SE513313C2 - Modifierad interferonproduktion - Google Patents

Description

513 313 2 Skillman, D.R, Liao, M-J, Testa, D. och Meltzer, M.S. (1993) AIDS Res. And Human Retrovir. 9, 1115-1122, Heim, A., Brehm, C., Stille-Siegener, M., Müller, G., Hake, S, Kandolf, R. och Figulla, H-R. (1995) J1 Mol. Cell Cardiol. 27, 2199-2208).

Det finns för närvarande tre sätt att producera a- interferon i industriell skala, alla med fundamentella skillnader i de cellsystem som används. I de prokaryota systemen har en gen som kodar för en enda subtyp, nästan uteslutande interferon a2, transfekterats in i Escheri- där proteinet uttrycks av bakterierna och där- Boll, W. et al Series B: Biol. chia coli, efter skördas (Weissmann, C., (1982) Phil. 299, 7-28). feron refereras här som Hagata, S., Trans. Royal Soc. London, Denna process för produktion av a-inter- De bak- teriella kulturerna kan användas till att effektivt pro- Sci. “rekombinant interferon”. ducera a-interferon, vilket medför att det är ett ekono- miskt fördelaktigt alternativ jämfört med celler av hu- mant ursprung. Bara en enda subtyp produceras dock och proteinerna är inte modifierade (t ex glykosylerade) i motsats till det interferon a2 som produceras i eukaryota celler. En klinisk nackdel förknippad med de rekombinanta a-interferon produkterna är deras tendens att inducera antikroppar mot a-interferon i vissa patienter. Dessa ne- utraliserande antikroppar har i flera publikationer visat sig negativt påverka den terapeutiska behandlingen med rekombinant a-interferon(Antonelli, G, Simeoni, E, M, DePisa, F., V, Pistello, M, Dianzani, F. (1997) Biother. 10, 7-14, Öberg, K. och Alm, G. (1997) Biother.10, 1-5).

Alternativt kan a-interferon produceras i humana Currenti, Colizzi, och celler, antingen fràn etablerade cell linjer som odlas in vitro, eller fràn primära celler, t.ex. perifera leukocy- ter som erhàlls som biprodukt från donerat blod. I dessa fall fàs en blandning av a-interferon subtyper, även om celler av olika ursprung kan producera olika subtypsmöns- ter (Goren, T, Fischer, D.G. och Rubinstein, M. (1986) J. 513 313 3 Interferon Res. 6, 323-329). Etablerade cell-linjer är kloner som fàtts från humana tumörer eller fràn celler som har immortaliserats, t.ex. genom behandling med Epstein-Barr virus. Dessa celler delar sig och växer obe- gränsat om ett lämpligt medium och gynnsamma förhållanden ges. Primära interferon-producerande celler t.ex. leuko- cyter delar sig däremot inte och har en finit livslängd.

Sådana celler är därför tillgängliga i en begränsad om- fattning och tillgàngen är en begränsande faktor för storskalig produktion av naturligt humant leukocyte a-in- terferon. Sätt att öka utbytet i produktionsprocessen är därför nödvändiga.

Eukaryota cell-system producerar mycket lite eller inget a-interferon spontant. Användningen av en “inducerare” är därför nödvändig för att initiera produk- tionen av a-interferon i cellerna. Följdaktligen har ett stort antal ämnen rapporterats initiera produktionen av a-interferon i ett flertal in vitro cell-system eller in vivo. De vanligaste inducerarna är olika virus, men syn- tetiska organiska substanser har också visats fungera som inducerare för produktionen av a-interferon. Några exem- pel är leu-enkephalin och naloxon in vivo i möss (Gabrilovac, J., Ikic-Sutlic, M., Knezevic, N. och Poljak, L. (1996) Res. Exp. Med. 196, 137-144), neovir in vivo i möss (Mezentseva M., Narovlyansky, A., Kondratieva, T och Ershov, F. (1997). J.Interferon Res. 17, Suppl.2, S94. Abstract), dipyridamol in vivo i männi- ska (Galabov A.S. och Mastikova M. (1984) Biomed.

