CS246668B1 - Kmen mikroorganismu Brevibactarium flavum CCM 3868 - Google Patents

Abstract

Účelem řešení je produkce esenciální aminokyseliny lysinu v mediu s melasou jako zdrojem uhlíku. Lysin syntetizuje a v mediu hromadí mutanta bakteriálního druhu Brevibacterium flavum. Působením mutagénu a aplikací medií se zvyšující se koncentrací melasy byla izolována mutanta rezistentní k S—(2-aminoethyl)-L-cysteinu, dependentní na homoserin a leucin a rostoucí v mediu s vysokým obsahem melasy, která kultivována 96 h v mediu s melasou jako zdrojem uhlíku, hydrolyzátem arašídové mouky jako zdrojem dusíku a s minerálními solemi za aerobních podmínek při 28 °C a neutrálním pH hromadila v prostředí 46 g/1 L-lysinu. Lysin, využívaný především jako doplněk krmiv, lze takto vyrábět s využitím mikroorganismů běžnými technologickými postupy.

Description

(54) Kmen mikroorganismu Brevibactarium flavum CCM 3868

Účelem řešení je produkce esenciální aminokyseliny lysinu v mediu s melasou jako zdrojem uhlíku. Lysin syntetizuje a v mediu hromadí mutanta bakteriálního druhu Brevibacterium flavum. Působením mutagénu a aplikací medií se zvyšující se koncentrací melasy byla izolována mutanta rezistentní k S—(2-aminoethyl)-L-cysteinu, dependentní na homoserin a leucin a rostoucí v mediu s vysokým obsahem melasy, která kultivována h v mediu s melasou jako zdrojem uhlíku, hydrolyzátem arašídové mouky jako zdrojem dusíku a s minerálními solemi za aerobních podmínek při 28 °C a neutrálním pH hromadila v prostředí 46 g/1 L-lysinu. Lysin, využívaný především jako doplněk krmiv, lze takto vyrábět s využitím mikroorganismů běžnými technologickými postupy.

Vynález se týká nového kmene mikroorganismu druhu Brevibacterium flavum, rezistentního k analogu lysinu a dependentniho na homoserin a leuoin, rostoucího v mediu s vysokým obsahem melasy a hromadícího v mediu s melasou jako zdrojem uhlíku a kyselým hydrolyzátem arašídové mouky a síranem amonným jako zdroji dusíku za aerobních podmínek a při neutrálním pH vysoká množství lysinu.

Vhodnými producenty lysinu, využívanými při jeho výrobě fermentační cestou, jsou'regulační mutanty koryneformních bakterií, selektované jako mutanty rezistentní k analogům aminokyselin a dependentni zároveň na aminokyseliny. Takovými mutanty jsou např. mutanty Brevibacterium lactofermentum rezistentní k S-(2-aminoethyl)-L-cysteinu a dependentni na alanin nebo leucin a hromadící v glukosovém mediu 30-40 g/1 lysinu (Tosaka, O.-Takinami, K.-Hirose> Y.: Agr. Biol. Chem. 42:1 181, 1978; Tosaka, O.-Enei, H.-Hirose, Y.: Trends in Biotechnology 1:70, 1983).

Při fermentační přípravě lysinu s použitím melasy jako zdroje uhlíku lze použít mutanty druhu Brevibacterium flavum a Corynebacterium glutamicum, které kromě rezistence k analogům aminokyselin a dependence na aminokyseliny byly ještě rezistentní k antibiotikům, např. k penicilinu nebo bacitracinu (US pat. 3 687 810, 1972; švýc. pat. 535 831, 1973). Produkce lysinu dosahované mutanty Brevibacterium flavum kolísaly v rozmezí 30-35 g/1.

Produkcí lysinu převyšuje dosud známé zmíněné kmeny nový kmen Brevibacterium flavum, uložený v Československé sbírce mikroorganismů Univerzity J. E. Purkyně v Brně, třída Obránců míru 10, pod označením CCM 3 868, který je předmětem vynálezu.

Hlavní výhodou nového kmene podle vynálezu je jeho schopnost růst v mediu s relativně vysokým obsahem melasy a v mediu s melasou jako zdrojem uhlíku produkovat lysin v relativně vysokých množstvích. Při kultivaci nového kmene v produkčním mediu s melasou, kyselým hydrolyzátem arašídové mouky a síranem amonným jako zdroji dusíku a minerálními solemi v baňkách inkubovaných na rotační třepačce při 28 °C a pH udržovaném vodným roztokem čpavku na pH 7,0 lze dosáhnout po 4denní kultivaci produkce lysinu 46 g/1.

Nový kmen Brevibacterium flavum CCM 3 868 je charakterizován následujícími morfologicko-kultivačními a fyziologickými vlastnostmi:

Grampozitivní, nepohyblivé, nesporulující kokky až krátké tyčinky.

Na masopeptonovém agaru tvoří okrouhlé, hladké, žluté kolonie s rovnými okraji.

Na krevním agaru tvoří okrouhlé, žluté kolonie s rovnými okraji, které nehemolyzují. při růstu v bujónu dochází k tvorbě zákalu a sedimentu, ne však blanky.

Fyziologické vlastnosti:

Optimální teplota: 28-30 °C.

Optimální pH: 6,8-7,2.

Aerobní organismus.

Želatinu neztekucuje.

Celulózu nerozkládá.

Glukózu, fruktózu, sacharózu zkvašuje .

Škrob hydrolyzuje jen slabě.

Dusičnany redukuje .

Sirovodík netvoří .

Indol netvoří.

Test na katalázu: pozitivní.

Voges-Proskauerův test: negativní.

K růstu vyžaduje z vitamínů biotin a thiamin, z aminokyselin homoserin a leucin.

