CS241086B2 - New/amido/ n-substituted bleomycines production - Google Patents

Description

(94) Způsob výroby nových (aniido)N-substituovaných bleomycinů

Vynález se 'týká způsobu výroby nových (amido) N-suibstituovaných bleomycinů.

Zvláště se vynález týká nového způsobu výroby málo toxických nových (amido)N-substituovaných bleomycinů obecného vzorce I

l ^г

CH^

CO-MM-X

(kde

BM znamená zbytek bleomycinového skeletu,

X znamená alkylovou skupinu se 6 až 10 atomy uhlíku nebo alkylovou skuipinu se 2 až 6 atomy uhlíku substituovanou mono- nebo di(Ci-C5)alkylaminovou skupinou, fenylethylaminovou skupinou nebo N-methyl-N- [ 3- [ 2-/p-chlorf enyl/ ethyl jaminopropyl ] aminovou skupinou,

СНъ CH.

СО^Н-(СН^(СН^^-Р_г

...·· (I)

Ri znamená cykloalkylovou skupinu s až 13 atomy uhlíku, alkylovou skupinu s 1 až 5 atomy uhlíku mající fenylový substituent, který může být ..substituován atomy halogenu, nebo fenylovou skupinu, která může být substituována alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující atomy halogenu, kyanoskuipinu a benzyloxyskupinu, a

R2 znamená atom vodíku, benzytovou skupinu nebo úibenzyloxybenzylovou skupinu.

Bleomyciny j-sou karcinostatické látky, které byly objeveny v roce 1966' Umezawou, jedním z autorů předloženého vynálezu, a spolupracovníky (Umezawa a kol., Journal of Antibiotics, 19A, str. 200 /1966/). Jsou produkovány mikroorganismem Streptomyces verticillus (Aotinomycet) a jsou to bazické, ve vodě rozpustné glykopeptidy, které jsou schopny snadné komplexace s jedním atomem -dvojmocné mědi.

Obvyklou kulturou je produkováno 16 bleomycinů, které byly izolovány (například Umezawa a -spol., Journal of Antibiotics 19A, 210 /1966/).

Z těchto bleomycinů bleamíciny Αι, A2, As, Bz a demethy--A2 ve formě, která neobsahuje atom mědi, jsou jako směs (odtud název bleomycinový komplex) široce používaný v oblasti .terapie rakoviny.

CONH,, ² I -...

CH2 -NH - CH - '* - ^CH ^ONH²

Podrobněji — bleomyciny jsou -s úspěchem používány především při 'léčení squamosního buněčného karcinomu, dále palk rakoviny kůže, hlavy -a krku, rakoviny plic a maligního lymphonu.

Různé bleomyciny jsou popsány také v USA patentu -č. 3 922 262 -a v obnoveném USA patentu č. 30 451.

Bleomyciny, které -obsahují atom mědi, se obvykle, vyrábějí fermentací. Bleomyciny, které neobsahují atom· mědi, se vyrábějí odstraněním atomu mědi z bleomycinů tento atom obsahujících. Termín „bleomycin“, jak je zde používán, znamená -obě formy, jak s atomem mědi, tak i bez tohoto atomu, bez další specifikace. ,

Bleomyciny jsou sloučeniny obecného vzorce II

kde R znamená koncový aminový zbytek bleornyícinu, v případě formy obsahující měď je atom mědi vynechán.

Tyto výše ‘uvedené bleomydny vykazují výborné účinky, nicméně však způsobují i vedlejší účinky, jako je .pulmonární toxicita, které závisí na způsobu jejich aplikace. Z tohoto důvodu je nyní jejich aplikace omezena. je proto žádoucí vývoj bleomycinů, které by měly menší vedlejší účinky.

S -cílem připravit tyto' látky na základě rozsáhlé studie, autoři vynálezu již dříve vynalezli amido(N)-substituované bleomyciny uvedeného obecného vzorce I.

-Výsledkem dalších studií autorů je zjištění, že amiďo(N)-substituov.ané bleomyciny obecného vzorce I lze vyrobit ve velkém množství reduktivní kondenzací amidoi(N)-substituovaných derivátů 3-(N-methyl-N-/3-amin.oipr opyl/iaminoj proipylaminobleomycinů obecného vzorce III

CONH&

₇CH ^Z CH^ CO-HH-X

kde

BM a X mají výše uvedený význam, s aldehydem obecného vzorce IV

R1CHO (IV) kde

Ri má výše uvedený význam a popřípadě se získaná sloučenina převede na jinou sloučeninu obecného vzorce I, kde substituenty Ri a Rz mají jiný výše uvedený význam.

Zbytek bleomyclnového skeletu označený BM v obecném vzorci I předloženého vynálezu je část -označená přerušovanými čárami v· obecném vzorci II bleomycinů a zahrnuje jak formu obsahující měď, tak formu prostou mědi.

Aldehydy obecného vzorce IV použité v tomto vynálezu zahrnují cykl-oalkýlal-dehydy s -až 13 atomy uhlíku a zejména cyklopentylaldehyd, cyklooktylaldehyd, cyklododekanoylaldehyd, cykloundekanoylaldehyd atd.

Fenylsubstituované nasycené alifatické aldehydy, jejichž samotný fenylcVý ' substituent může nést substituenty, zahrnují nasycené alifatické aldehydy s 1 až 5 atomy uhlíku, mající fenylový substltuent, jako -je fenylacetal-dehyd, fenylethylaldehyd a halogensubstituované fenyla-cetal-dehydy ' (.in^j^iříklad chlorf enylace-taldehyd).

Benzaldehydy zahrnu jí například ' benzaldehyd, halogenbenzaldehydy (například p-chlorbenzaldehyd, m-br-ombenzalde hyd), kyanobenzaldehyd a benzyloxybenzal-dehy-dy (například rnpj-dibenzyloxybenzaldehyd).

Sloučeniny obecného vzorce III použité v předloženém vynálezu jako výchozí materiál, mohou být připraveny hydrolýzou ' '3-(N-.methyl-N-/3-aminoipropyl/amiinn )p ropylaminobleomycinů (dále označován jako bleomycln APMP) použitím bleomycín inaktivačního enzymu (dále uváděn jako inaktivační enzym; Umezawa a kPl. Jouma-l of Antibiotios, 27, 419, /1974/) za vzniku 3-(N-m-ethyl-N-/3-amLnopropyl/aimino)propylaminodeamidobleomycinu (dále označován jako deamidobleomycin APMP) obecného vzorce

BM

CH<

l а рак kondenzací .deamidobleomycinu APMP s aminem obecného vzorce V

NH2—X (V) kde

X má význam uvedený pod obecným vzorcem I.

