CS211175B1 - Způsob připravy 6-aminopenicilanové kyseliny - Google Patents

Abstract

Vynález chrání postup využití filtrátu fermentaSní kapaliny a meziproduktů výroby benzylpenicilinu (penicilinu O), resp. meziproduktů z různých fází jeho izolace jako výchozích surových substrátů pro enzymovou přípravu 6-aminopenicilinové kyseliny (6-APK) pomocí zesítěných, agregovaných a vázaných buněk s penicilinacylázovou aktivitou, což vede k dalSí ekonomizaci výroby této kyseliny a tím polosyntetických penicilinů.

Description

Vynález ae týká způsobu přípravy 6-aminopenicilinové kyseliny (dále jen 6-APK) enzymovým .štěpením benzylpenicilinu zesítěnými nebo agregovanými nebo vázanými buňkami mikroorganismů s penicilinacylázovou aktivitou.

6-APK je klíčovým meziproduktem pro výrobu polosyntetických penicilinů; je známa řada postupů její výroby, a to v podstatě dvěma základními cestami, chemickou nebo enzymovou hydrolýzou základní substance, tj. izolované čisté draselné nebo sodné soli benzylpenicilinu. Prvá cesta, chemické hydrolýza, nemá v podstatě jinou možnost než vycházet z čisté suché substance benzylpenicilinu, nebol sám princip této hydrolýzy diktuje bezvodé prostředí a chránění chemicky labilních skupin (T. E. Carrington, Proč. R. Soc., Lond., B 179, 321 , 1971).

Druhá cesta, klasická enzymová hydrolýza pomocí nativních buněk mikroorganismu nebo rozpustného enzymu (NSR pat. spis č. 1 114 766), musí vycházet rovněž ze substance draselné nebo sodné soli benzylpenicilinu rozpuštěné ve vodě nebo v pufru, nebot nativní (rozpustný) enzym penicilinacyláza by byl při použití surových meziproduktů izolace benzylpenicilinu inaktivován, například proteolytickým netrávením v případě použití vyfermentované půdy, působením organických rozpouštědel, změnou iontové síly nebo různými toxickými příměsemi z dalších fází izolace benzylpenicilinu, což by nepříznivě ovlivňovalo výtěžek izolované 6-APK.

Enzymová hydrolýza penicilinu, zejména benzylpenicilinu, je postupem, který se stále více uplatňuje, poněvadž je méně náročný na suroviny a aparaturní vybavení, zejména při užití vázaných enzymů nebo vázaných buněk. Další výhodou vázané penicilinacylázy nebo vázaných buněk s touto aktivitou je možnost jejich mnohonásobného opakovaného nebo kontinuálního využití pro přípravu 6-APK, přičemž kvalita a ekonomie prooesu je řízena nejen náklady na výrobu biokatalyzátoru, nýbrž i jeho operační (pracovní) stabilitou; v praxi to znamená hodnotu, která informuje, kolikrát lze vázaný biokatalyzátor opakovaně použít, popřípadě kolik hodin kontinuálního provozu je biokatalyzátor schopen pracovat bez významného poklesu reakění rychlosti a stupně konverze benzylpenicilinu na 6-APK. Je pochopitelné, že operační stabilita většiny vázaných biokatalyzátorů bude při použití čisté substance benzylpenicilinu (ve formě draselné nebo sodné soli) rozpuštěné ve vodě nebo v pufru vyšši než při použití meziproduktů výroby benzylpenicilinu.

Pro výrobu ó-APK enzymovou hydrolýzou benzylpenicilinu bylo vyvinuto několik typů chemicky vázaných biokatalyzátorů na principu vázaných buněk s penicilinacylázovou aktivitou (čs. autorské osvědčeni č. 201 621, 197 101, 203 607 a 209 265), které dovolují použit různých meziproduktů výroby benzylpenicilinu, získaných například přímo z filtrátu vyfermentované půdy nebo v různých fázích izolace, aniž je významně ovlivněna jejich operační stabilita, nebol způsob kovalentního prokřížení enzymu v buňkách producenta podle citovaných vynálezů významně přispívá ke stabilitě vázaných buněk i při působení různých fyzikálních, fyzikálněchemických, chemických a biochemických vlivů.

