CS233493B1 - Spósob přípravy tabletového testu na stanovenie koncentrácie bielkovín v biologických tekutinách - Google Patents

Description

Vynález sa týká spfisobu přípravy tabletového testu na stanovenie koncentrácie bielkovin v biologických tekutinách.

Moderné metody stanovenia bielkovin v biologických tekutinách sú založené na meraní koncentrácie komplexu farbiva s bielkovinou za využitia spektrofotometrických technik.

[m.m. Brandford: Analyt. Bíochem. 72, 248 ¢1976)} J.J. Sedmak, S.E. Grossberg: Analyt. Biochem. 79, 544 (1977); T. Speotor: Analyt. Biochem. 86, 142 (1978JJ . Ne tomto principe bolí zatial’ vyvinuté len diagnostiků v tekutom stave ako napr. Microprotein Kit pre stanovenie koncentrácie bielkoviny v moři a mozgomiešnej tekutiny firmy Pierce (Microprotein Rapid Stát Kit for quantitative colorimetric determination of total protein in cerebróspinal fluid, urine and other biologie fluids. Intructions fy Piree N° 45700, (1979) alebo firmy Bio rad (Total protein Kit, Bio-Rad Protein Assay, Instruction manual Bio-Rad Laboratories, 1979). Nevýhodou uvedených postupov je skutočnosť, že uvedené diagnostiků sú v tekutom stave, použité, farbivá sú adhesívne ku skleněným povrchom a metoda je tak citlivá, že případné použitie pre stanovenie bielkovin o vyšších koncentráciách ako napr. v krvnom sére alebo plazme by bolo s ohTadom na nutnosť mnohonásobného riedenia nepraktické.

Uvedené nevýhody v podstatnej miere odstraňuje zpfisob přípravy tabletového testu na stanovenie koncentrácie bielkovin v biologických tekutinách podTa vynálezu, ktorého podstata spočívá v tom, že v prvom stupni sa připraví roztok farbiva 3-f N-etyl-N/3-metyl-4/Jjl- (4-etoxyanilino)feny 1-^2-metyl-4-Ί N-etyl-N-[3-( sódium sulfonáto)fenyl metyl]} aminofenyl)/metylén-2,5-dimetyl-2,5-cyklohexadién-1-ylidén/J imóniobbenzénsulfonátu, alebo [?3~N-etyl-N-/3-hydroxynietyl-4-/£4-( 4-etoxyanitino)f enyl-<g-hydroxymetyl-4-^N-etyl-N- ’ [3-(sódium sulfonéto)f enylmetyijj* eminofenyl^/metylén-2,5-dihydroxymetyl-2,5-oyklohexadién-1-ylidén/J imóniobenzénsulfonátu o koncentrácii 2 až 5 % hmotnostných v organickom rozpúšíadle neobmedzene sa miešajúoom s vodou s výhodou v metanole a/lebo v etanole a/lebo ich vodných roztokoch,v druhom stupni sa roztok naleje na mikrokryštalickú celulózu, pričom hmotnostný poměr roztoku farbiva k mikrokryštalickej celulóze nie je vyšší ako 0,7 až 1,0, načo sa po dokonalej homogenizácii mikrokryštalická celulóza vysuší pri teplote 20 až 100 °C, přeseje cez šito s veTkosťou ok o priemere 0,5 mm a v treťom stupni sa k vysušenej mikrokryštaliokej celulóze so sorbovaným farbivom přidá chlorid sodný v množstve 10 % hmotnostných a mastenec v množstve 2 % hmotnostnýoh, zhomogenizuje sa a tabletuje na tabletovacom stroji na tablety o hmotnosti 100 až 200 mg.

Prídavok chloridu sodného do tabletovej zmesi znižuje adhesivitu farbiva k povrchom sklenných laboratórnych nádobiek. Základnou zárukou vysokej homogenity distribúoie sorbovaného farbiva na mikrokryštalickú celulózu je, že farbivo sa musí rozpúšťať v rozpúšťadle s výhodou v metanole, ktorý sa potom z mikrokryštalickej celulózy dobře odpaří bez toho aby vznikol hrubý granulát, ktorý by viedol k zhoršenej homogenitě distribúoie farbiva na celulózovom nosiči. Hmotnostný poměr kvapalnej fázy k celulóze nemá byť vyšší ako 1, pretože zvýšenie tohto poměru vedie k zhoršenej homogenitě distribúcie sorbovaného farbiva.

