CS219257B2 - Method of making the eukaryotic protein - Google Patents

Description

Předmětem vynálezu je způsob syntézy eukaryotické bílkoviny při použití mikroorganismu, při němž se mikroorganismus transformuje vektorem pro přenos DNA, sestávajícím z bakteriálního genu s včleněným sledem nukleotidů, který je kódem pro eukaryotickou bílkovinu s následným pěstováním mikroorganismu za podmínek, dovolujících expresi bakteriálního genu, vyznačující se tím, že včleněný sled sestává z cDNA, která je kódem alespoň pro část eukaryotické bílkoviny, vektor pro přenos •DNA sestává z bakteriálního genu, obsahujícího alespoň oblast, řídící počátek transkripce a počátek translace a včleněný sled je uložen vzhledem k bakteriálnímu genu tak, že jakmile dojde k počátku transkripce a translace při pěstování transformovaného mikroorganismu za podmínek, dovolujících expresi bakteriálního genu, dochází také k transkripci a translaci uvedeného sledu, takže transformovaný mikroorganismus syntetizuje eukaryotickou bílkovinu nebo chimérní bílkovinu, která obsahuje eukaryotickou bílkovinu jako terminální sled aminokyselin na zakončení, na němž se nachází karboxylová skupina.

Pokrok v technologii- rekorbinantní DNA umožňuje - izolovat specifické geny a jejich části z vyšších . organismů, například z člověka a dalších savců a přenést tyto geny nebo jejich fragmenty ' do. různých - druhů mikroorganismů, například bakterií nebo kvasinek. Takto - - přenesený gen podléhá replikaci . a propagaci při rozmnožování transformovaného mikroorganismu. V důsledku toho může -transformovaný mikroorganismus nabýt schopnost vyrábět bílkovinu, pro· kterou je gen nebo jeho - fragment kódem, přičemž může jít o enzym, hormon, antigen, protilátku nebo o části těchto sloučenin. Mikroorganismus dále přenáší tuto· získanou schopnost, takže ve skutečnosti vzniká při přenosu nový kmen s uvedenými vlastnostmi. Tyto postupy byly - popsány například v publikaci Ullrlch A. a další, Science 196, 1313 (1977) a Seeburg, P. H. a další Nátuře 270, ' 486 (1977). Základní skutečností, která podmiňuje použití této technologie pro praktické - účely je to, že DNA všech · živých ' organismů, od mikroorganismů až po člověka je chemicky příbuzná a skládá se ze stále stejných čtyř nukleotidů. Podstatné . rozdíly spočívají ve sledu těchto nukleotidů v polymerní molekule DNA. Sled nukleotidů se užívá k charakteristice sledu aminokyselin v bílkovině, jíž je pak schopen mikroorganismus vyrábět. Přestože většina bílkovin různých organismů se od sebe liší, vztahy mezí kódem, to· je sledem nukleotidů a sledem aminokyselin. je v zásadě stejný pro· všechny druhy organismů. Například týž sled nukleotidů, který je kódem pro sled aminokyselin v růstovém hormonu v lidském podvěsku mozkovém je po· přenosu do mikroorganismu kódem pro vznik téhož sledu aminokyselin.

Zkratky, užívané v průběhu přihlášky jsou

uvedeny v následující tabulce 1: K&.;
	TABULKA 1
IIW”’··”.< DNA	kyselina drsoxyrieon.ukleová
RNA	kyselina ribonukleová
cDNA	komplementární DNA, enzymaticky syntetizovaná ze sledu mRNA
mRNA	RNA pro přenos do komplementárního· řetězce (messenger)
dATP	desoxyadenosintrifosfát
dGTP	desoxyguanosintrifoSfát
dCTP	desoxycy tidintrif- osfát
HCS	lidský choriový somatomamotropin
TCA	kyselina trichloroctová
HGH	lidský růstový hormon
A	adenin
T	thymin
G	guanin
C	cytosin
U	........ uráčil

Tris	2-amino-2-hydroxyethyl-l,3- -propanaiol
EDTA	kyselina ethylendiamintetraoctová
ATP	adenosin-tri-fosfát
TTP	thymiaintrifosiát
RGH	krysí růstový hormon

Kódové vztahy mezi sledem -nukleotidů v DNA a sledem aminokyselin v bílkovině jsou obecně známy jako . genetický - - kód . - a . jsou uvedeny v -tabulce 2.

TABULKA 2

Genetický kód

fenylalanin (Phe)	TTK
leucln (Leu)	XTY
isoleucin (Ile)	ATM
methionin (Met)	ATG
valín (Val)	GLT
serin (Ser)	QRS
prolin (Pro)	CCL
threonin (Thr)	ACL
alanin (Ala)	GCL
tyrosin (Tyr)	TAK
terminační signál	TAJ
terminační signál	TGA
histidin (His)	CAK
glutamin (Gin)	CAJ
asparagin (Asn)	AAK
lysin (Lys)	AAJ
kyselina asparagová (Asp)	GAK
kyselina glutamová (Glu)	GAJ
cystein. (Cys)	TGK
tryptofan (Try)	TGG
arginin (Arg)	WGZ
glycin - (Gly)	GGL

Klíč: Každý triplet písmen znamená trinukleotid mRNA se zakončením 5‘ . na levém konci a se zakončením 3‘ na pravém konci. Písmena znamenají purinové nebo pyrimidinové báze, které tvoří sled nukleotidů.

A adleiiln

G

C .-cytosin

T thymin

X T nebo- C v příaadě ,že Y zaamená A nebo G

X C v - případě, že - Y - znamená - C nebo- T

Y A, - G, C nebo T - v - - případě, - - že X znamená- C

Y A nebo G-- v - případě, - že . -X - znamená - T

W C - - nebo A - v - případě, - že -Z znamená - A - nebo G

W C v - případě, - že - Z - - . znamená - - C nebo- - T

Z A, G, - -C -nebo T - - v - případě, - že

W- znamená -C

Z A nebo-. G - v. -případě, -že - - W-znamená A

QR TC v případě, že S znamená A,

G, C nebo T

QR AG v případě, že S znamená T nebo C

S A, G, C nebo T v případě, že

QR znamená TC

S T nebo· C v případě, že QR znamená AG

J A nebo G

Κ T nebo C

L A , T , C neOo G

M A , C nebo T

Důležitou vlastností kódu je skutečnost, že každá -aminokyselina je charakterizována sledem trinukleotidů, nukleotidovým tripletem. Fosfodiesterové vazby, které spojují triplety jsou chemicky nerozeznatelné od ostatních mezinukleotidových vazeb v DNA. Z -toho vyplývá, že sled nukleotidů nemůže být odečten jako kód pro- sled aminokyselin bez další informace, která se týká způsobu odečtení, to- je bez další informace, která se týká seskupení tripletů, která je pro buňku genetickým poselstvím.

Předmětem vynálezu je způsob syntézy eukaryotické bílkoviny při použití mikroorganismu, při němž se mikroorganismus transformuje vektorem pro přenos DNA, sestávajícím z bakteriálního genu s včleněným sledem nukleotidů, který je kódem proeukaryotickou bílkovinu s následným pěstováním mikroorganismu za podmínek, dovolujících expresi bakteriálního genu, vyznačující se tím, že včleněný sled sestává z cDNA, která je kódem alespoň pro část eukaryotické bílkoviny, vektor pro přenos DNA sestává z bakteriálního- genu, obsahujícího - alespoň oblast, řídící počátek trans, kripce a počátek -translace a včleněný sled je uložen vzhledem k bakteriálnímu genu tak, že jakmile dojde k počátku transkripce a translace při pěstování transformovaného mikroorganismu za podmínek, dovolujících expresi bakteriálního genu, dochází také k transkripci a - -translaci uvedeného sledu, takže transformovaný mikroorganismus syntetizuje eukaryotickou bílkovinu nebo- chimérní bílkovinu, která obsahuje eukaryotickyselin - na zakončení, - na němž se nachází karboxylová -skupina.

Řada technik pro vznik -rekombinantní DNA užívá dvou skupin sloučenin, a -to vektorů pro přenos a restrikčních enzymů. Vektorem - pro přenos je molekula DNA, která mimo jiné obsahuje genetickou informaci, zajištující vlastní replikaci této kyseliny po přenosu do- kmene mikroorganismu. Příkladem vektorů pro přenos, běžně užívaných v - bakteriální genetice jsou -plazmidy a DNA některých bakteríofágů. Přestože plasmidy byly a jsou užívány jako vektory ve shora uvedeném smyslu, je zřejmé, že je možno užít i odlišné -typy vektorů. Plazmid je termín, kterým -se -označuje -autonomně se rep likující DNA, tak jak je možno·- ji nalézt - v mikrobiální buňce, přičemž - je odlišná ' od •vlastního genomu hostitelské buňky. Plazmid proto- není -geneticky vázán na -chromozom hostitelské buňky. Plazmidová DNA existuje jako kruhová struktura -s dvojím řetězcem -o molekulové hmotnosti řádu - několika miliónů daltonů, i když některé - molekuly mají molekulární hmotnost větší než 10® -daltonů. Tyto velké molekuly však tvoří obvykle pouze malý podíl celkového množství DNA v buňce. DNA, která je vektorem pr-o· přenos je obvykle oddělitelná od -hostitelské DNA -vzhledem k velkému rozdílu mezi rozměrem molekul obou uvedených kyselin. Vektory nesou genetickou informaci, která jim umožňuje -replikaci v rámci hostitelské buňky, -a to- v některých - případech nezávisle na -rychlosti -dělení hostitelské buňky. Některé plazmidy mají -tu vlastnost, že rychlost jejich replikace je možno řídit změnami růstových podmínek hostitelské buňky. Plazmidové DNA existuje jako uzavřený kruh. Vhodným způsobem - je však možno tento kruh otevřít, vsunout fragment heterologní DNA a kruh znovu uzavřít, čímž vzniká zvětšená molekula, která -obsahuje vsunutý segment DNA. V -tomto smyslu - může například DNA bakteroofága nést segment heterologní DNA, který je vsunut na místo některého z nepodstatných -genů bakterifága. V každém případě vektor- slouží pro přenos vsunutého fragmentu heterologní DNA.

