HU179435B - Diagnostical instrument for detecting leukocytes in body-liquides and process for producing reagents for the colourreactions - Google Patents

Diagnostical instrument for detecting leukocytes in body-liquides and process for producing reagents for the colourreactions Download PDF

Info

Publication number
HU179435B
HU179435B HU79BO1792A HUBO001792A HU179435B HU 179435 B HU179435 B HU 179435B HU 79BO1792 A HU79BO1792 A HU 79BO1792A HU BO001792 A HUBO001792 A HU BO001792A HU 179435 B HU179435 B HU 179435B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
halogen
amino acid
formula
leukocytes
optionally substituted
Prior art date
Application number
HU79BO1792A
Other languages
English (en)
Inventor
Dieter Berger
Franz Braun
Guenter Frey
Werner Guethlein
Wolfgang Werner
Original Assignee
Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Mannheim Gmbh filed Critical Boehringer Mannheim Gmbh
Publication of HU179435B publication Critical patent/HU179435B/hu

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5094—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for blood cell populations
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D327/00—Heterocyclic compounds containing rings having oxygen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D327/02—Heterocyclic compounds containing rings having oxygen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms one oxygen atom and one sulfur atom
    • C07D327/04—Five-membered rings
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Ecology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Heterocyclic Compounds Containing Sulfur Atoms (AREA)
  • Low-Molecular Organic Synthesis Reactions Using Catalysts (AREA)