Pharmacoth. 38, 412-413), 2-amino-5-bromo-6-methyl-4-py- rimidinol (2-ABMP) och dess derivat in vivo i människa (US Patent No 3,932,6l7, Stringfellow, D.A., Vanderberg, H.C. och Weed, S.D. (1980) J. Interferon Res. 1, 1-14) och antraquinon derivat in vivo i ett flertal arter (US patent 4,027,021). Etanol har rapporterats inducera ß-in- terferon produktion i Madin-Darby bovina njurceller (MDBK) i frånvaro av andra inducerare (Chelbi-Alix, M.K. 513 313 4 och Chousterman, S. (1992) J. Biol. Chem. 267, 1741- 1745).

Det finns nägra exempel där produktionen av a-inter- feron har ökats med hjälp av andra reagens, här benämnda som “förstårkare”, dvs. ämnen som är kapabla att öka a- interferon produktionen i celler som aktiverats av ett inducerande medel, men som själv inte inducerar produk- tionen av a-interferon. Karaktäristiskt för en förstär- kare är att den kan tillsàttas antingen före det medel som inducerar interferon, eller efter att induktionen har ägt rum. Ämnen som rapporterats som förstärkare av inter- feronproduktionen i humana celler är t.ex. calmodulinets inhibitor trifluoperazine, använt pà fibroblaster (Lin, H.R. (1990) J. Interferon Res. 10, 375- dexamethason använd som stimulerare pà en cell (US patent 4,266,024), och natriumbutyrat också använt som en stimulerare i en lymphoblastoid cell linje (EP O 097 353; EP O OOO 520).

Dessutom har det rapporterats att purin-derivatet teofyl- H-Y. och Thacore, 378), linje av lymphoblastoid ursprung lin fungerar som en förstärkare och ökar utbytet av a-in- terferon fràn mus Lpa celler inducerade med poly I:C (Zahorska, R., Korbecki, M., (1995) Ther. Exp. 43, och användningen av och Barciszewski, J.

Arch. Immunol. 43-46), vissa syntetiska organiska föreningar, företrädesvis tet- rametylurea (TMU) (EP O 097 353), eller dimetylsulfoxid (DMSO) (US Patent NO 4,266,024) ron utbytet fràn en lymphoblastoid cell linje behandlad har visats öka a-interfe- med en inducerare.

I arbetet som lett till denna uppfinning har vissa av dessa ämnen som rapporterats som inducerare eller för- stärkare när de använts in vivo eller pà fibroblaster och pà en cell-linje av lymphoblastoid usprung, testats pà humana leukocyter i syfte att öka a-interferon produk- tionen, dels före och dels efter induktion med Sendai vi- rus, men utan positiva resultat pà utbytet av a-interfe- IOII . lO 513 313 I vissa experiment observerades t.o.m. en minskning i a-interferon produktionen i humana leukocyter när före- ningar kända som förstärkare i cell-linjer tillsattes.

Till exempel har förbehandling med natriumbutyrat beskri- vits som en stimulerare som leder till ett ökat utbyte av d-interferon i en lymphoblastoid cell-linje (EP O 097 353; EP O OOO 520). I det här beskrivna arbetet ledde förbehandling av primära leukocyter med natriumbutyrat enligt en liknande procedur till en minskning av d-inter- feron utbytet, vilket pekar på fundamentala skillnader mellan cell-linjer och primära celler som produktions- system för a-interferon proteiner. Ändamålet med denna uppfinning är därför att till- handahålla en förbättrad process för produktion av a-in- terferon i humana leukocyter inducerade med virus.

Sammanfattning av uppfinningen Ändamålet med uppfinningen erhålles genom förfaran- det för tillverkning av a-interferon såsom angivits i kraven.

Enligt uppfinningen tillhandahålles förfarande för produktion av a-interferon innefattande stegen: i. induktion av humana leukocyter med ett virus, ii. behandling av leukocyterna med ett förstärkande medel valt från: a) teofyllin, 2-amino-5-bromo-6-metyl-4-pyrimidinol och tymin pg W b) ett organiskt lösningsmedel valt från gruppen bestå- ende av icke-aromatiska ketoner, alifatiska eller cy- kliska amider, alkylerade alifatiska eller cykliska urea derivat och alifatiska eller cykliska sulfoxider; eller en kombination av föreningarna från a) med ett organiskt lösningsmedel från b).