Přenos se uskutečňuje způsobem, který je znám jako transformace. V průběhu transformace dochází ke včlenění molekuly plazmidů do bakteriálních buněk, které byly smíseny s plazmidovou DNA. Zásadní průběh tohoto způsobu není zcela znám, působením některých pokusně zjištěných vlivů je však možno dosáhnout toho, aby co největší část užitých bakteriálních buněk - přijala plazmidovou DNA a byla -transformována. Jakmile je plazmid včleněn do buňky, dochází k jeho replikaci v rámci této buňky a replikovaný plazmid se dostává i do dceřiných buněk přidělení buňky. Jakákoli genetická informace, která je obsažena -ve -sledu nukleotidů plazmidové DNA může být -v zásadě vyjádřena hostitelskou buňkou. Transformovaná hostitelská buňka se obvykle rozezná právě vlastnostmi, které získá včleněním plazmidu, například svou odoln-ostí proti působení některých antibiotik. Různé plazmidy jsou rozeznatelné podle svých různých schopností nebo podle kombinací schopností, které přenášejí na hostitelské buňky, které je obsahují. Jakýkoliv plazmid je možno získat ve velkém množství tak, že se pěstuje čistá kultura buněk -s Jeho· -obsahem -a pak se izoluje z těchto buněk plazmidová DNA.

Restrikční endonukleáza jsou hydrolytické enzymy, které jsou schopny katalyzovat štěpení molekul DNA na určitých specifických místech. Místo působení restrikční en donukleázy je možno stanovit podle existence specifického sledu nukleotidů. Tento sled se - označuje jako místo působení restrikční endonukleázy. Byly'- izolovány restrikční - endonukleázy z - -nejrůznějších zdrojů - a tyto enzymy - byly - charakterizovány - svými --místy působení, to znamená sledem nukleotidů, - v němž - - mohou rozštěpit molekulu. Některé restrikční - endonukleázy hydrolyzují - -fosfodiesterové - vazby - v obou řetězcích stejným způsobem, takže vznikají- . „slepé - konce“. Jiné restrikční - -endonukleázy - katalyzují - hydcolýzu vazeb, - které jsou -od sebe -odděleny . jen - - - několika - nukleotidy, - takže - dochází ke vzniku volných - oblastí - . s - jednoduchým řetězcem- a s volnou vazbou - na každém konci rozštěpené molekuly. Tyto - jednoduché řetězce jsou - - komplementární a je jich tedy možno - užít - k opětnému - spojení hydnolyzované - DNA. Protože každá DNA, kterou - lze štěpit enzymem uvedeného typu, musí obsahovat totéž místo - pro- . působení enzymu, vzniknou vždy tytéž komplementární konce, takže je možno- -spolu spojit heterologní sledy DNA po· štěpení restrikční endonukleázou s - jiným sledem, který byl štěpen stejným způsobem. Tento postup je popsán například v publikaci Ro-berts R. J., Crit. Rev. B.iochem, -4, 123 (1976). Místa pro štěpení restrikční endonukleázou se vyskytují poměrně vzácně, obecná použitelnost restrikčních - endonukleáz -však byla podstatně rozšířena chemickou - syntézou oligonukleotidů s - dvojím řetězcem - a s- obsahem sledu, který je místem pro - působení těchto enzymů. Z tohoto důvodu je - možno zásadně jakýkoli segment DNA vázat na jakýkoli jiný segment - jednoduchým způsobem tak, že - se na Jeho konce naváže - příslušný oligonukleotid s - - obsahem místa působení pro restrikční endonukleázu produkt - -hydrolýzy po působení - příslušné restrikční endonukleázy má požadované komplementární konce. Tento- postup - je popsán například v publikaci Heyneker H. L. - - a -další, Nátuře 263, 748 . - (1976) a . Scheller R. H. a další, Science -196, 177 (1977). Důležitou -vlastností rozdělení míst pro- .působení restrikční endonukleázy je skutečnost, že tato místa- jsou rozložena zcela náhodně ve - sledu nukleotidů, zejména, pokud, jde - -o - způsob· odečítání - genetické informace. - Z - toho vyplývá, že štěpení restrikční endonukleázou může nastat mezi sousedními- - kodony -nebo i - uvnitř jediného- kodonu.

K - dispozici jsou také -obecnější způsoby štěpení DNA, kterých je možno užít k modifikaci jednotlivých zakončení. Je například možno - užít celou řadu nespecifických endonukleáz. Tyto - enzymy pak štěpí DNA zcela náhodně -na různých místech. Zakončení mohou - - být -modifikována vazbou různých sledů -dA + -dT nebo- dG + dC, - čímž -vzniknou místa- pro -působení -enzymu bez nutnosti navázání specifických -sledů.

Při použití rekombinantní - techniky proDNA bylo - možno- izolovat genetický kód -pro krysí růstový -hormon a tento -kód dále čistit, včlenit - - do plazmidu . -jako - vektoru a převést do mikroorganismu Escherichia coli, čímž vznikl kmen - Escherichia coli s genetickou schopností produkovat - krysí růstový -hormon.

Existence takového organismu má potenciálně velkou - cenu pro farmaceutický průmysl. Růstový hormon - - - savců, je velmi úzce vázán svojí strukturou - - -a - ze jména sledem aminokyselin. Přestože - hormony jednoho druhu jsou účinné - i - u -jiných druhů, - není tomu tak ve všech - případech. Například růstové hormony živočichů, odlišných od primátů, jsou neúčinné u lidí. Hormon je produkován podvěskem mozkovým ve velmi malém množství. Z tohoto - důvodu - -mohly být -až dosud dodávky přípravku s - růstovým hormonem, -zejména - lidským růstovým hormonem velmi malé. - Z - tohoto důvodu - je také nesmírně -omezen výzkum tohoto -hormonu. -Možnost produkce růstového- - hormonu člověka i jiných - živočichů by - měla - obrovský význam - ve farmakologii, - lékařství, - - veterinárním lékařství i- chovu- dobytka. - Podáváním růstového - hormonu -je - možno- léčit některé odchylky lidského růstu a vývoje. Hormon je možno získat z mrtvých - -lidí - -a je možno jej žít v -těžkých případech - - -trpaslictví, způsobeného nedostatečnou činností podvěsku mozkového. V - současné době - stojí toto - léčení 5000 dolarů - ročně jednoho nemocného. Bylo by zapotřebí - léčit každý rok 1000 nových pacientů, přestože vzhledem - k vysoké ceně je tato možnost omezena jen na nejtěžší případy. V případě, že - by bylo možno hormon dodávat za nižší -cenu, bylo by možno- léčit přibližně 10 000 dalších - . nemocných, jejichž stav je méně vážný, kteří by vš-ak přesto léčbu potřebovali. -Mimoto je zřejmé, že použití růstového hormonu - by bylo velmi účelné i u jiných onemocnění, například při krvácení do - trávicí soustavy, při hojení zlomenin a jiných - úrazů - a - u - metaibolických onemocnění - kostí. - V - současné době však není - k - dispozici dostatečné . - množství hormonu, aby - bylo- možno -prokázat účinnost této léčby.

Růstové hormony zvířat mají . rovněž - - své použití, zvláště v případech -chovu na - žír, kde je obvykle nutno - dosáhnout rychlé - zralosti -a ve-lké -hmotnosti zvířete - - při současné co největší - přeměně - krmivá - na bílkoviny. V případě, že se gen růstového- - - hormonu přenese do mikroorganismu, - je - -možhio - - vyvinout technologii, umožňující - - výrobu·, růstového hormonu v žádaném . - množství, -z - - žádaného zdroje při zlomku - dnešní ceny. - 'Bylo však zjištěno, že - při přenošu genu pro- . růstový -hormon do mikroorganismu ...nebylo možno- na -začátku dosáhnout - výroby růstového -hormonu ani prokázat - sebemenší množství růstového· hormonu v - použitém mikroorganismu.

Při použití -rekombinant DNA - tak, - jak - to bylo popsáno v přihlášce - č. -897 709 - - a - ve shora uvedené - publikaci - UHrlch A., bylo možno izolovat a čistit genetický ' kód pro krysí inzulín a včlenit tento kód do plazmidu a tento· vektor pak přenést do mikroorganismu Escherichia coli, čímž vznikl kmen Escherichia coli s genetickou schopností vyrábět krysí inzulín. Existence takového organismu má velký potenciální význam pro farmaceutický průmysl a pro lékařství. Až dosud jsou nemocní cukrovkou závislí na dodávce inzulínu, který je extrahován· ze slinivky břišní, získávané z jatek. Celkové požadavky na dodávku inzulínu patrně brzo· překročí možnost této· dodávky. Mimoto někteří nemocní jsou přecitlivělí na hovězí nebo vepřový · inzulín, který se k tomuto účelu běžně užívá. Bylo by proto žádoucí vyrábět lidský inzulín v co největším množství. Při přenosu inzulínového genu do mikroorganismu je možno vyvinout fermentační technologii, která umožní výrobu inzulínu v požadovaném množství z požadovaného zdroje. Prozatím však v případě inzulínového genu po jeho přenosu · do· mikroorganismu nebyla pozorována exprese tohoto genu.

Termín „exprese“ je užíván k vyjádření skutečností, že organismus velmi zřídka využívá všech genetických schopností v jakémkoli daném čase. I v poměrně jednoduchém organismu, například v bakterii, nedochází k syntéze celé řady bílkovin, které by buňka byla schopna produkovat, může však k jejich syntéze dojít za vhodných zevních podmínek. V případě, že se bílkovina, pro níž je kódem daný gen skutečně produkuje, nazývá se tato skutečnost expresí genu. V případě, že se bílkovina neprodukuje, k expresi genu nedochází. Obvykle je možno expresi genů v Escherbtra coli řídit tak, jak bude dále obecně uvedeno, například tak, že bílkoviny, jejichž funkce není v daném prostředí výhodná, se neprodukují a metabolická energie se uchovává. Je možno· uvést několik hypotéz na vysvětlení počátečního neúspěchu při expresi eukariotického genu v Escherichia coli. Bylo žjištěno mnoho rozdílů mezi expresí prokariotického genu a eukariotického genu •i · kontrolních genů. Objev včleněných sledů, které přerušují sledy, které jsou kódem pro některou z bílkovin u mnoha eukariotických genů, · dal vznik · domněnce, že ještě další 'strukturní rozdíly mohou nepříznivě ovlivnit schopnost prokariotických genů k expresi eukariotické DNA. Tyto skutečnosti byly podrobněji uvedeny například v publikacích Tilghman S. M. a další Proč. Nat. Acad., Sci · USA 74, 4406 (1977), a Jeffreys A. J. a Flavell, R. A. Cell 12, 1097 (1977). Je možné, že · eukariotická DNA obsahuje sled nukleotidů, který se chybně interpretuje při bakteriální transkripci · nebo· při použití translačních enzymů. Přestože univerzálnost genetického kódu je uznávanou skutečností, není · dostatečně vysvětleno pozorování, že •některé kodony jsou v eukariotické DNA zřejmě preferovány. Je dobře známo, že ří dicí prvky, které regulují dobu a množství exprese u genů živých buněk, jsou velmi odlišné od prvků buněk vyšších eukariotů, například krysy nebo· člověka, než je tomu u prokariotů, například u Escherichia coli.