Ak sa na rozpúšťanie farbiva použije etanol připadne aceton, tieto sa musia riediť vodou najlepšie v objemovom pomere 1 : 1, pretože v čistom etanole sa farbivo horšie rozpúšťa.

Za podmienok přípravy tabletového testu k stanoveniu koncentrácie bielkovin v biologických tekutinách podTa vynálezu možno dosiahnuť, že variačný koeficient obsahu farbiva a chloridu sodného sa pohybuje do 2 %, čím sa splňuje podmienka štandardizovateTnosti metody.

NakoTko pri príprave reakčného činidla z pripravenej tablety na stanovenie proteínov sa používajú látky běžné v keždom chemickom resp. klinicko biochemickom laboratórlu, ako destilovaná voda, metanol a kyselina chlorovodíková nie je nutné aby tieto zložky boli súčasťou tabletového diagnostického testu.

Výhodou nového postupu přípravy univerzálneho tabletového testu k stanoveniu koncentrácie bielkovin v biologických tekutinách je, že je to test suchý, ktorý sa dobré skladuje a přepravuje a uživatel’ si mfiže analytický reakčný roztok připravit pohotové podl’a potřeby v takom množstve aký potřebuje v rutinnej praxi pře denné resp. týždenné množstvo analýz. Ďalšou výhodou testu je, že pri skladovaní je stály a to tak v suchom stave ako i vo formě regeneračného pracovného roztoku, áalej, že farbivo nemá tendenoiu zvýšenej adhézie k skleněným stenám pracovných nádob resp. kyviet, So zvyšuje přesnost merania absorbancie.

Konkrétnejšie detaily přípravy nového talbetového testu na stanovenie bielkovín v biologických tekutinách sú uvedené v príkladoch, ktoré nie sú vyčerpávajúce ale iba ilustrujúce.

Přikladl g farbiva 3-[/N-etyl-N/3-metyl-4/Q-(4-etoxyanilino)fenyl-^2-metyl-4-'{N-etyl-N [3-C sódium sulfonáto)fenyl metyl]^ aninofenyl)/metylén-2,5-úimetyl-2,5-cyklohexadién-l-ylidén/J imóniobenzénsulfonétu (Coomasie Blue G) sa rozpustí v 1 000 ml metanolu a po rozpuštění sa naleje na 1 kg mikrokryštalickej celulózy o velkosti častíc 100 až 500 mikrometra. Reakčná zmes sa dobré zamieša, aby sa roztok farbiva homogenně distribuoval na pevnom nosiči celulózy. Po zhomogenizovaní sa mikrokryštalická celulóza vysuší od metanolu a to buá vol’ne na vzduchu alebo vo vákuovej sušiarni. Po vysušení sa celulóza so sorbovaným farbivom přeseje cez šito v velkosti 6k 0,5 mm, načo sa k presiatenu produktu přidá 100 g presiateho chloridu sodného a 20 g mastanca, dobře sa zamieša a homogenná tabletovacia zmes sa tabletuje na tabletovacom stroji za sucha na tablety o hmotnosti 200 mg. Pri stanoveni celkových proteinov v biologických tekutinách sa tableta připravená podl’a tohto příkladu mieša 15 rainút pri izbovej teplote v 100 ml regeneračného roztoku o zložení:

ml metanolu, 10 ml 2,5 mol.1^_1 kyseliny chlorovodíkové^ a 80 ml destilovanej vody. Po 15 minutách sa suspenzia přefiltruje od nerozpustnej celulózy a filtrát je vhodný na stanovenie celkových bielkovín v biologických tekutinách do koncentrácie 1,2 g/1 při pipetovaní biologického roztoku 50 /ul do 2,5 ml regeneračného roztoku. Přidáním proteinu sa roztok sfarbí do modra a koncentrácia bielkovín je úměrná absorbancii meranej při 620 nm. Absolútna hodnota koncentrácie bielkovín sa odčítá z kalibračnej křivky konštruovanej použitím roztoku proteinového Standartu.

