CS246669B1

CS246669B1 - Kmen mikroorganismu Corynebacterium glutamicum CCM 3800

Info

Publication number: CS246669B1
Application number: CS317285A
Authority: CS
Inventors: Jiri Plachy; Stanislav Ulbert; Karel Culik; Michal Bucko; Alexander Hano; Miroslav Barta; Emil Miklas
Original assignee: Jiri Plachy; Stanislav Ulbert; Karel Culik; Michal Bucko; Alexander Hano; Miroslav Barta; Emil Miklas
Priority date: 1985-04-30
Filing date: 1985-04-30
Publication date: 1986-10-16

Abstract

Účelem řešení se produkce esenciální aminokyseliny lysinu v mediu se sacharózou nebo melasou jako zdrojem uhlíku. Lysin syntetizuje a v mediu hromadí mutanta bakteriálního druhu Corynebacterium glutamicum. Působením mutagenu a aplikací selektivních medií byla izolována mutanta rezistentní k S-(2-aminoethyl)-L-cysteinu, dependentní na homoserin a citlivá na 2-fluorpyruvát, která kultivována 4 dny v mediu se sacharózou nebo melasou jako zdrojem uhlíku, hydrolyzátem arašídově mouky, kukuřičným výluhem a síranem amonným jako zdroji dusíku a s minerálními solemi hromadila při vysoké konverzi zá aerobních podmínek při 28 °C a neutrálním pH v prostředí 57 g/1 L-lysinu. Lysin, využívaný především jako doplněk krmiv, lze takto vyrábět s využitím mikroorganismů běžnými technologickými postupy

Description

Vynález se týká nového kmene mikroorganismu druhu Corynebacterium glutamlcum, rezistentního k analogu lysinu, dependentního na homoserin a citlivého na 2-fluorpyruvát, který v mediu s vhodným zdrojem uhlíku a dusíku hromadil při vysoké konverzi uhlíkatého zdroje za aerobních podmínek a při neutrálním pH vysoká množství lysinu.

Jako producenti lysinu, vhodní pro jeho výrobu fermentační cestou, se osvědčily mutanty koryneformních bakterií, které kromě dependence na aminokyseliny byly současně rezistentní k analogům aminokyselin.

Když však bylo zjištěno (Tosaka, O.-Morioka, H.-Takinami, K.: Abstracts of Papers, General Meeting of Agric. Biol. Chem. Soc. Japan, 1978, p. 176), že mutanty citlivé k 2-fluorpyruvátu produkuji relativně vysoká množství lysinu, byla ověřována možnost izolace mutant rodů Brevibacterium a Corynebacterium, které by kromě genetických znaků, chrakteristiokých pro produkci lysinu, tj. rezistence k S-(2-aminoethyl)-L-cysteinu a dependence na homoserin, vykazovaly také citlivost k 2-fluorpyruvátu (US pat. 4 275 157, 157, 1981).

Tak byla izolována např. mutanta Corynebacterium acetoglutamicum, rezistentní k S—(2— -aminoethyl)-L-cysteinu, dependentní na homoserin a alanin, citlivá na 2-fluorpyruvát a produkující v mediu s glukózou 39 g/1 L-lysinu při konverzi 39 %. S mutantou Brevibacterium flavum rezistentní k S-(2-aminoethyl)-L-cysteinu a citlivou na 2-fluorpyruvát bylo v mediu, kde zdrojem uhlíku byla opět glukóza, dosaženo produkce až 51 g/1 L-lysinu (Ozaki, H.-Shiio, I.: Agr. Biol. Chem. 47: 1569, 1983).

Produkcí lysinu převyšuje dosud známé zmíněné kmeny kmen Corynebacterium glutamicum, uložený v Československé sbírce mikroorganismů Univerzity J. E. Purkyně v Brně, třída Obránců míru 10, pod označením CCM 3 866, který je předmětem vynálezu.