Způsob, jímž se řídí exprese genu u Escherichia coli je již dobře znám v důsledku intenzivních výzkumů, které byly prováděny v průběhu posledních 20 let. Tyto pokusy byly popsány například v publikacích Hayes W., The Genetics of Bacteria And Their Viruses, 2. vydání, John Wiley a Sons, lne., New York (1968) a Watson J. D., The · Molecular Biology of the Gene, 3. vydání, Benjamin, Menlo Park, California (1976). Tyto studie prokázaly, že některé geny, obvykle ty, které jsou kódem pro bílkoviny s příbuznými funkcemi v buňce, jsou obvykle v kontinuálním sledu. Tento· sled se nazývá opeřen.. Všechny geny v operonu se transkrigují v tomtéž směru, přičemž se začíná od kodonu, který je kódem pro N-terminální aminokyselinu první bílkoviny ve sledu a pak se pokračuje až do C-terminálního zakončení poslední bílkoviny v operonu. ' ' Na začátku operonu v blízkosti kodonu pro N-terminální aminokyselinu existuje oblast DNA, která se nazývá řídicí oblast a která obsahuje celou řadu řídicích prvků včetně operátoru, promotoru a sledů pro· ribosomální místa vazby. Funkce těchto míst spočívá v tom, že řídí expresi genů, jejichž exprese odpovídá okamžitým potřebám organismu. Například geny, které jsou kódem pro enzymy, využitelné výlučně ke štěpení laktózy, jsou řízeny taik, že nedochází k jejich expresi dříve, než se v živném prostředí objeví laktóza nebo některý z jejích analogů. Kontrolní oblasti, kterých je nutně zapotřebí k expresi, jsou řídicí oblasti pro počátek transkripce a pro počátek translace. Exprese prvního genu ve sledu závisí na počátku transkripce a translace v poloze, která je kódem pro N-terminální aminokyselinu první bílkoviny operonu. Pak dochází k expresi každého genu po řadě tak dlouho, až dojde k terminačnímu signálu nebo· až je zařazen do řídicí oblasti jiný operon, který řídí odpověď na jiné seskupení podmínek zevního prostředí. Přestože od tohoto schématu může dojít k celé řadě odchylek, je důležitou skutečností, že gen musí být přesně uložen vzhledem k řídicí oblasti, zejména pokud jde o počátek transkripce a počátek translace, aby mohlo dojít k jeho expresi · v . prokariotickém organismu jako je Escherichia coli.

Bylo prokázáno, že je možno včlenit do operonu geny, které nejsou běžnou částí tohoto operonu. Klasický průkaz této možnosti byl podán v publikaci Jacob F. a další, J. Mol. Bíol. 13, 704 (1965). Tato publikace popisuje postup, při němž byly geny, · které byly kódy pro enzymy biosyntézy purinů přeneseny do· oblasti, řízené operonem pro laktózu. Došlo k úkazu, kdy exprese genu pro biosyntézu uvedeného· enzymu byla potlačena v nepřítomnosti laktózy nebo analogu laktózy a nebylo· možno' ' ji vyvolat podmínkami, které jinak běžně vyvolaly expresi.

Kromě operátoru, který řídí iniciaci transkripce genů, existují ještě kodony, jejichž funkcí je zastavit další syntézu a které tedy určují C-terminální zakončení dané bílkoviny. Tyto kodony byly uvedeny v tabulce 2 a jsou nazývány terminačními signály nebo· také kodony bez vlastního smyslu, protože nejsou běžným kódem pro žádnou aminokyselinu. V případě, že dojde ke zničení terminačního signálu mezi strukturálními geny operonu, dochází ke vzniku spojených genů, které může mít za následek produkci chimérního proteinu, který . sestává z dvou sledů aminokyselin podle příslušných ' genů, přičemž tyto sledy jsou mezi sebou vázány peptidovou vazbou. Ze skutečně dochází k produkci chimérních bílkovin při spojení genů, -bylo prokázáno v publikaci Benzer S. a - Champe S. P., Proč. Nat. Acad. Sci, USA 48, 114 (1962).

Byl také připraven vektor pro· p-řenos rekombinantního· plazmidu s obsahem té části operonu pro laktózu, která obsahuje operátor, promotor a podstatnou část strukturálního genu pro první -enzym operonu, kterým je /~-gila'ktoisidáza. Tento postup byl popsán v publikaci Polisky B. a další, Proč. Nati. Acad. Sel USA 73, 3900 (1976). - Původní plazmid byl označen pSF2124 jako- derivát ColEl a byl popsán v publikaci So M. a další Mol. Gen. Genet. 142, . 239 (1975). Oblast -operonu pro laktózu byla odvozena -od lambda pac 5 -a postup byl popsán v publikaci Shapiro J. -a -další, Nátuře 224, 768 (1969) při spojení 28S -ribosomální DNA z Xenopus lavis bezprostředně za fragmentem -genu pro- - -/;Sgalaktosidázu došlo k produkci RNA, schopné hybridizace s- 28S - DNA z Xenopus lavis -za přítomnosti induktoru operonu pro laktózu. Mimoto - některé kultury produkovaly určitý typ /-galaktosidázy s vyšší molekulární hmotností, než je hmotnost přírodního enzymu, takže patrně došlo k -syntéze chimérní bílkoviny.

Exprese nižšího -eukariotického genu z kvasinek po- přenosu na Escherichia coli byla popsána v publikaci Ratzkin B a Carbon J. Proč. Nat. Acad. Sci, USA 74, 487 (1977) a - Struhl D. a Da-vis R. W. Proč. Nat. Acad. Sci. USA 74, 5255 (1977). V těchtopokusech měly určité klonované geny kvasinek schopnost doplnit nedostatek bakterií, do nichž byly přeneseny, přestože jiné -geny kvasinek tuto schopnost neměly. Přenesené gemy kvasinek -obsahovaly svou vlastní řídicí оЫ-ast. Prostředky, jimiž je možno dosáhnout -exprese přenesením genu z kvasinek tedy patrně závisí na poměrně vzácné možnosti přenosu celého -strukturálního genu spolu s- jeho . -řídicí oblastí. Mimoto může existovat pouze omezené množství řídicích oblastí и kvasinek, jejichž funkce je zachována i v bakteriální buňce.

Podstata. vynálezu

Vynález se týká vektoru pro přenos DNA, který -obsahuje -eukariotický gen, --schopný exprese, dále mikroorganismu, který obsahuje -eukariotický gen -a v -němž dochází k jeho expresi, minibuňky, obsahující eukariotický gen, v níž dochází k jeho expresi a způsobu - produkce uvedeného plazmidu, -mikroorganismu a -minibuňky. Pod pojmem „vektor pro přenos a expresi“ se rozumí vektor pro- přenos, který -obsahuje eukariotický gen v takovém umístění vzhledem k řídicí oblasti, že může -dojít k expresi -genu v mikroorganismu, který -obsahuje uvedený vektor. Podstatnou vlastností tohoto- typu vektoru pro přenos a expresi je skutečnost, že heterologní gen, k jehož expresi má dojít, je vázán na prokariotický řídicí fragment. Řídicí fragment může sestávat pouze z části řídicí oblasti, která zajišťuje iniciaci transkripce a iniciaci translace a mimoto může obsahovat -část strukturálního genu. Heterologní DNA musí být vázána na -řídicí fragment takovým způsobem, - aby genetickou informaci bylo možno odečíst. Genetickou informaci je možno- - odečíst tehdy, když tatáž skupina nukleotidů má za -následek produkci správných aminokyselin v řídicím fragmentu i heterologním genu. V případě, že heterologní gen je vázán takovým způsobem, že informaci je možno -odečíst původním způsobem, dojde při -expresi genu, která je řízena řídicí oblastí k výrobě chimérní bílkoviny, v níž je produkt normálního- genu vázán na produkt heterologního genu.

Je tedy možno zásadně postupovat dvojím způsobem. Spojením eukariotického genu -s genem pro výrobu bílkoviny, běžně vyráběné nebo -chráněné před -rozpadem, - je možno zvýšit stálost chimérní bílkoviny. - - - S výhodou dojde k tomu, že chimérní bílkovina projde buněčnou membránou do -růstového prostředí. V tomto případě je pak snadnější i čištění -ex-tracelulární bílkoviny. -Druhou možností je vázat -eukariotický gen na -gen s -žádoucími genetickými vlastnostmi, například na gen, -jehož řídicí oblast má výhodné vlastnosti, které mohou usnadnit produkci vektoru pro- přenos a expresi, jeho udržení v -hostitelské buňce nebo -rychlost snytézy chimérní bílkoviny.

Příkladem prvního- postupu může být krysí -růstový hormon. -Gen pro krysí -růstový hormon byl navázán na gen -pro- /Slaktamázu z Escherichia- coli, která přenáší -odolnost proti ampicilinu. V případě, že .se vektor tohoto typu užije k transformaci mikroorganismu, dochází u tohoto mikroorganismu ke schopnosti produkovat chimérní bílkoviny, v nichž je sled aminokyselin z -části β-laktamážy spojen se sledem aminokyselin pro· prekursor krysího růstového 'hormonu RGH. Obdobným způsobem bylo možno spojit gen pro výrobu krysího prekursoru pro inzulín s genem pro· produkci /-galaktosidázy s Escherichia coli a vytvořit výsledný plazmid. Při expresi tohoto plazmidu došlo k produkci chimérní bílkoviny.

Základní požadavek pro použití způsobu podle vynálezu je ten, že musí vzniknout místo štěpení v oblasti genu, a to· v jeho řídicí oblasti. Stejným způsobem musí vzniknout místo štěpení v heterologní DNA na hranici nebo v blízkosti, avšak vně nukleotidového sledu, který je kódem pro N-t-erminální aminokyselinu bílkoviny, k jejíž syntéze má dojít. Spojení prokariotického genu DNA s heterologní DNA musí být takové, aby způsob odečítání v prokariotickém genu měl tentýž směr jako v heterologní ' DNA. Štěpení se pak s výhodou provádí působením restrikční endonukleázy, přičemž předem zvolená místa štěpení nesmí být citlivá na tentýž restrikční enzym. Z tohoto důvodu po spojení ze směru odečítání v prokariotické DNA a v heterologní DNA tentýž.

Je možné spojit náhodně štěpené prokariotickou a heterologní DNA a pak provádět selekci získaného materiálu podle příslušných hledisek. V tomto případě však je naděje na správný sled odečítání 1/3, naděje na správnou orientaci 1/2, to znamená, že· naděje ' na získání' genu schopného exprese je 1/6, i v tomto případě však je možno· správnou selekcí dosáhnout žádaného materiálu. Je tedy možné způsobem podle vynálezu spojit jakýkoliv eukariotický gen nebo jeho fragment se zvoleným prokariotickým genem nebo· jeho řídicím fragmentem a získat tak vektor, který je schopný exprese.