Enligt föreliggande uppfinning, visade det sig ovän- tat att tillsats ay_de föreningar och/eller ett organiskt lösningsmedel som angivits ovan, ökar mängden virus- inducerat a-interferon i leukocyter. Med tanke på att det l0 513 313 6 är en annan art i fallet mus Lpa celler och olika cellur- sprung när det gäller lymphoblastoida cell-linjer, samt beaktande den brist pà överensstämmelse som observerats mellan de olika cell systemen i de experiment som beskri- vits ovan, var det överraskande att teofyllin liksom ett lösningsmedel som dimetylsulfoxid ökade produktionen av a-interferon i virus inducerade primära leukocyter. Även pyrimidinderivatet 2-amino-5-bromo-6-methyl-4-pyrimidinol (2-ABMP) produktionen enligt föreliggande uppfinning med använd- befanns agera som en förstärkare av a-interferon ning av virus inducerade primära leukocyter. Eftersom 2- ABMP inte inducerade a-interferon i frànvaro av en viral inducerare i det experimentella system som beskrivits i denna uppfinning, är förstärkningsmekanismen uppenbart annorlunda för den in vivo induktion av a-interferon som beskrivits i litteraturen jämfört med den förstärkande effekt av a-interferon produktionen som beskrivits för denna substans i föreliggande uppfinning. Detta stärker ytterligare bevisen för att olika mekanismer gäller i olika humana cell system, och indikerar det oförutsägbara med att arbeta med tillatser till cellulära system eller organismer.

Som nämnts ovan har ett flertal ämnen använts som inducerare och förstärkare både i in vivo system och i olika cellkultur system. Eftersom litteraturdata i många fall avvek frän resultaten i föreliggande uppfinning, t.ex. oförmàgan av 2-ABMP att fungera som en interferon inducerare i cell systemet enligt uppfinningen, bör mànga unika egenskaper hos det cellulära systemet använt i upp- finningen pàpekas. Primära celler fràn perifert blod re- presenterar en vilande cell population i motsats till alla andra cellulära system som beskrivits för interferon produktion. Cellerna är inte aktiverade eller immortali- serade med virus, vilket är fallet för Burkitt's lymphoma celler eller sà kallade lymphoblastoida celler. De är inte heller tumörcells-linjer med dess inbyggda genetiska instabilitet och felreglerade gen-uttryck. Det har visats 513 313 7 att i en blandning av leukocyter erhàllen fràn humant blod är det monocyterna som är de huvudsakliga producen- terna av a-interferon efter Sendai virus behandling K. Matson, P. Och Alm, G (1990) Cellerna som använts i denna uppfinning (Sandberg, J.Immunology 145, 1015-1020). skiljer sig alltsà frán de etablerade cell-linjerna som använts för a-interferon produktion med avseende pà till- växtsätt, neoplastisk potential, närvaro av virala genom och celltyp. Effekterna av de testade faktorerna kan där- för i utgàngsläget inte förväntas vara lika som för andra celltyper, med skillnader i differentiering, metaboliskt tillstànd eller interferens av virala genom.

Detalierad beskrivning av uppfinningen Enligt föreliggande uppfinning visade det sig att tillsats av förstärkande medel i form av teofyllin, 2- amino-5-bromo-6-metyl-4-pyrimidinol eller tymin och/eller ett flertal organiska lösningsmedel signifikant ökar in- terferon produktionen i humana leukocyter inducerade med virus. De förstärkande medlen kan öka interferon utbytet antingen ensamma eller i en kombination av ett organiskt lösningsmedel med de nämnda föreningarna. Under vissa förhållanden är effekten av att kombinera dessa förstär- kande medel synergistisk, och visar en större effekt än den som fàs när substanserna används var för sig.

De organiska lösningsmedel som kan användas enligt uppfinningen är icke-aromatiska ketoner, alifatiska eller cykliska amider, alkylerade alifatiska eller cykliska urea derivat och alifatiska eller cykliska sulfoxider.

Som föredragna lösningsmedel kan nämnas aceton, 2-buta- non, l,3-dimetyl-2-imidazolidinone, dimetylsulfoxid, N- etyl-2-pyrrolidinon, 4-metyl-2-pentanon, N-metyl-2-pyrro- lidinon (NMP), dimetylacetamid, 2-pyrrolidinon. De mest föredragna före- 2-pyrrolidinon, tetrametylensulfoxid, N,N- ningarna presenterade under punkt a) ovan med avseende pà interferon produktion är teofyllin och 2-ABMP. Det mest föredragna lösningsmedlet år NMP. 513 313 8 Viruset som används kan vara vilket som helst, men det virus som föredras är Sendai virus, den mest potenta induceraren av a-interferon för renade humana leukocyter.