Ve významu X mohou být uvedeny například alkylové skupiny se 6 až 10 atomy uhlíku a alkylové skupiny se 2 až .6 atomy uhlíku línající primární amlnosubstituent.

Zvláště jsou výhodné n-oktylová, fenylethylaminopropylová, 3-[N-methyl-N- [ 3- (2-/p-chlorf enyl/ethyl jaminopropyljamlnojpropylová a di-n-butylaminopropylová skupina.

Sloučeniny obecného vzorce III mohou být připraveny například následujícím způsobem.

Hovězí játra se zhomogenizují s roztokem fosfátového pufru. Vzniklý homogenizát se odstředí při 8 000 ot/min. Supernatant se dialyzuje proti roztoku fosfátového pufru za účelem získání surového roztoku enzymu.

К surovému roztoku enzymu se přidá mědi prostá fonma bleomycinu APMP rozpuštěná v roztoku fosfátového pufru. Tato směs se nechá reagovat při teplotě 35 °C. Reakční směs se zbaví proteinů vhodnou metodou (například se přidává kyselina trichloroctová) dále označována jalko TCA (v množství asi 5 %, aby se vysrážely proteiny. Sraženina se odstraní odstředěním, promyje se pak 3 X 5% TCA, supernatan a promývací tekutiny se spojí).

Po neutralizaci se přidá octan měďnatý к reakční směsi prosté proteinů tak, že octan iměďnatý je v přebytku vzhledem к bleomycinu, aby požadovaný produkt byl převeden do formy chelátu s mědí.

Roztok měďnatého chelátu se pak odsolí tak, že se vlije na kolonu plněnou adsorpční pryskyřicí Diaion^R HP-40 s destilovanou vodou, kde se požadovaný produkt adsorbuje.

Po vymytí solí destilovanou vodou se provede eluce směsí 1/50N vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové a methanolu (1:4 obij./obj.).

Frakce mající absorpční maximum při vlnové délce asi 290 nm se shromáždí. Po neutralizaci anexem Dowex^R 44 (OH typ, vyrobeno Dow Chemical Go.) se spojené frakce zkoncentrují za sníženého tlaku a lyofilizují.

Získaný prášek se rozpustí v destilované vodě.' Vzniklý roztok se vlije za účelem adsonpce na kolonu plněnou CM-Sephadexem^R C-25 (Na⁺ typ, vyrobeného Pharmacia Fine Chemicals Co.) předtím uvedeného do rovnovážného stavu 1/20 M roztokem pufru kyseliny octové s octanem sodným o pH 4,5.

Eluce se provede metodou lineárního koncentračního gradientu, při .které se kontinuálně přidává chlorid sodný к výše uvedenému roztoku pufru к postupnému zvýšení koncentrace sodných iontů na 1,0 M. Modra8 vě fialové frakce požadovaného produktu se shromáždí.

Spojené frakce se zbaví soli stejným odsolením pomocí Dlaionu^R HP-40 použitým dříve a pak se lyofilizují, čímž se získá modrý amorfní prášek formy deamidobleomyclnu APMP obsahující měď.

Takto získaný deamidobleomycin APMP se pak kondenzuje s aiminem obecného vzorce V použitím známých metod pro tvorbu amidového řetězce kyselin, jako je metoda popsaná v USA patentu č. 4195 018 a pak, je-li to nutné, odstraní se měď ik získání reakční směsi obsahující sloučeninu obecného vzorce III.

Ve výše uvedené kondenzační reakci se užívá kondenzačních činidel jako je cyklohexylkarbodiimid, l-ethyl-3-(3-dimethylaiminopropyl Jkarbodiimid, l-cyklohexyl-3-( 2-morfolinoethyl)karbodiimid, diisopropylkarbodlimld, dlfenylfosforazidát (DPPA), diethylfosforokyanidát (DEPC), 6-ch'lor-l-p-chlorbenzensulfonyloxybenztriazal (CCBT) a podobně.

Spolu s výše uvedenými kondenzačními činidly mohou být použity přídavné kondenzační látky jako je p-nitrofenol, o,p-dinitrofenol, pentachlorfenol, 2,4,5-triohlorfenol, pentafluorfenol, N-hydroxysukcinimid, N-.hydroxy-5-norboirnen-2,3-dikarboxyimid, 1-hydroxybenztriazol a podobně.

Kondenzace se provádí v rozpouštědle jako je voda, dimethylformaldehyd, acetonitri'1 nebo jejich směs. Pracuje se při reakční teplotě od —20 do 50 °C, výhodně —10 až 30 °C. Doba reakce není omezena, postačuje doba 1 až 70 hodin.

Sloučenina obecného vzorce III se izoluje z reakční směsi následujícím způsobem. К výše získané reakční směsi se přidá organické rozpouštědlo, jako je aceton, ether a podobně к vysrážení požadovaného produktu. Pak se sraženina rozpustí v destilované vodě. pH roztoku se upraví na hodnotu 6 a zbaví se solí vlitím na kolonu naplněnou adsorptivní pryskyřicí, jako je Amberlite^R XAD-2 (výrobce Rohm and Haas Co.) s destilovanou vodou, kde se požadovaný produkt adsorbuje.

Po vymytí solí destilovanou vodou se provede eluce okyseleným vodným methanolem, například směsí 1/50 N vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové a methanolu (1:4 obj./obj.J. Frakce s absorpčním maximem okolo 290 nm se shromáždí. Po neutralizaci anexem, Dowex^R 44 (OH typ, vyrobený Dow Chemical Co.) se spojené frakce zahustí a lyofilizují. Získá se surový prášek sloučeniny obecného vzorce III.

_ч Dále je popsán postup, při kterém je vypuštěn stupeň odsolení. V tomto případě se uvedená sraženina rozpustí v destilovarié vodě a dále zpracovává v následujícím stupni.

Výše získaný prášek se rozpustí v destilované vodě. Roztok se vlije na kolonu naplněnou CM-Sephadexem^R C-25 (Na⁺ typ, výrobce Pharmacia Fine Chernicals Co.), který byl dříve uveden do rovnovážného stavu roztokem 1/20 M kyseliny octové — octanu -sodného (pufr) o pH 4,5 za účelem adsonpce.