Hlavní výhodou nového kmene podle vynálezu je jeho schopnost produkovat vysoká množství lysinu s vysokou účinností konverze uhlíkatého zdroje. Při kultivaci nového kmene v produkčním mediu se sacharosou nebo melasou jako zdroji uhlíku, s kyselým hydrolyzátem arašídové mouky, kukuřičným výluhem a síranem amonným jako zdroji dusíku a s minerálními solemi v baňkách inkubovaných na rotační třepačce při 28 °C a pH udržovaném vodným roztokem čpavku na pH 7,0 lze dosáhnout po 4denní kultivaci produkce lysinu 50 g/1 (s melasou) a 57 g/1 (se sacharózou) při konverzi 30 a 35 %.

Nový kmen Corynebacterium glutamicum CCM 3 866 je charakterizován následujícími morfologicko-kultivačnimi a fyziologickými vlastnostmi:

Grampozitivní, nepohyblivé, nesporulující kokky až krátké tyčinky, vyskytující se jednotlivě, v párech i v nepravidelných shlucích.

Na masopeptonovém agaru tvoří okrouhlé, hladké, lesklé, krémově bílé kolonie, s rovnými okraj i.

Na masopeptonovém šikmém agaru vytváří intenzívní bílý nárůst po celém povrchu agaru, k pigmentaci nedochází.

Při růstu v bujónu dochází k tvorbě zákalu a sedimentu, blanka se netvoří.

Na krevním agaru tvoří kulaté, hladké, šedé kolonie, s rovnými okraji, nehemolyzující.

Fyziologické vlastnosti:

Optimální teplota: 27 až 32 °C .

Optimální pH: 7,0 až 7,2.

Aerobní organismus .

Želatinu neztekucuje .

Lakmusové mléko odbarvuje, ale nesráží .

Glukózu, fruktózu a sacharózu zkvašuje .

Škrob hydrolyzuje jen slabě .

Celulózu nerozkládá ·

Dusičnany neredukuje.

Sirovodík netvoří.

Indol netvoři.

Test na katalázu: pozitivní.

Test na methylenovou modř: negativní,

Voges-Proskauerův test: negativní.

K růstu vyžaduje z vitamínů biotin a z aminokyselin homoserin.

Výchozí kmen Corynebacterium glutamicum CCM 3 287, rezistentní k S-(2-amínoethyl)-L-cysteinu a dependentní na homoserin, se submersně kultivuje ?’ h v kompletním mediu a buněčná suspenze se po promytí fosfátovým pufrem (pH 7,2) vystaví 18hodinovému působení 0,05M roztoku ethylmethansulfonátu ve fosfátovém pufru (pH 7,2).

Buněčná suspenze se po aplikaci mutagenu promyje sterilní destilovanou vodou a 5 % (obj.) promyté suspenze se očkuje baňka s kompletním mediem, která se inkubuje 24 h. Promytou suspenzí vhodně naředěnou se očkují plotny s minimálním mediem doplněným homoserinem. Kolonie vyrostlé na plotnách se sterilními razidly přenesou na plotny s minimálním mediem doplněným homoserinem a plotny s minimálním mediem s homoserinem a 2-fluorpyruvátem.

Mutanty citlivé na fluorpyruvát se vyočkují na šikmé masopeptonové agary. Isoláty vyrostlé na šikmých agarech se po otestování stupně rezistence k S-(2-aminoethyl)-L-cysteinu, dependence na homoserin a citlivosti na 2-fluorpyruvát produkčně hodnotí v produkčním mediu se sacharózou nebo melasou.

Podrobnosti vynálezu vyplývají z následujících příkladů provedení:

Příklad 1

Mikroorganismem Corynebacterium glutamicum CCM 3 287 se očkuje 60 ml kompletního media v 500ml varné baňce. Složení kompletního media je následující:

glukóza hydrolyzát kaseinu kvasničný extrakt KH₂P°4 ^K2^HPO4 roztok solí

0,5 %

1,0

0,5

0,3

0,1 ml/1 000 ml media (Roztok solí je roztok 0,5 g FeSO^ . 7 f^O a 0,5 g MnSO^ . 4 H₂O ve 100 ml vody.)

Zaočkovaná baňka se inkubuje na rotační třepačce (frekvence otáček - 3,7, výstředník 25 mm) 24 h při 28 °C. Buněčná suspenze se potom 2x promyje fosfátovým pufrem (pH 7,2) a po promytí se vystaví 18hodinovému působení 0,05M roztoku ethylmethansulfonátu ve fosfátovém pufru (pH 7,2).