Bylo zjištěno, že delšího významného technického a především ekonomického pokroku lze dosáhnout pomooí zvláště levného způsobu separace a koncentrace benzylpenicilinu z vyfermentované půdy bez obvyklé extrakce, ve spojení se štěpením získaného koncentrátu pomocí vázaných buněk, což je předmětem tohoto vynálezu a bude podrobněji vysvětleno níže. Aplikací tohoto postupu lze několikanásobně snížit výrobní náklady na jednotku benzylpenicilinu ve filtrátu vyfermentované půdy ve srovnání se stejným množstvím benzylpenicilinu ve formě pevné draselné soli.

Dále se využívá té výhodné skutečnosti, že enzymové štěpeni biokatalyzátory podle citovaných vynálezů je natolik substétově specifické, že příměs cizích látek v surovém koncentrátu benzylpenicilinu, získaného z filtrátu vyfermentované půdy, neruší enzymový proces a izolaci 6-APK z reakění směsi.

211175 ,

Předmětem vynálezu je tedy způsob přípravy 6-aminopenicilénové kyseliny enzymovým Štěpením bezylpenicilinu zesítěnými nebo agregovanými nebo vázanými buňkami mikroorganismů s penicilinázovou aktivitou; podstata tohoto způsobu spoěívá v tom, že se jako výchozí suroviny pro Štěpení používá vodná fáze s hodnotou pH 7,0 až 8,0, získaná v nSkterám ze stupňů zpracovávání vyfermentovaná půdy na benzylpenicilin, obsahující rozpustnou sůl benzylpenicilinu, zejména sůl sodnou, draselnou nebo amonnou, v koncentraci 2 až 7 96 hmot., načež se po ukončeným StSpení okyselením reakSní směsi při teplotě 0 až 10 °C v přítomnosti organického, s vodou nemísitelnáho rozpouštědla, například butylacetátu, vyloučí 6-aminopenicilánová kyselina, která se izoluje a oddělená organická fáze se zpracuje na kyselinu fenyloctovou.

Velmi výhodně se podle vynálezu používá jako vodné fáze s hodnotou pH 7,0 až 8,0 roztoku amonná soli benzylpenicilinu vzniklého neutralizací čpavkovou vodou z volné kyseliny benzylpenicilinu, získané z filtrátu vyfermentovaná půdy okyselením na pH 1,5 až 2,5 a oddělením, s výhodou odstředěním, při teplotS -5 až 0 °C.

Další výhodná možnost spočívá v použití roztoku sodná nebo draselná soli benzylpenicilinu získaného z bohatého butylacetátového extraktu s obsahem volná kyseliny benzylpenicili' nu reextrakcí vodným roztokem hydroxidu nebo uhličitanu sodného nebo draselného, jako vodné fáze s hodnotou pH 7,0 až 8,0.

Jako vodná fáze s hodnotou pH 7,0 až 8,0 je použitelný například táž vodný roztok surové draselné soli benzylpenicilinu, získané z bohatého butylacetátového extraktu vysolením nasyceným roztokem octanu draselného a oddělením v pevné formě.

Je samozřejmé, že kromě ilustrativně uvedených příkladů nejsou vyloučeny i jiné eventuality vodné fáze jako výchozí suroviny, pokud vyhovují daným podmínkám.

Zásadní předností způsobu podle vynálezu je skutečnost, že pro výrobu ó-APK není nutné izolovat benzylpenicilin ve formě čisté substance, zpravidla ve formě draselné soli jako konečného produktu, takže odpadá nejnákladnějSí izolační stupeň, tj. extrakce okyseleného filtrátu vyfermentovaná půdy organickým, s vodou nemísitelným rozpouštědlem, například butylacetátem, vedoucí k relativně velmi čistému a koncentrovanému roztoku benzylpenicilinu, Při bezextrakčním způsobu přípravy vodného koncentrátu benzylpenicilinu se účelně filtrát vyfermentovaná půdy ochlazuje na teplotu -5 až -3 °C, s výhodou kolem -2 °C, kdy kryoskopic· ký efekt rozpustných solí dovoluje podchlazení filtrátu na teploty pod 0 °C za stálého míchání, aniž se ve větší míře tvoří ledová tříšl.

