CS220789B2

CS220789B2 - Diagnostic means for evidence of the leucosyte in the body liquids

Info

Publication number: CS220789B2
Application number: CS794249A
Authority: CS
Inventors: Dieter Berger; Franz Braun; Gunter Frey; Werner Guthlein; Wolfgang Werner
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1978-06-20
Filing date: 1979-06-20
Publication date: 1983-04-29
Also published as: HU179435B; YU142679A; EP0007407A1; EP0007407B1; JPS631347B2; US4331760A; DE2826965A1; DE2960421D1; CA1129848A; ATE90T1; JPS552992A; ZA793037B

Description

Důkaz leukocytů v tělesných tekutinách, obzvláště v . moči, zaujímá přední místo v diagnostice onemocnění ledvin a urogenitálníhia traktu.

Dříve se prováli tento ^důkaz tožkopádným spoeítámm leukocytá · v neodstře^né moči nebo v močovém sedimentu. Obě metody jsou povahou obecné, protože zachycují jen intaktrn ^leukoc^yt^y. Na ^dru^hé straně je známo, že rychtos-t rozpad teukocytůí je podle prostředí moči enormě kolísavá, ta^kže se musí počítat napřfclad v shně a^lkaric^ké mioci s ^poločasem rozpa^du leukocytó jen 60 minut. U nízkého počtu leukocytů nebo u delšího, stání moči jsou následkem i zkresleně negativní nálezy.

Nehledě k chybě způsobené rozkladem ^leukoc^ytů^, poskytuje kvantitattvní mikroskopick^é stanovení ^leukoc^ytů v neodstíetlén^ nehom!o!genizoivan.^é moči v počrtam ^kom^ůrce velmi spolehlivé hodnoty. V praxi se používá tato. metoda však jen zřídka, protože je obtížná, únavná a zabírejte! mnoho· času a podmiňuje · nasazení školného· personálu.

Převládající počet stanovení leukocytů v moči s|e provádí v lékařské praxi podle tak zvané metody zorného pole v sedimentu moči. Pro totto stanovení se musí nejprve získat odstředěním sediment. Přitom se však koncentrují tak^é ostatrn ’slo^žky močí^{, k}teré — jako například epithelové buňky a soИ — . mohou .· značně ztěžovat mlkrostopcké sčítání · leukocytů. Kolísající obsah s^dim^nnehomogenizovaný sediment a různá mtooskopcka zvření nebo r'ůzn^é optíc^kévybavení mikroskopu vede k tomu, že obv^yk^lé „kvantitativní“ stanovení ^počtu teukocytů na mikroskopické zorné pole může být zatíženo chybami několika set procent.

Úkolem v^yn^álezu je ^proto ^připravit ^diagniostický prostředek, se kterým se může jednoduchým a snadno· zvládnutelným způsobem · a pokud možno rychle a úplně dokázat leukocyty v tělesných tekutinách.

^principem ^důkazu ^pro tyto zkou^šky teukocytů může být enzymatická reakce, protože leukocyty mají široce rozvětvené enzymatické spektrum.

V US patentu č. 3 087 794 je již popsán a nárokován· důkaz leukocytů, který · byl veden přes penoxidickou aktivitu granulocytických leukocytů. Savý nosič, který je impregnován peroxidem vodíku a organickým indikátorem, například o-tolidinem, ukazuje ^přítomn,ost ^leu^kocytů vytvořerám barevnéhb ox^iidačn^ího ^produ^ktu. Tato zkouška má však podstatné nevýhody. Na jedné straně mají pe^oxidické reakce zcela obecně oproti . redukujícím látkám v moči, jako napří^kl'ad oproti ^kyselin^ě askorbové značnou ^poruchovost. Na druhé straně jsou v literatuře (viz. na^p^^íklad L. МеШв^ Med. Welt 23, 399 /1972/) zmínky o nestabilitě peroxidázy leukocytů v prostředí moči, která dává podnět k nesprávným nálezům.

Kolorimetrické průkazní metody, které ^s^oči^v<a;j^í na esterotytické aktivité enz^ym^ůpřítomných vie stanovených . systémech, mají několik tet sivé stóte místo v hstochemic^ a cytochemlcké enzymologii (shov, například A. G. E. Pearse, Histochemistry, Theoretical . and . Appl^edl. V principu se použijí při této metodě bezbarvé nebo slabě zabarvené estery, které se rozloží enzymatickým štěpením většinou na bezbarvou kyselinovou a případně bezbarvou alkoholovou (fenolovou) složku. Posledně jmenovaná složka se potom nechá reagovat po enzymatickém zmydelnění na barevné produkty (například kopulace s diazoniovymi solemi nebo oxidační reakce).

