CS233493B1

CS233493B1 - A method of preparing a tablet test to determine protein concentration in biological fluids

Info

Publication number: CS233493B1
Application number: CS835540A
Authority: CS
Inventors: Jiri Zemek; Ludovit Kuniak
Original assignee: Jiri Zemek; Ludovit Kuniak
Priority date: 1983-07-25
Filing date: 1983-07-25
Publication date: 1985-03-14
Also published as: CS554083A1

Abstract

Uvedeného účelu sn dosiahne tým, že vhodné farbivo s výhodou Coomasie Blue G (C.I, 42655) alebo jeho derivát sa rozpustí v organickom rozpúšťadle s výhodou metanolu alebo etanolu a vo formě roztoku sa nanesie na mikrokryšteličku celulózu v pomere asi 1 : 1. Po vysušení sa mikrokryátalická celulóza zhomogenizuje s 0,1 dielom chloridu sodného a 0,02 dielami mastenca a tabletuje sa na tabletovacom stroji na tablety o hmotnosti 100 až 200 mg. Suché tablety sa před použitím suspenduji! v 100 ml regeneračného roztoku skládájúceho sa z 10 ml alkoholu a 10 ml 2,5 až 6 M kyseliny chlorovodíkovej a 80 ml destllovanej vody. Po odfiltrovaní nerozpustnej mikrokryátalickej celulózy sa filtrát použije na stanovenie bielkovín, pričom sa přidáním bielkoviny reakčný roztok zafarbí do modra a intenzita zafarbertia je úměrná Koncentrácii bielkovín.The above purpose is achieved by dissolving a suitable dye, preferably Coomassie Blue G (C.I. 42655) or a derivative thereof, in an organic solvent, preferably methanol or ethanol, and applying the solution to the microcrystalline cellulose in a ratio of about 1:1. After drying, the microcrystalline cellulose is homogenized with 0.1 part of sodium chloride and 0.02 parts of talc and tableted on a tabletting machine to tablets weighing 100 to 200 mg. The dry tablets are suspended before use in 100 ml of a regeneration solution consisting of 10 ml of alcohol and 10 ml of 2.5 to 6 M hydrochloric acid and 80 ml of distilled water. After filtering off the insoluble microcrystalline cellulose, the filtrate is used for protein determination, whereby the addition of protein turns the reaction solution blue and the intensity of the coloration is proportional to the protein concentration.

Description

Vynález sa týká spfisobu přípravy tabletového testu na stanovenie koncentrácie bielkovin v biologických tekutinách.The invention relates to a method for preparing a tablet test for determining the protein concentration in biological fluids.

Moderné metody stanovenia bielkovin v biologických tekutinách sú založené na meraní koncentrácie komplexu farbiva s bielkovinou za využitia spektrofotometrických technik.Modern methods for the determination of proteins in biological fluids are based on the measurement of the concentration of dye-protein complex using spectrophotometric techniques.

[m.m. Brandford: Analyt. Bíochem. 72, 248 ¢1976)} J.J. Sedmak, S.E. Grossberg: Analyt. Biochem. 79, 544 (1977); T. Speotor: Analyt. Biochem. 86, 142 (1978JJ . Ne tomto principe bolí zatial’ vyvinuté len diagnostiků v tekutom stave ako napr. Microprotein Kit pre stanovenie koncentrácie bielkoviny v moři a mozgomiešnej tekutiny firmy Pierce (Microprotein Rapid Stát Kit for quantitative colorimetric determination of total protein in cerebróspinal fluid, urine and other biologie fluids. Intructions fy Piree N° 45700, (1979) alebo firmy Bio rad (Total protein Kit, Bio-Rad Protein Assay, Instruction manual Bio-Rad Laboratories, 1979). Nevýhodou uvedených postupov je skutočnosť, že uvedené diagnostiků sú v tekutom stave, použité, farbivá sú adhesívne ku skleněným povrchom a metoda je tak citlivá, že případné použitie pre stanovenie bielkovin o vyšších koncentráciách ako napr. v krvnom sére alebo plazme by bolo s ohTadom na nutnosť mnohonásobného riedenia nepraktické.[m.m. Brandford: Analyt. Bíochem. 72, 248-276)} J.J. Sedmak, S.E. Grossberg: Analyt. Biochem. 79, 544 (1977); T. Speotor: Analyt. Biochem. 86, 142 (1978JJ) So far, only liquid diagnostics such as the Microprotein Kit for Pierce Protein Concentration and Cerebral Spinal Fluid have been developed for this principle. Piine N ° 45700, (1979) or Bio rad (Total protein kit, Bio-Rad Protein Assay, Instruction Manual Bio-Rad Laboratories, 1979). they are in liquid form, used, the dyes are adhesive to glass surfaces and the method is so sensitive that the possible use for the determination of proteins at higher concentrations such as in blood serum or plasma would be impractical due to the need for multiple dilutions.