Filtrát vyfermentovaná půdy je možno chladit jednak v zásobníku, jednak průtočně při zpracování celé šarže. Podchlazený filtrát se pak okyseluje, opět nejlépe průtočně, přítokem anorganické kyseliny, například 30% kyseliny sírové, tak, aby výsledné pH podchlazeného roztoku bylo 1,8 až 2,0. Za těchto podmínek je benzylpenicilin ve formě volné kyseliny určitou, byl krátkou dobu, relativně stálý a jeho rozpustnost je velmi nízká.

Benzylpenicilin ve formě volné kyseliny při vylučování z roztoku nevykrystalizuje, ale sráží se jako amorfní zákal, jehož částečky tvoří olejovíté kapénky, které se shlukují a vlivem podchlazení tuhnou. Jsou specificky těžší než voda a dají se vlivem odstředivé síly oddělit. Při průtočném způsobu zpracování filtrátu vyfermentovaná půdy při jedná z alternativ realizace vynálezu se odstřeáuje benzylpenicilin na kontinuálně pracujících samovyprazdňujících odstředivkách, na nichž při relativně rychlém průtoku se zpracovávaný materiál jen mírně otepluje. Těžká fáze benzylpenicilinu odstřelovaná v poměrně malém objemu několika procent je po výstřelu z bubnu odstředivky okamžitě neutralizována roztokem alkálie nebo pufru.

Získaný koncentrát soli benzylpenicilinu je poměrně čistý; v přepočtu na sušinu obsahuje více než 92 % hmot. čisté soli. Podle koncentrace použitého roztoku alkálie nebo pufru má získaný koncentrát obsah sušiny 10 až 30 % hmot, a má dostatečnou koncentraci pro použití jako substrátu při následném štěpení benzylpenicilinu pomocí vázané penicilinacylázy v zesítěných nebo agregovaných nebo navzájem vázaných buňkách producenta tohoto enzymu.

Jak koncentrace, tak zejména čistota koncentrátu závisí na kvalitě vyfermentované půdy, na stupni autolýzy producenta benzylpenicilinu, sekundární kontaminaci apod. V případech, kdy vyfermentované půda obsahuje větší množství bílkovin a dalších makromolekulárních látek biologického původu, je účelné ji předem parciálně deproteinovat nebo částečným okyselením v rozmezí pH 4,0 až 6,0, s výhodou v přítomnosti flokulačních činidel, zbavit větší části makromolekulárních látek a buněčného detritu filtraci nebo odstředěním a teprve potom vyloučit volnou kyselinu benzylpenicilinu snížením pH filtrátu vyfermentované půdy, oddělit ji, neutralizovat a rozpustit na vodný koncentrát popsaným způsobem.

Při zcela anomálních šaržích fermentace, například u silně kontaminovaných nebo špatně separovatelných vyfermentovaných půd, kromě výše zmíněné předchozí částečné deproteinace je účelné ještě filtrát zatížit malým množstvím nepolárního rozpouštědla o větší specifické hmotnosti než voda, například chloroformem, trichlorethylenem apod., s výhodou v přítomnosti tenzidů, a teprve potom provést vyloučení volné kyseliny benzylpenicilinu uvedeným postupem. Množství použitého nepolárního rozpouětšdla se pohybuje buá v mezích rozpoustnosti, popřípadě emulgovatelnosti tohoto rozpouštědla ve vyfermentované půdě, nebo tuto mez nemnoho překračuje.

Množství tenzidů se pohybuje v rozmezí 0,5 až 2,0 % obj.j s výhodou lze používat neionogenních tenzidů, například různých typů na bázi alkylfenolů. Pokud získaný vodný neutralizovaný koncentrát benzylpenicilinu je příliš barevný, je možno tuto barevnost snížit adsorpcí barviv na kativní uhlí nebo iontoměnné pryskyřice.