Description

Diagnosztikai eszköz leukociták kimutatására testfolyadékokban és eljárás az ehhez megfelelő színképzők előállítására
2
A leukociták kimutatása testfolyadékokban, különösen vizeletben kiemelkedő szerepet foglal el a vese és az urogenitális traktus megbetegedéseinek diagnosztikájában.
Ezideig ezt a kimutatást a leukociták centrifugálatlan vizeletben vagy vizelet-üledékben való fáradságos számlálásával végezték. Mindkét módszerben természetesen közös, hogy csak intakt Ieukocitákat vesz figyelembe. Másrészt ismeretes, hogy a leukocita-lízis sebességét a vizelet tulajdonságai befolyásolják, így például erősen lúgos vizeletben körülbelül 60 perces leukocita felezési idővel kell számolni. Túl alacsony leukocitaszámoknak illetve hosszabb vizelet-állásidőknek hamis negatív leletek a következményei.
A Hzis-hibától eltekintve a leukociták centrifugáiatlan, homogenizált vizeletben történő kvantitatív mikroszkópiás meghatározása számlálókamrában eléggé megbízható eredményeket szolgáltat. A gyakorlatban mégis csak ritkán alkalmazzák ezt a módszert, mivel fáradságos és időtrabló, és az alkalmazás iskolázott személyzetet igényel.
A vizeletből történő leukocitameghatározások túlnyomó többségét az orvosi gyakorlatban a vizeletüledékből végzik az úgynevezett látótér módszerrel. Ehhez előbb centrifugálással vizsgálati anyagot (üledéket) kell nyerni. Ekkor azonban a vizelet más alkotórészei is feldúsulnak, amelyek - így például a hámsejtek és sók - a leukociták mikroszkópos számlálását lényegesen megnehezítik. Kisebb üle déktartalom, az üledék inhomogenitása, valamint különböző nagyítások vagy a mikroszkóp eltérő optikai kiképzése azt eredményezheti, hogy a szokásos „kvantitatív” kifejezés a mikroszkóp látóterében 5 számolt leukocitákról a gyakorlatban többszáz százalékos hibát is takarhat.
A jelen találmány feladata ezért az volt, hogy olyan diagnosztikai eszközt szolgáltasson, amellyel a leukociták testfolyadékokban egyszerű és könnyen 10 kezelhető módon, valamint lehetőleg gyorsan és tökéletesen mutathatók ki.
Ilyen leukocitavizsgálat alapját egy enzimatikus reakció nyújtja, mivel a leukociták széles enzimspektrummal rendelkeznek.
A 3 087 794 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban már leírtak egy leukocitavizsgálatot, amely a granulocita leukocitákban meglevő peroxidáz aktivitásra vezethető vissza. Egy hidrogén-peroxiddal és valamilyen szerves indikátorral, 20 például o-tolidinnel impregnált szivóképes hordozó színes oxidációs termék keletkezésével jelzi a leukociták jelenlétét. Egy ilyen teszt azonban döntő hátrányokkal is rendelkezik. Egyrészt redukáló anyagokkal, így például aszkorbinsawal a vizeletben végbemenő peroxidáz reakciók jelentős zavarforrást jelentenek. Másrészt több irodalmi hivatkozás [lásd például L. Mettler, Med. Welt 23, 399 (1972)] található a leukocita-peroxidáz vizeletben való instabilitására vonatkozólag, ami hamis negatív leleteket eredményezhet.
!79435
Néhány éve hódítottak tartósan teret a hiszto- és dtokémiai enzimológiában olyan kolorimetriás kimutatási módszerek, amelyek a meghatározandó rendszerekben előforduló enzimek észteráz aktivitásán alapulnak. (Lásd például A. G. E. Pearsc, Histochemistry, Theoretical and Applied.). Lényegében színtelen vagy enyhén színes észtereket reagáltatnak, amelyek az enzimes hasításkor legtöbbnyire színtelen savkomponensre és szintén színtelen alkohol/fenol)- komponensre esnek szét. Az utóbbiakat azután az enzimes hidrolízist követő reakcióban színes termékekké reagáltatják (például diazóniumsokkal kapcsolva vagy oxidativ reakciókkal).
így például F. Schmalzl és H. Braunsteiner a Kiin. Wschr. 46, 642 (1968)-ban leírtak egy specifikus citokémiai leukocita-észteráz kimutatást, ahol szubsztrátként Naphtoi-As-D-klór-acetátot és a színes azo-vegyület képzéséhez valamilyen diazóniumsót használtak.
Leukociták testfolyadékokban, így például vizeletben való gyors és egyszerű kimutatására szolgáló diagnosztikai eszközként az ilyen fajta kétkomponensű rendszerek nem bizonyultak megfelelőnek, mivel a vizeletben előforduló sok egyéb vegyület, így urobilinogén, szterkobilinogén, bilirubin és egyebek, diazóniumsókkal szintén reagálnak. Ezért ez a módszer túlságosan érzéketlen. Például 5000 leukocita/gl esetén semmilyen reakciót nem mutatnak a minták.
Meglepően azt találtuk, hogy stabil és gyorsan jelző diagnosztikai szert kapunk, amellyel testfolyadékokban jól kimutathatók leukociták, ha a neutrofil leukocita-granulocitákban előforduló észterázok kimutatásához szubsztrátként szulfonftalein-észtereket alkalmazunk.
A jelen találmány tárgya ezért diagnosztikai szer, leukociták kimutatására testfolyadékokban, amely egy színképzővel és szokásos adalékanyagokkal impregnált szívóképes hordozóból áll, és az jellemzi, hogy a leukocitákban előforduló észterázok kimutatására szubsztrátként I általános képletű szulfonftalein-észtereket - a képletben
Rí jelentése valamely, adott esetben halogénatommal vagy' rövidszénláncú alkoxicsoporttal szubsztituált 1-5 szénatomos alifás karbonsav- benzoesav- vagy naftoesavgyök, benzoil-oxi-karbonil- vagy rövidszén· lánc ú alkoxi-karbonil-nitrogén-védőcsoporttal rendelkező aminosav- vagy 2-4 aminosavbó! álló peptid-gyök, emellett az aminosav- vagy peptidgyök adott esetben nitro- vagy O-acetil-csoporttal szubsztituált,
R2 jelentése halogénatom vagy valamely rövidszénláncú alkilcsoport,
R3 és R4 jelentése azonos vagy eltérő, éspedig hidrogénatom vagy halogénatom tartalmaz.
A találmány tárgya továbbá eljárás leukociták testfolyadékokban való kimutatására szolgáló diagnosztikai eszközök előállítására.
Az I általános képletű szulfonftalein-észterek nagyrészt új vegyületek. Az irodalomból eddig csak a 4’,4”-diacetil-3’,5’,3”,5”- tetrabróm-fenolszulfonftalein (=brómfenolként-diacetát) és a 4’,4”-dibenzoil-3’,5’,3”,5”-tetrabróm-fenolszulfonftalein (=brómfenolkék-dibenzoát) ismeretes. [W. R. Omdorff, F. W. Sherwood, 1. Am. Chem. Soc. 45, 486 (1923)].
A találmány további táigya eljárás Γ általános képletű új szül tonhaléin észterek előállítására - a képletben