F. Schmalzl a H. Braunsteiner popisují V Klín. Wscher. 46. 642 (1968) sp^(^i:fický cytochemický důkaz leukocytoesterazy naftotem-AS-D-c.hloir-acetátem jako substrátem a diazoniovou solí pro vytvoření barevné azosloučeniny.

Pro diagnostický prostředek k rychlému a jednoduchému důkazu leukocytů v tělesných tekutinách, jako například v moči, nejsou dvousložkové systémy tohoto druhu vhodné, protože jak známo reaguje mnoho sloučenin přítomných v moči, jako urobilinogen, sterkobilinogen, bilirubin . aj. s . diazoniovými solemi. Kromě toho je tento důkaz . můO cit^livý^, napnMad vzorky s 50^lC° teukocyty/^l neukazují ^žádnou reakch

Nyní bylo neočekávaně zjištěno, že se získá stabilní a rychle ukazující diagnostický prostředek, se kterým se dobře dokáží leukocyty v tělesných tekutinách, když se použije jako substrát k důkazu esterázy přítomné v neutrofilních leukocytech- granulhcytech sulfonftaleinový ester;

Předmětem vynálezu . je diagnostický prostředek k důkazu leukocytů v . tělesných tekutinách, ..sestávající» ze . savého nosiče, .. který je . impregnovaný chromogenemt a . vhodným ^který se v^yznačuje t^ že jako chromogen se. použije· sulfonftalemový ester obecného vzorce I

ve kterém

Ri znamená zbytek alifatické karboxylové kyseliny s 1 až 4 atomy uhlíku nebo benzo^y1, ^ípataě substituovaný ^halo^genem^, s vý hodou -chlorem a bromem, nebo alkoxyskupinou s 1 až 5, s výhodou 1 až 3 atomy uhlí^ku, zb^yte^k přfrodtá L-^a-amino^kysellny nebo dipeptidový zbytek opatřený na dusíku ochrannou skupinou jako acylovým zbytkem,

Rz - znamená atom halogenu, s výhodou chloru a bromu, - nebo azylovou slkupmu s ¹ až 5 s výhodou ¹ a^{ž 3} atom^y uhlto^

R3 a Ri, které mohou být stejné nebo rozdílné, znamenají vodík nebo atom halogenu, s výhodou chlor nebo- brom.

Sulfonftaleinové estery obecného vzorce I jsou většinou nov^é sloučeniny. Z literatury je ^pouze známý ^díacet^yl-3‘^,5‘^,3“^,5“-tetrabromfenolsulfonftalein ( = bromfenolová modř — díacetát) a dibenzo^yl-³‘,⁵‘^,3“^,5“-tetrabnomfenollsUfonftalein [= hnomfenolová modř — dibenzoiát), W. R. Orndorf,

F. W. Sherwood, J. Amer. Chem. Soc. 45, 486 (1323).

Nové sulfonftaleinové estery mají obecný vzorec I‘

ve kterém

Rz, Rí a Ri mají výše uvedený význam a Ri‘ m^á stejný význam ja^ko R^ av^ša^{k p}ro případ, že Rz a R3 představuje atom bromu a R4 atom vodíku, neznamená acetyl nebo benzcyl.

Příprava sloučenin se může provádět podle známých metod tak, že se nechají reagovat příslušné, známé sulfonftaleiny obecného vzorce II

ve kterém,

R2^, R³ a ^{- - R}i maj^í vý^še uvedený význam^, s kyselinami obecného vzorce III

HO^—R¹‘ (IHL ve kterém ^Ri‘ m^á výše uvedený význam^, nebo^- s vhodným reaktivním derivátem.

Jako reakttvrn deriváty se použijí zvlá^é příslušné anhydridy kyseliny - karboxylové nebo chloridy kyseliny karboxylové, případně za přídavku - terciárních aminů. K přípravě esterů aminokyseliny a peptidu se použijí s^ynt^ézm metod^y obv^yklé v cliemii pepUá.^ jako například metody založené na směsného anhydrldu a chloridu kyseliny.

