CS264856B1

CS264856B1 - Kmen mikroorganismu Brevibacterium flavum CCM 3982

Info

Publication number: CS264856B1
Application number: CS868482A
Authority: CS
Inventors: Jiri Dr Csc Plachy; Stanislav Ing Ulbert; Karel Dr Culik; Alexandr Hano; Michal Ing Csc Bucko; Vladislav Vlcek; Frantisek Dr Csc Smekal; Gabriela Ing Borosova; Emil Ing Miklas; Petr Ing Csc Pilat
Original assignee: Jiri Dr Csc Plachy; Ulbert Stanislav; Karel Dr Culik; Alexandr Hano; Bucko Michal; Vladislav Vlcek; Frantisek Dr Csc Smekal; Borosova Gabriela; Miklas Emil; Pilat Petr
Priority date: 1986-11-21
Filing date: 1986-11-21
Publication date: 1989-09-12
Also published as: CS848286A1

Abstract

Účelem řešení je produkce esenciální aminokyseliny lysinu v médiu sa sacharosou jako zdrojem uhlíku. Lysin syntetizuje a v médiu hromadí mutanta bakteriálního druhu Brevibacterium flavum. Působením mutagénu a aplikací selektivních médií byla izolována mutanta rezistentní k S—(2-aminoethyl)-L-cysteinu, dependentní na homoserin a leucin a citlivá na 2-fluorpyruvát sodný> která kultivována 4 dny v médiu se sacharosou jako zdrojem uhlíku, hydrolyzátem arašídové mouky a kukuřičným výluhem jako zdroji organického a síranem amonným jako anorganickým zdrojem dusíku a s minerálními solemi hromadila při vysoké konverzi za aerobních podmínek při 28 °C a neutrálním pH v prostředí 58 g/L L-lysinu. Lysin, využívaný především jako doplněk krmiv, lze takto vyrábět s využitím mikroorganismů běžnými technologickými postupy.

Description

Vynález se týká nového kmene mikroorganismu druhu Brevibacterium flavum rezistentního k analogu lysinu, dependentního na homoserin a leucin a citlivého na 2-fluorpyruvát, který v médiu s vhodným zdrojem uhlíku a dusíku hromadil při vysoké konverzi uhlíkatého zdroje za aerobních podmínek a při neutrálním pH vysoká množství lysinu.

Při fermentační přípravě lysinu jsou jako produkční organismy využívány mutanty koryneformnich bakterií s více genetickými znaky, které jsou mutantami auxotrofně-regulačními, vykazujícími .ještě citlivost k inhibitorům klíčových enzymů biosyntézy lysinu. S cílem izolovat takové mutanty byly izolovány mutanty druhu Brevibacterium flavum, které kromě rezistence k analogu lysinu, tj. k S-(2-aminoethyl)-L-cysteinu a dependence na homoserin a leucin jsou citlivé na 2-flourpyruvát sodný. S mutantou Brevibacterium flavum rezistentní k S-(2-aminoethyl) -L-cysteinu a citlivou na fluorpyruvát bylo v médiu s glukosou jako zdrojem uhlíku dosaženo produkce 51 g/L L-lysinu (Ozaki, H.-Shiio, I.: Agric. Biol. Chem. 47:1569, 1983).

Výše produkce lysinu je závislá na optimálním poměru dehydrogenázy a karboxylázy pyrohroznové kyseliny, které jako enzymy metabolismu glukózy reprezentují zároveň klíčové enzymy biosyntézy lysinu. Tyto enzymy rozhodují totiž o tom, zda bude pyruvát využit v energetickém metabolismu ₍net}O-bude přednostně v přítomnosti nadbytku biotlnu a při inhibici dehydrogenázy, vyvolané fluorpyruvátem, metabolizován karboxylázou, aktivovanou biotinem, na oxalacetát, z něhož se tvoří asparagová kyselina - výchozí sloučenina biosyntézy lysinu u baktérií (Tosaka, O.-Takinami, K.: Agric. Biol. Chem. 42:95, 1978; Tosaka, CA-Yoshijiara, Y.-Ikeda, S.-Takinami, K,: Agric. Biol. Chem. 49:1305, 1985).