R2, R3 és R4 jelentése az előbb megadottakkal azonos és Rí jelentése azonos Rí jelentésével, azzal a megkötéssel, hogy ha R2 és R3 jelentése brómatom és R4 jelentése hidrogénatom, akkor Rt acetil- vagy benzoil-csoporttól eltérő jelentésű.
Az I’ általános képletű új szulfonftalein-észterek előállítása önmagában ismert módszerekkel történik. Előnyösen önmagában ismert módon a megfelelő ismert II általános képletű szulfonftaleineket - ahol R2, R3 és R4 jelentése az előbb megadottakkal azonos - III általános képletű savakkal
- ahoi Rí jelentése az előbb megadottakkal azonos - illetve ezek alkalmas reakcióképes származékaival reagáltatjuk.
A karbonsav-észterek előállításánál reakcióképes származékokként főleg a megfelelő karbonsavanhidrideket illetve karbonsav-kloridokat használjuk, adott esetben tercier aminok hozzáadása közben. Az aminosav- és peptid-észterek előállításánál a peptidkémiában szokásos szintézismódszereket, így például a vegyes anhidrides és a savkloridos módszert alkalmazzuk.
Az Rí, R], R2, R3 és R4 jelentésénél említett halogénatomokon fluor-, klór- és brómatomokat, előnyösen klór- és brómatomot értünk.
Az Rí illetve Rí szubsztituensek jelentésénél említett „rövidszénláncú alkoxiesoport” valamint az R2 szubsztituens jelentésénél említett „rövidszénláncú alkilcsoport” 1-5, előnyösen 1- 3 szénatomot tartalmaz. Legelőnyösebb a metoxi- illetve metil-csoport.
Az Rí illetve Rí szubsztituensek jelentésénél említett alifás karbonsavgyökök előnyösen 1-4 szénatomos alifás karbonsavak savgyökei, különösen előnyös az acetil-, propionil-, valamint a benzoil-gyök.
Az Rí illetve R] szubsztituensek jelentésénél említett aminosavgyökök a természetes L-a-aminosavak gyökei. Különösen előnyös az L-alanin, L-fenilalanin, L-lizin, L-tirozin és L-arginin savgyöke, amely egy nitrocsoporttal lehet szubsztituálva, és az esetleg jelenlevő hidroxilcsoport adott esetben valamilyen szokásos oxigén-védőcsoporttal, például acetilcsoporttal lehet védve.
Az Rí illetve Rí szubsztituensek jelentésénél említett peptidgyökön di-, tri- és tetrapeptidek, előnyösen dipeptidek gyökeit értjük, amelyeknek aminosav-komponensei előnyösen az előbb említett aminosavakból kerülnek ki.
A színképzőkként használt I általános képletű szulfonftalein-észtereket 104 — 10_1 mól/liter, elő2 nyösen ΙΟ’3 - 10’2 mól/liter koncentrációban alkalmazzuk az impregnáló oldatban.
A leukocita kimutatásra szolgáló diagnosztikai eszköz egyik további alkotórésze valamilyen megfelelő pufferrendszer. Foszfát-, barbiturát-, borát-, 5 trisz(hidroxi-metil)-amino-metán[Trisz], 2-amino-2-metil-l,3-propándiol[Amediol], vagy aminosav-pufferok jönnek számításba, ahol a ρΗ-értéket és kapacitást úgy kell megválasztani, hogy a tesztcsíknak a testfolyadékba való bemártása után ezen 6 10, elő- 10 nyösen 7-9 közötti pH-érték álljon be.
Előnyös továbbá a leukociták lestfolyadékokban való kimutatására szolgáló, találmány szerinti diagnosztikai eszközök készítésénél tenzideket is alkalmazni, mivei ezáltal rövidebb reakcióidők érhetők 15 el. Előnyösen kationaktív nedvesítő szereket, így például kvaterner piridiumsókat használnak 0,052%, előnyösen 0,1-0,5% koncentrációban.
A találmány szerinti diagnosztikai eszköz előállítása céljából előnyösen szívóképes hordozókat, így 20 például szűrőpapírt, cellulóz- vagy műszál-filcet tesztcsíkok készítéséhez alkalmazott szokásos reagensek (szubsztrát, puffer, adott esetben tenzidek vagy sűrítőszerek, így például polivinilpirrolidon, karboxi-metil-cellulóz és keményítő, stabilizálószerek, 25 például aminosavak, háttérszínezékek, például tartrazin, stb.) könnyen illő oldószerekkel, így például vízzel, metanollal, etanollal vagy acetonnal készült oldataival impregnálunk. Ez célszerűen két külön műveletben történik. Először egy vizes oldattal imp- 30 regnálunk, amely a puffért tartalmazza. Utána az I általános képletű észteráz-szubsztrát oldatával impregnálunk. Különleges esetekben fordított impregnálási sorrend is alkalmazható. A kész tesztpapírok önmagukban is használhatók vagy ismert módon fo- 35 gókra ragasztva vagy előnyösen a 2 118 455 számú német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi leírás szerint műanyagok és finomlyukú szitaszövet közé hegesztve.
így olyan diagnosztikai eszközt kapunk, amely a vizsgálandó testfolyadékba való bemártás után gyorsan és egyszerűen kiértékelhető módon színreakcióval mutatja leukociták jelenlétét. Mivel a neutrofil leukocita-granulocitákban előforduló észterázok 45 aktivitása a leukociták lízise után is teljesen megmarad, a találmány szerinti diagnosztikai eszközzel mind intakt mind autolizált leukociták mérhetők. Lízis-hiba következésképp nem fordul elő.
1. példa
Szűrőpapírt (például Schleicher 4 Schüll 23 SL) egymásután impregnálunk az alábbi oldatokkal, és 55 utána 60 °C-on megszárítjuk.
1. oldat:
Trisz(hidroxi-metil)-amino-metán
0,1 n sósavoldat körülbelül
Desztillált víz feltöltve
0,61 g ml
100 ml-re.
Az oldatot 0,1 n sósavoldattal 9,0 pH-ra állítjuk be- 65
2. oldat:
Diacetil-1,5,6,7,3’,5’,3” ,5”-oktabróm-fenolszulfonftalein (rtetrabrómfenolkék-diacetát) 0,107 g
Aceton feltöltve 100 ml-re.
Így fehér tesztpapírt kapunk, amely leukocita-tartalmú vizeletbe mártva kékre színeződik. Az elszíneződés ideje a következő:
5000 leukocita/μΐ vizelet,
2000 leukocita/μΙ vizelet,
1000 leukocita/μΐ vizelet,
500 leukocita/μΐ vizelet, körülbelül 2 perc, körülbelül 5 perc, körülbelül 10 perc, körülbelül 15 perc.
A teszt érzékenysége körülbelül 500 leukocita/μΐ.
Hasonló tulajdonságú tesztpapírokat (érzékenység: 300-1000 leukocita/μΐ) kapunk, ha diacetil-4,5,6,7,3’,5 ’,3 ”,5 ’’-oktabróm-fenolszulfonftalein (rtetrabrómfenolkék-diacetát) helyett a következő szubsztrátokat használjuk:
a) Diacetil-3’,3”-diklór-fenolszulfonftalein (=klórfenolvörös -diacetát) leukocita-tartalmú vizeletbe mártva vörös reakcióterméket eredményez.
b) Diacetil-5’,5”-dibróm-o-krezolszulfonftalein (=brómkrezolbíbor-diacetát) bíborszínű reakcióterméket ad.
