3 5 7 5 3 10 2 4 3 5 3 10 4 50 2 25 2 20 3 10 3 50 4 5 4 8,4 6

Vliv potenciačního činidla na výtěžek interferonu v přítomnosti i nepřítomnosti sodnésoli kyseliny máselné

Buňky Namalwa/WRL kultivované tak, jak je to popsáno v příkladu 1, byly zředěnyna 1x10° buněk/ml. Kultura byla rozdělena rovnoměrně do dvou odstředovacích baněk. Dojedné baňky byla přidána sodná sůl kyseliny máselné v koncentraci 1 mM. Ve druhé bylpřídavek vynechán. Obě kultury byly inkubovány za míchání po dobu 38 hodin. Buňky bylyindukovány virem Sendai, jak je to popsáno v příkladu 1. Jak je uvedeno v tabulce IIníže, potenciační činidla byla přidána k indukovaným kulturám s přídavkem a bez přídavkusodné soli kyseliny máselné. Interferon byl izolován a připraven pro stanovení, jak jepopsáno v příkladu 1 a bylo stanoveno zvýšené výtěžku interferonu ve srovnání se standardníkontrolou. Získané výsledky jsou uvedeny v tabulce II níže. 251766 8

Koncentrace po- Zvýšeni titru tenciačního či- interferonu nidla (mM) vzhledem ke kontrole

Tabulka II

Koncentrace sodné solikyseliny máselné užiták předběžnému ošetřeníNamalwa buněk (mM) Pótenciační činidlo při-dané při indukci 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 Příklad 3 žádné acetanilid Ν,Ν-dimetylacetamid dimetylsulfoxid N-metylbenzamid tetrametylmočovína žádné acetanilidN.N-dimetylacetamiddimetylsulfoxidN-metylbenzamidtetrametylmočovína . 2 5 140 8,4 2 5 140 4 8,4 1 3 3 2 3 6 1 2 2 2 3 3

Použití dimetylsulfoxidu jako stimulátoru i potenciačního činidla

Buňky Namalwa/WRL pěstované tak, jak je popsáno v příkladu 1, byly zředěny čerstvýmmédiem na koncentraci 1x10® buněk/ml. Kultura byla rozdělena rovnoměrně do dvou odstředo-vacích baněk. Do jedné baňky byl do koncentrace 140 mM přidán dimetylsulfoxid. Do druhébaňky nebylo přidáno nic. Obě kultury byly inkubovány za míchání po dobu 48 hodin. Buňkybyly odstředěny při 800 x g, znovu suspendovány v čerstvém médiu do koncentrace 3x10® bu-něk/ml a indukovány na interferon jak je popsáno v příkladu 1. Dimetylsulfoxid byl přidándo koncentrace 140 mM k jedné indukované kultuře připravené z bu»ěk ošetřených předemdimetylsulfoxidem a rovněž přidán ve stejné koncentraci k jedné z indukovaných kultur,připravené z buněk neošetřených předem dimetylsulfoxidem. Po uplynutí doby 24 hodin bylinterferon izolován a připraven ke stanovení jak je popsáno v příkladu 1.

Koncentrace dimetylsulfoxidu uži-tého k předběžnému působení nabuňky Namalwa (mM)

Koncentrace dimetylsulfoxidu Titr interferonupřidaného k indukci (mM) (log^g jedn./ml) 0 0 3,55 140 0 4,0 0 140 3,9 140 140 4,3 Příklad 4

Kinetika produkce interferonu V přítomnosti i nepřítomnosti potenciačního činidla a bezpředběžného působení sodné soli kyseliny máselné a s ním

Buňky Namalwa/WRL pěstované tak, jak je popsáno v příkladu 1, byly zředěny čerstvýmmédiem do koncentrace 1x10®. Kultura byl rozdělena do dvou odstředovacích baněk. Do jednébaňky byla přidána sodná sůl kyseliny máselné do koncentrace 1 mM; ve druhé baňce bylopřidání vynecháno, obě kultury byly inkubovány za míchání po dobu 48 hodin. Buňky bylyodstředěny při 800 x g, znovu suspendovány v čerstvém médiu do koncentrace 3x10® buněk/mla indukovány k tvorbě interferonu,· jak je to popsáno v příkladu 1. Tetrametylmočovínabyla přidána do koncentrace 8,4 mM k polovině indukovaných kultur, připravených z buněkpředem ošetřených sodnou solí kyseliny máselné a rovněž byla přidána ve stejné koncentraci 9 251766 k druhé polovině indukovaných kultur připravených z buněk neošetřených sodnou soli kyselinymáselné. Do zbývajících kultur nebyla tetrametylmočovina přidána. Byly čtyři skupinyindukovaných buněk, které obsahovaly buňky ošetřené předem sodnou solí kyseliny máselnéa ke kterým byla přidána nebo nebyla přidána tetrametylmočovina v době indukce interferonupomocí Sendai viru a buňky neošetřené sodnou solí kyseliny máselné, ke kterým byla přidánanebo nebyla přidána tetrametylmočovina v době indukce virem Sendai. V intervalech 2 hodin,jedna kultura z každé ze čtyř skupin byla odstředěna při 800 x g. Médium bylo odstraněno a buněčné peletky pečlivě odvodněny. Buňky byly suspendoványznovu do původního objemu čerstvého média, ke kterému byla potom přidána tetrametylmočovina,pokud byla přítomna v médiu před odstředěním. Po dalších dvou hodinách inkubace byl izolováninterferon ve stejných kulturách, jako je popsáno v příkladu 1.