Jako ha^lo^gen v substituentu ^Ri‘, ^R3 a Ri se -rozumí fluor, chlor a brom, - s výhodou chlor a brom.

„AJkoxyskuprna“ v substituento ^Ri nebo ^Ri‘ a „alk^ylová skupina“ substitueníu ^Rz obsahuje 1 -až 5, s výhodou 1 až 3 - atomy uhlíku, přičemž je obzvláště výhodná methoxyskupina nebo methylová skupina.

Jako zbytk^{y k}arbox^ylové ^kyselⁱn^y substi^tuentu Ri nebo ^Ri‘ přicházej! v úvahu zb^ytky alifatických karboxylových kyselin s 1 až 4 atomy uhlíku, nebo také aromatických karboxylových kyselin, jako například, benzoové kyseliny. Obzvláště výhodné - jsou acetylové, propionylové -a benzoylové zbytky.

Jako zbytky a^jinokys^hny substituentu Ri nebo Rl‘ jsou výho^dn^é zbytky pírodm^ L-a-aminokyselin, obzvláště L-alaninu, L-fenylalanlnu, L-lysinu, L-tynosinu, L-argininu, které mohou býh substituované nitroiskupinou^, a jejichž -eventu^áln^ě pritomM h^ydrloxylová skupina má na kyslíku ochrannou skupinu, například acetyiovciu skupinu.

Jako peptidový zbytek v definici substituentu. Ri nebo ^Ri‘ se rozum^{í d}lpept^idy, při^čem^ž jako amínotyselma se použj vý^še uvedené aminokyseliny.

Sulfonftaleinové estery vzorce I použité ^po^dle vynátezu jako c^hromo^gen^y se použijí v koncentraci ^1O~^{4 až} Эд“¹ mol^! s výhotou 10^_3 a^{ž 10}~² mol/^1 mpre^ačního roztoku.

Další složkou diagnostického - prostředku k důkazu leukocytů je vhodný pufrový systém. Jako pufr přichází například v úvahu fosforečnan, barbiturát, borltan, tris-(hyroxymethyl) -amino-methan, 2-amino-2-methylpropan-l^,3-^díol nebo aшino^kyselina^{, při}čemž hodnota pH a kapacita se musí zvolit tak, aby se po ponoření zkušebního proužku do tělesné tekutiny upravilo pH na hodnotu 6 až 10, s výhodou 7 až 9.

^Dále je výho^dn^{é p}oužít při pripravé ^d1agnestického prostředku podle vynálezu k důkazu ^leukoc^yt^ů v tělesnýc^{h -} te^kutmách j‘e^ště tonsto^ protože se ta^k m^ůže dosiáhnout krat^ší -reakěrn ^dob^y.

2 0 7 8 3 minutách, minutách^

10> minutách, minutách.

S výhodou se použijí kationaktivní smáčecí prostředky, jako například kvartérní pyridiniové soli v koncentraci 0,0'5 až 2 %, s výhodou 0,1 až 0.5 °/o.

Pro přípravu diagnostického prostředku podle vynálezu se s výhodou impregnuje savý. nosič, jako například filtrační papír, celulóza nebo viskózové rouno, roztokem potřebných reagencií, obvykle používaných к přípravě zkušebních proužků (substrát, pufr, případně tensidy nebo· také zahušťovadlo, jako například polyvinylpyrolidon, karboxymeťhylcelulóza a škrob, stabilizační prostředek, například aminokyseliny, barvivo pozadí, například tartrazin atd.) v snadno-těkavých rozpouštědlech, jako například vodě, methanolu.; ethanolu nebo acetonu. Toto· se provádí ve dvou oddělených stupních. Nejprve se imp-regnuje vodným roztokem, který obsahuje pufr. Potom se impregnuje roztokem substrátu к důkazu esterázy obecného vzorce I. Ve speciálních případech se může také použít opačný pc-stup impregnace. Hotové zkušební papírky se použijí jako takové nebo se známým způsobem přilepí na držátko nebo se podle DE patentu č. 2 118 455 navaří s výhodou mezi plastickou hmotu a jemnou mřížku.