c) Diacetil-3’,5’,3”,5”-tetrabróm-fenol· szulfonft áléin (=brómfenolkék-diacetát) kék reakcióterméket ad.
d) Diacetil-3’,3”-dibróm-5’,5”-diklór-fenolszulfonftalein (=brómklórfenolkék-diacetát) kék reakcióterméket ad.
e) Diacetil-4,5,6,7-tetrabróm-3’,5’,3”,5”-tetraklór-fenolszulfonftalein (tetrabróm-tetraklórfenolkék-diacetát) kék reakcióterméket ad.
f) Di-(klór-acetil)-3’,3”-dibróm-5,,5”-diklór-fenolszulfonftáléin (=brómklórfenolkék-di-klóracetát) kék reakcióterméket ad.
g) Di-(klór-acetil)-3’,5’,3”,5”-tetrabróm-fenolszulfonftalein (=brómfenolkék-di-klóracetát) kék reakcióterméket ad.
h) Di-(klór-acetil)-4,5,6,7,3’,5’,3”,5”-oktabróm-fenolszulfonftalein (=tetrabrómfenolkék-di-klóracetát) kék reakcióterméket ad.
i) Di-(2-metoxi-propionil)-4,5,6,7,3’,5’,3”,5”-oktabróm-fenolszulfon italéin [=tetrabrómfenolkék-di-(2-metoxi-propionát)] kék reakcióterméket ad.
j) Dibenzoil4,5,6,7)3’,5’,3”,5”-oktabróm-fenolszulfonftalein (rtetrabrómfenolkék-dibenzoát) kék reakcióterméket ad.
2. példa
Szűrőpapírt (például Schleicher t Schüll 23 SL) egymásután a következő oldatokkal impregnálunk, és utána 60 °C-on megszárítjuk:
1. oldat:
Dinátriunvtetraborát-dekahidrát 1,91 g
0,1 n sósavoldat körülbelül 20 ml
Desztillált víz kiegészítve 100 ml-re.
Az oldatot 0,1 n sósavoldattal 9,0 pH-ra állítjuk be.
2. oldat:
Dí[N-(beiiziloxi-karbonil)-L-feniIalanil]-3’,5’,3”,5”-tetrabróm-fenolszulfonftalein [=di(N-benzüoxi-karboml-L-fenilalani!)-brómfenolkék] 0,123 g
Aceton feltöltve 100 ml-re.
Így fehér tesztpapírt kapunk, amely leukocita-tar talmú vizeletbe mártáskor körülbelül 10 perc elteltével kékre szineződik. A teszt érzékenysége körülbelül 1000 leukocitaí/rl.
Hasonló tulajdonságokkal (érzékenység: 800 -3000 leukocita/μΐ) rendelkező tesztpapirokat kapunk, ha di[N-(benziloxi-karbonil)-L-fenila!anil]-3'· ,5’,3”,5”- tetrabróm-fenolszulfonftalein helyett a következő szubsztrátokat használjuk, mikor is leukocitatartalmú vizeletbe mártva minden esetben kék reakciótermékek keletkeznek:
a) Di[N-(benziloxi-karbonil)-L-alanilj-3’,5’,3”,5”-tetrabróm-fenolszulfonftalein[=di(N-benziloxi-karbonü-L-alanill-bróm-fenolkék].
b) Di[Na,NCJ-di(benziloxi-karbonil)-L-lizil|-3’,5’,3”,5”-tetrabróm-fenolszulfonftaleiní=di[Na,NÖJ-di(benziloxi-karbonil)-L-lizil]-brómfenolkék/.
c) Di[N-(benziloxi-karbonil)-O-acetil-L-tirozü]-3’,5’,3”,5”-tetrabróm-fenolszulfonftaIein/=di[N-(benziloxi-karbonil)•0-acetil-L-tirozil]-brómfenolkék(.
d) Di[N-(benziloxi-karbonil)-N-(etoxi-kaibonil)-O-acetil-L-tirozü]-3’,5’,3”,5”-tetrabróm-fenolszulfonftalein^dijN-(benzüoxi-karbonil)-N-(etoxi-karbonil)· -0-acetil-L-tirozil]-brómfenolkék(.
e) Di[Na-(benziloxi-karbon:l)-N<1’-nitro-L-
-argi nil ]-3 ’,5 ’,3 ”,5 ”-tetrabróm-fenolszulfonftalein /=ΰί[Ν0-(6βηζί1οχί4ί8Η>οηί1)-Νω· -nitro-L-arginil]-brómfenolkék/.
f) Di[N-(benziloxi-karbonil)-L-alanil-L-alanil]-3’,5’,3”,5”-tetrabróm-fenolszulfonftalein /-di[N-(benziloxi-karbonil)-L-alanil-L-alanil]-brómfenolkék/.
g) Di[N-(benziloxi-karbonÍl)-L-alanil]-4,5,6,7,3’,5’,3”,5”-oktabróm-fenolszulfonftalein /=di[N-(benziloxi-katbonil)-L-alanil]-tetrabrómfenolkékí.
3. példa
Szűrőpapírt (például Schleicher & Schüll 23 SL) egymás után a következő oldatokkal impregnálunk, 5 és utána 60 °C-on megszárítjuk:
1. oldat:
Trisz(hidroxi-metil)-amino-metán
0,1 n sósavoldat körülbelül
Lauril-piridinium-klorid Desztillált víz feltöltve
0,61 g ml
0,2 g
100 ml-re.
Az oldatot 0,1 n sósavoldattal 9,0 pH-ra állítjuk be.
2. oldat:
Macetil-4,5,6,7,3’,5’,3”,5”-oktabróm20 -fenolszulfonftalein (=tetrabrómfenolkék-diacetát) 0,107 g
Aceton feltöltve 100 ml-re.
Fehér tesztpapírt kapunk, amely leukocita-tar25 talmú vizeletbe mártva körülbelül 1 perc múlva kékre szineződik. A teszt érzékenysége körülbelül 500 Ieukocita/μΙ.
Az 1. és 2. példa szerinti más szubsztrátokkal is 30 készítettünk hálósítószerekkel, így például a fentebb alkalmazott lauril-piridinium-kloriddal, tesztpapírokat, amelyeknél a hálósítószer nélküli analóg tesztpapírokhoz képest a felére rövidült a reakcióidő.
4. példa
Diacetil-4,5,6,7,3’,5’,3”,5”-oktabróm-fenolszulfonftalein (=tetrabróm40 fenolkék-diacetát).
5,0 g (5 mmól) tetrabrómfenolkéket melegítés közben feloldunk 54 g = 50 ml (0,45 mól) frissen desztillált ecetsavanhidridben, és 3 órán át vissza45 folyó hűtő alatt forraljuk. Az oldat vákuumban való bepárlása után az olajos maradékot kevés izopropanollal elkeverjük, és toluolból átkristályosítjuk. Az így kapott diacetát 166-167 °C-on olvad, és 2 mól kristályecetsavat tartalmaz, amelyet foszfor-pentoxid 50 felett 60 °C-on végzett szárítással eltávolítunk. így 4,2 g (77,4%) tetrabrómfenolkék-diacetátot kapunk színtelen kristályos anyagként, amelynek olvadáspontja 174 °C (bomlás).
Hasonló módon kapjuk a megfelelően szubszti55 tuált fenolszulfonftaleinekből a következő vegyületeket:
a) Diacetil-3’,3”-diklór-fenolszulfonftalein (ddórfenolvörös-diacetát), színtelen kristályok, olvadáspont 132 °C (bomlás).
b) Diacetil-S’,5”-dibróm-o-krezolszulfonftalein (=brómkrezolbíbor-diacetát), színtelen kristályok, olvadáspont 132 °C (bomlás).
c) Diacetil-3’,3”-dibróm-5’,5”-diklór-fenolszulfonftalein (=brómklórfenolkék-diacetát), színtelen kristályok, olvadáspont: 217 °C (bomlás).
d) Diacetil-4,5,6,7-tetrabróm-3’.5’,3”,5”-tetraklór-fenolszulfonftalein (=tetrabrómtetraklórfenolkék-diacetát), színtelen kristályok, olvadáspont 253-254 °C (bomlás).
5. példa
Di(klór-aceti!)-4,5,6,7,3’,5’,3”,5”-oktabróm-fenolszulfonftalein [=tetrabrómfenolkék-di(klór-acetát)].
5,0 g (5 minői) tetrabrómfenolkék 100 ml vízmentes tetrahidrofuránnal készült oldatához keverés közben hozzáadunk 0,81 ml (10 mmól) vízmentes piridint, és hűtés közben 10°C-on hozzácsepegtetjük 1,18 g (0,79 ml = 10,5 mmól) frissen desztillált klór-acetil-klorid 3 ml vízmentes tetrahidrofuránnal készült oldatát. Szobahőmérsékleten 2 órát kevertetjük, utána a keletkezett piridinium-kloridot kiszűrjük, és a szűrletet vákuumban 50 °C-on bepótoljuk. így 6,1 g olajos maradékot kapunk, ezt 50 ml izopropanollal forraljuk, az oldatlan részeket kiszűrjük. Jeges fürdőben való hűtés után 3,9 g (68,7%) tctrabrómfenolkék-di(klór-acetát)-ot kapunk enyhén sárgás kristályokként, olvadáspont: 226-227 °C (bomlás).