Podrobný popis způsobu podle vynálezu

K přenosu segmentu heterologní DNA na určité 'místo vektoru tak, aby došlo k expresi heterologní DNA a ke vzniku chimérní bílkoviny je nutno zachovat několik podmínek. Především je zapotřebí zvolit funkční gen ve vektoru a do tohoto genu včlenit heterologní DNA. Volba fragmentu operonu závisí na proveditelnosti celého postupu. V případě použití operonu pro resistenci proti ampicilinu, který je kódem pro produkci enzymu /-laktamázy, jde o velmi výhodný postup, protože tento operon je již přítomen v celé řadě plazmidů, které jsou běžně pro tuto práci užívány a také z toho důvodu, že tento enzym se nachází v periplazmatických prostorech a je uvolňován při tvorbě sferoplastů. V případě, že je možno pozorovat totéž u chimérní bílkoviny, je možno· stabilizovat bílkovinu přenosem do periplazmatickéhO' prostoru nebo vyloučením této· bíkoviny z vnitřního prostoru buňky. ' Tímto způsobem je · také možno velmi zjednodušit čištění této· bílkoviny. V tomto smyslu je velmi atraktivní lac-operon, protože tento operon je geneticky podrobně prostudován a je · k dispozici celá řada · mutant, které mohou změnit rychlost exprese genu při ' ' řízení lac operátorem. Je nutno· vzít v úvahu také možnost biosyntézy chimérních bílkovin, které je možno· snadno štěpit enzymaticky nebo chemicky a tak oddělit od chimér ní bílkoviny žádaný segment.

Gen, na nějž má být vázána heterologní DNA, může být štěpen nespecifickým nebo specifickým způsobem. Nespecifické štěpení je možno· provést různými endonukleázami nebo ultrazvukem. V tomto případě obvykle vzniknou jednotné molekuly. Příslušnými mikrobiologickými a selekčními způsoby je pak možno stanovit, zdali došlo k plazmidu, který je · schopen exprese. Z ' materiálů, které uvedeným postupem mohou vzniknout, je tento případ poměrně vzácný. Z tohoto důvodu klade štěpení na nespecifických místech velké nároky na. selekční postupy i na citlivost těchto postupů a na ostatní způsoby stanovení.

S výhodou se proto užívá specifického štěpení pří použití předem zvolené restrikční endonukleázy, která působí na známém místě. S výhodou se postup provádí tak, že existuje ještě další místo pro působení enzymu, a to buď pro působení téhož enzymu, nebo pro působení jiné restrikční endonukleázy. Přítomnost tohoto místa dovoluje odstranit určitý úsek plazmidu a nahradit 'tento úsek novým segmentem, který obsahuje heterologní DNA.

Bez 'ohledu na to, jakým způsobem je ' , na začátku odštěpen prokariotický gen, je možno· modifikovat jeho zakončení tak, že se na tato zakončení naváží nukleotidy, čímž je možno vytvořit nebo změnit specifická místa pro působení restrikčního enzymu nebo je možno usnadnit vzájemnou vazbu zakončení. Je známa celá řada exonukleáz, které hydrolyzují fosfodiesterové vazby · na zakončeních 3‘ a 5‘. Celá řada restrikčních endonukleáz štěpí DNA s dvojitým řetězcem tak, že vznikají krátké jednoduché řetězce u odštěpených konců. Tyto řetězce je popřípadě možno odstranit exonukleázami, například nukleázou Sl, která je specifická pro určitý substrát. Je však možno také získat párová zakončení tak, že se prodlouží komplementární řetězec navázáním krátkého segmentu DNA, který vyplní nepárovou oblast. K tomuto účelu je možno užít enzym DNA polymerázu. Další možností je přidat nukleotidy náhodným způsobem. Například při náhodné vazbě kyseliny desoxyguanilové (dG]a desoxycytidylové (dC) může vzniknout sled GGCC, který se odečítá od zakončení 5‘ k 3‘ zleva doprava. Tento sled je místem působení enzymu Hae ΙΙΊ. Použitím náhodné vazby nukleotidů je tedy možno vytvořit nové místo· působení pro restrikční enzymy, přestože tato místa budou náhodně rozložena vzhledem k' původnímu zákonce ní a vzhledem ke způsobu odečítání. Výhodná a specifická metoda k modifikaci těchto zakončení je syntéza oligonukleotidů, které se účastní této vazby a která je popsána v . publikaci Scheller R. H. a další, Science 196, 177 (1977). Tímto způsobem je možno přidat., na zakončení molekuly DNA jakýkoliv požadovaný sled nukleotidů. Tím je tedy možno. i zařadit jakékoliv místo pro· působení . restrikčního enzymu. V zásadě . je možno navázat i dlouhé sledy nukleotidů. Je pravděpodobné, že bude možno syntetizovat i řídicí oblast, která řídí začátek transkripce a translace a že bude také možno· takto vzniklý .sled navázat přímo na heterologní DNA.

Tentýž způsob pro modifikaci zakončení fragmentu prokariotického operonu je možno· použít i v případě heterogenní DNA. Je samozřejmé, že toto působení nesmí narušit nebo· modifikovat sled, který je kódem pro bílkovinu, která má být syntetizována. Heterologní fragment DNA, k jehož přenosu má dojít, nesmí obsahovat sled pro prokariotickou řídicí funkci a s výhodou má .obsahovat místa pro· působení restrikčního. enzymu vně oblastí, k jejíž expresi má dojít. S výhodou jsou tato místa vhodná pro působení téže restrikční endonukleázy, která byla užita k vynětí oblasti plazmidu, do· níž má být vsazen fragment heterogenní DNA. Tento· požadavek není absolutní a· je v případě potřeby možno jej obejít například chemickým způsobem. Podstatné je pouze to, aby místa štěpení operonu a heterologní DNA bylo možno navázat a aby tato místa byla odečítána stejným způsobem. Tato podmínka je nutná k tomu, aby bylo možno, správně odečíst heterologní kodony. Například v případě, že se místo štěpení v operonu .nachází mezí triplety, je nutné, aby místo štěpení v heterologní DNA bylo umístěno· rovněž mezi triplety. . V případě, že místo štěpení v operonu se nachází za prvním nukleotidem směrem od zakončení 3‘ v tripletu, je nutné, aby místo štěpení v heterologní Dna bylo uloženo za dvěma nukleotidy od zakončení 5‘ tripletu a podobně.

Dále je nutné, aby heterologní DNA byla vložena ve správném směru. Směr transkripce heterologního genu musí být .tentýž jako · směr transkripce operonu. Jinak je informace v . heterologní DNA odečítána opačným způsobem a je tedy beze smyslu. V některých případech je možno stanovit, zda došlo ke správnému včlenění. V jiných případech je možno· provádět . selekci, protože ke správné orientaci dochází z 50'% pravděpodobností.

Je také nutné navrhnout selekční systém k tomu, aby bylo možno identifikovat mezi produkty reakce, katalyzované DNA--igázou ty vektory, .které obsahují správnou kombinaci polynukleotldových fragmentů.

Obecný postup bude pochopitelnější v případě,. že bude doplněn, popisem specifických technik, které jsou užívány při prová dění způsobu podle vynálezu. Na obr. 1 .jsou uvedeny stupně, které se používají při · · vytváření plazmidu, který obsahuje převážnou část genu pro krysí proinzulín ve vazbě na řídicí oblast .a krátký úsek na· strukturálním genu jSgalaktosidázy. Na .obr. 1 až 4 je .DNA s dvojitým řetězcem znázorněna jednoduchou čárou a plazmidová DNA, . která má tvar smyčky, je znázorněna kruhem. .Přibližné umístění místa působení restrikčních endonukleáz. je rovněž vyznačen. Geny, . o které běží, to jest operon pro· laktózu (lacj, kód pro odolnost proti ampicilinu (Ap^rj, který je kódem pro produkci J-aktamázy a .odolnost proti tetracyklinu (Th) jsou znázorněny jako oblouky, které jsou zakresleny rovnoběžně s přibližným umístěním těchto úseků relativní k místům působení -restrikčních endonukleáz . a k sobě navzájem. Šipky znázorňují směr transkripce .pro každý z .uvedených genů.

Plazmid pBH20 s včleněným fragmentem operonu pro laktózu lambda plac5· pro· štěpení HaellI v blízkosti řídicí oblasti byl již předem sestrojen, jak bylo· popsáno v · publikaci Itakura K. a další, Science 198, 1077 (1977). V případě, že na pBH20 působí EcoRI restrikční endonukleázy, dojde k redukci lineární plazmidové molekuly s· jednoduchým řetězcem a komplementárními · zakončeními. Tato· zakončení je možno oddělit působením nukleázy Sl. Výsledná· molekula se podrobí působení DNA-ligázy za současného navázání syntetického- nukleotidového· dekameru, který obsahuje místo· působení prorestrikční enzym HindlII. Tato vazba nepárových zakončení byla popsána v .publikaci Sgaramella V. a další, Proč. Nat. Acad. Sci. USA 67, 1468 (1970). Účelem přidání místa působení pro HindlII je umožnit .specifickou vazebnou .reakci s fragmentem genu pro proinzulín. Vazba působením DN-ligázy poskytuje vyšší výtěžek navázaných molekul v případě, že zakončení jsou kohezívní. Fragment proinzulínového· genu, pAU-1 .obsahuje celý strukturální gen pro proinzulín· s výjimkou dvou 2 N terminální aminokyseliny. Ze znalosti sledu nukleotidů . · ve fragmentu lac-genu v pAU-1 je · možno ·. usuzovat, že odečítání genu proinzulínu · bude souhlasit s odečítáním lac-fragmentu. .Sled lac v oblasti místa štěpení enzymem EcoRI je tento

5‘-GGATTCACTGG-3‘

3‘-CCTAAGTGTGA.C.CTTAA-5‘

Působením nukleázy Sl má být · .odstraněn pouze terminální nepárový sled TTAA. V- některých .případech dojde k tomu, že nukleáza Sl oddělí z řetězce ještě další zbytky, což je nežádoucí, protože · může · dojít k . porušení způsobu odečítání. V tomto . případě však došlo ke správnému působení enzymu a navázání dalšího sledu vzniklo místo.

Μ působení Hae III v místě spojení sledu po působení HindlII a lac-DNA:

5‘-GGATTCACTGGCCAAGCTTGG

3‘-CCTAAGTGACCGGTTCGAACC místo působení HaelII.

Tímto způsobem bylo možno provádět kontrolu správného· produktu nezávisle na expresi tak, že byl prokázán vznik nového· místa pro působení HaelII.