Pro enzymové ětěpení se koncentrát benzylpenicilinu ředí demineralizovanou vodou tak, aby výsledná koncentrace benzylpenicilinu byla ekvivalentní 1 až 7% roztoku draselné nebo sodné soli benzylpenicilinu, a to v závislosti na typu vázaného biokatalyzátoru a volbě procesů štěpení zesítěnými nebo agregovanými nebo vázanými buňkami producenta penicilinacylázy.

Způsob podle vynálezu umožňuje, jak již bylo zmíněno, použití jako výchozího substrátu pro enzymové ětěpení různých meziproduktů výroby substance benzylpenicilinu a meziproduktů z různých fází izolace, zejména vodného koncentrátu získaného z butylacetátového extraktu vyfermentované půdy, popřípadě surových solí benzylpenicilinu, nepromytých a/nebo částečně promytých organickými rozpouštědly, což vede k další ekonomizaci výroby 6-APK eliminací ztrát při izolaci a čištění benzylpenicilinu.

Při vlastní enzymové hydrolýze neutrálního zředěného konoentátu benzylpenicilinu, získaného některým z popsaných postupů, se v závislosti na typu použitého vázaného buněčného katalyzátoru postupuje podle čs. autorských osvědčení č. 20, 621 a č. 209 676. Při vsádkovém opakovaném použití biokatalyzátoru proběhne štěpení za 90 až 120 minut a množství vytvořené 6-APK přesahuje 95 % teorie.

Z konverzní směsi se 6-APK získává změnou pH na izoelektrický bod, po předchozím smísení s nepolárním organickým rozpouštědlem nemisitelným s vodou, například butylacetátem, chloroformem apod., a po předchlazeni této směsi na teplotu v rozmezí 10 až -2 °C. Za těchto podmínek vykryštelovaná 6-APK se pak promývá vodou a acetonem a vysuší. Získaná 6-APK je zpravidla tak kvalitní, že nejsou zapotřebí již žádné další čisticí operace; její obsah v produktu se pohybuje mezi 97 až 100 % hmot. a nerozpustný zbytek činí 0,5 až 5,0 % hmot.

Dalším výhodným důsledkem způsobu podle vynálezu je to, že po procesu enzymové hydrolýzy a získání 6-APK lze zhodnotit matečné louhy a získat na nich kyselinu fenyloctovou v čistotě vhodné pro použití jako prekurzor při biosyntéze benzylpenicilinu a jako induktor bio211175 syntézy enzymu penicilinacylázy při kultivaci produkčních buněk pro výrobu vázaných buněčných biokatalyzátorů.

Způsob podle vynálezu je v dalším ilustrován příklady provedení, které uvádějí některé z možností použití vhodných výchozích látek, aniž se ovšem omezují pouze na tyto případy.

Příklad 1

000 1 vyfermentované živné půdy obsahující 26 300 j. penicilinu G na ml filtrátu bylo postupně zchlazovéno a současně zbavováno mycelia produkčního mikroorganismu na rotačním vakuovém filtru. V součtu s promývací vodou bylo získáno 42 000 1 žlutohnědého, téměř čirého filtrátu, o aktivitě 18 930 j./ml, který byl průtočně dále zchlazován na průměrnou teplotu -2 °C a veden na směšovací čerpadlo.

Přítokem předchlazené 30% kyseliny 3Írové byl čerpaný filtrát průtočně okyselován na hodnotu pH 1,8 až 2,0. Okyselením docházelo k mírnému zvýšení teploty filtrátu, který byl za směšovacím čerpadlem veden ihned na samovyprazdňovací odstředivky, typu Leval BRPX s gravitačním polem cca 6 000 O na obvodě bubnu. Průtok odstředivkami byl regulován na cca 6 000 1/h a automatické parciální vyprazdňování bylo nařízeno na jednominutový interval.

S každým parciálním výstřelem sedimentu byl odseparován cca 1 litr volné kyseliny penicilinu G, která z odstředivky vypadávala do chlazeného neutralizačního kotlíku opatřeného míchadlem. Během odstřeáování docházelo ke zvýšeni teploty zpracovaného materiálu a aparaturní uspořádání mělo proto co nejkratši spoje. Byl volen co nejrychlejší průtok filtrátu odstředivkou a rovněž po nejkratši parciální odstřel, oboje v závislostí na zpracovatelnosti vyfermentované půdy, a tedy schopnosti úplného odloučení volné kyseliny penicilinu G od filtrátu v odstředivém poli.