Analóg módon kapjuk a megfelelően szubsztituált fenolszulfonftaleinekből és a megfelelő savkloridókból a következő vegyületeket:
a) Di(klór-acetil)-3’,5’,3”,5”-tetrabróm-
-fenolszulfonftalein [-brómfenolkék-di(ldór-acetát)], színtelen kristályok, olvadáspont 206—207 °C (bomlás).
b) Di(klór-acetil)-3’,3”-dibróm-5’,5”-diklórfenolszulfonftalein (=brómklórfenolkék-di(klór-acetát)], színtelen kristályok, olvadáspont: 172 °C (bomlás).
c) Di(2-metoxi-propionil)-4,5,6,7,3’,5’53”,5”-oktabróm-fenolszulfonftalein (=tetrabrómfenolkék-di(2-metoxi-propionát)], színtelen kristályok, olvadáspont 214-216°C (bomlás).
d) Dibenzoil-4,5,6,7,3’,5’,3”,5”-oktabróm-
-fenolszulfonftalein (rtetrabrómfenolkék-dibenzoát), színtelen kristályok, olvadáspont 196-197 °C (bomlás).
6. példa
3i'í-i;öenziloxi-karbonil)L-alanil]-3’,5 ’,3”,5”teírabróm-fenolszulfonftalein j=di[N<Denzíjűxi-karbonil)-L-alanil]-brómfenolkék/.
1. oldat:
A vegyes anhidrid előállításához 3,13 g (14 mmól) N-(benziloxi-karbonil)-L-alanint feloldunk 5 50 ml vízmentes tetrahidrofuránban, hozzáadunk 1,93 ml (14 mmól) trietil-amint, és -15 °C és —20 C közé lehűtjük. Utána keverés közben hozzápipettázunk 1,34 ml (14 mmól) klór-hangyasav-etilésztert, és a reakcióelegyet nedvesség kizárása mellű lett 20-30 percig a hűtőfürdőben hagyjuk.
2. oldat:
4,69 g (7 mmól) brómfenolkéket feloldunk 45 ml 15 vízmentes tetrahidrofuránban, és -10 °C és -15 °C közé hűtjük.
Reakció:
Az 1. oldatból a vegyes anhidrid képződésekor kivált trietil-ammónium-kloridot gyorsan kiszűrjük, és a szűrletet hozzáadjuk a 2. oldathoz. Még 2 ml piridint adunk hozzá, és nedvesség kizárása mellett -15 C-on kevertetjük, mikor is lassan széndioxid 25 fejlődik.
Mintegy 2 óra múlva másodszor, mintegy 16 óra múlva harmadszor is hozzáadunk azonos mennyiségű frissen készített, szűrt vegyes anhidridet (1. oldat), és utána tovább keverjük még körülbelül 5 órán át 30 -15° C-on.
Feldolgozáskor a reakcióelegyhez néhány csepp vizet adunk (a fölös anhidrid elbontására), és az oldószert vákuumban eldesztilláljuk. A maradékot 100 ml etil-acetáttal oldjuk, és egymás után 30 ml 35 1 n citromsavoldattal, 20 ml vízzel, 70 ml 7%-os nátrium-hidrogén-karbonát oldattal és kétszer 25 ml vízzel mossuk. Nátrium-szulfáton való szárítás után az etil-acetátos fázist vákuumban bepároljuk. így 1J ,3 g sárgás, ragacsos nyersterméket kapunk, ame40 lyet oszlopkromatográfiásan tisztítunk szilikagélen toluol : dioxán : etil-acetát (9:2:1) eleggyel eluálva.
így 5,5 g (68%) di[N-(benziloxi-karbonil)-L-alanil]-3’,5’,3”,5”-tetrabróm-fenolszulfonftaleint kapunk színtelen, amorf porként, [a]£° = -33,6° (c = 1, 45 metanol).
Az analízis szerint a vegyület 0,39 mól vizet, 0,19 mól dioxánt és 0,60 mól toluolt tartalmaz.
Hasonló módon kapjuk a következő vegyületeket a megfelelően szubsztituált fenolszulfonftaleinek 50 különböző aminosavakkal való reagáltatásával:
a) Di[N-(benziloxi-karbonil)-L-femlalanil]-
-3’,5’,3”,5”-teirabróm-fenolszulfonftaiein /=di[N-(benziloxi-karbonil)55 -L-feniJalanil]-brómfenolkék/, színtelen, amorf por, [a]p° - -33,5° (c = 1, etil-acetát).
b) Οί[Ν0,Νω -di(benziloxi-karbonil)-L-lizil]-3’,5’,3”,5”-tetrabróm-fenol- szulfonftalein /=ιϋ[Να,Νω-ύί(0ειιζί1οχί-karbonil)-L-Iizil]-brómfenolkék/, színtelen, amorf por, [α]θο = -15,0° (c = 1, etil-acetát).
c) Di[N-(benziloxi-karbonil)-O-acetil-L-
-tirozü]-3’,5’,3”,5”-tetrabróm5
-fenolszulfonfiaiéin /=di[N-(benziloxi-karbonil)-O-acetil-L-tirozilj-brómfenolkék/, színtelen, amorf por, amely 0,6 mól etil-acetátot tartalmaz.
[aj™ = -35,3° (c = 1, etil-acetát).
A szintézisnél melléktermékként még az alábbi vegyület válik ki:
Di[N-(benziloxi-karbonil)-N-(etoXÍ-karbonil)-O-acetil-I.-tirozil]-3,5,3”,5”-tetrabrómfenolszulfonftalein /=di[N-(benziloxi•karbonil)-N-(etoxi-karbonil)-0-acetii-L-tirozil ]-brómfenolkék/, színtelen, amorf por, [α]^° = -19,5° (c= 1, etil-acetát).
d) Di[N-(benziloxi-karbonil)-L-alanil]Jt,5,6,7,3’,5’,3”>5”-oktabróm-fenolszulfonftalein /=di[N-(benziloxi-karbonil)-L-aianil]-tetrabrömfenolkék/, színtelen amorf por, [“Jd0 = -28,7° (c = 1, metanol).
7. példa
Di[N-(benziloxi-karbonil)-L-alanil-L-alanilj-3’,5’,3”,5”-tetrabróm-fenolszulfonftalein /=di[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaiúl-L-alanil ]-brómfenolkék/.
1. oldat:
Az egylépéses módszer szerint a savklorid előállításához 1,18 g (4 mmól) N-(benziloxi-karbonil)-L-a!anil-L-alanint feloldunk 10 ml vízmentes dimetil- 35 -formamidban, és -30 °C-ra lehűtjük. Utána keverés és hűtés közben hozzápipettázunk 0,32 ml (4,4 mmól) tionil-kloridot, és a reakcióelegyet nedvesség kizárása mellett 30 percig a hűtőfürdőben (-30 °C) hagyjuk. 40
2. oldat:
1,34 g (2 mmól) brómfenolkéket feloldunk 10 ml vízmentes dimetil-fonnamidban, és —10°C és 45 -20 °C közé hűtjük.
Reakció:
A 2. oldatot hozzáadjuk az 1. oldathoz, majd 50 hozzáadunk még 1 ml piridint a reakcióelegyhez, és 2 órán át —10 C és -20 °C között majd 2 órán át szobahőmérsékleten kevertetjük. Ugyanilyen menynyiségű frissen készített savkloridot (1. oldat) valamint piridint összesen még háromszor adunk hozzá, 55 mikor is mindenkor betartjuk a fenti reakciókörülményeket.
Feldolgozáskor a reakcióelegyet vákuumban szárazra pároljuk és utána a 6. példában megadottak szerint kezeljük tovább. 60 így 2,67 g amorf nyersterméket kapunk, amelyet oszlopkromatográfiásan tisztítunk szilikagélen heptán : etil-acetát (1 :2) eleggyel eluálva. így 1>4 g (57%) di[N-(benziloxi-karbonil)-L-alanil-L-alanilj-3’,5’,3” 5”-tetrabróm-fenolszulfonftaleint kapunk színtelen, amorf porként, amely 0,6 mól etil-acetátot tartalmaz: [tx]n° ‘ 5,9° (c = 1, eül-acetát).
Hasonló módon kapjuk a következő vegyületet is:
Di[Nü(benzüoxi-karbonil)-Nw-nitro-L-argiriil]-3’,5’,3”,5”-tetrabróm-fenolszulfonftaíein (ídijN^-íbenziloxi-karbonilj-N^-nitro-L-arginilj-brómfenolkék/, színtelen, amorf por, amely 0,6 mól kloroformot tartalmaz, [o]p° = -12,0° (c -1, ecetsav).