Po aplikaci mutagenu se suspenze 2x promyje sterilní destilovanou vodou a 5 % (obj.) suspenze se očkuje 500ml varná baňka se 60 ml kompletního media, která se inkubuje 24 h při 28 °C na rotační třepačce. Buněčná suspenze se 2x promyje sterilní destilovanou vodou a vhodně naředěnou suspenzí se očkují plotny s minimálním médiem doplněné 0,001 mg/ml L-homoserinu. Složení minimálního media je následující:

glukóza citran sodný

0,1 % 0,04 0,7 0,2

(NH₄)₂I	SO₄	0,1
Mgso₄ .	7 H₂O	0,01
roztok	biotinu	2 mg/1 000 ml
roztok	solí	1 ral/1 000 ml
agar		2,5 %

(Roztok solí je roztok 0,5 g FeSO₄ . 7 HjO a 0,5 g MnSO^ . 4 H₂O ve 100 ml vody.)

Kolonie, vyrostlé na plotnách po 2-3 dnech inkubace při 28 °C, byly sterilními razidly přeneseny na plotny s minimálním mediem, doplněné jednak homoserinem a jednak homoserinem a 10 ^ug/ml 2-fluorpyruvátu sodného. Mutanty citlivé na fluorpyruvát se vyoěkují na šikmé masopeptonové agary a isoláty vyrostlé na agarech se jednak testují na stupeň rezistence k S—(2— -aminoethyl)-L-cysteinu, na dependenci na homoserin a citlivost na 2-fluorpyruvát, jednak se zjištuje jejich schopnost produkovat lysin v produkčních mediích se saoharózou nebo melasou jako zdroji uhlíku.

Příklad 2

Kulturou kmene Corynebacterium glutamicum CCM 3 866, 24 h starou, se očkuje 60 ml inokulačního media CSL-B-S v 500ml varných baňkách. Složení inokulačního media je následující:

sacharóza 2,5 % kukuřičný výluh (65 % sušiny) 3,0 pH 7,0

Zaočkované baňky se inkubují na rotační třepačce (frekvence otáček - 3,7, výstředník 25 mm) 24 h při 28 °C. 10 % (obj.) inokula se očkují 500ml varné baňky s 20 ml produkčního media BS nebo BM následujícího složení:

Medium BS: sacharóza hydrolyzát arašídové mouky

15,0 %

20,0 % (obj.)

kukuřičný	výluh	1,5 %
<^NH4»2^SO4		1,5
kh₂po₄		0,2
MgSO₄ . 7	^H2°	0,03
CaC0₃		2,0
FeSO₄ . 7	h₂°	0,002 %
MnSO, . 4	^H2°	0,002
biotin (technický)	0,00005
pH		7,0

30,0 %

15,0 % (obj.)

Medium BM: melasa hydrolyzát arašídové mouky

kukuřičný	výluh	1,5 %
(NH₄)₂SO₄		1,5
^KH2^PO4		0,2
MgSO₄ . 7	^H2°	0,03
CaCOj		2,0
FeSO, . 7 4	^H2°	0,002
MnS0₄ . 4	^H2°	0,002

biotin (technický) 0,00005 pH

7,0

Během 4denní kultivace se pH upravuje ve 24hodínových intervalech vodným roztokem čpavku na hodnotu 7,0-7,2. Na konci kultivace se stanoví obsah lysinu a cukru v kultivační tekutině. Lysin se stanovuje manometricky s použitím dekarboxylázy lysinu a cukr jako glukóza s použitím analyzátoru glukózy Glucose Analyzer 2 (Beckman, U.S.A.,.

Produkce lysinu po 4 dnech kultivace v mediu BS je 57 g/1 (konverze - 35 %) a v mediu BM 50 g/1 (konverze - 30 %).

Claims

Kmen mikroorganismu Corynebacterium glutamicum CCM 3 866, rezistentní k S-(2-aminoethyl)-L-cysteinu, dependentní na homoserin a citlivý na 2-fluorpyruvát, produkující při vysoké konverzi lysin.