Proinzulínový fragment a fragment lac genu byly podrobeny působení enzymu HindIII, čímž vznikla kohezívní zakončení, která byla spojena působením T4 DNA ligázy. Produktem tohoto· působení pak byly transformovány budky Escherichia coli. Tyto buňky pak byly podrobeny selekci podle své schopnosti růst za přítomnosti ampicilinu. Ty transformované buňky, které obsahovaly fragment proínzulínového· genu nebyly odolné při koncentraci 20 ug/ml tetracyklinu. Sled pAU-1 v pLRI-1 je oddělen místy působení pro HindMI, který byl užit pro · včlenění tohoto sledu. Uložení sledu pAU-1 v pLRI-1 je takové, že heterologní DNA přerušuje část promotoru pro gen odolnosti proti tetracyklinu · a tímto způsobem · snižuje jeho expresi. Avšak v případě, že sled pAU-1 je orientován tak, že část dA:d T genu přiléhá ke zbývající části sledu promotoru, dojde k určité expresi genu pro· · odolnost proti tetracyklinu. V důsledku toho může sled pAU-1 včleněný v příslušné orientaci působit vznik odolnosti k nízkým koncentracím tetracyklinu řádu 5 og/ml v bakteriích, · které obsahují tento vektor. Tato ^;skutečnost byla použita pro selekci vektorů se správnou orientací uvedeného sledu. Pak byly transformované kolonie sledovány vzhledem k existenci nového místa pro HáelII izolací plazmidů, působením HaelII a analýzou takto vzniklých fragmentů elektroforézou na gelu. Plazmidy, které splňovaly všechny požadavky, byly zvoleny k dalším pokusům na expresi a označeny pLRI-1, jak je schematicky znázorněno na obr. 2.

Byly užity dvě metody sledování · exprese proinzulínového genu v pLR-1. Především byla srovnávána velikost bílkovin, které byly produkovány transformovanými buňkami s· velikostí bílkoviny v molekule, které byly produkovány buňkami transformovanými pBH20 elektroforézou na akrylamidovém gelu s dodecylsíranem sodným (SDS). V oblasti očekávané chimérní bílkoviny se nacházela celá řada dalších bílkovin, takže chimérní bílkovinu nebylo možno nalézt. Druhý pokus byl proveden při použití transformovaných minibuněk. Tyto buňky jsou produkovány v průběhu růstu mutanty Escherichia coli P678-54, jak je popsáno v publikaci Adler Η. I. a další, Proč. Nat. Acad. Sci. USA 57, 321 (1966). Kromě normálního· buněčného dělení dochází u buněk mutanty P678-54 ještě k aberantnímu dělení, jehož důsledkem je tvorba minibuněk, které jsou daleko menší, než původní buňky a neobsahují původní buněčnou DNA. V důsledku toho nemají tyto minibuňky schopnost provádět syntézu bílkovin, řízenou DNA. Jinak se zdají minibuňky normální, mají buněčnou stěnu normálního· vzhledu a · také buněčná plazma je zjevně stejná s běžnou buněčnou plazmou. V případě transformace plazmidem produkuje kmen minibuněk další minibuňky, které obsahují kopii plazmidů. Tyto minibuňky mají omezenou schopnost exprese plazmidového genu. Počet bílkovin, ' které mohou být produkovány těmito minibuňkami, je podstatně omezen ve srovnání s normálními buňkami, a tato skutečnost vytváří základ pro analýzu syntézy bílkovin, řízenou plazmidem. Tato analýza se pak provádí elektroforézou na SDS-akrylamidovém gelu, jak bylo popsáno v publikaci Meagher R. B. a další, Cell 10, 521 (1977). Výsledky této analýzy při použití minibuněk, transformovaných působením pLRI-1 byly rovněž negativní.

Výsledky, které byly až dosud získány při použití pLRI-1, ukazují na nízkou úroveň zjistitelné exprese při · použití tohoto plazmidu. Cr.imsrní bílkovina je novou látkou s novým sledem aminokyselin. V přítomné době je nemožné předpovědět do· detailu konfiguraci nebo funkční vlastnosti bílkovin ze sledu jejich aminokyselin. Není také možno· předem určit odpověď buňky na novou bílkovinu. Chimérní bílkovina může 'být nestálá v nitrobuněčném prostředí ze zatím neznámých důvodů. Bílkovina může být rozložena nitrobuněčnými proteázami nebo se může vázat na nerozpustné složky buněk. Délka /3galakt-osidázového genu, který · přispívá k vytváření chimérní bílkoviny, není jediným faktorem, protože byla možno pozorovat i expresi vaječného albuminu, vázaného · na (3-aalaktosidázový řetězec téže délky. S největší pravděpodobností je kritickým faktorem povaha a vlastnosti specifické chimérní bílkoviny, k jejíž expresi dochází. Protože pLRI-1 má správný způsob odečítání a správnou orientaci, je možno očekávat, že při použití příslušného testu bude nakonec možno· prokázat expresi proinzulínového genu.

Při druhém typu pokusů bylo užito velké molekuly heterologní DNA, která obsahovala celý gen proinzulínu a mimoto 13 aminokyselin preinzulínového· sledu. Na obr. 3 je znázorněno konstrukční schéma plazmidu, do něhož byl členěn gen krysího prekursoru preinzulínu. Plazmid pBGP120, popsaný ve shora uvedené publikaci Polisky B. a další byl použit jako zdroj fragmentu lac operonu, který je kódem přibližně pro· 1000 aminokyselin. Plazmid pBR322, popsaný v publikaci Bolivar F. a další, Gene 2, 95 (1977) byl použit k přenosu lac operonu a jeho fragmentu vzhledem ke svému menšímu rozměru a snadné transformaci, růstu a izolace. Oba plazmidy byly odštěpeny 'restrikčními endonukleázami HindlII a EcoRI - z každého - plazmidu byly získány dva fragmenty, jejichž molekulární hmotnost je uvedena na obr. 3. Směs fragmentů byla vázána · působením T4 DNA ligázy, čímž byly získány plazmidy, zkřížené produkty a pravděpodobně ještě celá ' řada komplexních- - forem. Všechny kombinace bylo možno rozlišit -elektroforézou na · agarézovém gelu.

Transformanty byly podrobeny selekci na plotnách XGal (Millér J., Experiments in Moleculat Genetics, Gold · Spring Harbor Lsboratory, 1972) s obsahem ampicilinu. Kolonie s· jSgalaktosidázeu jsou na těchto- .plotnách modré - s - rostou pouze ty kolonie, které obsahují Ap^r. Aby bylo možno zjistit správný rozměr - plazmidu, bylo odebráno několik modrých kolonií s z každé této kolonie byly- - znovu vypěstovány malé kultury, plazmidy- byly znovu izolovány s byla zjišťována jejich velikost na agarózovém gelu. Správná velikost je 6,5 x 10⁶ dsltonů. Aby bylo možno dále potvrdit strukturu požadovaného plazmidu, byly měřeny rozměry fragmentů po- štěpení enzymy Hin-dlII s EcoRI elektroforézou na polyskrylamidovém gelu. Diagram pro výsledný plazmid, - který byl označen pTS-1, je uveden -na obr. 4.

Aby bylo- možno sestrojit fregment inzulínového genu, který je kódem pro- celý sled proinzulínu, byly navázány dvs předem klonované fragmenty, jejichž sled nukleotidů je znám, s to pAU-1 s - pAU-2, jak bylo popsáno - ve shora uvedené publikaci Ullrich

A. Dva fragmenty se ve svém sledu překrývají a mají společné místo Alul v překrývající se oblasti. Toto míste- bylo užito- ke štěpení. Předtím však byly působením alkalické fosfatázy odstraněny terminální fosfátové skupiny. Štěpením vznikly nepárové konce, --s protože ke štěpení došlo v oblasti společného- sledu, došlo- by po novém spojení obou fragmentů- k rekonstituci celého genu. Dvs větší fragmenty, jejichž spojení bylo pozorováno, byly čištěny elektreférézeu před působením ligázy. Po působení ligázy byly frakcionovány tři zásadně možné produkty - elek'tréfor·ézeu na gelu s byl izolován požadovaný fragment střední velikosti. Tímto· způsobem bylo možno včlenit - i pAU-1 i pAU-2. - Zbývající zakončení této molekuly mají - kohezívní zakončení typu HindlII. Celá molekula- byla tedy okamžitě včleněna do pBR322 v místě, vhodném pro- štěpení enzymem HindlII -s ke -zbývajícím stupňům celého - postupu bylo pak- možno užít transformantů, které nesly výsledný plazmid.

Inzulínový gen byl uvolněn z plazmidu působením- enzymu - HindlII s byl čištěn. Koncové - skupiny byly modifikovány - působením nukleázy S1 k odstranění jednoduchých - řetězců -s pak byla provedena - vazba na- následující sled nukleotidů:

TGAATTCA

ACTTAAGT .

Tímto způsobem bylo získáno místo, specifické pro působení enzymu EcoRI, -jak bylo popsáno v publikaci Greene P. J. a další,

J. Mol. Biol. 99, 237 (1975'). Na m^^ifiko^^nou DNA pak bylo působeno EcoRI s -byls včleněna do- pTS-1 v místě, vhodnému pro . působení EcoRI. Tímto způsobem mohlo; být v místě pro působení EcoRI dosaženo správného způsobu -odečtení genu pro produkci' e-galaktosidázy, jsk bylo popsáno ve svrchu; uvedené publikaci - Polisky - B. s další. - -Test na - správnou orientaci - včleněného inzulínového genu byl proveden při využití - - místa pro působení HaelII ve včleněném - inzulíno-vém genu, protože toto místo je uloženo, asymetricky vzhledem k ostatním místům· - pro' působení HaelII v plazmidu. Správná orientace má za následek možnost - předpovědět velikost fragmentů po- štěpení HaelII. Výsledný plazmid se správně včleněným; - inzulínovým -genem byl označen pLRI-2 - s - je - chsfaktorizován diagramem, uvedeným na - obr. 2. Obdobným postupem je možno - -dojít' ke konstrukci plazmidu pro expresi lidskéhoinzulínu při zachování svrchu uvedených zásad.

Reakční sled pro navázání genu pro -. krysí růstový hormon na gen - pro /í-laktamázu- - je. d alším příkladem tohoto postupu. - Ns - obr. - 5 je tento postup diagramaticky - znázorněn: Ns obr. 5 je znázorněna DNA s - dvojitým- řetězcem jednoduchou čárou s - plazmidová; DNA, která má -formu- zavřené' smyčky, - je znázorněna kruhem. PřiЫižné;.mí'ste·prc.ιpů- sobení restrikěního enzymu je rovněž -oznat čeno. Relevantní geny, s to pro - krysí -růsto- vý hormon (RGH), pro -odolnost proti - ampicilinu (A.MP), který je současně - -kódem pro redukci /31aktam.ázy a pro - -odolnost· - proti; tetracyklinu (TET) jsou - znázorněny jako čtyřúhelníky v přibližném umístění vzhledem k místům působení restrikčních- - enzymů a vzhledem -k sobě navzájem.