Eluce se provede metodou ‘lineárního koncentračního gradientu, .při které se konstantně přidává k výše uvedenému roztoku pufru chlorid sodný až k postupnému zvýšení koncentrace sodných iontů na 1,0 . M.

Protože nezreagované látky a vedlejší produkty se eluují dříve, lze je separovat a odstranit použitím ultrafialového absorpčního monitoru. Jestliže frakce požadovaného produktu obsahují nečistoty, opakuje se výše uvedená chromatografie, aby se úplně odstranily nečistoty.

Výše uvedená chroimatc-grafie může být nahrazena chromatografií za použití adsorptivní pryskyřice Jako je Amberlite* XAD-'2. Při této- chnomaitografii se vodný roztok surového produktu vlije na kolonu plněnou pryskyřicí, například s 1% vodným roztokem octanu amonného, za účelem adsorpce požadovaného- -produktu.

Eluce se provede pomocí metody lineárního koncentračního gradientu, při které se k výše uvedenému roztoku pufru přidává methanol k postupnému -zvýšení koncentrace metbianOlu. Protože se stává, že .nezreagované látky se eluují dříve a vedlejší produkty později, lze je odstranit použitím ultrafialového absorpčního monitoru.

Jestliže se u frakcí požadovaného produktu zjistí, že obsahují nečistoty, opakuje se uvedená chromatografie za účelem úplného odstranění nečistot.

Výše uvedené dva .přečišťovací postupy lze použít samostatně nebo ve vzájemné kombinaci.

Takto získané frakce požadovaného produktu se .zbaví soli odsolením za použití adsorptivní pryskyřice, jako je Amberlite* XAD-2, jak je popsáno výše a pak se lyoíilizují. Zí-ská -se forma sloučeniny obecného vzorce III obsahující měď jako modrý amorfní prášek.

Tuto formu obsahující měď lze převést na formu prostou mědi známým způsobem, jako je způsob .používající EDTA -popsaný v USA patentu č. 3 929 993.

Příklad konverze na formu prostou mědi je -popsán níže. Forma obsahující iměď se rozpustí v -destilované vodě. Tento roztok se vlije za účelem adsorpce -na kolonu naplněnou Amberli-tem^R XAD-2 s destilovanou vodou.

. Pryskyřice se promyje vodným roztokem obsahujícím chlorid sodný a -5·% dvoj,sodnou sůl kyseliny ethylendiamintetraoctové (dále označována jako EDTA X 2 Na), proto, aby imě-ďnadý· -ion byl navázán pomocí EDTA a forma prostá mědi zůstala na měniči.

Pryskyřice - se promyje -chloridem sodným, aby se odstranila EDTA X 2 Na a dále se promyje -destilovanou vodou. Následující eluce se provede okyseleným vodným imethanolem, například směsí 1/50 N vodného roztoku -kyseliny chlorovodíkové a .methanolu (1:4 -obj./obj.) a shromáždí se frakce vykazující absorpční maximum při vlnové délce asi 290 nm. pH spojených frakcí se upraví na hodnotu 6 použitím Dowcxu?· 44 (OH typ, výrobce Dow Chemi-cal Co.) a -pak se zahustí za sníženého tlaku - a lyoflli.zuj.í - za vzniku bílého amorfního prášku hydrochloridu mědi prosté formy sloučeniny obecného vzorce

III.

Jestliže se ve výše uvedeném postupu místo vodného .rozteku kyseliny chlorovodíkové použije vodný roztok kyseliny sírové, získá se -sulfát. Z toho je zřejmé, že vhodným výběrem kyseliny ve výše uvedené eluci, .lze získat -sůl s požadovanou -kyselinou.

Podle předloženého vynálezu se dále reduktivně kondenzuje takto získaná sloučenina obecného vzorce III s aldehydem obecného vzorce IV.

Jako reduktivní činidla použitá v této kondenzaci lze uvést borohydrosloučeniny (například kyanoborohydrld sodný, borohydrid sodný, borohydrid lithný, borohydrid -draselný, bisftrifenylfosfinjtetrahydroboratoměď atd.).

Katalytickou redukci lze provést za použití katalyzátoru, jako je paládium na uhlí. Použitím dvou nebo méně mol, výhodně 1 až

l. 5 mol. aldehydu obecného vzorce IV na 1 mol sloučeniny obecného vzorce III, vzniká sloučenina obecného vzorce I, kde R2 znamená hlavně vodík. Použitím 3 nebo více mol vzniká sloučenina obecného vzorce I, kde Rz znamená skupinu obecného- vzorce —-CHz—Ri. Požadovaný přídavek aldehydu pro přípravu -sloučenin obecného vz-orce I, kde R2 je vodík, je -1,2 mol a 5 až 15 mol, výhodně asi 10 mol, pro získání sloučeniny obecného vzorce I, kde Ri znamená skupinu obecného vzorce —CHz—Ri. V případě, že aldehyd -obecného vzorce IV, - je sloučeninou obtížně rozpustnou v methanolu, jako je

m. p-dibenzylo-xybenzaldehyd, může být jeho množství sníženo s tím, že bude prodloužena reakční doba. .

Výše uvedené kondenzační reakce nemají nijak omezeno použití rozpouštědel, pokud se tato neúčastní reakce. Jako- rozpouštědla se užívají polární rozpouštědla jako voda, methanol, ethanol, dimethylformamid, dimethylsulfoxid, tetrahydrofuran a acetonitril a jejich -směsi. Reakční teplota je —5 až 80 °C, běžně 0 až 50 °C. Zvláště je žádoucí, aby pro získání sloučeniny, kde R? znamená vodík, byla užita teplota 0 -až 35 °C a teplota 35 až 50 PC pro získání sloučeniny, kde R2 znamená skupinu obecného vzorce —CH2—Ri při použití -aldehydu velké stérické zábrany nebo nízké rozpustnosti. Vhodná reakční doba je 3 až 70 hodin. Při použití aldehydu velké -sférické zábrany nebo nízké rozpustnosti je vhodnější reakční doba (například 150 hodin).