Uvedené nevýhody v podstatnej miere odstraňuje zpfisob přípravy tabletového testu na stanovenie koncentrácie bielkovin v biologických tekutinách podTa vynálezu, ktorého podstata spočívá v tom, že v prvom stupni sa připraví roztok farbiva 3-f N-etyl-N/3-metyl-4/Jjl- (4-etoxyanilino)feny 1-^2-metyl-4-Ί N-etyl-N-[3-( sódium sulfonáto)fenyl metyl]} aminofenyl)/metylén-2,5-dimetyl-2,5-cyklohexadién-1-ylidén/J imóniobbenzénsulfonátu, alebo [?3~N-etyl-N-/3-hydroxynietyl-4-/£4-( 4-etoxyanitino)f enyl-<g-hydroxymetyl-4-^N-etyl-N- ’ [3-(sódium sulfonéto)f enylmetyijj* eminofenyl^/metylén-2,5-dihydroxymetyl-2,5-oyklohexadién-1-ylidén/J imóniobenzénsulfonátu o koncentrácii 2 až 5 % hmotnostných v organickom rozpúšíadle neobmedzene sa miešajúoom s vodou s výhodou v metanole a/lebo v etanole a/lebo ich vodných roztokoch,v druhom stupni sa roztok naleje na mikrokryštalickú celulózu, pričom hmotnostný poměr roztoku farbiva k mikrokryštalickej celulóze nie je vyšší ako 0,7 až 1,0, načo sa po dokonalej homogenizácii mikrokryštalická celulóza vysuší pri teplote 20 až 100 °C, přeseje cez šito s veTkosťou ok o priemere 0,5 mm a v treťom stupni sa k vysušenej mikrokryštaliokej celulóze so sorbovaným farbivom přidá chlorid sodný v množstve 10 % hmotnostných a mastenec v množstve 2 % hmotnostnýoh, zhomogenizuje sa a tabletuje na tabletovacom stroji na tablety o hmotnosti 100 až 200 mg.The above disadvantages are substantially eliminated by the preparation of a tablet test for the determination of the protein concentration in biological fluids according to the invention, which consists in preparing, in the first step, a dye solution of 3-N-ethyl-N (3-methyl-4). - (4-ethoxyanilino) phenyl 1- (2-methyl-4-N-ethyl-N- [3- (sodium sulfonate) phenyl methyl]} aminophenyl) methylene-2,5-dimethyl-2,5-cyclohexadiene 1-ylidene / 1H-imoniumbenzenesulfonate, or [3- N -ethyl-N- (3-hydroxyniethyl) -4- [4- (4-ethoxyanitino) phenyl] -hydroxymethyl-4- N -ethyl- N- '[3- (sodium sulfonato) phenylmethyl] aminophenyl- (methylene-2,5-dihydroxymethyl-2,5-cyclohexadiene-1-ylidene) imoniumbenzenesulfonate at a concentration of 2 to 5% by weight in an organic solvent is mixed unlimitedly with water, preferably methanol and / or ethanol and / or aqueous solutions thereof, in a second step, the solution is poured onto microcrystalline cellulose, the weight ratio of dye solution to microcrystalline cell being the ose is not higher than 0.7 to 1.0, after which the microcrystalline cellulose is dried at 20 to 100 ° C after complete homogenization, passed through a 0.5 mm diameter sieve and in the third stage dried microcrystalline cellulose is dried with sorbed dye, sodium chloride at 10% by weight and talc at 2% by weight are added, homogenized and tableted on a tablet machine for tablets weighing 100-200 mg.

