CS250361B1 - Kmen mikroorganismu Corynebacterium glutamicum CCM 3867 - Google Patents

Abstract

Řešení se týká kmene mikroorganismu Corynebacterium glutamicum CCM 3867, dependentní na homoserin a resistentní k S-(2- -aminoethylj-L-cysteinu a chlorlysinu, produkující lysin.

Description

Vynález se týká kmene mikroorganismu druhu Corynebácterium glutamicum, dependentního ha homoserin a resistentního k analogům lysinu, který v médiu s vhodným zdrojem uhlíku a dusíku hromadil za aerobních podmínek a při neutrálním pH vysoká množství lysinu.

Vhodnými producenty lysinu jsou mutanty koryneformních bakterií, především mutanty rodů Brevibacterium a Corynebacterium. Z těchto mutant se osvědčily mutanty regulační a mutanty současně regulační a auxotrofní, selektované jako mutanty resistentní k analogům aminokyselin a zároveň dependentní na aminokyseliny. Významná množství lysinu hromadily v prostředí některé mutanty Brevibacterium flavum resistentní k analogu lysinu, tj. k S-(2-aminoethyl)-L-cysteinu (Sáno, K.-Shiio, I.: JJ. Gen. Appl. Microbiol. 16, 373. 1970 j. Mutanty Corynebacterium glutamicum, vyznačující se kromě resistence k S-( 2-aminoethyl )-L-cysteinu také dependencí na takové aminokyseliny jako je serin, prolin, leucin a alanin, hromadily v médiu 30 až 40 g/1 lysinu (západoněmecký patent 2 321 461, 1973). Mutanta Brevibacterium lactofermentum současně resistentní k S-(2-aminoethyl )-L-cysteinu a k -amino-hydroxyvalerové kyselině hromadila v médiu 32 g/1 lysinu (Tosaka, O. Takinami, K. Hirose, Y.: Agr. Biol. Chem. 42, 745, 1978 j.

Produkcí lysinu převyšuje dosud známé umíněné kmeny kmen Corynebácterium glutamicum, uložený v Československé sbírce mikroorganismů University J. E. Purkyně v Brně, třída Obránců míru 10, pod označením CCM 3867, který je předmětem vynálezu.

Autoři vynálezu se rovněž zabývali způsobem šlechtění mikroorganismu Corynebacterium glutamicum, kterým se nový kmen získává. Podstata šlechtění spočívá v tom, že se na kulturu výchozího kmene mikroorganismu působí roztokem 0,05 M ethylmethansulfonátu po dobu 18 hodin, načež se izolují získané mutanty, vyrostlé po kultivaci v tekutém kompletním médiu, na minimálním tuhém médiu doplněném 0,001 mg/ /ml L-homoserinu a 1 mg/ml chlorlysinu. Chlorlysln, tj. 2,6-diamino-4-chlorhexankarbonová kyselina, je analog lysinu, který má vodíkový atom v poloze 4 nahrazen atomem chloru. S výhodou se používá 0,05 M roztoku ethylmethansulfonátu ve fosfátovém pufru (pH 7,2).

Hlavní výhodou nového kmene podle vynálezu je zvýšení produkce lysinu, podmíněné dependencí na homoserin a resistencí k dvěma analogům lysinu, tj. k S-( 2-aminoethyl )-L-cysteinu a k chlorlysinu. Při kultivaci nového kmene v produkčním médiu se sacharózou a melasou nebo jen s melasou jako zdroji uhlíku, s kyselým hydrolyzátem arašídové mouky, kukuřičným výluhem a síranem amonným jako zdroji dusíku a s minerálními solemi v baňkách inkubovaných na rotační třepačce při 28 °C a pH udržovaném vodným roztokem čpavku na hodnotě 7,0 lze dosáhnout po 4-denní kultivaci produkce L-lysinu 52 g/1 (v médiu se sacharózou a melasou] a 45 g/1 (v médiu s melasou).

Nový kmen Corynebácterium glutamicum CCM 3867 je charakterizován následujícími morfologicko-kultivačními a fyziologickými vlastnostmi:

Grampozitivní, nepohyblivé, nesporulující kokky až krátké tyčinky, vyskytující se jednotlivě, v párech i v nepravidelných shlucích.

Na masopeptonovém agaru tvoří okrouhlé, hladké, lesklé, krémově bílé kolonie, s rovnými okraji.

Na masopeptonovém šikém agaru vytváří intenzívní bílý nárůst po celém povrchu agaru, k pigmentaci nedochází.

Při růstu v bujónu dochází k tvorbě zákalu a sedimentu, blanka se netvoří.

Na krevním agaru tvoří kulaté, hladké, šedé kolonie, s rovnými okraji, nehemolysující.

Fyziologické vlastnosti:

Optimální teplota: 28 až 30 °C.

Optimální pH: 7,0 až 7,2.

Aerobní organismus.

Želatinu neztekucuje.

Lakmusové mléko odbarvuje, ale nesráží. Glukózu, fruktózu a sacharózu zkvašuje. Škrob hydrolyzuje slabě.

Celulózu nerozkládá.

Dusičnany netvoří.

Sirovodík netvoří.

Indol netvoří.

Test na katalázu: pozitivní.

Test na methylenovou modř: negativní. Voges-Proskauerův test: negativní.

K růstu vyžaduje z vitaminů biotin a z aminokyselin homoserin.