Příklad 2

Postup podía příkladu 1 s tým rozdielom, že na rozpúštanie farbiva sa použije zmes etanolu a vody v objemíSvom pomere 1:1. Hotové tablety sa rozpúštajú v 100 ml roztoku o zložení: 10 ml etanolu, 10 ml 6 mol.I^-' kyseliny chlorovodíkovém ^a ml destilovanej vody. Regeneračný roztok farbiva je vhodný na stanovenie celkových bielkovín o koncentrácii do 20 g/1 pri pipetovaní 50 /ul skúmaného roztoku do 2,5 ml regeneračného roztoku farbiva.

Příklad 3

Postup podía příkladu 1 s tým rozdielom, že roztok farbiva nanášený na mikrokryštalickú celulózu má koncentráciu 4 % hmotnostných t.j. rozpúšťa sa 40 g farbiva a tablety majú hmotnost 100 mg. Regeneračný roztok má obdobné vlastnosti len rozsah linearity absorbancie v závislosti na koncentrácii bielkovín v biologickom roztoku je asi 10 % užší.

Příklad 4

Postup podl’a příkladu 1 s tým rozdielom, že ako farbivo sa použije 40 g[/3-N-etyl-N-/3-hydroxymetyl-4/[é-(4-etoxyanilino)fenyl-{2-hydroxymetyl-4—^N-etyl-N-[3-(sódium sulfonáto) f enylmetyíQ aminof enyl)/metylén-2,5-dihydroxymetyl-2,5-cyklohexadién-1 -ylidén/[J imóniobenzénsulfonátu a tabletuje sa na tablety o hmotnosti 100 mg. Regeneračný roztok má obdobné vlastnosti ako v příklade 1. '

Vynález možno využiť všade, kde je potřebné stanovit rýchlo a poměrně presne obsah bielkovín hlavně v biologických roztokoch, zvlášť pre diagnostické účely. Dá sa však využiť i v priemyslovej praxi pri medzioperačnej kontrole najma substrátov obsahujúcich vodorozpustné bielkoviny.

Claims (1)

1. PREDMET VYNÁLEZU

   Spčsob přípravy tabletového testu na stanovenie koncentrácle bielkovín v biologických tekutinách vyznačený tým, že v prvom stupni sa připraví roztok farbiva 3-[^N_etyl^_N/3~ -metyl“4/£4-(-etoxyanillno)fenyl-^2-metyl-4-^N-etyl-N[3-(sódium sulfonáto)fenyl metyl]J aminofenyl)/metylén-2,5-dimetyl-2,5-cyklohexadién-1 -ylidén/JJ imóniobenzénsulfonátu, alebo 3“J]N-etyl-N-/3-hydroxymetyl-4-/ [4-( 4-etoxyanilino)fenyl-\2-hydroxymety 1-4—(N-etyl-N£]3-(sódium sulfonáto) feny lmetylJJ aminofenyl^ /metylén-2,5-dihydroxymetyl-2,5-cyklohexadién-1-ylidén/J imóniobenzénsulfonátu o koncentrácii 2 až 5 % hmotnostných v organickom rozpúšťadle neobmedzene sa miešajúcom s vodou s výhodou v metanole a/alebo v etanole a/alebo ich vodných roztokoch, v druhom stupni sa roztok naleje na mikrokryštalickú celulózu, pričom hmotnostný poměr roztoku farbiva k mikrokryštalickej celulóze nie je vyšší ako 0,7 až 1,0, naěo sa po dokonalej homogenizácii mikrokryštalická celulóza vysuší pri teplote 20 až 100 °C, přeseje cez šito s vel’kosťou Čk o priemere 0,5 mm a v treťom stupni sa k vysušenej mikrokryštalickej celulóze so sorbovaným farbivom přidá chlorid sodný v množstve 10 S6 hmotnostných a mastenec v množstve 2 % hmotnosti, zhomogenizuje sa a tabletuje na tablety o hmotnosti 100 až 200 mg.