Z -takto získané reakční směsi se izoluje sloučenina -obecného vzorce I následujícím způsobem. V případě použití borohydridové sloučeniny se -upraví hodnota pH reakční směsi na 1 kyselinou chlorovodíkovou a míchá při teplotě místnosti po dobu 5 až 10 minut tak, -aby se rozložilo reduktivní činidlo přidané v přebytku. Potom -se reakční směs zneutralizuje, zbaví -methanolu destilací za sníženého tlaku, pomocí extrakce etherem nebo butanolem -se .zbaví přebytku aldehydu a ketonu a odsolí se následujícím způsobem. Reakční směs se vlije na kolonu naplněnou adsorptivní pryskyřicí jako je AmberliteR XAD-2 (výrobce Rojhm and Haas Co.) s destilovanou vodou za účelem adso.rpce požadovaného produktu. Po vymytí soli destilovanou vodou se provede eluce kyselým vodným methanolem, například směsí 1/50 N vodného -roztoku ky-seliny -chlorovodíkové a methanolu (1:4 obj./obj.), shromáždí se frakce obsahující modrý bleomycinový derivát. Spojené frakce · se, je-li to nutné, neutralizují -anexem DowexR 44 (OH typ, výrobce Dow Chemical Co.), zahustí se za sníženého tlaku a lyofillzují za vzniku modrého prášku požadovaného surového produktu.

Další přečištění se provede následujícím způsobem.

Výše uvedený prášek se rozpustí v destilované vodě. Tento roztok se vlije na kolonu naplněnou CM-SephadexemR C-25 (Na* typ, výrobce Pharmacia Fine Chemicals Co.) předtím uvedeného do rovnovážného - stavu -.1/20 M roztokem pufru kyselina ootová-octan sodný o pH 4,5 za účelem adsorpce. E - luče se provede metodou lineárního koncentračního gradientu, při které se postupně přidává chlorid sodný k výše uvedenému .roztoku pufru, až -k postupnému zvýšení koncentrace - Na + iontů na 1,0 - M. Jestliže u frakcí požadovaného produktu se -zjistí nečistoty, lze -doplnit výše uvedenou chromatografii chromatografií za použití adsorptivní pryskyřice jako je AmberliteR XAD-2. Spojené -. frakce -se vlijí na kolonu naplněnou pryskyřicí, například se 4 % vodným roztokem octanu amoného, za účelem adsorpce - požadovaného produktu. Eluce se provede metodou lineárního koncentračního gradientu, při které se průběžně přidává k výše -uvedenému roztoku pufru methanol k postupnému zvýšení koncentrace methanolu. V tomto případě se nezreagované látky eluují nejprve, sloučenina, ve které R2 je vodík. se eluuje jako další a sloučenina, kde Ri a R2 mají stejný význam, se eluuje jako poslední. Oddělení těchto frakcí se spolehlivě provede použitím ultrafialového -absorpčního monitoru. Jestliže jsou ve frakcích požadovaného produktu zjištěny .nečistoty, opakuje se výše uvedená chromatografie za účelem úplného odstranění nečistot.

V -tomto stupni lze kolonu CM SephadexuR C-25 nahradit kolonou CM SepharoseR CL-'6B (výrobce Pharmacia Fine Chemicals Co.) nebo ToyopearlR ·650 (výrobce TOYO SODA MFG CO.), nebo podobně naplněnou kolonou a promytou methanolem. V tomto případě lze vynechat odsolení po reakci. Reakční směs se přímo vlije' na kolonu za účelem adsorpce požadovaného produktu. Po vymytí činidel atd. methanolem se eluce provede vodným roztokem methanolu obsahujícím 0,1 M chlorid sodný. Spojené frakce se chromatografují na AmberlltuR XAD-2.

Spojené frakce požadovaného produktu připravené 'tímto způsobem se odsolí pomocí D-iaionuR HP-40 - použitého výše -a pak se lyofillzují -za -získání formy (amido)N-substituovaného bleomycinu obecného vzorce I obsahujícího měď ve formě modrého amorfního prášku.

Formu obsahující měď (amido)N-substituovaného bleomycinu takto získanou lze zbavit mědi výše popsaným způsobem za vzniku požadované -soli mědi prosté formy ve formě bílého prášku.

Typické příklady -sloučenin podle vynálezu jsou uvedeny v tabulce I a .jejich fyzikálně-chemtcké vlastnosti v tabulce 2.

Tabulka 1

sloučenina č.	• název sloučeniny	zkratka
1	3-[N-meeh yl-N-ÍS-Íp-chlorbenzylamino)propyl] aminoj-propylamino ( amido )N- - [ 3- (/3?-l‘-f enylethylamino· Jpropyl ] -BLM ·	dMCLBZ-PEP
2	3-{N-mettlyl-N-[3-(ρ-ch-orbenzylamiIO>)pro-	dMCLBZ-
	pyl ] aminoJipropylamino (amido) N- [okrtyl ] -BLM	OCT
3	S-lN-cmethyl-N- [ 3- (2-/p-chl.qrf enyl/ethyl-
	ámino Jpropyl] ammoJirOpyraminoh (ami-	dMCLPE-PEP
	do) N- [ 3- (/3/-l‘-f enyleth^y^:^c^^milr^o^·) propyl ] -BLM	dMCLPE
4	3-(N-m ethyl-N-) 3-(2-/, r-chlorf enyl/etihylamino) rroρylramlnoJpr·opy-amlnoc (amido )N-(oktyl[-BLM	dMCLPE-OCT
6	3--1^--^ 6^И:^5^1--^-[[^--(^i^ tihyla.mi- no )propyl] laiimin o'p popy yam ino- (amidoJN- [ 3-(/3/-l‘-f enylethylamino Jpropyl ] -BLM·	dMCNBZ-PEP
6	31N-me'thyl--N-3'(ρ-¢lkano0en'zylmethy-amino·) proipyl ] aminojpropylamino- (amido )N-[okttyl--BLM	dMCNBZ-OCT
7	3-[Ν-π^1ιιΊιΝ-- 3--c yklooktylmethyiiainino)rгopy- ] aminoliprqpyl.ammo- (amido) N- [ 3/ 3/-14 eny-eιthy- paminopropyl ] -BLM	dMCO-PEP
8	3-ÍN-methyl-N-[ 3- (oyiklooktyltoethy lamino) propyl ] aminol^propylamino- (amidoJN-[oktyl--BLM	dMCO-OCT
9	3-lN-methyl-N- [ 3-bis( m^cdibenzyooxybenzylamino Jpropyl ]am^no’.prcpylamino[	dDD-PEP
	(amido)N-[3-(/3/-r-f enylethylamino ppropyl]-BLM -
10	3c{N-m·othy--N- [ 3-bis (mlp-dibenzy-oxybenzylamino Jiproipyl ] aminoppropyíaminoc (amido·) N- [ n-okty 1 ] -BLM	dDD-OCT
11	3-{N-methy 1-N- [ 3- (2/ρ-chI(orfe.ny-/ ethylamino Jpropyl pamino>)prorylaminoιt amido ) N-|3- [N-methyl-N ] -3- (2-/p--chlorf enyl/erthyiamino· Jpropyl [ amtoo ] propyl}-BLM	dMCLPE-MCLPE
12	3-jN-methyl-N[[ 3- [2-/p-ohlorf enyl/ethylamino Jiprqpyl ^amin<Opropylamino- (amido) N- [ 3- (di-n-bu lytamrno p pro;pyl ] -BLM	dMCLPE-EPA
13	3--N--nethhl-N-[3--!p-kyyan0e.nrylamino)propyl ] amin.opropylamino(amldo )N-(3-( di-n-butylamino Ppropyl]-BLM	dMCNBZ-BPA