Prídavok chloridu sodného do tabletovej zmesi znižuje adhesivitu farbiva k povrchom sklenných laboratórnych nádobiek. Základnou zárukou vysokej homogenity distribúoie sorbovaného farbiva na mikrokryštalickú celulózu je, že farbivo sa musí rozpúšťať v rozpúšťadle s výhodou v metanole, ktorý sa potom z mikrokryštalickej celulózy dobře odpaří bez toho aby vznikol hrubý granulát, ktorý by viedol k zhoršenej homogenitě distribúoie farbiva na celulózovom nosiči. Hmotnostný poměr kvapalnej fázy k celulóze nemá byť vyšší ako 1, pretože zvýšenie tohto poměru vedie k zhoršenej homogenitě distribúcie sorbovaného farbiva.The addition of sodium chloride to the tablet composition reduces the adhesion of the dye to the surfaces of the glass laboratory vials. The basic guarantee of the high homogeneity of the sorbed dye distribution to microcrystalline cellulose is that the dye must be dissolved in a solvent preferably in methanol, which then evaporates well from the microcrystalline cellulose without forming a coarse granulate which would lead to impaired homogeneity of the dye distribution on the cellulose carrier. . The weight ratio of liquid phase to cellulose should not be greater than 1, as an increase in this ratio leads to a deteriorated homogeneity of the sorbed dye distribution.

Ak sa na rozpúšťanie farbiva použije etanol připadne aceton, tieto sa musia riediť vodou najlepšie v objemovom pomere 1 : 1, pretože v čistom etanole sa farbivo horšie rozpúšťa.If ethanol or acetone is used to dissolve the dye, these must be diluted with water preferably in a 1: 1 ratio by volume, since the dye is more difficult to dissolve in pure ethanol.

Za podmienok přípravy tabletového testu k stanoveniu koncentrácie bielkovin v biologických tekutinách podTa vynálezu možno dosiahnuť, že variačný koeficient obsahu farbiva a chloridu sodného sa pohybuje do 2 %, čím sa splňuje podmienka štandardizovateTnosti metody.Under the conditions of the preparation of a tablet test to determine the protein concentration in biological fluids according to the invention, it is possible to achieve a variation coefficient of dye and sodium chloride content of up to 2%, thereby satisfying the standardizability condition of the method.

NakoTko pri príprave reakčného činidla z pripravenej tablety na stanovenie proteínov sa používajú látky běžné v keždom chemickom resp. klinicko biochemickom laboratórlu, ako destilovaná voda, metanol a kyselina chlorovodíková nie je nutné aby tieto zložky boli súčasťou tabletového diagnostického testu.As the reagents are prepared from the prepared protein determination tablet, substances common to each chemical or chemical reagent are used. clinical biochemical laboratory, such as distilled water, methanol and hydrochloric acid, it is not necessary that these components be part of a tablet diagnostic test.

Výhodou nového postupu přípravy univerzálneho tabletového testu k stanoveniu koncentrácie bielkovin v biologických tekutinách je, že je to test suchý, ktorý sa dobré skladuje a přepravuje a uživatel’ si mfiže analytický reakčný roztok připravit pohotové podl’a potřeby v takom množstve aký potřebuje v rutinnej praxi pře denné resp. týždenné množstvo analýz. Ďalšou výhodou testu je, že pri skladovaní je stály a to tak v suchom stave ako i vo formě regeneračného pracovného roztoku, áalej, že farbivo nemá tendenoiu zvýšenej adhézie k skleněným stenám pracovných nádob resp. kyviet, So zvyšuje přesnost merania absorbancie.The advantage of the new universal tablet test procedure for determining protein concentration in biological fluids is that it is a dry test that is well stored and transported and the user can prepare the analytical reaction solution readily as needed in routine practice daily, respectively. weekly amount of analysis. A further advantage of the test is that it is stable when stored, both in the dry state and in the form of a regenerative working solution, furthermore that the colorant does not tend to have an increased adhesion to the glass walls of the working vessels or the working walls. kyviet, So increases the measurement accuracy of absorbance.

Konkrétnejšie detaily přípravy nového talbetového testu na stanovenie bielkovín v biologických tekutinách sú uvedené v príkladoch, ktoré nie sú vyčerpávajúce ale iba ilustrujúce.More specific details of the preparation of the novel talb assay for the determination of proteins in biological fluids are given in the examples, which are not exhaustive but merely illustrative.