V neutralizačním kotli byla za míchání vyloučená kyselina penicilinu G_;ihned neutralizována přídavky zředěné čpavkové vody tak, aby výsledné pH koncentrátu se pohybovalo v roz mezí hodnot 6,2 až 7,2. Po naplnění neutralizačního kotle byl přítok z odstředivky přepnut na kotlík druhý a koncentrát z prvního kotlíku byl přečerpán do centrálního nerezového zásobníku, kde byl získaný koncentrát udržován při teplotě 3 až 8 °C.

Celkem bylo získáno 2 430 1 koncentrátu o biologické účinnosti 291 000 j./ml, tj.

% výtěžku, vztaženo na filtrát vyfermentované půdy. Koncentrát byl smíchán s 30 kg Karboventu, po 15 min míchání filtrován přes kalolis s naplavenou křemelinovou vrstvou. Odbarvený koncentrát byl skladován opět při teplotě v rozmezí 3 až 8 °C a dále použit pro enzymovou přípravu 6-APK ve dvou opakovaných šaržích.

Do reakčního nerezového kotle objemu 5 000 1, vybaveného topnými hady, míchadlem a opa' 2 třeného nad spodní výpustí filtračním sítem o ploše 1 m , potaženým filtrační plachetkou, bylo načerpáno vždy 1 200 1 odbarveného koncentrátu a neředěno na 3 000 1 demineralizovanou vodou. K roztoku penicilinu bylo přidáno 500 1 vodné suspenze vázaných buněk'producenta penicilinacylázy, získaných postupem podle čs. autorského osvědčení č. 203 607.

Výsledné naředšní vázaných buněk pro štěpení koncentrátu penicilinu G bylo 14%, vztaženo na vlhký sediment buněk a 2,15%, vztaženo na suchou hmotu, a dále bylo postupováno podle čs. autorského osvědčení č. (PV 2533-79). Konec procesu štěpení roztoku byl za 125 minut při hodnotě pH 7,8 a vzniklé koncentraci 6-APK 32 800 /ig/ml reakční směsi. Chlazený obsah kotle byl vypuštěn ihned spodní výpustí přes filtrační plachetku a čerpán přes pojistný filtr typu Seitz 40x40 s 20 vložkami do průtočného chladiče.

Průtokem chladičem byl roztok zchlazen na 2 °C a poté jímán v krystalizačním kotli, kde bylo předloženo 350 1 butylacetátu, ochlazeného na °C. Současně s přítokem chladné reakční směsi byl obsah kotle intenzívně míchán a pH roztoku bylo upravováno 30% kyselinou sírovou na hodnotu pH 4,2 za udržování teploty 2 °C. Po úpravě celého objemu roztoku tímto způsobem bylo mícháno ještě 90 minut a dále po stanovení zbytkového obsahu v matečných louzích po vykrystalování byla 6-AřK filtrována na bubnové odstředivce, promyta chladnou vodou a poté acetonem. Ve dvou opakovaných šaržích bylo získáno celkem 80,1 % teorie 6-APK o obsahu účinné látky 98,9 % a vlhkosti 0,4 %.

Příklad 2

36,5 np vyfermentované půdy s obsahem 18 400 j. penicilinu G/ml filtrátu bylo zfiltrováno postupně za stálého ochlazování přes rotační filtr. Poněvadž vyfermentované půda byla zasažena kontaminací během posledních 48 hodin kultivace, nebyl filtrát čirý. Ke 48 filtrátu a promývací vody z filtru bylo za míchání a chlazení přidáno 1,5 obj. % trichloretylenu a 0,2 % tenzidu (Slovafol 9095 a směs za míchání dále chlazena a vedena přes průtočný chladič pří -2 °C na směrovací čerpadlo, kde byla kontinuálně okyselována 20% kyselinou sírovou na hodnoty pH mezi 1,8 až 2,1 dále ihned zpracována na samovyprazdňovací odstředivce způsobem popsaným v příkladu 1.