Původní plazmid - s obsahem RGH - genu - by.l· odvozen způsobem podle přihlášky číslo· 897 710 s podle publikace Seeburg P. H.· s ' další, Nátuře 270, 486 -(1977) -s byl - o-značen pRGH-1. Sled nukleotidů - - pro - krysí růstovýhormon, obsažený v pRGH-1 - byl stanoven- a: srovnáván s těmi -částmi - aminokyselinového: sledu krysího růstového hormonu, které- jsou známy. Sled nukleotidů pro plazmid’- RGH i je dlouhý přibližně 800 párů - bází - s zahrnuje nukleotidy, které jsou kódem pro - 26- aminokyselin prepeptidu s 29 nukleotidů, které jsou částí 5‘-nepřen-esené oblasti - -růstového hormonu, převážně jeho - mRNA; - - Mimoto- obsahuje sled - přibližně 100 - - nukleotid dů, to jest - celou 3‘-n'epřeneseneu - oblast. Místo pro působení restrikční -endonukleázy Pstl - je možno nalézt mezi: 23. - s 24· - aminokyselinou sledu pre-RGH. Toto - místo' rovněž: existuje v genu pro - odolnost- proti, ampicilinu v plazmidech - pMB9 - s - pBR322. RGH, - sled v pRGH-1 je ohraničen místy pro působení HindlII, který byl užit pro jeho včlenění.

Gen o 800 párech bází pro RGH byl izolován působením HindlII na pRGH-1 a byl čištěn elektroforézou na polyakrylamidovém gelu. Plazmid pMB.9, který obsahuje jediné místo pro působení HindlII v promotoru pro odolnost proti tetracyklinu, byl štěpen enzymem HindlII a podroben působení bakteriální alkalické fosfatázy, aby nedošlo ke zpětné vazbě týchž konců v dalších stupních, jak bylo uvedeno v přihlášce č. 898 887 a ve shora uvedené publikaci Ullricha A. a dalších. Směs rozštěpené plazmidové DNA a segmentu RGH DNA se podrobí působení DNA ligázy, čímž vznikne plazmid, který je možno označit pMB9 (RGH), jak je znázorněno na diagramu v obr. 5. Výsledné plazmidý byly použity к transformaci Escherichia coli a získány zpět selekcí kolonií, odolných proti tetracyklinu v koncentracích 5 ^g/ml.

Zásadně byly možné dvě orientace sledu RGH. Žádanou orientaci bylo možno odlišit přípravou radioaktivně značeného plazmidu z izolátů jediné kolonie s následným štěpením endonukleázami EcoRI a Pstl. Rozměr značených fragmentů bylo možno stanovit elektroforézou na gelu. Orientace RGH segmentu v opačném směru má za následek, že místo- pro· působení Pstl leží blíže к místu pro působení EcoRI, čímž vzniká po štěpení oběma restrikčními -enzymy menší fragment, než bylo možno očekávat při správné orientaci.

Při následujícím čištění správně orientovaného pMB9 (RGH) byl plazmid podroben působení endonukleáz Pstl a BamHI. Plazmid pBR322, znázorněný na obr. 5, byl rovněž podroben působení enzymů Pstl a BamHI. V plazmidu pBR32Ž se nachází místo pro působení enzymu Pstl mezi aminokyselinami 182 a 183, počítáno od N-zakončení β-laktamázového genu, a to od první z 23 aminokyselin bílkoviny, která je prekursorem (3-laktamázy. Místo pro působení BamHI je v genu pro odolnost proti tetracyklinu na přesně stejném místě jako v pMB9, protože tato oblast pBR322 byla odvozena od pMB9, jak je popsáno ve shora uvedené publikaci Bolivar F.

Po působení enzymu se pBR322 podrobí působení bakteriální alkalické fosfatázy, aby nemohlo dojít к opětné vazbě získaných zakončení. Fragmenty pak byly spojeny působením DNA ligázy s rozštěpením pBM9 (RGH).

Výsledná struktura plazmidu je znázorněna na obr. 1 a je označena pExRGH, aby bylo možno označit úlohu tohoto plazmidu pro expresi. Po transformaci produkty působení ligázy se transformované bakterie podrobí selekci na odolnost proti vysokým koncentracím tetracyklinu 20 ^g/ml. Protože původní plazmid pMB9 (RGH) je odolný pouzie proti koncentrací tetracyklinu 5 ^g/ /ml a po působení fosfatázy nemohlo dojít ke vzájemnému spojení fragmentů pBR322 bylo možno oddělit elektroforeticky malý fragment a byly získány kolonie jediného typu, v nichž docházelo к expresi plazmidu. Plazmid je odolný proti tetracyklinu vzhledem к opětnému vytvoření úplného genu pro odolnost proti tet-racyklinu v místě štěpení BamHI. Odvození každé oblasti plazmidu je tedy toto: oblast ve směru hodinových ručiček počíná v místě štěpení Pstl, přechází přes místo štěpení EcoRI a HindlII к místu pro štěpe-ní enzymem BamHI, celá tato oblast pochází z pBR322. Od místa štěpení BamHI к dalšímu místu štěpení EcoRI až do místa štěpení HindlII je odvozena od pMB9 a oblast označovaná RGH se nachází mezi místem štěpení HindlII až do místa štěpení Pstl, které má svůj původ v pRGH-1.

Úplný sled nukleotidů DNA růstového hormonu a genu pro (3-laktamázu v pBR322 jsou známy a popsány například ve shora uvedené publikaci Seeburg P. a další a v publikaci Sutcliffe a další, Proč. Nat. Acad. Sel. USA 75, (1978). Rekonstrukce těchto dvousledů jejich spojením v místě štěpení Pstl determinuje fázi sledu pro pre-RGH, protože byla determinována i orientace úseku RGH v pMB9. Na obr. 6 je znázorněn sled v oblasti místa Pstl v pExRGH a je naznačen také správný způsob odečítání pre-RGH, který je v tomto případě zachován. Z toho vyplývá, že produkt, pro nějž je tato oblast kódem, je chimérní polypeptid, který sestává z N-terminálních 182 aminokyselin β-laktamázy, z nichž prvních 23 aminokyselin tvoří část předběžného sledu, pak následuje 23 aminokyselin předběžného sledu RGH a 190 aminokyselin vlastního RGH. Elektroforézou a imunochemickým způsobem je možno prokázat, že transformované buňky Escherichia coli skutečně produkují takovou bílkovinu po transformaci pExRGH, jak bude prokázáno v následujících příkladech.

V oblasti produkce bílkovin, pro něž jsou kódem plazmidy, jsou dvě základní obtíže. První z těchto obtíží je obecný problém, který spočívá v tom, že vzniklá bílkovina se získává v čisté formě z růstového prostředí nebo z buněčného extraktu. К tomuto účelu je možno užít řady metod. V některých případech jsou specifické bílkoviny vylučovány do živného· prostředí. К tomuto úkazu dochází například v případě (3-laktamázy, jejíž velká část je uvolňována do živného prostředí, jakmile dochází к přeměně buněk na sporoplasty. Nitrobuněčný transport chimérní bílkoviny není možno předpokládat na základě chování kterékoliv bílkoviny, která vytváří její strukturu. Při elektroforéze na polyakrylamidovém gelu s dodecylsíranem sodným bylo v případě polypeptidů produkovaných minibuňkami kmene P678-54 s obsahem pExRGH nebo pBR322 několik rozdílů, jak bylo možno očekávat v případě dvou podobných, avšak odlišných plazmidu.

Je - překvapující, že nový . -polypeptid má molekulární hmotnost přibližně 47 000 v případě,· -že jde o· minibuňky s obsahem pExRGH. Tento údaj je v mezích experimentální chyby očekávané molekulární hmotnosti chimérní bílkoviny, · která obsahuje /S-aktamázový · fragment a pre-RGH . a -jejíž . molekulární. -hmotnost by měla bý-t 44 300. Na druhé . straně minibuňky s· obsahem pExRGH nevytváří -dva polypeptidy, které by odpovídaly pre-/Maktamáze a β-laktamáze a které jsou přítomny v minibuňkách s obsahem pBR322. Detaily tohoto pokusu jsou uvedeny v příkladu 2.

Shora uvedený způsob je· vhodný pro vytváření plazmidu, který je schopný exprese a .obsahuje gen lidského růstového· hormonu · (HGH). · Až dosud byl · klonován pouze fragment genu HGH, který obsahuje · celý strukturální gen pro - hormon s výjimkou prvních · 23 aminokyselin. Fragment HGH byl včleněn do plazmidu působením enzymu HindlII a je tedy možno jej tímto enzymem izolovat, jak bylo popsáno ve shora uvedené publikaci Seeburg a další a přihlášce . č. 897 710. · Zakončení je · možno modifikovat tak, · · že · se . nepárová zakončení vyplní při použití - reakce, katalyzované DNA polymerázou. Výsledný fragment HGH s nepárovými · -zakončeními · je možno spojit s podobným fragmentem β- laktamázového· genu, který · .vzniká po· působení enzymu HindlII. Způsob pro· vytváření · a expresi plazmidu s obsahem celého sledu HGH bude v zásadě podobný, jakmile dojde ke klonování celého sledu, který je kódem pro tento· hormon.

Je zřejmé, že obdobným způsobem je možno připravit i vektory pro další bílkoviny, které budou - rovněž schopny exprese. Například exprese lidského růstového hormonu · je · možno shora uvedeným způsobem dosáhnout, stejně jako exprese růstových hormonů skotu, vepře . a ovce. Obdobným způsobem je popsanou metodu mo'žno užít i proexpresi · genu pro lidský inzulín · a genů pro inzulíny jiných živočišných druhů. Protože jde · o obecný způsob, je možno jej použít · prodosažení . toho, aby mikroorganismus produkoval jakoukoliv eukariotickou bílkovinu až na · zřejmé výjimky, kterými 'budou například bílkoviny toxické pro mikroorganismus.

V následujících příkladech bude podrobněji popsáno, jak je možno· připravit vektor, mikroorganismy i zajistit expresi genu RGH a genu pro krysí · inzulín v těchto mikroorganismech.