Tabulka 2	chromatografie'0 formy obsahující měď na tenké vrstvě Rf	elektroforéza*2) formy obsahující měď, Rm (Rm alaninu — 1)
slouč. č.	zkratka	UV absorpce formy prosté mědi maximum pří nm (El %/lcm)
1	dMCLBZ-PEP	289 (90)	0,53	1,16
2	dMCLBZ-OCT	290 (88)	0,50	1,08
3	dMCLPE-PEP	290 (79)	0,53	1,04
4	dMCLPE-OCT	290 ' (85)	0,52	0,96
' 5	dMCNBZ-PEP	291 (93)	0,69	1,10
•6	dMCNBZ-OCT	292 (94)	0,59	0,95
7	dMCO-PEP	291 (89)	0,53	1,06
8	dMCO-OCT	291 (83)	0,42	0,96
9	dDD-PEP	285 (74)	0,09	0,93
10	dDD-OCT	285 (76)	0,04	0,64
11	dMCLPE-MCLPE	290 (79)	0,25	1,20
12	dMCLPE-BPA	290 (83)	0,60	1,11
13	dMCNBZ-BPA	290 (81)	0,70	1,10

poznámka:

*^l> SWikagel -60F Silanized^R (Merck Co.); methanol- 6% octan amonný (60:40 ob]./ /obj.) *²⁾ Avicel SF^R (FMC Co.); kyselina mravenčí —kyselina octová—vod-a (27 : 75 : 900 obj./ /obj.), 800 V, 15 minut

Biologické vlastnosti, které byly testovány .na typických sloučeninách podle tohoto vynálezu, jsou uvedeny níže.

1. Antimikrobiální účinnosti na Mycobacterium Smegmatis ATCC 607 a Bacillus subtilis.

Antimikrobiální účinnosti byly testovány na uvedených mikroorganismech razítkovou technikou na agarových plotnách. Účinnost byla stanovována vzhledem k účinnosti standardního vzorku bleomycinu Az [ve formě, která neobsahuje měď), jehož účinnost je 10.00 pgging.

2. Účinost inhibice rUstu kultury buněk HeLa S3.

Buňky HeLa S3 se naočkují na médium (MEM s 10% hovězího séra) v plastických Petriho miskách. Dva dny po naočkování se přidá k médiu testovaný bleomycin. V inkubaci se pokračuje další tři dny, pak se spo čítají buňky. Procentuální inhibice rUstu se vypočte podle následující rovnice;

Procentuální inhibice rUstu [v %) = = 100 X /B—Л/) /B—C/, kde '

A znamená konečný počet buněk třetí den po přidání testovaného vzorku,

B znamená konečný počet buněk kontrolního vzorku (bez přidání testovaného vzorku) a

C znamená počet buněk v době přidání testovaného vzorku.

ID50 (koncentrace zpUsobují 50% inhibici) se vyhodnotí z křivky koncentrace vzorku proti procentuální inhibicí.

Výsledky testu 1. a 2. jsou uvedeny v tabulce 3.

Tabulka 3	.....z-··- .. .....- - ·
slouč. č.	zkratka	antimikrobiální účinnost sloučeniny prosté mědi (,ug/mg) na Mvcobacferium na Bacili u*s smegmatis ATCC 607 subtilis	Koncentrace způsobující 50% in'^^ růstu (IDso) Sloučeniny (prosté mědi vůči HeL-a Só buňkám (ID50) ;zg/ml
1 ·	dMCLBZ-PEP	14,880	2,590	0,53
2	dMCLPE-OCT	38,200	1,808	0,43
3	dMCLPE-PEP	15,593	4,237	0,3'7
4	dMCLPE-OCT	38,750	1,898	0,23
5	dMCNBZ-PEP	21,877	11,0 56	0,-50
6	dMCNBZ-OCT	49,270	381	0,28
7	dMCO-PEP	54,345	7,273	0,33
8	dMCO-OCT	65,733	5,473	0,23
9	dDD-PEP	115	23	0,058
10	dDD-OCT	153	13	0,30
11	dMCLPE-MCLPE	650	270	0,30
12	dMCLPE-BPA	31,690	3,690	0,40
13	dMCNBZ-BPA	14,730	4,755	1,10

3. Pulmonární toxicita (pulmonární fibrosa) u myší

Pro testy byly použity ICR myši (samečci ve stáří 15 týdnů) ve -skupinách po 9 myších. Každá myš dostávala denní dávku 5 mg/kg testovaného vzorku intraperitoneální injekcí, jednou denně, po dobu 10 po sobě .následujících dnů. Od ukončení podávání testovaného vzorku byly myši po dobu 5 týdnů pozorovány, potom byly utraceny a pitvou byl sledován výskyt a .stupeň pulmonární fibrosy. Vyhodnocení bylo děláno na základě porovnání počtu testovaných myší trpících pulmonární flbrosou a na základě stupně onemocnění. Výsledky testu jsou uvedeny v .tabulce 4.

Stupeň onemocnění je vyjádřen číselně podle následující stupnice:

Počet bodů žádná fibrosa akumulace exudátu v pulmonární alveoli a ' fibrose - podobná změna v alveolárním septu fibrosa v několika oblastech roztroušená fibrosa fibrosa na ví-ce .než dvou třetí- nách celkové -plochy.

„Poměr“ býl vypočten ze srovnání -s „bleomycinovým komplexem“.