Získá se diagnostický prostředek, který -po ponoření do zkoumané tělesné tekutiny ukáže rychle a jednoduchým způsobem pomocí barevné reakce přítomných leuko-cytů. Protože zůstane aktivita esterázy přítomné v neutrofilních leukocytech — granulocytech plně zachována také po rozkladu leuko-cytů, mohou se diagnostickým prostředkem stanovovat jak intaktní, tak rozložené leukocyty. Chyba rozpadem nepřichází v úvahu.

Příklad 1

Filtrační papír (například Schleicher -f 4- Schúll 213 SL) se postupně impregnuje následujícími roztoky a potom se suší při 60 °C:

Roztok 1 tris-(hydroxymethyl jaminomethan 0,61 g kyselina solná, C,1 N cca 5 ml destilovaná voda do 1-00 ml

Roztok se upraví 0,1 N kyselinou solnou na hodnotu pH 9,0.

Roztok 2 diacetyl-4, '5,6,7,3‘,5‘,3“ 5“-oktabromfenolsulfonoftalein (= tetrabromfenolová modř idiacetát) 0,107 g aceton, do· 100 ml

Získá se bílý zkušební papír, který po ponoření do moči obsahující leukocyty se zabarví modře.

Může dokázat:

5000 leukocytů/μΐ moči v cca

2000 leukocytů/μΐ moči, v cca 1000 leukocytů/μΐ moči v cca

500- leukocytů/μΐ moči v cca

Citlivost zkoušky leží asi při 500 leukocytů/μΐ;

Zkušební papírky s podobnými vlastnostmi (citlivost. 300 až 1000 leukocytů/μΐ) se získají, když se použijí místo diacetyl-4-5,6,7,3‘,5‘,З^и,5^и-Ю1к1аЬготГепо18иКопЙаг leinu (.= tetrabromfenolové modři-diacetátu) následující substráty.:

a) Diacetyb3‘,3“-dichlorf enolsulfonf talein (= chlorfenolová červeň diacetát) poskytuje při ponoření do moči obsahující leukocyty červený reakční produkt.

b) Diacetyl-5‘,5“-dibrom-o-kresolsulfonftalein ( = bromkresolový purpur diacetát) poskytuje purpuro-vě zbarvený reakční produkt.

c) Diacety-3^t,5^t,3^u,5^u-tetrabromfenolsulfonftalein ( = bromfenolová modř diaceton) poskytuje modrý reakční produkt.

d) Diacetyl-3\3“-dibrom-5‘,5“-dichlorfenolsulfonfLalein ( = bromchlorfenolová modř diacetát) poskytuje modrý reakční produkt.

e) Diacetyl-4,5,6,7,-tetrabrom-3‘,5‘,3“,5^U-tetrachlorfenolsulfonftalein (= tetrabromtetrachlorfenolová modř diacetát) poskytuje modrý reakční produkt.

f) Dichloracetyl-3‘,3“-dibrom-5‘,6“-dichlorfenolsulfonftalein (= bromchlorfenolová modř dichloracetát) poskytuje modrý reakční produkt.

g) Dichloracetyl-3^t,5^<,3^u,5^u-tetrabromfenolsulfonftalein ( = bromfenolová modř dichloracetát) poskytuje modrý reakční produkt.

h) Dichloracetyl-4,5,6,7,3‘,5‘,3“,5“-oktabro-mfenolsulfonftalein ( = tetrabromfenolová modř dichloracetát) poskytuje modrý reakční .produkt.

i) Di-(2-methoxypropionyl)-^^^^^‘^‘^‘‘^“-oktabromfenolsulfonftalein /= tetrabromfenolová modř di-(2-methoxyprop-ionát)/ poskytuje modrý reakční produkt.

j) Dibenzoyl-4,5,6,7,3‘,5‘,3“,5“-oktabromfenolsulfonftalein (= tetrabromfenolová modř dibenzoát) poskytuje modrý reakční produkt.

224'789

Př-íkla-d· 2

Filtrační papír· (např. Schleicher· + Schůll 23 · SLj, se postupně · impregnuje· následujícími roztdky a potom se suší při 6Ό· °C:

Roztok 1 di-natrium-tetrabor^át-deka.h^ydr^át · 1,91 g k^yselina solná · 0,1·· N* coa- 20 · m¹ vo^da destitovan# do lOO.ml

Roztok se upraví 0,1 N kyselinou solnou · na hodnotu pH 9,0.