Přikladl g farbiva 3-[/N-etyl-N/3-metyl-4/Q-(4-etoxyanilino)fenyl-^2-metyl-4-'{N-etyl-N [3-C sódium sulfonáto)fenyl metyl]^ aninofenyl)/metylén-2,5-úimetyl-2,5-cyklohexadién-l-ylidén/J imóniobenzénsulfonétu (Coomasie Blue G) sa rozpustí v 1 000 ml metanolu a po rozpuštění sa naleje na 1 kg mikrokryštalickej celulózy o velkosti častíc 100 až 500 mikrometra. Reakčná zmes sa dobré zamieša, aby sa roztok farbiva homogenně distribuoval na pevnom nosiči celulózy. Po zhomogenizovaní sa mikrokryštalická celulóza vysuší od metanolu a to buá vol’ne na vzduchu alebo vo vákuovej sušiarni. Po vysušení sa celulóza so sorbovaným farbivom přeseje cez šito v velkosti 6k 0,5 mm, načo sa k presiatenu produktu přidá 100 g presiateho chloridu sodného a 20 g mastanca, dobře sa zamieša a homogenná tabletovacia zmes sa tabletuje na tabletovacom stroji za sucha na tablety o hmotnosti 200 mg. Pri stanoveni celkových proteinov v biologických tekutinách sa tableta připravená podl’a tohto příkladu mieša 15 rainút pri izbovej teplote v 100 ml regeneračného roztoku o zložení:Example 1g of 3 - [(N-ethyl-N) 3-methyl-4] - [4- (4-ethoxyanilino) phenyl] -2-methyl-4- {N-ethyl-N [3-C sodium sulfonate) phenyl dye methyl] (4-aminophenyl) / methylene-2,5-dimethyl-2,5-cyclohexadien-1-ylidene / 1-Ionobenzenesulfonate (Coomasie Blue G) is dissolved in 1000 ml of methanol and poured onto 1 kg of microcrystalline cellulose 100 to 500 microns. The reaction mixture is well mixed to distribute the dye solution homogeneously on a solid cellulose carrier. After homogenization, the microcrystalline cellulose is dried from methanol either in air or in a vacuum oven. After drying, the dye-sorbed cellulose is passed through a 6k 0.5 mm sieve, then 100 g of sieved sodium chloride and 20 g of talc are added to the sieves, mixed well and the homogeneous tablet mixture is tabletted on a tabletting machine dry to tablets. weighing 200 mg. To determine total proteins in biological fluids, the tablet prepared according to this example is blended for 15 minutes at room temperature in 100 ml of a regeneration solution of the composition:

ml metanolu, 10 ml 2,5 mol.1^_1 kyseliny chlorovodíkové^ a 80 ml destilovanej vody. Po 15 minutách sa suspenzia přefiltruje od nerozpustnej celulózy a filtrát je vhodný na stanovenie celkových bielkovín v biologických tekutinách do koncentrácie 1,2 g/1 při pipetovaní biologického roztoku 50 /ul do 2,5 ml regeneračného roztoku. Přidáním proteinu sa roztok sfarbí do modra a koncentrácia bielkovín je úměrná absorbancii meranej při 620 nm. Absolútna hodnota koncentrácie bielkovín sa odčítá z kalibračnej křivky konštruovanej použitím roztoku proteinového Standartu.mL of methanol, 10 ml of 2.5 mol.1 ^_1 ^ HCl and 80 ml of distilled water. After 15 minutes, the suspension is filtered from insoluble cellulose and the filtrate is suitable for the determination of total proteins in biological fluids to a concentration of 1.2 g / l by pipetting 50 µl of biological solution into 2.5 ml of regeneration solution. Adding the protein turns the solution blue and the protein concentration is proportional to the absorbance measured at 620 nm. The absolute value of the protein concentration is read from a calibration curve constructed using a protein standard solution.

Příklad 2Example 2

Postup podía příkladu 1 s tým rozdielom, že na rozpúštanie farbiva sa použije zmes etanolu a vody v objemíSvom pomere 1:1. Hotové tablety sa rozpúštajú v 100 ml roztoku o zložení: 10 ml etanolu, 10 ml 6 mol.I^-' kyseliny chlorovodíkovém ^a ml destilovanej vody. Regeneračný roztok farbiva je vhodný na stanovenie celkových bielkovín o koncentrácii do 20 g/1 pri pipetovaní 50 /ul skúmaného roztoku do 2,5 ml regeneračného roztoku farbiva.The procedure of Example 1, except that a 1: 1 mixture of ethanol and water was used to dissolve the dye. Finished tablets dissolved in 100 ml of a solution composed of 10 ml of ethanol and 10 ml of 6 mol m ^- 'hydrochloric acid ^and ml of distilled water. The dye recovery solution is suitable for the determination of total proteins up to 20 g / l when pipetting 50 µl of the test solution into 2.5 ml dye recovery solution.