Příklad 1

Pro konstrukci vektorů, schopných exprese . a průkazu syntézy chimérní bílkoviny bylo užito následujících postupů:

A. Růst, izolace a čištění plazmidů se provádí tak, že se transformované buňky pěstují · přes · noc · ve vhodném - objemu živného· prostředí, například 500 ml, za stálého tře pání · při teplotě 37 °C. Je možno užít, kultur, transformovaných různými plazmidy -typu . ColEI, například · pBR322, · a· tyto - kultury -·-je možno podrobit působení . chloramfenikolu v koncentraci 170 /ig/ml · na dobu 12 až ·16· hodin, čímž je možno dosáhnout vyššího· množství plazmidu. Buňky se oddělí · odstředěním,, promyjí se - 0,01 M Tris, 0,001 M · EDTA; - o ·pH 8, znovu se uvedou v suspenzi v · 10 ml chladného 25% roztoku sacharózy v 0,05 M - - Tris a 0,001 H EDTA o pH · 8. Pak - se · přidají 2 · ml lysozymu o koncentraci 5 · mg/ml v . 0,25 ·Μ Tris o pH 8 a pak ještě 4 ml 0,25 -M- EDTA o pH 8. Po 5 až 10 minutách inkubace - v .ledové drti se buňky rozruší přidáním 0,1 · .objemového % přípravku · Triton - X-100₍ - (Rohmer a Haas Corp. Rutherford, N. . J.) ·· v Tris-EDTA pufru o pH 8. Po opatrném · promíchání se směs inkubuje 15 minut · v - ledové drti. Výsledný rozrušený · materiál - · se .odstřeďuje při 20 000 otáčkách za· minutu .po dobu’25 minut v rotoru SS34 -odstředivky Sorval - (Dupont Instruments, · Wilmington, - Del.).. -Supernatant se slije a dále · se čistí chromatografií na Sephadexu G-100 · (Pharmacia C-hemical Corp., Uppsala, Švédsko), .sloupec · se vymývá 0,2 M · NaCl, 0,05 M Tris · a ·. 0,001 -M EDTA · o pH 8. DNA, - která se - stanoví absorpcí při 260 nm, se vysráží· přidáním 2 · objemů chladného ethanolu o · koncentraci 95 .· % (hmotnostní/objemová %), 0,03 - · objemu 3M octanu sodného s · následujícím stáním; - přes noc při teplotě —20 °C. Sraženina - se · · oddělí, znovu se uvede v suspenzi v Tris-EDTA .· pufru a odstřeďuje se v CsCl s .obsahem ethidiřnribr.omidu a propidiumjodidu. - Zkumavka o rozměru 1,2 x 5 cm obsahuje 2,2 g CsCl, 2,1 ml vzorku a 0,15 ml · propidiumjodidu v koncentraci 2 mg/ml ve. vodě.· . Zkumavky se odstředí při 36 000 otáčkách za minutu podobu 18 · áž 24 hodin při teplotě · 20 - °C - v - rotoru SW39 (Beckman Instrument . Co., Fullerton, Kalifornie) nebo v ekvivalentním -- rotoru. Frakce s obsahem DNA se · nechají · projít sloupcem kationtoměniče k · odstranění. · propi-diumjodidu a získaný - materiál · se dialyzuje · proti 0,01 M Tris, 0,001 · M EDTA - o · pH 8 a 0,3 M octanu sodnému k . odstranění . -zbytku CsCl.

B. Transformace Escherichia- coli'RR-1-se provádí tak, - že se pěstuje - - 10 -ml- - kultury- v bujónu L - přes - noc při teplotě . 37°C, - pak se kultura zředí 1:50 objemovým dílům - a 25 · ml zředěné kultury se - pěstuje tak · dlouho, - - až se dosáhne hustoty 2 až - 5 x 108 - buněk/ml (střed log fáze). Buňky se oddělí odstředěním, znovu iíse uvedou v suspenzi ve 215 . ml 10 mmolů NaCl, znovu se odstředí a - . znovu se uvede v -suspenzi ve 20 ml -chladného -30 mmolů CaClz. Pak se buňky uloží - na - - 20 - minut do ledové - drti, za studená se ..· odstředí a znovu se uvedou v suspenzi v 1 ml 30 -mmolů CaCla. K 0,2 -ml buněk se . přidá 0,1 - - ml DNA, - 10 pg/ml v 30 mmolech CaClž, 0,01 - -M Tris, a 0,001 M EDTA -o - pH - 7,5, - Směs - se=ho dinu inkubuje v ledové drti, pak se přenese na 90 sekund do teploty 42 °C a pak se přenese zpět do ledové drti. Přidá se živné prostředí, bohaté na živné látky, například 3 ml bujónu L a buňky se pak pěstují při teplotě 37 °C po dobu 3 až 12 hodin před nanesením na plotny.

Transformace Escherichia coli X1776 se provádí obdobným způsobem, tak jak bylopopsáno v US přihlášce č. 897 709.

C. Restrikční endonukleázy je možno získat z celé řady komerčních zdrojů, jak je popsáno ve shora uvedená publikaci Uřrich A. a další, Seeburg P. H. a další a v US přihláškách č. 897 709 -a 897 710. V těchto publikacích jsou rovněž popsány podmínky inkubace pro štěpení DNA působením restrikčních endonukleáz.

D. T4 DNA-ligázu je možno získat z Bethesda Research Labs, Rockville, Md. Podmínky pro tuto reakci Jsou popsány ve shora uvedených publikacích ULlrich A. a další, Seeburg P. H. a další, - Sga-ramella a další a v US přihláškách č. 897 709 a 897 710,

E. Elektroforéza na gelu byla prováděna způsobem podle publikací Dingman C. W. -a Peacock A. C., Biochemistry 7, 659 (1968) a Maniatis, T. a -další, Biochemistry 14, 3787 (1975).

F. V některých případech bylo možno provádět Imunologické zkoušky v případě možnosti čištění protilátky a antigenu, a také proto, aby bylo možno vyloučit vliv různých nečistot, přítomných v materiálu, který byl užit jako antigen, a podle příjmu nebo při imunizaci zvířat. Bylo užito- chromatografie, při níž stacionární fází byla Sepha-rose 4B, Trademark Pharmacia Chendcal Corp , Uppsala, - Švédsko) s protilátkou nebo antigenem kovalentně vázaným po působení bromkyanu, jak bylo popsáno v publikaci March S. C. a další Anal. Biochem. 60, 149 (1974). Vzorek, který byl -čištěn byl nanesen na sloupec v chloridu sodném s fosfátovým pufrem, pak byl sloupec promyt 15 objemy téhož pufru a 5 objemy 0,05 M octanu sodného o pH 4,5, načež byl vymýván 0,05 M glycinu s kyselinou chlorovodíkovou o pH 2,2.

G. Ke zjištění chimérní bílkoviny s obsahem inzulínu nebo růstového hormonu bylo- užito radioimunologických zkoušek. Byly zkoumány lyzáty buněk, transformovaných plazmidem, a to- buď v surovém stavu nebo po částečném čištění běžným způsobem. Byly také připraveny série ředění, k nimž byla přidána protilátka proti hovězímu inzulínu (Miles Laboratories, Elkhardt, Ind.), proti C-pepti-du inzulínu - (Yanai-ha-ra C. a další, Symposium on Proinsulin, Insulin -and C-peptide, To-koshima, Japonsko 1978, koordinováno Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) nebo proti krysímu růstovému hormonu, kte rý byl připraven imunizací samců opic Rhesus proti čištěnému růstovému hormonu krysy. Značený antigeny byly (¹²⁵I)-inisulin (New England Nuclear Corp., Boston, Mass,). (125l)-tyrosylovaný C-peptid krysy (Yanaihara a další) nebo (¹²5l)-růstový hormon. Postup byl prováděn modifikací způsobu, popsaného v publikaci Mergan a Lazarow, Diabates 12, 115 (1963), modifikace byla popsána v publikaci Kessler S. W., J. Immunol, 115, 1617, (1975) a bylo v ní užito- buněk Staphylococcus -aureus C místo druhé protilátky k vysrážení komplexu antigenu s protilátkou.

H. Stanovení exprese bylo prováděno způsobem, který byl popsán v publikacích Erlich, H. A. a další, Cell 10, 681 (1978) a Broome S. a Gilbert W., Proč. Nat. Acad. Sel. USA 75, 2746 (1978).

Příklad 2

V tomto- příkladu je popisována analýza značení bílkovin po- syntéze transformovanými buňkami. Bílkoviny byly značeny přidáním í 35S)-methioninu, (³H) -aminokyselin nebo (14C)-aminokyselin k růstovému prostředí. Pak byly připraveny surové nebo částečně čištěné lyzáty a bílkoviny byly frakcionovány elektroforézou na akrylamidovém gelu s dodecylsíranem sodným způsobem podle publikace Lemmli U. K., Natu-re - 227, 680 (1970) nebo dvourozměrnou elektroforézou na gelu se stanovením isoelektrického- -bodu, popsanou v publikaci 0‘Fa-rrell P. H, a další J. Biol. Chem. 250, 4007 (1975). Při prvním způsobu dochází k frakcionaci bílkovin podle molekulární hmotnosti, při druhém mimoto ještě podle celkového iontového náboje. Radioaktivní 'bílkoviny je pak možno zjistit autoradiog-raifií, tak jak bylo popsáno svrchu v publikacích Ullrich A. a další nebo Seeburg P. H. a další a v US přihláškách č. 897 709 a 897 710.

Ke snížení počtu značených bílkovin bylo v některých případech užito lyzátů transformovaných minibuněk. K tomuto účelu jsou vhodné kmen Ericherichia coli X1776 -a P678-54, které produkují minibuňky.

Na obr. 7 jsou znázorněny ellktreferetické pásy, získané pří použití minibuněk X1776. Pás (a) byl získán z netransformovaných buněk X1776. Pás (b) byl získán z buněk X1776, transformovaných pBR322. Pás (c) byl získán z buněk X1776- tranзfermevaných pTS-1 a pás (d) -z buněk X1776 transformovaných pLRI-2. Pás /J-galaktosidázy, označený číslem 2 je možno pozorovat v buňkách, transformovaných pTS-1, kdežto další pás -označený 1, je možno pozorovat po působení pLRI-2. V pokusu bylo užito akrylamidového -gelu o koncentraci 18 % (hmotnostní/objemová %). Další dělení bylo prováděno ještě - při použití gelů o koncentraci 6 % (hmotnostní/objemová %).