Roztok 2 di- ·( N-benzyloxykarbonyl-L-f enylalanyl) ^^^“^“-tetrabromfenols.ulfonftaten ' /= di- (N-benzyloxykartbmyii-L-fenylala* n^y1) ^brom^fenolová · modř/ 0,123 · g aceton, do 100 · ml

Získá se bílý zkušební papír, který se při ponoření do moči obsahující leukocyty po cca 10 minutách modře zbarví. Citlivost zkoušky je asi při 1000 leukocytech/μΐ.

Zkušební' papírky s. · podobnými vlastnostmi · (oitlivostÍ 800· až · ³0·00 · teukocytá/ulj · se získají, když · se · použijí místo· di-(N-benz.y.loxykrrbonyl-L-^fenylalrnylj-3‘,5‘^,3“,^,5“-^te^trrbromfenolsujfonftr1einu následující substráty, přičemž se získají ve všech případech při ponoření · do · · moči · obsahu jící i leukocyty · modré reakční· produkty.

a j · Di· (N-benzyloxy karbonyhL-alany! j -3‘^,5‘^,3“^,5“-tetrabrom^fenolsu^1fon^ftrlein · /= dl·(:N*benzyloxykarbonnl'1I--alannl·j-bromíenolová' modř/ b ] · Dii(Na,N«-di'benz'^loxy:kar.bon'^.l-L-lysylj ^r3‘^,5‘_r3“,5 “-tetrabromtenolsulfonf talem · /= di (Na.Ntt-dlbenzyJoxyk-aBbonyl-L-lysylj ' bromfenolová c j Di i(N-benzyloxy:karbonyl-O-acetyl-L-tyrosylj ^‘^‘^-“^“-tetrabromfenolsulfonftalein /= di (N-benzyloxykarbonybC--acety--L·-tyrosyl·) bromfenolová'· modř/ d j Di {-N-benzykoxykarbonyl-N-ethoxykarbonylO-ace t^^t^l^'^^-^t^yros^yl · j-3‘,5’,³“^,5“-tétrabromfenolsulfonf talein /== di( N-benzyloxylíarbonyl-N-ethoxykarbony1-O.-acetyl1L·-tyrosyl·jbr·onluno1ová · modř/ e j Di (N^-benzWoxykarbonyl-Mwuiirro-L· -ar^gin^yl j-3‘,5^<,3“^,5“-tetrrbromfunolsulfonftrlein ^/= ^di (N a-benzy Loxylk-ar hony b^-nitro-L-arginyl^lj^bromfeno^lová · modř/ fj Di- (N-^b^nιi^5^t(^)^l^l^;^r^bony1-I,-rιl-^n^y1lLL·alaiiyl]-3\5\3“,5“-tetrabromfeiiols'ulfoiiftalein ^/= di(N-^benz^ylofc^ykar^bon^yl-^L-a^lani^yl-^L-alan^ylj bromfenolová modř^/ gj Di (N-benzyJ<oxyкarbon у.1-L-a lan-yl -) _r-áSAy^.S^^S^uktabrtjmfenolsulí onftalein· ^/ = di (N-^benzy^loxykarbonyl-^L-alany^l ] tetrabromfenolová · modř/

Příklad·3

Filtrační papír (například Schleicher + + Schůll 23 SLj. se · postupně · impregnuje následujícími roztoky a potom se suší · prii 60 °C:

Roztok 1 trisíhydroxymethtliaminomethan · 0,61 g kyselina solná, 0,1 N cca·' 5 ml laurtlpyridiniiumchlorid 0,2· g destilovaná voda do· 100 ' ml

Roztok: se · upraví 0,1; N kyselinou · solnou na hodnotu p-H 9,0.

Roztok 2-.

DiacetyMí^J^.^.S^^-oktabromfenolsulfonftalein (·=> tetrahromfenolová · modř diacetetj · 0^,107 · ^gaceton, · do 100 ml

Získá · se·· bílý · zkušební papír, který · se · při ponoření do · moči · obsal^i^^jící· leukocyty · asi po· 1· minutě· zabarví; modře. Citlivost zkoušky · je· · asi pí SOfádukoovteclh/uL·

Také · s · dalšími substráty příkladu· 1· a 2 se· získ-ají · se · smáčedl-em, · jako· · například · výše· použitým · laur^t^'lp^t^^ri^dinu^n^(^řltoi’’k^e^m; zkušební' papírky, které· mají · oproti analogickým: zkušebním · papírkům.· bez smáčedla o· polovinu kratší r^eakční^^^bu.