. Produkcí lysinu převyšuje dosud známé kmeny kmen Brevibacterium flavum CCM 3982, který je předmětem vynálezu. Hlavní předností nového kmene podle vynálezu je jeho schopnost produkovat vysoká množství lysinu při vysokém stupni konverze uhlíkatého zdroje. Při kultivaci nového kmene v produkčním médiu se sacharózou jako zdrojem uhlíku, s kyselým hydrolyzátem arašídové mouky a kukuřičným výluhem jako komplexními a síranem amonným jako anorganickým zdrojem dusíku a s minerálními solemi byly zaznamenány po 4denní kultivaci při 28 °C a pH udržovaném vodným roztokem čpavku na hodnotě 7,0 produkce lysinu 58 g/L při konverzi 40 %.

Nový kmen Brevibacterium flavum CCM 3982 je charakterizován následujícími morfologicko-kultivačními a fyziologickými vlastnostmi:

Grampozitivní, nepohyblivé, nesporulující kokky až krátké tyčinky, vyskytující se jednotlivě i v nepravidelných shlucích.

Na masopeptonovém agaru tvoří okrouhlé, žluté kolonie s rovnými okraji; na masopeptonovém šikmém agaru vytváří intenzívní žlutý nárůst po celém povrchu agaru; v bujónu je možno pozorovat zákal a sediment, blanka se netvoří.

Fyziologické vlastnosti: optimální teplota - 28-30 °C, optimální pH - 6,8-7,2, aerobní organismus, želatinu neztekucuje, celulózu nerozkládá, zkvašuje glukózu, fruktózu, sacharózu, škrob nehydrolyzuje, dusičnany redukuje, sirovodík netvoří, indol netvoří.

Test na katalázu: pozitivní.

Voges-Proskauerův text: negativní.

K růstu vyžaduje z vitamínů biotin a thiamin, z aminokyselin homoserin a leucin.

Buněčná suspenze výchozího kmene Brevibacterium flavum CCM 3736 rezistentního k S-(2-aminoethyl)-L-cysteinu a dependentního na homoserin a leucin, vyrostlá v kompletním médiu, se vy3 staví po promytí fosfátovým pufrem (pH 7,2) 18hodinovému působení 0.05M ethylmethansulfonátu a suspenzí po aplikaci mutagénu a po promytí sterilní destilovanou vodou se očkuje baňka s kompletním médiem. 24hod. promytou a neředěnou suspenzí se očkují plotny s minimálním médiem doplněným homoserinem a leucinem a plotny s minimálním médiem stejně obohaceným, ale obsahujícím ještě 2-fluorpyruvát sodný. Mutanty citlivé na fluorpyruvát se podrobují - po zjištění stupně rezistence k S-(2-aminoethyl)-L-cysteinu, dependence na homoserin a leucin a citlivosti na fluorpyruvát - produkčnímu hodnocení v produkčním médiu se sachorózou,hydrolyzátem arašídové mouky, kukuřičným výluhem a minerálními solemi, očkovaném inokulem vyrostlým v médiu se sacharózou, octanem sodným a kukuřičným výluhem.

Podrobnosti vynálezu vyplývají z následujících příkladů provedeni:

Příklad 1

Mikroorganismus Brevibactierum flavum CCM 3736 se očkuje 60 ml kompletního média v 500ml varné baňce. Složeni kompletního média je následující:

glukóza 0,5 % hydrolyzát kaseinu 1,0 kvasničný extrakt 0,5 kh₂po₄

K₂HP°4 roztok solí agar (do tuhých médií) (Roztok solí je roztok 0,5 g

0,3

0,1 ml/1000 ml média

2,5

FeSO^.7 H₂O a 0,5 g MnSO^.4 H₂O ve 100 ml vody.)