Oddělená těžká fáze byla shormažáována v jímacím kotli a za intenzivního míchání a chlazení ihned průběžně neutralizována zředěnou čpavkovou vodou na pH 6,8. Po zpracování celá šařže filtrátu byle od vodného koncentrátu v jímacím kotli odpuštěna oddělená těžká fáze rozpouštědla a ke zbylému koncentrátu přidáno 0,2 % aktivního uhlí a 0,5 % křemeliny. Vodný koncentrát byl zfiltrován a zpracován kontinuálním procesem enzymového štěpní 2% roztoku (vztaženo na suchou hmotu amonné soli penicilinu G) za přídavku fosfátů (0,06 M fosfátový pufr, pH 7,8) na soustavě 3 kolon s pevným ložem vázaných buněk postupem podle Ss. autorského osvědčeni č. 209 676.

Reakční směs posledního stupně kaskády štěpeni byla kontinuálně zohlazována na +5 °C průchodem přes výměník a kontinuálně extrahována na rotačním horizontálním extraktoru při úpravě pH 20% kyselinou sírovou na hodnotu 1,9 butylacetétem v poměru 6:1. Vyextrahovaná vodná fáze byla kontinuálně jímána v kotli, kde byla za intenzivního máchání a stálého chla zení na teplotu 2 °C kontinuálně neutralizována zředěným roztokem hydroxidu draselného na pH 6,8. Z neutralizačního kotle byl průběžně čerpán zředěný roztok 6-APK na filmovou odparku a roztok zahuštován při teplotě brýdových par 26 °C 5 až 7násobnš a jímán do krystalizačního kotle. V tomto kotli byl zahuštěný roztok kontinálně chlazen na +2 °C a okyselován na pH 4,3.

Po úpravě a krystalizací celého objemu roztoku za trvalého chlazení bylo ještě 2 hodiny mícháno. Vykrystalovana 6-APK byla odstředěna na bubnové odstředivce, promyté ledovou vodou a acetonem a vysušena za vakua. Bylo získáno 163,2 kg 6-APK o obsahu účinné látky 97,6 %.

Organická butylacetátová fáze získaná při kontinuální extrakci obsahovala kromě nepatr ných zbytků penicilinu a rozkladných produktů prakticky celé ekvivalentní množství kyseliny fenyloctové a byla zpracována následujícím způsobem.

V extrakčním kotli byl bohatý butylacetát neutralizován čpavkovou vodou na pH 7,8 až 8,0 a získaná vodná fáze byla oddělena. Těžká vodná fáze byla oddělena a provedena ještě jedna extrakce zbylé butylacetátová fáze vodou, vodné fáze spojeny a získáno celkem 360 1 32% roztoku fenyloctanu amonného, vhodného pro přímé použití při prekurzorováni pro biosyntézu penicilinu G.

2,1175

Přiklad 3 m^ vyfermentované půdy s obsahem 16 900 j. penicilinu G/Ml filtrátu bylo zfiltrováno postupně za stálého ochlazení přes rotační filtr. Poněvadž vyfermentovaná půda byla silně opalescentní vlivem částečné autolýzy buněk producenta penicilinu G, byla k 90 m^ filtrá tu a promývaoí vody z filtru za míchání a chlazení přidáno 0,25 obj. % flokulantu (Sedipur KA). Poté byl filtrát okyselen 3016 kyselinou sírovou n$ hodnotu pH 4,6; po promíchání a ochlazení na +5 °C byla vzniklá sraženina oddělena přes rotační filtr’ a čirý filtrát byl veden přes průtokový chladič při -2 °C na směrovací čerpadlo, kde byl kontinuálně okyselovén 20% kyselinou sírovou na hodnotu pH mezi 1,8 až 2,1 a vzniklá těžká fáze byla ihned zpracována způsobem popsaným v příkladu 1, včetně okamžité průběžné neutralizace zředěnou čpavkovou vodou za míchání a chlazení a odbarvení neutrálního koncentrátu směsí aktivního uhlí a křemeliny.