Jak je zřejmé z uvedených výsledků, sloučeniny podle -tohoto vynálezu mají vysokou inhibici růstu kultury HeLa S3 buněk i významnou -antimikrobiální účinnost a mají velmi nízkou pulmonární toxicitu, což -jsou pozitivní fakta pro jejich použití v (tllnických oblastech.

Vynález je dále ilustrován podrobněji v příkladech, není však jimi nikterak -omezen.

Příklady

Stupeň A .

Osmset gramů čerstvých hovězích jater se homcgenizuje v 1/6 1 0,05 M fosforečnanového pufru o pH 7,2. Hornogenizcvaná směs se. odstře-fuje 30 minut při 8 000 ot/min. S-upernatant se dialyzuje proti 0,05 M roztoku fosforečnanového pufru za použití -celúlózové membrány.

Připraví -se tak roztok surového enzymu. K 32,7 g bleoimycinu APMP -se přidá 1,5 1 roztoku -surového enzymu. Směs se nechá reagovat při 37 °C 24 hodin. K reakční směsi se- přidá 150 ml 55% kyseliny trichloroctové (dále uváděna jako- TCA), vysráží se protein.

Sraženina se odstředí a promyje se třikrát 5% TCA. Supecnatant a všechny promývací roztoky se spojí. Po- neutralizaci 4 M hydroxidem sodným, se spojené - roztoky smísí -s 5 g octanu měďnatého (1,2 ekvivalentu bleomycinu), vytvoří se komplex mědi s požadovaným produktem.

Odsolení se provede vlitím měďnatého komplexu na kolonu o objemu 7 -litrů .plněnou adsorptivnl pryskyřicí DiaionR HP 40 (výrobce Mitsubishl Chemical Co.) ve vodě. Požadovaný produkt se na koloně adsorbuje. Sůl se vymyje 14 litry destilované vody.

Eluce se provádí směsí 1/50 N vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové a m-ethanolu (1:4 -objj/obj.). Frakce s absorpčním maximem kolem vlnové délky 290 nm se shromáždí. Spojené frakce se neutralizují

Dowexem^R 44 (OH typ, výrobce Dow Chemlcal Co.) a ipak se zahustí za sníženého tlalku.

Získaný 'koncentrát se vlije :na ‘kolonu o objemu 3 litrů plněnou CM Sephadexem C-25 (Na⁺ typ, výrobce Pharmiacia Fine Ohemicals Co.), předtím uvedeného do rovnovážného stavu roztokem 1/20 M kyseliny octové a octanu sodného (pufr o pH 4,5), požadovaný produkt se adsorbuje.

Eluce se .provádí metodou lineárního koncentračního gradientu, při které se přidává к tlumivému roztoku postupně chlorid sodný až do zvýšení koncentrace sodíku na 1,0 M. Modré frakce, které se eluují při koncentraci sodíku asi 0,6 M se shromáždí a spojí. Spojené frakce se odsolí .pomocí Diaionu^R HP 40 výše popsaným způsobem a pak se lyofilizují. Získá se 21,7 g modrého amorfního prášku měď obsahující formy deamidobleomycinu APMP. Výtěžek činí 66 %.

Modrý prášek vykazuje absorpční .maxima (E 1 %/lcm) při 24'1 nm (127) a 292 nm (104), měřeno v destilované vodě.

Prášek vykazuje absorpce v infračerveném světle (cm^-1) měřeno metodou KBr-itablety při 3 350, 1 725, 1 650, 1 560, 1 460, 1 380, Ϊ 200, 1140, 1100, 1060, 1020, 990, 880 a 770.

Další fyzikálně-chemické vlastnosti jsou uvedeny v 'tabulce 5.

Stupeň В

Ve 100 iml dimethylformamidu se rozpustí 5 g mědi obsahující formy deamidobleomycinu APMP získaného ve stupni A a 8,3 g (10 ekvivalentů vzhledem к bleomycinu) hydrochloridu 3-(/S/-l‘-fenylethylamí.no)propylaminu (dále označován jako PEP-amin-hydr ochilorid).

К výslednému roztoku se po ochlazení na O °C za míchání přidá 13,4 g (30 ekvivalentů vztaženo na mol bleomycinu) 1-hydroxybenztriazolu a 3,63 ml N-methylmorfolinu a p.ak 6,8 g (10 ekvivalentů na mol bleomycinu) dicyklohexylkarbodlimidu. Směs se pak nechá reagovat při teplotě místnosti za míchání ’6 hodin.

К reakční směsi se přidá desetinásobný roztok acetonu. Požadovaný .produkt se vy sráží. Po promytí acetonem se sraženina rozpustí v destilované vodě. Roztok se vlfje na kolonu objemu 500 ml naplněnou CM Sephadexem C-25 (Na⁺ typ, výrobce Pharmacla Fine Chemicals Co.), předtím 'uvedeným do· rovnovážného· stavu pufrovacím roztokem 1/20 M kyseliny octové — octanu sodného· o pH 4,5.

Produkt se adsorbuje. Eluce se .provádí metodou lineárního koncentračního gradientu, při které se к roztoku pufru. přidává chlorid sodný do dosažení koncentrace sodíku na 1,0 M. Modré frakce eluované při koncentraci sodíku asi 0,7 M se shromáždí a spojí.

Spojené frakce se odsolí pomocí Di.aionu^R HP-40 (500 ml) výše popsaným způsobem a pak se lyofilizují. Získá se 3,3 g měď obsahující formy 3-(N-methylaminopropyl)-amino,pr opyl/amldo/N- [ 3- (/S/-l‘-f enylethylami•nojpropyl]bleomycinu (dále označován jako dAPMP-PEP) ve formě modrého amorfního prášku.

Výtěžek činí 66 °/o. Tento .produkt vykazuje UV absorpční maxima (E 1 %/lcm) při měření v destilované vodě při 241 nm· (108) a 292 .nm (87). Produkt vykazuje IR absorpční maxima (vlnová délka, cm^-1) při měření metodou KBr-tablety při 3 350, 1 725, 1 645, 1 560, 1 '460, 1 380, 1 250, 1140, 1100, 1 06Ю, 1015, 990, 880, 765 a 700.

Další fyzikálně-chemické vlastnosti jsou uvedeny v tabulce 5.

Ve výše uvedeném stupni В se nahradí PEP-amin-tiydrochlorid a N-methylmorfolin n-okitylaminem, čímž se získá 3-(N-methylami.noipropyl)aminopropylamino-/amido/N-(n-oktyl)-bleomycin (dále označován jako dAPMP-OCT).