Při způsobu šlechtění podle vynálezu se postupuje tak, že se výchozí kmen Corynebacterium glutamicum CCM 3287, resistentní k S-( 2-aminoethyl J-L-cysteinu a dependentní na homoserin, nechá submersně růst 24 hodin v kompletním médiu a buněčná suspenze se po promytí fosfátovým pufrem s hodnotou pH 7,2 vystaví působení mutagénu, v tomto případě 0,05 M roztoku ethylmethansulfonátu ve fosfátovém pufru (pH 7,2). Po této operaci se promytou suspenzí očkuje baňka s kompletním médiem, která se inkubuje 24 hodin. Promytou suspenzí vhodně naředěnou se očkují plotny s minimálním médiem doplněným homoserinem a chlorlysinem. Mutanty resistentní k chlorlysinu se vyočkují na šikmé masopeptonové agary. Isoláty vyrostlé na agarech se po otestování stupně resistence k S-( 2-aminoethyl)-L-cysteinu a k chlorlysinu a dependence na homoserin produkčně hodnotí v médiích se sacharózou a melasou nebo jen s melasou jako zdrojem uhlíku.

Podrobnosti vynálezu vyplývají z následujících příkladů provedení:

Přikladl

Mikroorganismem Corynebacterium glutamicum CCM 3287 se očkuje 60 ml kompletního média v 500 ml varné baňce. Složení kompletního média je následující:

glukóza 0,5 % hydrolyzát kaseinu 1,0 kvasničný extrakt 0,5

KH2PO4 0,3

K2HPO4 0,1 roztok solí 1 ml/1 000 ml média (Roztok solí je roztok 0,5 g FeSO4.7H2O a 0,5 g MnSOá. 4ΗϊΟ ve 100 ml vody).

Zaočkovaná baňka se inkubuje na rotační třepačce (frekvence otáček — 3,7, výstředník — 25 mm) 24 h při 28°C. Buněčná suspenze se potom 2X promyje fosfátovým pufrem (pH 7,2) a po promytí se vystaví 18 hodinovému působení 0,05 M roztoku ethylmethansulfonátu ve fosfátovém pufru (pH 7,2). Po aplikaci mutagénu se suspenze 2X promyje sterilní destilovanou vodou a 5% (obj.) suspenze se očkuje 500 ml varná baňka se 60 ml kompletního média, která se inkubuje 24 h při 2i8 °C na rotační třepačce. Buněčná suspenze se 2X promyje sterilní destilovanou vodou a vhodně naředěnou suspenzí se očkují plotny s minimálním médiem doplněným 0,001 mg/ml a 1 mg/

/ml chlorlysinu.	Složení minimálního mé-	melasa	25,0 %
dia je následující:		hydrolyzát arašídové mouky	18,0% (obj.)
		kukuřičný výluh	1,5
glukóza	0,1 %	(NH4)2SO4	1,5
citran sodný	0,04	KH2PO4	0,2
KH2PO4	0,7	MgSO4.7HzO	0,03
K2HPO4	0,2	CaCOs	2,0
(NH4)2SO4	0,1	FeSOá.7HaO	0,002
MgSOá,. 7H2O	0,01	MnSCH.4H2O	0,002
roztok biotinu	2 mg/1 000 ml	biotin (technický)	0,00005
roztok solí	1 ml/1 000 ml	pH	7,0
agar	2,5 %
		Během 4denní kultivace se	pH upravuje
(Roztok solí je roztok 0,5 g FeSCh. 7HžO a	ve 24 hodinových intervalech	vodným roz-

0,5 g MnSO4.4H'2O ve 100 ml vody).

Mutanty resistentní k chlorlysinu se vyočkují na šikmé masopeptonové agary a isoláty vyrostlé na agarech se jednak testují na dependenci na homoserin a resistenci k S-(2-aminoethyl)-L-cysteinu a chlorlysinu, jednak se zjišťuje jejich schopnost produkovat lysin v produkčních médiích se sacharózou a melasou nebo jen s melasou jako zdrojem uhlíku.

Příklad 2

Kulturou kmene Corynebacterium glutamicum CCM 3867, 24 h starou, se očkuje 60 mililitrů inokulačního média CSL-B-S v 500 mililitrech varných baňkách. Složení inokulačního média je následující:

sacharóza 2,5 % kukuřičný výluh (65 % sušiny] 3,0 pH 7,0

Zaočkované baňky se inkubují na rotační třepačce (frekvence otáček — 3,7, výstředník — 25 mm (2(4 h při 28°. 10 % (obj.) inokula se očkují 500 ml varné baňky s 20 mililitrech produkčního média BSM nebo BM-1 následujícího složení:

Médium BSM:

sacharóza 15,0 % melasa 3,0 hydrolyzát arašídové mouky 22,0% (obj.) kukuřičný výluh 1,5 (NHi)₂SO4 1,5

KH2PO4 0,2

MgSO4.7HžO 0,03

CaCOs 2,0

FeSOá. 7H2O 0,002

MnS04.4H2O 0,002 biotin (technický) 0,00005 pH 7,0

Médium BM-1:

tokem čpavku na hodnotu 7,0 — 7,2. Na konci kultivace se stanoví obsah lysinu a cukru v kultivační tekutině. Lysin se stanovuje manometricky s použitím dekarboxylasy lysinu a cukr jako glukóza s použitím analyzátoru glukózy Glucose Analyzer 2 (Beckman, U.S.A.).

Produkce lysinu po 4 dnech kultivace v médiu BSM činila 52 g/1 a v médiu BM-1

Claims (1)

1. Kmen mikroorganismu Corynebacterium glutamicum CCM 3867 dependentní na homoserin a resistentní k S-(2-aminoethyl)-L -cysteinu a chlorlysinu, produkující lysin.