Claims (4)

1. Diagnosztikai eszköz ieukociták kimutatására testfolyadékokban, amely színképzővel, megfelelő pufferanyaggal, valamint járulékos, szokásosan alkalmazott segédanyagokkal impregnált szívóképes hor-
20 dozóból áll, azzal jellemezve, hogy színképzőként I általános képletü szulfonftalein-észtert - a képletben
Rj jelentése valamely, adott esetben halogén25 atommal vagy rövidszénláncú alkoxicsoporttal szubsztituált 1-5 szénatomos alifás karbonsav-, benzoesav- vagy naftoesavgyök, benzoil-oxi-karbonil- vagy rövidszénláncú alkoxi-karbonil-nitrogén-védőcso30 porttal rendelkező aminosav- vagy 2-4 aminosavból álló peptíd-gyök, emellett az aminosav- vagy peptidgyök adott esetben nitro- vagy O-acetil-csoporttal szubsztituált,
R2 jelentése halogénatom vagy valamely rövidszénláncú alkilcsoport,
R3 és R4 jelentése azonos vagy eltérő, éspedig hidrogénatom vagy halogénatom tartalmaz.
2. Az 1. igénypont szerinti diagnosztikai szer kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy a hordozó járulékos segédanyagként valamilyen nedvesítőszert tartalmaz.
3. Eljárás az 1. igénypont szerinti Ieukociták kimutatására szolgáló diagnosztikai eszköz előállítására, szívóképes hordozóinak színképzők, megfelelő pufferanyagok, valamint járulékos szokásosan alkalmazott segédanyagok oldatával végzett impregnálása útján, azzal jellemezve, hogy színképzőként egy vagy több I általános· képletü szulfonftaleinésztert - a képletben
Rí jelentése valamely, adott esetben halogénatommal vagy rövidszénláncú alkoxicsoporttal szubsztituált 1-5 szénatomos alifás karbonsav-, benzoesav- vagy naftoesavgyök, benzoil-oxi-karbonil- vagy rövidszénláncú alkoxi-karbonil-nitrogén-védőcsoporttal rendelkező aminosav- vagy 2-4 aminosavból álló peptid-gyök, emellett az aminosav- vagy peptidgyök adott esetben nitro- vagy O-acetil-csoporttal szubsztituált,
R2 jelentése halogénatom vagy valamely rö55 vidszénláncú alkilcsoport,
R3 és R» jelentése azonos vagy eltérő- éspedig hidrogénatom vagy halogénatom — alkalmazunk.
4. Eljárás az Γ általános képletű szulfonftalein-észterek - a képletben
R’i jelentése valamely, adott esetben halogénatommal vagy rövidszénláncú alkoxicsoporttal szubsztituált 1-5 szénatomos alifás karbonsav-, benzoesav- vagy naftoesavgyök, benzoil-oxi-karbonil- vagy rövidszénláncú alkoxi-karbonil-nitrogén-védőcsoporttal rendelkező aminosav- vagy 2-4 aminosavbcl álló peptid-gyök, emellett az aminosav- vagy peptidgyök adott esetben nitro- vagy O-acetil-csoporttal szubsztituált,
Rj jelentése halogénatom vagy valamely rövidszénláncú alkilcsoport,
R3 és R4 jelentése azonos vagy eltérő, éspedig hidrogénatom vagy halogénatom, azzal a megkötéssel, hogy ha R2 és R3 jelentése brómatom és
R4 jelentése hidrogénatom, akkor Rí acetilcsoporttól vagy benzoilcsoporttól eltérő jelentésű előállítására, azzal jellemezve, hogy egy II általános képletű vegyületet ahol R2, R3 és R4 jelentése az előbb megadottakkal azonos - egy III általános képletű savval
- ahol RJ jelentése az előbb megadottakkal azonos - illetve ezek valamely alkalmas reakcióképes származékával reagáltatunk.
HU79BO1792A 1978-06-20 1979-06-19 Diagnostical instrument for detecting leukocytes in body-liquides and process for producing reagents for the colourreactions HU179435B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19782826965 DE2826965A1 (de) 1978-06-20 1978-06-20 Diagnostisches mittel zum nachweis von leukozyten in koerperfluessigkeiten und dafuer geeignete chromogene