Příklad 4

Diacety¹-4,^5,6,7,3‘,5‘^,3“.5“-ok.trbromfunolsulfonftalein (= tetrabriomfenodlová modř diac^^.átj

5,0 · g · (5· mmoluj tetrabTiomfenolové · modři se rozpustí při zahřívání v 54 · g · [; tj. 50 mililitrů (0,45 · molujjčerstvě destilovaného acetanhydndu a zahnvá se 3 h ^pod · zpětným chladičem. Po zahuštění roztoku ve vakuu se · rozmíóhá^:olejjovitý · zbytek · s · malým . množstvím isoproipamolu a překrystaluje · se · z toluenu. Získaný · diiacetát·. taje při · 166 až 167· °C a obsahuje ·· 2 moly · krystalické · kyseliny octové, které se odstraní sušením při 60 °C za přítomnosti· kysličníku· fosforečného. Získá se ^{4,2 g} = ⁷7^,4· % tetrabromfunotové modři diacetátu, bezbarvé'· krystaly, t. t. 174· °C (rlozkLj.

Analio^gickým z^působem se· získají' z' ^příslušně substituovaných ^lunols^dfonltα¹uinů následnicí ^Slomcei^'tny:

И

a) Diacetyl-3‘,3“-dichlbrfenolsulfonftalein (chlorfenolová červeň diacetát), bezbarvé krystaly, t. t. 132 °C (rozkl.)

b) Diacetyl-5‘,5“-dibr|om-o-kresolsulfonftalein (= brlomkresotový purpur diacetát), bezbarvé krystaly t. t. 117 °C (rozkl.)

c) Diacetyl-3‘,3“-dibriom-5‘,5“-dichHorfenolsulfonftalein (|= bnomchliorfenolová modř + diacetát), bezbarvé krystaly, t. t. 217°C (rozkl.)

d) Diacetyl-4,5,6,7-tetrabrom-3‘,5‘,3“,5“-tetrachlorfenolsultonftalein (= tetrabromtetrachlorfenioilová modř diacetát), bezbarvé krystaly, t. t. 253 až 254 stupňů Celsia (rozkl.).

Příklad 5

Dichloraoetyl-4,5,6,7,3‘,5‘,3“,5“-oktabromfenolsulfonftalein (= tetrabriomfenolová modř dichloracetát)

К roztoku 5,0 g (5 mmolů) tetrabromfenlolové modři ve 100 ml absolutního tetrahydriofurahu se přidá za míchání 0,81 ml (10 mmolů) absolutního pyridinu a za chlazení se přikape při 10 °C roztok 1,18 g [ tj 0,79 ml (10,5 mmolů)] čerstvě destilovaného chloracetylchlioridu ve 3 ml absolutního tetrahydrofuranu. Po 2 hodinách míchání při teplotě místntostl se vytvořený pyridin-hydrochlorid odsaje a filtrát se odpaří ve vakuu při 50 °C. Získá se 6,1 g olejovitého zbytku; tento zbytek se vaří s 50 ml isopropanolu, nerozpustné částky se oddělí. Po ochlazení v ledové lázni se ižoluje 3,9 g (68,7 %) tetrabromfenolové modři dichloracetátu, slabě nažloutlých krystalů, t. t. 226 až 227°C (rozkl.).

Analogickým způsobem se získají z příslušně substituovaných fenolsulfonftaleim' a příslušných chloridů kyseliny následující sloučeniny:

a) Dlchloracetyl-3^,,5‘,3“,5“-tetrabromfenolsulfonftalein (·— bromfenolová modř dichloracetát), bezbarvé krystaly, t. t. 206 až 207°C (rozkl.)

b) Dichloracetyl-3‘,3“-dibrom-5‘,5“-dichlorfenolsulfonftalein [= bromchlorfenioitová modř dichloracetát), bezbarvé krystaly, t. t. 172°C (rozkl.)

c) Dl- (2-methoKypropionyl) -4,5,6,7,3‘,5‘,3“,5“-oktabr,omfenolsulfonftalein /== tetrabromfenolová modř di-(2-methoxypropilonát)/, bezbarvé krystaly, t. t. 214 až 216°C (rozklad).

d) Dibenzoiyl-4,5,6,7,3‘,5‘,3“,5“-oktabriomf enolsulf oni talein (·= tetrabromfenolová modř dibenzoát), bezbarvé krystaly, 1.1. 196 až 197 °C (rozkl. j.