Je schopen růst v mediu se 60 i melasy.

Výchozí kmen, Brevibacterium flavum CCM 3 736, rezistentní k S-(2-aminoethyl)-L-cysteinu a dependentní na homoserin a leucin, se submerzně kultivuje 24 h v kompletním mediu a buněčná suspenze po promytl fosfátovým pufrem (pH 7,2) se vystaví 18hod. působení 0,05M roztoku ethylmethansulfonátu ve fosfátovém pufru (pH 7,2). Buněčná suspenze po aplikaci mutagenu se promyje sterilní destilovanou vodou a 5 % (obj.) promyté suspenze se očkují baňky s kompletním médiem, které se inkubují 24 h. 24hod. kulturou se očkují baňky s mediem MeM, obsahujícím 50 í melasy, a to 1 S (obj.) inokula.

Po 4 dnech kultivace se kultura přeočkuje (opět použito 1% inokula) do baněk s mediem MeM se 60 % melasy. Po 4denní kultivaci se kultura vyočkuje na plotny s kompletním mediem. Kolonie vyrostlé po 2 dnech na plotnách se vyočkují na šikmé agary a izoláty vyrostlé na šikmých masopeptonových agarech se jednak testují na stupeň rezistence k S-(2-aminoethyl)-L-cysteinu a na dependenci na homoserin a leucin, jednak se zjištuje jejich schopnost produkovat lysin v mediu s melasou jako zdrojem uhlíku.

Podrobnosti vynálezu vyplývají z následujících příkladů provedení:

Příklad 1

Mikroorganismem Brevlbacterium flavum CCM 3 736 se očkuje 60 ml kompletního media v 500ml varné baňce. Složeni kompletního media je následující:

glukóza hydrolyzát kaseinu kvasničný extrakt KH₂ ^p°4 ^K2^HPO4 roztok solí agar (do tuhých medií)

0,5 %

1,0

0,5

0,3

0,1 ml/1 000 ml media 2,5 % (Roztok solí je roztok 0,5 g FeSO^.7 HjO a 0,5 g MnSO^.4 H₂O ve 100 ml vody.)

Zaočkovaná baňka se inkubuje na rotační třepačce (frekvence otáček - 3,7, výstředník 25 mm) 24 h při 28 °C. Buněčná suspenze se potom 2x promyje fosfátovým pufrem (pH 7,2) a po promytí se vystaví 18hod. působení 0,05M roztoku ethylmethansulfonátu ve fosfátovém pufru (pH 7,2). Po aplikaci mutagenu se suspenze 2x promyje sterilní destilovanou vodou a 5% (obj.) suspenze se očkuje 500 ml varná baňka se 60 ml kompletního media, která se inkubuje 24 h při 28 °C na rotační třepačce. 1 % (obj.) kultivační tekutiny se očkuje 500 ml varná baňka s 20 ml media MeM následujícího složeni:

melasa	50,0 %
hydrolyzát arašídové mouky	2,0
močovina	0,5
(nh4)2so4	0,5
kh2po4	0,04
MgSO4.7 H2O	0,05
CaCO,	3,0
pH	7,5

Zaočkovaná baňka se inkubuje 4 dny při 28 °C. 1 % (obj.) kultivační tekutiny se opět očkuje 500ml varná baňka s 20 ml media MeM obsahujícího 60 % melasy a buněčnou suspenzí po 4denní inkubaci na rotační třepačce při 28 °C se po naředění očkují plotny s kompletním mediem. Plotny se inkubují při 28 °C 2 dny a kolonie vyrostlé na plotnách se vyočkují na šikmé agary s masopeptonovým mediem. Vyrostlé izoláty se testují na stupeň rezistence k S-(2-aminoethyl)-L-cysteinu, na dependenci na homoserin a leucin a na schopnost produkovat lysin v mediu s melasou jako zdrojem uhlíku.

Příklad

Kulturou kmene Brevibacterium flavum CCM 3 868, 24 h starou, se očkuje 60 ml inokulačního media CSL-B-S v 500ml varných baňkách. Stejným způsobem se naočkuje kontrola, tj. výchozí kmen Brevibacterium flavum CCM 3 736; Složení inokulačního media je následující:

sacharóza kukuřičný výluh (65 % sušiny) pH

2,5 % 3,0

7,0

Zaočkované baňky se inkubují na rotační třepačce (frekvence otáček - 3,7, výstředník 25 mm) 24 h při 28 C. 10 % (obj.) media B-Me následujícího složení:

inokula se očkují 500 ml varné baňky s 20 ml produkčního

melasa	30,0 %
hydrolyzát arašídové mouky	15 % (ob
(nh4)2so4	1,5 %
kh2po4	0,2
MgSO4.7 H20	0,03
CaCOj	2,0
FeSO4 . 7 H2O	0,002
MnSO4.4 H2O	0,002
thiamin (hydrochlorid)	0,0002
biotin (technický)	0,00005
PH	7,0

Během 4denní kultivace se pH upravuje ve 24hod. intervalech vodným roztokem čpavku na hodnotu 7,0-7,2. Na konci kultivace se stanoví obsah lysinu a cukru v kultivační tekutině. Lysin se stanovuje manometricky s použitím dekarboxylázy lysinu a cukr jako glukóza s použi tím analyzátoru glukózy Glucose Analyzer 2 (Beokman, U.S.A.).

Produkce lysinu po 4 dnech kultivace činila 46 g/1 (produkce kontroly 30 g/1).

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Kmen mikroorganismu Brevibacterium flavum CCM 3 868, rezistentní k S-(2-aminoethyl)-L-cysteinu, dependentní na homoserin a leucin, rostoucí v mediu s vysokým obsahem melasy a produkující lysin v mediu s melasou jako zdrojem uhlíku.