Titr interferonu (log^g referenční jednotky/ml)

Buňky Namalwa předem neošetřené Buňky Namalwa ošetřené předem 1 mMsodnou solí kyseliny máselné Doba, kdy byl bez potenciač- k indukci při- k indukci nepři- k indukci přidá- interferon ního Činidla dáno 8,4 mM te- dáno potenciační dáno 8,4 mM po indukci izo-lován (hodiny) k indukci tetrametylmočo- viny činidlo tetrametylmočo- viny 0-2 0,75 0,75 1,05 1,05 2-4 0,75 0,75 2,6 2,7 4-6 1,8 1,7 4,05 4,2 6-8 2,55 2,9 4,25 4,65 8-10 2,7 3,5 4,1 4,9 10-12 2,8 3,7 3,95 4,65 12-14 2,6 3,75 ' 3,55 4,5 14-16 2,6 3,7 3,25 4,1 16-18 2,45 3,55 3,15 3,95 Příklad 5

Vliv přidáni sodné soli kyseliny máselné v indukci v přítomnosti a nepřítomnosti předchozíhoošetření sodnou solí kyseliny máselné

Buňky Namalwa pěstované tak, jak je popsáno v příkladu 1, byly odstraněny při 800 x g,znovu suspendovány do čerstvého média na koncentraci 3x10° buněk/ml indukovaných na inter-feron jako v příkladu 1. Bezprostředně po indukci buněk virem Sendai byla přidána sodnásůl kyseliny máselné do koncentrace uvedené v tabulce níže. Po 24 hodinách inkubacev médiu byl interferon izolován jako v příkladu 1.

Koncentrace sodné soli kyseliny máselné přidané Titr interferonu log^p referenční k indukované kultuře (mM) jednotky/ml 4,38 4.32 4.334,274,174,143,933,83 0 0,1 0,2 0,5 1 2 5 10

Claims (8)

1. 251766 10 PŘEDMĚT VYNALEZU

   1. Způsob výrobu interferonu zahrnující přidávání induktoru k lymfoblastoidním buňkám,které jsou schopné indukce za tvorby interferonu, vyznačující se tím, že během indukce nebo krátce po indukci se na buňky působí potenciačním činidlem vybraným ze skupiny sloučenin,která zahrnuje N-acety1-p-aminofenol, acetamid, /C^-Cg-aikyl/acetamidy, acetanilid, /C^-Cg--alkoxy/acetanilidy, alkylen-bisacetamidy, Ν,Ν-dimety-hexanámid, dimetylsulfoxid, C^-Cg--alkylamidy, /C^-Cg-alkyl/benzamidy, /C|-Cg-alkyl/-2-imidazolidinony, l-/C^-Cg-alkyl/-2--pyrrolidony, 2-piperidon, l-ZCj^-Cg-alkyiy-ž-piperidony, pyridin-N-oxidové a močovinovéderiváty, N-acetyl-p-aminofenol, Ν,Ν-dimetylacetamid, 1,3-dimetyl-2-imidazolidinon, dimetyl-sulfoxid, p-etoxyacetanilid, hexametylen-bisacetamid, 1-metylpiperidon a tetrametylmočovinu,přičemž se působí potenciačním činidlem v koncentraci 0,1 až 500 mM.
2. 2. Způsob podle bodu 2, vyznačující se tím,'že se působí potenciačním činidlem v kon-centraci 1 až 200 mM.
3. 3. Způsob podle bodu 2, vyznačující se tím, že se působí potenciačním činidlemv koncentraci 5 až 50 mM.
4. 4. Způsob podle kteréhokoli z bodů 1 až 4, vyznačující se tím, že potenciační činidlose přidává během indukce.
5. 5. Způsob podle některého z bodů 1 až 4, vyznačující se tím, že potenciační činidlose přidává v době dvou hodin po indukcí.
6. 6. Způsob podle některého z bodů 1 až 6, vyznačující se tím, že na buňky před indukcíse působí stimulátorem.
7. 7. Způsob podle bodu 7, vyznačující se tím, že jako stimulátorem se působí alkanovoukyselinou s přímým řetězcem o 1 až 6 atomech uhlíku nebo její solí.
8. 8. Způsob podle bodu 8, vyznačující se tím, že alkanovou kyselinou je kyselina máselná.