Tento produkt vykazuje UV absorpční maxima (E 1 °/o/i c.m) při měření v destilované vodě ,přl 241 nm (118) a 292 nm (95).

Produkt vykazuje IR absorpční maxima (vlnová délka cm^-1) při měření metodou KBr-tablety při 3 350, 2 940, 1720, 1640, 1 555, 1 460, 1 370, 1 250, 1115, 1100, 1 060, 1010, 995, 9'30, 880 a 760..

Další fyzikálně-chemické vlastnosti jsou uvedeny v tabulce 5.

Tabulka 5

Připravená sloučenina	Chromatografie n.a tenké vrstvě*1 formy obsahující měd, Rf	Elekitroforéza*2 formy •obsahující .měď, Rm (Rm alaninu 1,0)
deamidobleomycin APMP	0,28	0,93
dAPMP-PEP	0,23	1.17
dAPMP-OCT	0,37	1,00

*² Avicel SF^R (FMC Co.), kyselina mravenčí — kyselina octová — voda (27 : 75 : 900 obj./obj.), 800 V, 15 minut.

^X1 Sllica Gel 60 F 254 Silanized^R (Merck Co.), měřeno ve směsi methanol — 6% octan amonný (60 : 40 obj./obj.);

Jestliže se ve stupni В nahradí PEP-amin-hydrochlorid 3-(di-n-butylamino)propylaiminem .nebo N-[3-[N-methyl-N-(3-/2-/.p-chlorfenyl/ethylarmno jpropyl Jamino^propylaminem, získá se odpovídající derivát deamidobleomycinu APMP.

Stupeň C

Jeden gram měď obsahující formy dAPMP-PEP získané ve stupni В se rozpustí ve 100 mililitrech methanolu. Přidá se 700 mg (asi 4 ekvivalenty vzhledem к bleomycinů] m,p-dibenzyloxybenzaldehyd u.

Pak se přidá 48 mg (asi 1,3 ekvivalentu bleomycinů) kyanoborohydridu. Směs se nechá reagovat při 40 °C 48 hodin. Reakční směs se pak vlije na kolonu objemu 100 ml plněnou CM-ToyOipearl^R 650 (Na⁺ ty.p, výrobce TOYO SODA MFG) předem promytou methanolem.

Požadovaný produkt se adsorbuje. Kolona se .promyje 20Ό ml methanolu. Eluce se provede metodou lineárního koncentračního gradientu, při ikteré se přidává postupně 500 ml rozteku methanol—voda (7:3), který obsahuje 0,2 M chloridu sodného к 500 milimetrům roztoku methanol—voda (7 : 3).

130 m'1 modrých frakcí, které se eluují při koncentraci soli asi 0,12 M, se vlije na kolonu objemu 160 ml plněnou Amberlltem^R XAD-2 za účelem adsorpce. Eluce se provádí metodou lineárního koncentračního gradientu, při které se .přidává postupně 1 litr, methanolu к 1 litru 0,05 M tíumivého roztoku kyselina octová—octan sodný o pH 4,5 za lineárního růstu koncentrace methanolu.

Modré frakce, které se eluují při koncentraci methanolu asi 00 %, se vlijí na kolonu objemu 1'00 m'l plněnou Amberlítem^R XAD-2. Požadovaný produkt se 'adsorbuje. Po promytí 2Ό0 ml vody se eluce provede směsí 1/50 N kyseliny chlorovodíkové a methanolu . (1: 4 cbj./obj.j.

Modré frakce se shromáždí, spojí, neutra lizují Dowexem” 44 (OH typ, výrobce Dor,v Chemical Co.) a zahustí do sucha. Získá se '670 mg modrého prášku. Tento prášek se rozpustí v 50 ml vody. Roztok se vlije na kolonu objemu 1Ό0 ml naplněnou Amberlitem” XAD-2.

Požadovaný produkt se adsorbuje. Kolena se promyje 300 ml 5% roztoku (.vodného) EDTA. 2 Na, 100 ml 2°/o vodného roztoku chloridu sodného a 200 ml vody v uvedeném pořadí. P,ak se provede eluce směsí 1/50 N vodného rozteku kyseliny chlorovodíkové a methanolu (1:4 obj./obj.).

Frakce vykazující absorpční maximum při vlnové délce kolem 290 nm. Jejich pH se upraví na hodnotu -6,0 použitím Dowexu^R 44 (OH typ) a lyafilizují se. Získá se 640 mg mědi prosté formy hydrochloridu dDD-PEP jako bílého amorfního prášku. Výtěžek činí 64 %.

Tento produkt vykazuje absorpční maxima (UV) (El %/lcm) při měření v destilované vodě při 285 nm (74,4). Produkt vykazuje IR absorpční maxima (vlnová délka cm^-1) při měření metodou КВг-tabletv ipři 3 400, 2 900, 1 710, 1 650, 1 545, 1 505, 1450, 1 380, 1 260, 1136, 1 060, 1 010, 800, 730 a '690.

Další fyzikálně-chemické vlastnosti jsou uvedeny v tabulce 1.

Jestliže se ve stupni C použije jako výchozí bleomycin dAPMP-OCT a provede se výše uvedený postup, získá se dDD-OCT.

Jestliže se ve stupni С1/ jako výchozí látka použijí deriváty deamidobleomycinu APMP získané ve stupni В odpovídající požadovaným produktům, 2/ použijí se látky jako jsou aldehyd, cyklooktylaldehyd, p-chlorbenzaldehyd· a p-kyanobenzaldehyd •odpovídající požadovaným produktům, 3/ tyto aldehydy se použijí v množství 1,2 mol na 1 mol deamidobleomycinového APMP derivátu, 4/ a reakce se provede výše popsaným způsobem, získají se produkty uvedené v· tabulce 1.

Claims (8)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   1. Způsob výroby nových (amido)N-substituovaných bleomycinů obecného vzorce I kde

   Ri má 'výše uvedený význam kde

   BM znamená zbytek bleomyclno.vého skeletu,

   X znamená alkylovou skupinu se 6 až 10 atomy uhlíku nebo alkylovou · skupinu se · 2 až 6 atomy uhlíku substituovanou mono- · nebo •di(Ci-C5)alkylamínovou skupinou, fenylethylaminovou skupinou nebo N-methyl-N- [3-(2-/p-chlorf enyl/e-thyl Jaminopropyl Jaminovou skupinou,.