Příklad 3Example 3

Postup podía příkladu 1 s tým rozdielom, že roztok farbiva nanášený na mikrokryštalickú celulózu má koncentráciu 4 % hmotnostných t.j. rozpúšťa sa 40 g farbiva a tablety majú hmotnost 100 mg. Regeneračný roztok má obdobné vlastnosti len rozsah linearity absorbancie v závislosti na koncentrácii bielkovín v biologickom roztoku je asi 10 % užší.The process of Example 1, except that the dye solution applied to the microcrystalline cellulose has a concentration of 4% by weight, i.e. 40 g of the dye is dissolved and the tablets have a weight of 100 mg. The regeneration solution has similar properties only the extent of linearity of the absorbance is about 10% narrower depending on the protein concentration in the biological solution.

Příklad 4Example 4

Postup podl’a příkladu 1 s tým rozdielom, že ako farbivo sa použije 40 g[/3-N-etyl-N-/3-hydroxymetyl-4/[é-(4-etoxyanilino)fenyl-{2-hydroxymetyl-4—^N-etyl-N-[3-(sódium sulfonáto) f enylmetyíQ aminof enyl)/metylén-2,5-dihydroxymetyl-2,5-cyklohexadién-1 -ylidén/[J imóniobenzénsulfonátu a tabletuje sa na tablety o hmotnosti 100 mg. Regeneračný roztok má obdobné vlastnosti ako v příklade 1. 'The procedure of Example 1 is followed, except that 40 g of [(3-N-ethyl-N-) 3-hydroxymethyl-4] [[(4-ethoxyanilino) phenyl] - (2-hydroxymethyl-4)] is used as the dye. - N-Ethyl-N- [3- (sodium sulfonate) phenylmethyl (aminophenyl)] - methylene-2,5-dihydroxymethyl-2,5-cyclohexadiene-1-ylidene / [i] imonobenzenesulfonate and tablet to tablets weighing 100 mg. The regeneration solution has properties similar to those of Example 1. '

Vynález možno využiť všade, kde je potřebné stanovit rýchlo a poměrně presne obsah bielkovín hlavně v biologických roztokoch, zvlášť pre diagnostické účely. Dá sa však využiť i v priemyslovej praxi pri medzioperačnej kontrole najma substrátov obsahujúcich vodorozpustné bielkoviny.The invention can be used wherever it is necessary to determine rapidly and relatively accurately the protein content, especially in biological solutions, especially for diagnostic purposes. However, it can also be used in industrial practice for in-process control, in particular of substrates containing water-soluble proteins.

Claims

OBJECT OF THE INVENTION

Preparation of tablet Spčsob assay to determine koncentrácle proteins in biological fluids, characterized in that in a first step, the dye solution was prepared 3- ^[N_et yl ^_N / 3 ~ -methyl "4 / £ 4 - (- etoxyanillno) phenyl-2-methyl- 4- [N-ethyl-N [3- (sodium sulfonate) phenyl methyl] aminophenyl) / methylene-2,5-dimethyl-2,5-cyclohexadiene-1-ylidene / 1H imonobenzenesulfonate, or 3 ' J] N- ethyl-N- [3-hydroxymethyl-4- [4- (4-ethoxyanilino) phenyl] -2-hydroxymethyl-4- (N-ethyl-N) -3- (sodium sulfonate) phenylmethyl] aminophenyl-4-methylene -2,5-dihydroxymethyl-2,5-cyclohexadien-1-ylidene / 2-aminobenzenesulfonate at a concentration of 2 to 5% by weight in an organic solvent mixed with water, preferably in methanol and / or ethanol and / or aqueous solutions thereof, in a second step, the solution is poured onto microcrystalline cellulose, wherein the weight ratio of dye solution to microcrystalline cellulose is not more than 0.7 to 1.0, after which the micro the crystalline cellulose is dried at a temperature of 20 to 100 ° C, passed through a 0.5 mm diameter CK sieve and, in a third step, 10% by weight sodium chloride 10% by weight and 2% talc are added to the dried microcrystalline cellulose with sorbed dye. % by weight, homogenized and tableted to tablets weighing 100 to 200 mg.