Na obr. 8 je znázorněn výsledek částečného čištění lyzátů buněk Escherichia coli, které byly transformovány DG-75. Buňky byly pěstovány do optimální hustoty nižší než 1,0 při 650 nm při délce 1 cm, odděleny odstředěním a zmrazený. Zmrazené buňky byly mlety při teplotě 0 °C v předem stanoveném hliníkovém zařízení, bylo užito 7 g buněk v 1 litru kultury za přítomnosti fenylmethylsulfonylfíuoridu (PMSF), který inhibuje proteolytické enzymy. Rozrušené buňky z 1 litru kultury byly uvedeny v suspenzi ve 100 ml 0,02 M Tris o pH 7,5, 0,01 M MgClz, 0,1 M NaCl a 1 ml PMSF o koncentraci 1 °/o (hmotnoistní/objemová %) v dimethylsulfoxldu. Pak byl přidán síran amonný do konečné koncentrace 33 % (hmotnostní/objemová %). Vysrážená bílkovina se odstředí a dialyzuje proti 40 mmolům Tris o pH 8,0, 1 mmol EDTA, 1 nM MgCh a 5 nM β-merkaptoethanolu. DG-75 obsahuje chromozomální gen pro (3-galaktosidázu. Tato (3-galaktosidáza však v blízkosti N-terminálního zakončení není úplná a je proto inaktivní. Naproti tomu po transformaci pLRI-2 se získá účinný enzym, protože pravděpodobně dojde к doplnění struktury. V tomto případě může být /3-gal‘aktosidáza, která je tetramerem účinná i ve formě smíšeného tetrameru, který sestává z jednotlivých neaktivních složek. Při elektroforéze na gelu dochází к disociaci tetra-meru. Pásy (a) a ('j) byly získány při použití běžně dodávané galaktosidázy (Boehringer-Mannheim Corp., New York, N. Y.), tak jak je označeno šipkami. Pás (d) byl získán z bílkoviny, kterou bylo možno vysrážet působením 3,3% síranu amonného (hmotnostní/cbjemová %). Částečně čištěná bílkovina byla frakcionována chromatografií na přípravku DEAE-BioGel, (BioRad Laboratories, Richmond, Kalifornie). /3-galaktosidáza byla vázána na sloupec při použití 40 rnmolů Tris o pH 8,0, 1 mmol EDTA, 1 mmol MgClz, 5 mmolů β-merkaptoethanolu, avšak většina chimérní bílkoviny, sestávající z galaktoeidázy a pre-proinsulinu vázána nebyla. Bílkoviny, které nebyly při této reakci vázány byly znovu podrobeny chromatografií na gelu (b) a (c). Tyto sloupce byly vymývány při použití lineárního gradientu chloridu sodného. Byla stanovena účinnost /3-galaktosidázy a frakce, které byly získány v blízkosti nejvyšší účinnosti byly analyzovány v pásech (e až i). Vrchol účinnosti byl spojen s pásem (g). Jak bylo možno očekávat, tento vrchol sestával z větší části z normální (3-galaktosidázy, avšak obsahoval malé množství chimérní β-galaktosidázy s proinzulínem, jak bylo usuzováno z hustoty pásu.

Na obr. 9 je znázorněn výsledek elektroforézy na .polyakrylamidovém gelu o koncentraci 18 % (hmotnostní/objemová %) při použití bílkovin z nefrakclonovaného lyzátu Jediné kolonie Escherichia coli CSH20. Kmen CSH20 byl popsán ve svrchu uvedené publikaci Miller J. a další. V kmeni CSH20 dochá zí к velkému poškození chromozomálního genu pro (3-galaktosidázu. V důsledku toho buňka neprodukuje žádnou bílkovinu tohoto rozměru, leda 'že by do ní byl včleněn plazmid s obsahem uvedeného genu. Kultura kmene CSH20 transformovaného pLRI-2 byla nanesena na plotny XGal s obsahem ampicilinu. Bylo možno pozorovat bílé i modré kolonie. V dráze 28 je možno vidět spektrum bílkovin pro bílou kolonii, v dráze 29 spektrum pro modrou kolonii. Zatímco v dráze 29 je možno jasně pozorovat pás pro chimérní bílkovinu u šipky 1, v dráze 28 kolonie zřejmě neměla schopnost produkovat chimérní bílkoviny. Tento rozdíl v expresi plazmidu zatím není vysvětlen. Obdobné chování je možno pozorovat i u buněk, které byly transformovány pTSl. V dráhách 30 a 31 jsou uvedena spektra pro bílou a modrou kolonii. Je tedy možno provést výběr podle syntézy požadovaných bílkovin za určitých růstových podmínek, přestože mechanismus není znám. V dráze 32 je znázorněno spektrum lyzátu Escherichia coli CSH17 (Miller J.), u něhož dochází pouze к malému poškození β-galaktosidázy. V dráze A je uvedena čištěná /S-galaktosidáza jako kontrola.

Údaje, uvedené na obr. 7 až 9 tedy prokazují syntézu chimérní bílkoviny, která obsahuje část sledu pro (S-galaktosidázu a proinzulínový sled. Tento závěr byl potvrzen analýzou nukleotidového sledu kombinovaného genu v pLRI-2. Sled nukleotidů odpovídal kódu pro očekávanou chimérní bílkovinu.

Na obr. 10 je znázorněna elektroforéza na gelu při použití bílkoviny, produkované min buňkami Escherichia coli P678—54, které byly transformovány pExRGH nebo pBR322. Bílkovina po transformaci pBR322 je znázorněna v dráze A. Tmavý pás při šipce 2 je /З-laktamáza, jak je možno zjistit při srovnání s kontrolní dráhou C, v níž je uvedena extracelulárně vyloučená β-laktamáza. V pásu В je uvedeno spektrum pro pExRGH. Je zřejmé, že /3-laktamáza není přítomna, zato je šipkou 1 znázorněn nový pás s molekulovou hmotností 47 000. Vypočítaná molekulární hmotnost chimérní bílkoviny byla 44 300, takže naměřená hodnota je v rozmezí 10% chyby užité metody.

Příklad 3

Na obr. 11 jsou znázorněny výsledky radioimunologického sledování kolonií transformovaných pECRGH nebo pBR322. Tímto způsobem uvedeným v příkladu 1H jsou kolonie transformovaných bakterií částečně rozrušeny působením chloroformových: .par, pak převrstveny filmem z plastické hmoty s antisérem proti růstovému hormonu, pak se tento film vystaví působení (¹²⁵I J^protilátky proti růstovému hormonu, která se může vázat, jak je to v imunochemii obvyklé na místa, obsazená růstovým hormonem nebo imunologicky příbuznou chimérní bílkovinu. Po promytí se pak film exponuje na autoradiografické desce. Jak je zřejmé z obr.

11, všechny kolonie transformované pExRGH byly pozitivní, pokud jde o· produkci růstového hormonu, kdežto kolonie, transformované pBR322 byly negativní.

Citlivost této metody je prokázána na obr.

12. Byly pěstovány kolonie bakterií, které obsahují plazmid pEcRGH nebo pBR322 nebo· neobsahovaly žádný plazmid. V levém sloupci jsou uvedeny výsledky svrchu uvedených zkoušek. V případě, že byl přidán přebytek neznačeného· růstového hormonu, došlo k úplné vazbě (^jj-protilátky, takže nedošlo k vazbě na kolonie. Při druhém kontrolním pokusu bylo· užito normální neimunní opičí sérum místo protilátky proti růstovému hormonu. V pravém sloupci jsou uvedena množství RGH, jichž bylo zapotřebí · ke stanovení hranic citlivosti. Přestože bylo možno opakovaně dosáhnout pozitivního výsledku při koncentraci 8 ng, nebylo · možno· při nižších koncentracích dosáhnout žádný

Claims (6)

1. PŘEDMET

   1. Způsob syntézy eukaryotické bílkoviny při použití mikroorganismu, při němž se mikroorganismus · transformuje vektorem . · pro přenos DNA, sestávajícím z bakteriálního genu s včleněným sledem ' nukleotidů,: který je kódem pro eukaryotickou bílkovinu s . následným pěstováním mikroorganismu za podmínek, dovolujících expresi bakteriálního genu, vyznačující se tím, že včleněný sled sestává z CDNA, která je kódem · alespoň · pro část eukaryotické bílkoviny, vektor pro přenos DNA sestává z bakteriálního genu, -obsahujícího alespoň oblast, · · řídící počátek transkripce a počátek translace .. a .včleněný sled je uložen vzhledem k bakteriálnímu genu tak, že jakmile dojde k · počátku · transkripce a translace při pěstování transformovaného · mikroorganismu za podmínek, · dovolujících expresi bakteriálního genu, -dochází také k transkripci a translaci uvedeného sledu, takže transformovaný· mikroorganismus syntetizuje eukaryotickou bílkovinu nebo chimérní bílkovinu, která obsahuje eukaryoti-ckou bílkovinu jako terminální sled aminokyselin na zakončení, na němž se nachází karboxylová skupina.
2. 2. Způsob podle· bodu 1 vyznačující se tím, výsledek. Příčina 'této náhlé ztráty citlivosti není známa.

   Imunologický test byl užit také k potvrzení totožnosti -chimérní bílkoviny, sestávající z β-galaktosidázy a inzulínu a znázorněné na obr. 7 áž 9. Na bílkoviny, izolované elektroforézou na gelu se nejprve působí bromkyanem a pak se nanesou na gel, určený k provádění zkoušek. Výsledky jsou uvedeny na -obr. 13. V dráze A je možno· prokázat velkou bílkovinu, která byla identifikována jako spojení β-galaktosidázy a inzulínu. V dráze B se nachází samotná /8galaktosidáza a v -dráze C samotný inzulín. Výsledek ukazuje, že . chimérní bílkovina obsahuje inzulínový sled, . a · že inzulínový sled reaguje po působení bromkyanem s protilátkou proti inzulínu. Mimoto byla křivka citlivosti normální, to znamená, že nedošlo k náhlému přerušení.

   Přestože způsob podle vynálezu byl popsán v souvislosti se specifickými provedeními, je zřejmé, že jde o obecný způsob, který dovoluje celou řadu modifikací, které rovněž spadají do -oboru vynálezu.

   vynalezu že se jako mikroorganismu užije Escherichia coli, bakteriální . gen obsahuje část strukturálního genu Escherichia · coli pro beta-galaktosidázu a eukaryotickou bílkovinou je inzulín.
3. 3. Způsob podle bodů 1 a 2 vyznačující se tím, že včleněným sledem je klonovaný fragment .cDNA, ·označovaný jako· pAU-1 a jako vektoru · pro přenos DNA, užitého k · transformaci · · mikroorganismu se použije pLRI-1.
4. 4. Způsob podle bodů 1 a 2 vyznačující se tím, že včleněný sled se vytvoří · kombinací klonovaných fragmentů cDNA, Označených pAU-1 a.pAU-2.,· na · společném · místě pro štěpení enzymem*.- Alul a vektorem pro přenos DNA, · · užitým k transformaci mikroorganismu je pLRI-2.
5. 5. Způsob podle bodu 1 vyznačující se tím, že se jako mikroorganismu užije Escherichia coli, bakteriální gen obsahuje části strukturálního genu Escherichia coli pro· beta-laktamázu a eukaryotickou bílkovinou · je růstový hormon.
6. 6. · Způsob podle bodů 1 a 5 vyznačující se tím,· · že vektorem, užitým pro přenos DNA při transformaci mikroorganismu je pExRGH.