   Ri znamená oykloalkylovou skupinu s až 13 atomy uhlíku, alkylovou skupinu s 1 až 5 atomy uhlíku imaiící fenylový substituent, který může být substituován atomy halogenu, nebo fenylovou skupinu, která může být substituována alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující atomy halogenu, kyanoskupinu a ben.zyloxyisku.pinu, a

   R2· znamená atom vodíku, benzylovou skupinu nebo dibenzyloxybenzylovou skupinu, vyznačující se tím, že se (amldo)N-substituovaný derivát 3-(N-meihyl-N-/3-aminopropyl/aminoj propylaminobleomyoinu obecného vzorce III conh,

   I

   CH

   NH.

   CH

   Z^CHx

   CO-NH-X

   C/-A

   I ² CO-NH-ÍCH^N-ÍCHz

   BM (III) kde

   BM a X’ mají výše uvedený význam, nechá reduktivně kondenzovat s aldehydem obecného vzorce· IV ·

   RíCHO (IV) kde

   Ri má výše uvedený význam a popřípadě se získaná sloučenina přivede na jinou sloučeninu obecného vzorce I, kde substituenty Ri a R2 mají jiný, výše uvedený význam.
2. 2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se použijí odpovídajícím způsobem substituované výchozí látky za · vzniku sloučenin obecného· vzorce I, kde X znamená oktyl, fenylethylaminopropyl, N-methyl-N- [
3. 3- (2-/p-chlorf enyl/ ethyl jaminoipropyl ] aminapropyl nebo dibutylaminopropyl.

   ’ 3. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se použije odpovídajícím způsobem substituovaných výchozích · látek za vzniku sloučenin obecného vzorce I, kde X znamená oktyl, fenylethylaminopropyl, N-methyl-N- [ 3- (2-/p-chlorf enyl/ethyl) amlnopropyl ] aminopropyl nebo dibutylaminopropyl, jako aldehyd se použije cyklooktylaldehyd, halogenfenylacetaldehyd nebo dibenzyloxybenzáldehyd, a Ri znamená oyklookitylmethyl, halogenfenylethyl nebo dibenzyloxyfenylne· thyl.
4. 4. Způsob · podle bodu 1, pro. výrobu 3-jN-methyl-N- [ 3- (2-/p-chlorf enyl/ethylamino)pro|pyl]a.minOjpropylαnino-(ůmido)-N-[3-(/S/·Γ-fenyleihylanino)propyl]-bleomyoinu, 3-{N-mnt'ilyl-N-[3--p-kyanobeιnzylamlno)ρropyl]'ад[lino}-proιpylamino-(anidojN- [ 3- (/S/-l‘-f eny lethylamlno) pr opyl ] -bleomycinu nebo· 3-{N-mn'thyl-^N[3-(cyklooktyanei·hylαnino)ρropyl ] aminojpropylamino- (amido )ⁱN--3-(/S/-l‘-fenylethylamino).propyl]bleonycinu, vyznačující se tím, že se 3-(Nneth·ylalnincprΌpyl·amino)propyl- (amido·) N- [ 3- (/S/-1 ‘-fenyle thylamino jpropyl ] -bleo· myoin nechá reduktivně kondenzovat s p-ohlorbenzαldehyden, p-kyanobenzaldehydem nebo oyklooktylalde.hyden.
5. 5. Způsob podle bodu 1 pro výrobu 3-{N-

   -methyl-N-[ 3- (cyklookiylnethylanino)pг·opyl Jaminolpr opylamino- (amido) N- [ oktyl ] -bleotnycinu, 3-{N-methyl-N- [3- (2>/Z*-0llorfenylethylamino/propyl) amino]prqpyl}αnlno-(anido)N-[oktyl] -bleonyoinu, 3-{N-methyl-N- [ 3- (p·kyanobenzylanino) propyl ] anino}pro!pylantno-(a'nido)N([oklayl]-Ыeomyoinu nebo 3-j^N.met.hyl·N--3-bls(m,p-dibenzyloxybenzyl Jamlnopropyl ] -amtnoj-pr opy lamino- (amido )N- [ n-oktyl] -bleomycinu, vyznačující se tím, že se 3·(N(m^thyIαnlnopropyl) -.aminopropylamino- (amido) N- [ n-oktyl]-bleomycin neohá reduktivně kondenzovat s cyklooktylaldehydem, p-ohlorfenyl· acetaldehydem, p-kyαnofenylbenzaldehyden nebo n,p-dibenzyIoxybenzαldehyden.
6. 6. Způsob podle bodu 1 pro výrobu 3-{N-methyl-N- [ 3- (2-/p-chlor fenyl/ethylamíno ] propyl] aminobpropy lamino- (amido ] N- [ 3-

   -{^di-n}b.u::^<!l^i^m.in3jpropyl-bleomycinu nebo· 3*{N’ietetylyl-N- [ 3- (p-kyanobenzylamino) propyl ] ammoj-propylamíno-tamido) N- [ 3- (d i-n-butylamino )<propyl]-bleomycmu, vyznačující se -tím, že se nechá redukitivně kondenzovat 3- (N-methylaminopropyl jaminopropyl-ammo- (amido )N- (3-/di-o-butlyamioo/propyl)-bleomycio s p-chlorfenylacetaldehydem -nebo .p-kyanobenzaldehyde.m.
7. 7. Způsob podle bodu 1 ,pro výrobu 3-JN-methyl-N- [ 3- (2-/,p-chlorfenyl/ethyIammo) propyl ] aminoS-propylamino- (amido) N-J3-/N-methyl-N-[ 3-(2/p-chlorfeoyl/ethylamioo)-propyl] amlno]pro!pylbleoιmycinu, vyznačují- cí se tím, že se S-fN-m^thylaminoproi amioopropylamioo-(amido )N-|3- (N-meth; -N- [ 3- (2--p -chlorfenyl/ ethylamino Jpropyí -a.mшojρrαpyj}-bleomycio nechá redukti kondenzovat s p-chloríenylacetaldehyde
8. 8. Způsob pcdle bodu 1 pro výrobu 3· -methyl-N- [ 3-bis( m,p-dibeozyloxybeozyl }amioopropyll'ammo';propylamino-(.amiidojr -(n-oktylj-bleomycinu, vyznačující se tí. že se 3-(N-metthylaminopl·opyl)-amiooρr pylamino-(amidoJN-[ n-oktyl ]-bleomycin ne chá kondenzovat -s mlp-dibenzyloKybenza dehydem.