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU179435B true HU179435B (en) 1982-10-28

Family

ID=6042236

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU79BO1792A HU179435B (en) 1978-06-20 1979-06-19 Diagnostical instrument for detecting leukocytes in body-liquides and process for producing reagents for the colourreactions

Country Status (10)

Country Link
US (1) US4331760A (hu)
EP (1) EP0007407B1 (hu)
JP (1) JPS552992A (hu)
AT (1) ATE90T1 (hu)
CA (1) CA1129848A (hu)
CS (1) CS220789B2 (hu)
DE (2) DE2826965A1 (hu)
HU (1) HU179435B (hu)
YU (1) YU142679A (hu)
ZA (1) ZA793037B (hu)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2905531A1 (de) * 1979-02-14 1981-01-08 Boehringer Mannheim Gmbh Diagnostisches mittel zum nachweis von leukozyten in koerperfluessigkeiten
US4537718A (en) * 1982-10-26 1985-08-27 Columbia University In The City Of New York Impermeant spectroscopic probes
US4610961A (en) * 1982-12-27 1986-09-09 Eastman Kodak Company Inhibition of reduction activities of leukocytes
DE3413118A1 (de) * 1984-04-06 1985-10-24 Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Ind. Analysenverfahren und mittel zum nachweis esterolytischer und/oder proteolytischer enzyme
DE3412939A1 (de) * 1984-04-06 1985-10-17 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Substrate fuer hydrolasen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
DE3413120A1 (de) * 1984-04-06 1985-10-24 Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Ind. Analysenverfahren und mittel zum nachweis esterolytischer und/oder proteolytischer enzyme
US5384411A (en) * 1991-06-20 1995-01-24 Hewlett-Packard Company Immobilization of PH-sensitive dyes to solid supports
JPH07501202A (ja) * 1991-12-09 1995-02-09 アボツト・ラボラトリーズ ペルオキシダーゼ及び過酸化物の比色定量
US6821952B1 (en) 1995-07-20 2004-11-23 Perkinelmer Las, Inc. Fluorescent vasoactive intestinal peptide (VIP)
AU6352296A (en) * 1995-07-20 1997-02-18 Advanced Bioconcept, Inc. Cell sorting with fluorescent peptides
EP1185710A2 (en) * 1999-04-16 2002-03-13 Zymetx, Inc. Viral detection method using viral encoded enzymes and chemiluminescent substrates
US20030147777A1 (en) * 2002-01-23 2003-08-07 Ghanekar Vinay D. Test composition and device for the determination of cyanuric acid in water
US7727206B2 (en) * 2005-12-27 2010-06-01 Gorres Geoffrey H Device for monitoring a patient for a urinary tract infection
FR2949113B1 (fr) * 2009-08-11 2012-04-13 Advanced Accelerator Applic Composes a base de sultones, leurs derives substitues par des nucleophiles, notamment des radionucleides, procedes et applications
CN112964704B (zh) * 2021-02-04 2024-03-22 甘肃润达药业有限公司 一种防风草内酯检测试纸、比色卡及快速检测方法