Příklad 6

Di- (N-benzyloxykarbonyl-L-alanyl) -3‘_l5‘,3“,5“-tetrabrlomfenlolsulfonftalein /= di- (N-benzyloxykarbonyl-L-alanyl) bromfenolová modř/

Roztok 1

Pro přípravu směsného anhydridu se rozpustí 3,13 g (14 mmol) N-benzyloxykarbonyl-L-alaninu v 50 ml absolutního tetrahydrofuranu, přidá se 1,93 ml (14 mmolů) triethylaminu a ochladí se na —15 až —20 °G. Potom sie připepituje za míchání 1,34 ml (14 mmolů) ethylesteru kyseliny chlormravenčí a reakční směs se nechá za vyloučení vody 20 až 30 minut v chladné lázni.

Roztok 2

4,69 g (7 mmolů) bromfenolová modři se rozpustí v 45 ml absolutního tetrahydrofuranu a (ochladí se na —10 až —15 °C.

Reakce

Triethylaminhydrochlorid vyloučený z roztoku 1 při tvorbě směsného anhydridu se rychle odsaje a filtrát se přidá к roztoku 2. Přidají se ještě 2 ml pyridinu a za nepřístupu vlhkosti se míchá při —15 °C, přičemž pomalu uniká kysličník uhličitý.

Asi po 2 hodinách se přidá podruhé, asi po 16 hodinách potřetí, stejné množství čerstvě připraveného odsátého směsného anhydridu (roztok 1) a míchá se potom ještě asi 5 hodin při —15 °C.

Potom se reakční směs zpracuje tak, že se přidá několik kapek vody (k rozkladu přebytečného anhydridu) a rozpouštědlo se oddesťiluje ve vakuu. Zbytek se rozpustí ve 100 ml octanu a postupně se promyje 30 ml 1 N roztoku kyseliny citrónové, 20 ml vody, 70 ml 7°/p roztoku hydrogenuhličitanu slodného а 2X 25 ml vody. Po sušení síranem sodným se octanová fáze odpaří ve vakuu. Získá se 11,3 g nažloutlého, lepkavého surového produktu, který se čistí sloupcovou chromatografií na silikagelu za použití směsi toluen-dioxan-octan (9:2:1).

Získá se 5,5 g (68 %) di-(N-benzyloxykarbonyl-L-alanyl )-3‘,5‘,3“,5“-tetrabromfenoilsulfonftaleinu jako bezbarvého, amorfního prášku, a_D20 = —33,6 °C (с = 1 %, methanol).

Plodle analýzy obsahuje sloučenina ještě 0,39 molu vody, 0,19 molu dioxanu, 0,60 molu toluenu.

22'0789

Analogickým způsobem se získají následující sloučeniny reakcí příslušně substituovaných fenolsulfonftaleinů s různými aminokyselinami:

a) Di- (N-benzyloxykarb!onyl-L-fenylalanyl)-3‘,5^s,3“,5“-ťetrabr'omfenolsulfoinftalein /= di- (N-benzy.lioixykarbonyl-L-fenylalanyl ) brcimfenotová modř/, bezbarvý amorfní prášek, a-_D20 = —33,5 °G (c = 1 o/o, ethylacetát)

b) Db (К«,Ы«-й1Ьепгу1охукагЬопу1-Ь-1уsyl)-3‘,5‘,3“,5“-tetrabromfenolsulfonftalein /= di- {Να,Νω-dibenzylOKykarbonyl-E-lysyljbrOTnfenoloivá modř/, bezbarvý amorfní prášek, аь²⁰ = —15°G (c = 1^! %, ethylacetát) c j Di-(N-benzylioxykarbonyl-O-acetyl-L-tyrosyl) -3‘,5‘,3“,5“tetrabromfenolsulfoinftalein /= di- (N-benzyloxykarbonyl-O-acetyl-L·-tyrosyljbromfenolová modř/, bezbarvý, amorfní prášek, který obsahuje 0,6 ml octanu, a_D ²⁰ = —35,3 °C (с = 1 %, ethylacetát)

Jako vedlejší produkt přitom ještě vznikne:

Dl- (N-benz.ylOK^ykarbonyl-N-ethoxykarbonyl-O-acetyl-L-tyrosy 1) -3‘,5‘,3“,5“-tetrabromfeniolsulf oni ta lein /= di- (N-benzylOKykarbonyl-N-ethoxykarbonyl-O-acetyl-L-tyrlosyl) bromfenolová modř, bezbarvý, amorfní prášek, a_D ²⁰ = —19,5 stupňů Celsia (c — 1 %, ethylacetát)

d) 01-(М-Ьепгу1о1хукагЬопу1-Ь-а1апу1)-4,5,6,7,3‘,5‘,3“,5“-oktabromfenoIsulfo'nftalein /= di- (N-benzytoxykarbonyl-L-alanyl J tetrabromfenolová modř/, bezbarvý, amorfní prášek, «o²⁰ = —28,7 °C (с = 1 % methanol).

Příklad 7

Di- (N-benzyloxykarbonyl-L-alanylJ-3‘,5‘,3“,5“-tetrabromfen01sulfonftalein /= di- (N-benzyloixykarbiotnyl-L-alanyl-L-alany 1) bromfenollová modř/

Roztok 1

Pro přípravu chloridu kyseliny se podle jedhostupňové metody rozpustí 1,18 g (4 mmolů) N benzyloxykarbonyl-L-alany 1-L-alaninu v 10 ml absolutního dimethylformamidu a ochladí se na —30 °C. Potom se za míchání a chlazení připipetuje 0,32 ml (4,4 mmolu) thionylbhloridu a reakční směs se nechá 30 minut za vyloučení vody v chladicí lázní (—30 °C).

Roztok 2

1,34 g (2 mmolu) bnomfenolOvé modři se rozpustí 10 ml absolutního dimethylformamidu a ochladí se na —10 až —20 °C.

Reakce 2

Roztok 2 se přidá к roztoku 1, přidá se 1 ml pyridinu a 2 hodiny se míchá při —10 až — 20 °C, potom 2 hodiny při teplotě místnosti. Stejná množství čerstvě připraveného chloridu kyseliny (roztok 1) a pyridinu se přidají celkem ještě 3X, přičemž se vždy zachovají výše uvedené reakční podmínky.

Reakční směs se potom odpaří ve vakuu doi sucha a potom se dále zpracuje jak uvedeno v příkladu 6.

Získá se 2,67 g amorfního surového produktu, který se čistí sloupcovou chromatografií na silikagelu za použití směsi heptan-ethylester kyseliny octové v poměru 1:2.

Získá se 1,4 g (57 %) di-(N-benzyloxykarbonyl-L-alanyl-L-alanyl )-3‘,5‘,3“,5“-tetrabromfenoisulfonftaleinu jako bezbarvého, amorfního prášku, který obsahuje 0,6 molu ethylesteru kyseliny octové; a_D20 ₌ _5,9°c (c — 1 %, ethylacetát).

Analogickým způsobem se získá následující sloučenina:

a) Di- (Nia-benzyloxykarbonyl-Nw-nitrlo-L-arginyl) -3‘,5‘,3“,5“-tetrabromfenoilslulfonftalein /= ďl- (Na-benzyloxykarbonyl-Nw-nitro-Larginyl) bromfenolová modř/, bezbarvý, amorfní prášek, který obsahuje 0,6 molu chloroformu, .a_D ²⁰ = —12,0°C (c = %, ethylacetát).

Claims

Diagnostický prostředek к důkazu leukocytů v tělesných tekutinách sestávající ze savého nosiče, který je Impregnovaný chronrogenem a vhodným pufrem, vyznačený tím, že jako chriomiogen se použije sulfonftaleinový ester obecného· vzorce I ve kterém

Ri znamená zbytek alifatické karboxylové kyseliny s 1 až 4 atomy uhlíku nebo· benzoyl, případně substituovaný halogenem, s výhodou chlorem a bromem, nebo altooxyskupinou s 1 až 5, s výhodou 1 až 3 atomy uhlíku, zbytek přírodní L-a-aminokyseliny nebo· dipeptidoivý zbytek opatřený na dusíku ochrannou skupinou, jako acyliovým zbytkem,

R2 znamená atom halogenu, s výhodou chloru a brlomu, nebo alkylovou skupinu s 1 až 5, s výhodou 1 až 3 atomy uhlíku,

R3 a R4, které mohou být stejné nebo rozdílné, znamenají vodík nebo atom halogenu, s výhodiou chlor nebo brom.