Chlazený neutrální koncentrát penicilinu G byl postupně po částech ředěn na objem 2 000 1 demineralízovanou vodou tak, aby koncentrace benzylpenicilinu činila 6,2 % (hmota/ /objem); Štěpení bylo provedeno v 6 semikontinuálníčh cyklech hydrolýzy pomooí zešítěných a permeabilizovanýoh buněk postupem podle čs. autorského osvědčení č. 201 621 a bylo vyrobeno 318 kg 6-APK o obsahu účinné látky 98,6 % nerozpustný zbytek 4,25 %. Fenyloctová kyselina byla ve formě 40% roztoku amonné soli regenerována způsobem popsaným v příkladu 2.

Přiklad 4

760 1 bohatého butylaoetátového extraktu o účinnosti 68 500 j. penicilinu G, získa' ného zpracováním filtrátu vyfermentovanéj půdy, bylo na rotačním extraktoru reextrehováno do

070 1 2,75% roztoku uhličitanu draselného v demineralizované vodě. Získaný vodný koncentrát o aktivitě 93 800 j/ml a o hodnotě pH 7,5 byl rozdělen na dva stejné objemové díly, které byly zpracovány semikontinuálním způsobem pomoci zešítěných buněk postupem podle čs. autorského osvědčení č. 201 621. Z prvého cyklu bylo získáno 100,30 kg 6-APK o čistotě 98,6 %, z druhého cyklu 111,20 kg 6-APK o čistotě 97,8 %.

Příklad5

Bohatý butylaoetátový extrakt byl zpracován do surové K-soli benzylpenicilinu nasyceným roztokem octanu draselného ve vodě. Surová K-sůl, vysolená nadbytkem octanu draselného z vodné fáze, byla separována na rychloběžné bubnové odstředivce a po separaci matečných louhů byla surová draselná nepromytá sůl benzylpenicilinu rozpuětěna na 6% roztok a ten podroben enzymové hydrolýze pomocí zešítěných a permeabilizovaných buněk postupem podle čs. autorského osvědčení č. 201 621. Získaná 6-APK měla čistotu 98,8 % a výtěžek činil 80,2 % teorie.

Claims (4)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   1. Způsob přípravy 6-aminopenicilánové kyseliny enzymovým štěpením benzylpenicilinu zesítěnými nebo agregovanými nebo vázanými buňkami mikroorganismů s penicilinaoylázovou aktivitou, vyznačující se tím, že se jako výchozí suroviny pro štěpení používá vodná fáze s hodnotou pH 7,0 až 8,0 získané v některém ze stupňů zpracovávání vyfermentované půdy na henzylpenicilin, obsahující rozpustnou sůl benzylpenicilinu, zejména sůl sodnou, draselnou nebo amonnou, v koncentraci 2 až 7 % hmot., načež se po ukončeném štěpení vyloučí okyselením reakční směsi při teplotě 0 až 10 °C a v přítomnosti organického, s vodou nemísitelného rozpouštědla, například butylacetátu, 6-aminopenicilánová kyselina, která se izoluje a oddělená organická fáze se zpracuje na kyselinu fenyloctovou.

   251175
2. 2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se jako vodné fáze s hodnotou pH 7,0 až 8,0 používá roztoku amonné soli benzyplenicilinu, vzniklého neutralizací čpavkovou vodou volné kyseliny benzylpenicilinu, získané z filtrátu vyfermentované půdy okyselením na pH 1,5 až 2,5 a oddělením, s výhodou odstředěním, při teplotě -5 až 0 °C.
3. 3. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, še se jako vodné fáze s hodnotou pH 7,0 až 8,0 používá roztoku sodné nebo draselné soli benzylpenicilinu, získaného z bohatého butylacetátového extraktu s obsahem volné kyše iny benzylpenicilinu reextrakcí vodným roztokem hydroxidu nebo uhličitanu sodného nebo draselného.
4. 4. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se jako vodné fáze s hodnotou pH 7,0 až 8,0 používá vodného roztoku surové draselné soli benzylpenicilinu, získané z bohatého butylacetátového extraktu vysolením nasyceným roztokem octanu draselného a oddělením v pev né formě.