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA722579A (en) * 1965-11-30 L. Babson Arthur Diagnostic preparation for the determination of serum alkaline phosphatase
US1786611A (en) * 1928-04-04 1930-12-30 Hynson Westcott & Dunning Inc Halogenated sulphone phthaleins
CH409198A (de) * 1957-08-17 1966-03-15 Svoboda Vlastimil Verfahren zur Herstellung von substituierten Sulfonphthaleinfarbstoffen
US3087794A (en) * 1960-05-23 1963-04-30 Miles Lab Chemical test for differentiating leucocytes from erythrocytes
CH397921A (de) * 1960-11-21 1965-08-31 Ciba Geigy Verfahren zur Herstellung von Schwefelfarbstoffen
GB1128371A (en) * 1965-10-04 1968-09-25 Miles Lab Diagnostic composition
CH506792A (de) * 1968-09-20 1971-04-30 Merck Ag E Neues Mittel und Verfahren zur Lipasebestimmung
US3741875A (en) * 1970-10-30 1973-06-26 Mount Sinai Res Foundation Inc Process and apparatus for obtaining a differential white blood cell count
JPS5338621B1 (hu) * 1971-03-08 1978-10-17
JPS5342438B2 (hu) * 1974-05-20 1978-11-11
US4045290A (en) * 1975-02-28 1977-08-30 Princeton Biomedix Incorporated Diagnostic method and compounds for use therewith
US4022667A (en) * 1975-09-22 1977-05-10 The University Of Alabama Substrate solution for carboxylic ester hydrolase determination
US4046514A (en) * 1976-11-24 1977-09-06 Miles Laboratories, Inc. Test device and method for determining a component in a sample

Also Published As

Publication number Publication date
EP0007407B1 (de) 1981-06-17
CS220789B2 (en) 1983-04-29
DE2960421D1 (en) 1981-09-24
EP0007407A1 (de) 1980-02-06
JPS631347B2 (hu) 1988-01-12
US4331760A (en) 1982-05-25
ATE90T1 (de) 1981-07-15
DE2826965A1 (de) 1980-01-17
JPS552992A (en) 1980-01-10
ZA793037B (en) 1980-07-30
YU142679A (en) 1983-04-30
CA1129848A (en) 1982-08-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4278763A (en) Diagnostic agents for the detection of proteolytic enzymes
HU179435B (en) Diagnostical instrument for detecting leukocytes in body-liquides and process for producing reagents for the colourreactions
US4657855A (en) Composition and test device for determining the presence of leukocytes, esterase and protease in a test sample
FI85988B (fi) Screeningsfoerfarande foer gram-negativa bakterier och foer bakteruri orsakad av dessa, i screeningsfoerfarandet anvaendbar enhetlig screeningsanordning och foerfarande foer framstaellning av den.
CA1311333C (en) Aminoluciferin derivatives, processes for the production thereof and their application in the determination of enzyme activities
FI85990C (fi) Sammansaettning innehaollande zwitterjonkopplingsmedel och testanordning foer bestaemning av leukocyter.
JPS6241710B2 (hu)
US3979447A (en) γ-Glutamyl-4-nitroanilide compounds
US4296202A (en) Diagnostic composition for the detection of leukocytes and chromogens useful therein
US4209459A (en) Novel L-leucyl-4-hydroxyanilide derivatives
JPH0873422A (ja) 新規アミノ酸エステルおよび白血球、エステラーゼ又はプロテアーゼの検出方法
US4469789A (en) Amino acid and peptide esters of leuko-indoaniline compounds and compositions for the detection of proteolytic enzymes
US3986931A (en) γ-GLUTAMYL-4-NITROANILIDE COMPOUNDS AND THEIR USE IN DETERMINING γ-GLUTAMYL TRANSPEPTIDASE
EP0516532A1 (fr) Dérivés de coumarines hydrosolubles, leur préparation et leur utilisation comme substrat d&#39;enzyme ou pour la préparation de tels substrats
GB2095666A (en) N-acetyl- -d-glucosaminides
US4049702A (en) γ-Glutamyl-4-nitroanilide compounds
US4418012A (en) Leucylalany-arginine derivative
JPH07242639A (ja) エステル分解酵素又は蛋白質分解酵素の測定方法及びこれに用いる試薬組成物
CN118005552A (zh) 一种选择性识别半胱氨酸的双光子荧光探针及其制备和应用
SU675053A1 (ru) 9-Йодацетамидо-метил-антрацен в качестве люминесцентной метки дл белков и белковоподобных полимеров
JPH01186861A (ja) 過酸エステル化合物，その製造法ならびに該化合物を用いた試験組成物及び試験具
JPH04103568A (ja) チオフェノールエステル及びこれを用いた加水分解酵素の測定器具
JPH03246285A (ja) アゾレゾルシノールエステル誘導体および加水分解酵素基質
NO841653L (no) Fremgangsmaate for bestemmelse av katepsin b i naervaer av andre proteolytiske enzymer, og forbindelser for bruk til dette

Legal Events

Date Code Title Description
HU90 Patent valid on 900628