Leukocyt-rening, inkubering av cellerna och virus induction görs i stort sett enligt original metoden från Cantell et al. (Cantell, K., Kauppinen, H.- L. och Myllylä, G. (1981) Methods in Enzymology 78, 29- 38).

Hirvonen, S., De humana leukocyterna som använts i uppfinningen prepareras fràn buffy coats genom en första centrifuge- ring för att fraktionera komponenterna, àtföljt av se- kventiell borttagning av plasma lagret och leukocyt frak- tionen m.h.a. sug. Kvarvarande röda blod celler som kon- taminerar leukocytfraktionen lyseras tvà gänger med 2 - 4 volymer av kall 0.83 % ammonium klorid och varje lyse- ringssteg följs av centrifugering för att ta tillvara cellerna. Den slutliga leukocyte fraktionen re-suspende- ras i ett basalt medium, t.ex. EMEM (Eagle's minimum essential medium) supplementerat med polyetylenglycol- (PEG) genom att tillsätta PEG 6000 till en slutlig koncentra- Efter fällning i 3-5 fälld human plasma. PEG-fälld plasma prepareras tion av 6 % (w/w) till human plasma. dagar i kyla tas supernatanten av och lagras fryst fram till användning.Temperaturen i inkubationsmediet är satt till 36 - 37°C och kontinuerlig omrörning används. Human PEG-fälld plasma % (v/v), terferon (normalt 100 IU/ml) tillsätts till en koncentration av 1 - (v/v). sätts till inkubationsmediet företrädesvis 4 % En liten mängd a-in- som ett priming steg, men andra koncentrationer, upp till flera tusen units per ml kan användas. Humana leukocyter tillsätts sedan till en koncentration av 3 - 15 miljoner celler /mL, företrädesvis 7 - 11 miljoner celler per mL.

Den likartade storleken pá förstärkningseffekten som ob- serverats när olika cellhalter använts gör det troligt att effekten kan ses även vid cellkoncentrationen utanför detta område. Priming steget tilläts normalt pàgà i l - 5 helst 1.5 timmar, -2 timmar. 513 313 9 Induktion av interferon görs genom att tillsätta Sendai virus, generellt 30 mL virus fràn allantoid vätska per liter inkubationsmedium men bàde mindre och större mängder visade pà god inducerande förmåga och det mest föredragna omràdet är 500-2000 hemagglutinerande virus partiklar per cell. En minskning av inkubationstemperatu- ren till 29°C - 32 °C görs (Morser, J. And Shuttleworth, J. (1981) J. Gen. 163-174) gare 1 till 4 timmar, företrädesvis efter l till 2 tim- Virology 56, efter ytterli- mar.

Den optimala tidpunkten för att sätta till de olika förstärkande medlen_yarierar, men generellt ses en ökning i a-interferon produktionen när ämnena tillsätts antingen vid samma tidpunkt som cellerna eller upp till flera tim- mar efter induktionen, företrädesvis i närheten av tid- punkten för temperatursänknings-steget.

Koncentrationsomrädet där tillsatserna är effektiva i att öka interferonproduktionen varierar mellan olika föreningar men för de minst toxiska lösningsmedlen kan en positiv effekt ses i omrädet 1 mM - 0.3 M, företrädesvis i omrâdet 3 mM - 50 mM och mest föredraget inom 5 mM - 20 mM. För de mer toxiska lösningsmedlen ligger de lämpliga koncentrationerna i mer begränsade områden. För teofyl- lin, 2-amino-5-bromo-6-metyl-4-pyrimidinol och tymin är det effektiva området 5 pM - 0.5 mM, helst 20pM - 0.15 mM. Efter dessa tillsatser tilläts inkubationen fortgå över natt med kontinuerlig omrörning. Ett centrifuge- ringssteg görs för att ta bort cellerna och supernatanten analyseras med en ELISA för att kvantifiera u-interferon.