Zaočkovaná baňka se inkubuje na rotační třepačce (frekvence - 3,7 Hz, výstředník - 25 mm) h při 28 °C. Buněčná suspenze se 2x promyje fosfátovým pufrem (pH 7,2) a po promytí se vystaví 18hod. působení 0,05M roztoku ethylmethansulfonátu ve fosfátovém pufru (pH 7,2). Po aplikaci mutagénu se suspenze 2x promyje sterilní destilovanou vodou a 5% (obj.) suspenze se očkuje 500 ml varná baňka se 60 ml kompletního média, která se inkubuje 24 h při 28 °C na rotační třepačce. Buněčná suspenze se 2x promyje sterilní destilovanou vodou a vhodně naředěnou suspenzí se očkují plotny s minimálním médieum doplněným 0,1 mg/ml L-homoserinu a 0,05 mg/ /ml L-leucinu. Složení minimálního média je následující:

glukóza	0,1 %
citran sodný	0,04
kh₂po₄	0,7
k₂hp°₄	0,2
(nh₄)₂so₄	0,1
MgSO₄.7 H₂O	0,01
roztok biotinu	2 mg/1000 ml média
roztok soli	1 ml/1000 ml média
agar	2,5 %

(Roztok solí: 0,5 g FeSO₄-7 HjO a 0,5 g MnSO_4<4 H₂O ve 100 ml vody.)

Kolonie, vyrostlé na plotnách po 3 dnech inkubace při 28 °C, se sterilními razidly přenese na plotny s minimálním médiem doplněným jednak homoserinem a leucinem, jednak homoserinem, leucinem a 0,1 mg/ml 2-fluorpyruvátu sodného. Mutanty citlivé na fluorpyruvát se vyočkují na šikmé masopeptonové agary a izoláty vyrostlé na agarech se jednak testují na stupeň rezistence k S-(2-aminoethyl)-L-cysteinu, na dependenci na homoserin a leucin a na citlivost na 2-fluorpyruvát sodný, jednak se zjišíuje jejich schopnost produkovat lysin v produkčním médiu se sacharózou, hydrolyzátem arašídové mouky, kukuřičným výluhem a minerálními solemi.

Příklad 2

Kulturou kmene Brevibacterium flavum CCM ..., 24 h starou, se očkuje 50 ml inokulačního média v 500 ml varných baňkách.

•jní inokulačního média: sacharóza 2,0 % ’ octan sodný 5,0 kukuřičný výluh (60 % suš.) 3,0 pH 7,0

Zaočkované baňky se inkubují na rotační třepačce (frekvence - 3,7 Hz, výstředník - 25 mm) 24 h při 28 °C . 12 % (obj.) inokula se očkuji 500 ml varné baňky s 20 ml produkčního média následujícího složení:

sacharóza 15,0 % kys. hydrolyzát arašídové mouky 20,0 % (obj.) kukuřičný výluh (60 % sušiny) 1,0 % (nh₄)₂so₄ 1,0 k₂hpo₄ 0,1

MgSO₄.7 H₂0 0,01

CaC0₃ 3,0

PH, 7,0

Během 4denni kultivace se pH upravuje 10% roztokem čpavku na hodnotu 7,0. Na konci kultivace se stanoví obsah lysinu a cukru v kultivační tekutině. Lysin se stanovuje oscilopolarograficky a cukr jako glukóza s použitím analyzátoru glukózy Glucose Analyzer 2 (Beckman,

USA) .

Produkce lysinu po 4 dnech kultivace činila 58 g/1 (konverze 40 %).

Claims

PŘEDMĚT VYNÁLEZU

Kmen mikroorganismu Brevibacterium flavum CCM 3982 rezistentní k S-(2-aminoethyl)-L-cysteinu, dependentní na homoserin a leucin, produkující při vysoké konverzi lysin, s citlivostí na 2-fluorpyruvát sodný.