Uppfinningen kommer nu att illustreras med följande icke begränsande exempel och med hänvisning till figu- Ierna I Figurtexter FigurlA: Effekt pä a-interferon produktion i Sendai virus inducerade humana leukocyter av tillsats av olika orga- 513 313 niska lösningsmedel till inkubationsmediet. Mängden a- interferon som producerats beräknas som procent av en referens utan tillsats av organiska lösningsmedel (=lOO %).

Figur lB: Effekt pà a-interferon produktion i Sendai virus inducerade humana leukocyter av tillsats av olika orga- niska lösningsmedel i kombination med 2-ABMP till inku- bationsmediet. Mängden a-interferon som producerats be- räknas som procent av en referens utan tillsats av för- stärkare (=lOO %).

Figur 2: Effekt pà d-interferon produktion i Sendai virus inducerade humana leukocyter av tillsats av olika purin och pyrimidin derivat vid olika NMP koncentrationer.

Mängden av a-interferon som producerats beräknas som procent av en referens utan tillsats av förstärkande ämne (=lOO %).

Figur 3: Effekt pà d-interferon produktion i Sendai virus inducerade humana leukocyter av tillsats av olika mäng- der av teofyllin vid olika DMSO koncentrationer. Mängden av a-interferon som producerats beräknas som procent av en referens utan tillsats av förstärkande medel (=lOO %).

Figur 4: Effekt pà a-interferon produktion i Sendai virus inducerade humana leukocyter av tillsats av NMP och teo- fyllin till inkubationsmediet i laboratorieskale- fer- mentorer. Mängden av a-interferon som producerats beräk- 513 313 ll nas som procent av en referens utan tillsats av för- stärkande ämne (=lOO %).

Tabell 1 Effekt på a-interferon produktionen av tillsats av förstärkande medel, 2-ABMP och DMSO, båda till Sendai vi- rus inducerade humana leukocyter och till icke inducerade humana leukocyter.

Exempel 1. a-interferon produktion från Sendai virus inducerade hu- mana leukocyter efter inkubering med olika organiska lös- ningsmedel.

Humana leukocyter preparerade fràn buffy coats och använda i koncentrationer mellan 8 och ll miljoner cel- ler per mL inkuberas i ett basalt medium (antingen EMEM eller ett modifierat EMEM) supplementerat med 1.5 g/L tricine och 4 % (v/v) PEG fälld plasma. Experimenten görs i en volym av 40 mL medium i 100 mL glas flskor med kon- med 100 IU/mL G- interferon i 1.5 timmar vid 37°C innan tillsats av tinuerlig omrörning. Cellerna ”primas” mL/L av Sendai virus. Efter 1.5 timmar sänks inkuba- tions-temperaturen till 30°C och de organiska lösnings- medlen sätts till inkubations-mediet. Lösningsmedlen som använts är aceton, DMSO (slutlig koncentration: 5 mL/L), 2-butanon, NN-dimetylacetamid, NMP, tetrametylensulfoxid (2,5 mL/L), TMU (1.5 mL/L), 2-pyrrolidinon (l.25 mL/L), 4-metyl-2-pentanon, 1,3-dimetyl-2-imidazolidinon och N- etyl-2-pyrrolidinon (0.6 mL/L). Incubationen tilläts där- efter fortsätta över natt. Cellerna tas bart med ett centrifugeringssteg och supernatanterna analyseras med en ELISA för att kvantifiera a-interferon.

Resultaten visas i Figur 1A.

Inkubationsförhàllandena ovan användes i exemplet som visas i Figur lB, men i detta fall är vissa av de or- ganiska lösningsmedlen kombinerade med 50 till 100 pg/mL av 2-ABMP. l5 513 313 12 Exempel 2 a-interferon produktion i Sendai virus inducerade humana leukocyter efter inkubering med purin och pyrimidin deri- vat, i frånvaro eller närvaro av ett organiskt lösnings- medel.

Exempel l upprepas med samma inkubationsförhàllanden men med tillsats av ett purin- och tvà pyrimidinderivat, antingen ensamma eller i kombination med NMP. Den purin som använts är teofyllin (50 pg/ml) och pyrimidinerna är 2-ABMP (50 pg/ml) eller tymin (140 pg/ml).

Resultaten visas i Figur 2.

Exempel 3 a-interferon produktion i Sendai virus inducerade humana leukocyter efter inkubation med teofyllin och olika kon- centrationer av ett organiskt lösningsmedel.

Proceduren fràn exempel 1 är upprepad men med till- sats av det organiska lösningsmedlet DMSO och purinen te- ofyllin. DMSO tillsätts med 2.5 mL/L eller 5 mL/L. Teo- fyllin koncentrationen varieras mellen 5 pg/mL och 100 pg/mL.

Resultaten visas i Figur 3.

Exempel 4 a-interferon produktion i Sendai virus inducerade humana leukocyter inkuberade i laboratorieskale fermentorer En uppskalning är gjord där resultaten erhållna i liten skala används för att hitta lämpliga förhållanden för laboratorie fermentorerna. Olika experiment är gjorda för att jämföra a-interferon produktionen i en fermentor där NMP och teofyllin är tillsatta med en referens- fermentor där inget förstärkande medel är tillsatt. Expe- rimenten är gjorda i fermentorer i laboratorieskala med 2 L medium per kärl. Mängden teofyllin är 50 pg/mL, medan NMP varierar fràn 1.75 mL/L till 3 mL/L. hàllandena är enligt Exempel 1. Resultaten visas i Figur 4.

Inkubationsför- lO l5 513 313 13 Exempel 5 a-interferon produktion i humana leukocyter inkuberade med 2-ABMP och DMSO. Effekter av virus induktion.

Exempel l är upprepat med samma inkubationsförhàl- landen men med tillsats av 2-ABMP i kombination med DMSO.

De förstärkande medlen sätts bàde till Sendai virus indu- cerade leukocyter och till icke inducerade leukocyter och effekten pà a-interferon produktionen jämförs. 2-ABMP tillsätts till en koncentration av 50 gg/ml och mängden tillsatt DMSO är 5 mL/L.

Resultaten visas i Tabell 1.

Tabell 1.

Virus induktion Förstärkande medel Utbyte av a- interferon Sendai virus (30 Inget 100 % mL/L) Sendai virus (30 2-ABMP (50 pg/mL) 146 % mL/L) och DMSO (5 mL/L) Ingen 2-ABMP (50 pg/mL) < 1 % och DMSO (5 mL/L) Slutsats I denna uppfinning har det visats att tillsats av olika organiska lösningsmedel liksom olika puriner och pyrimidiner reproducerbart ökar produktionen av a-inter- feron i virus inducerade humana leukocyter. Den största ökningen fås när purin eller pyrimidin derivaten kombine- ras med ett organiskt lösningsmedel.

Claims (8)

10 15 20 25 30 35 513 313 14 Patentkrav

1. Förfarande för produktion av d-interferon inne- fattande stegen: i) inducering av humana leukocyter med ett virus, ii) behandling av leukocyterna med ett förstärkande me- del valt från a) teofyllin, 2-amino-5-bromo-6-metyl-4-pyrimidinol eller tymin b) ett organiskt lösningsmedel valt fràn gruppen bestà- ende av icke-aromatiska ketoner, alifatiska eller cy- kliska amider, alkylerade alifatiska eller cykliska urea- derivat och alifatiska eller cykliska sulfoxider; eller en kombination av föreningarna från a) med ett organiskt lösningsmedel från b).

2. Förfarande enligt krav 1, kännetecknat av att leukocyterna är monocyter.

3. Förfarande enligt krav 1 eller 2, kànnetecknat av att det förstärkande medlet är tillsatt vid samma tid- punkt eller upp till 4 timmar efter virus induktionen.

4. Förfarande enligt krav l - 3, kännetecknat av att viruset är Sendai virus.

5. Förfarande enligt krav 1 - 4, kännetecknat av att det organiska lösningsmedlet är nàgot av aceton, 2-buta- non, l,3-dimetyl-2-imidazolidinon, dimetylsulfoxid, N- etyl-2-pyrrolidinon, 4-metyl-2-pentanon, N-metyl-2-pyrro- lidinon, 2-pyrrolidinon, tetrametylen sulfoxid, N,N-dime- tylacetamid, 2-pyrrolidinon.

6. Förfarande enligt krav 5, kännetecknat av att det förstärkande medlet är teofyllin.

7. Förfarande enligt krav 5, kännetecknat av att det förstärkande medlet är 2-amino-5-bromo-6-metyl-4-pyrimi- dinol.

8. Förfarande enligt krav 1 - 4, kännetecknat av att lösningsmedlet är N-metyl-2-pyrrolidinon. N