CS207715B2 - Method of preparation of the 6-aminopenicillane acid - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu přípravy 6-aminopenicillanové kyseliny enzymatickou hydrolýzou penclllinu, při kterém se vodný roztok tohoto penicillinu uvádí do styku s penicillinacylázou immobilizovanou ve formě částic, jako katalyzátorem při teplotě 15 až 45 °C a pH 6,5 až 9,0. Podle vynálezu se vodný roztok penicillinu recirkuiuje ložem o hloubce 1 až 6 cm obsahujícím tento katalyzátor ve formě částic rychlostí· toku 0,4 až 3 objemy lože za minutu. Přednostně se jako penicillinu používá draselné soli penicillinu G, lože má hloubku asi 2 až 3 cm, částice katalyzátoru obsahují immobilizované buňky Próteus rettgeri, obsahující enzym, teplota je asi 35 až 40 °C a· pH je asi 7,5 až 8,2.

Vynález se týká penicillinů, zejména pak enzymatické deacylace penicillinů na 6-aminopenlcillanovou kyselinu.

6-amino'penicillanová kyselina, obvykle označovaná jako> 6-APA je meziproduktem při výrobě syntetického penicillinů a kromě jiných způsobů se připravuje též deacylací penicillinů. Tato konverze se prováděla jak chemickými, tak biochemickými technikami. Chemická konverze, jejíž příklad je uveden v patentu USA č. 3 499 909 je nevýhodná z toho důvodu, že . představuje mnobastupňový proces, který vyžaduje podmínky nízké teploty, jejichž udržování je energeticky náročné a specializované zařízení. Biochemická . konverze používá enzymu penicillinacylázy nebo> penicillinamiidázy. V patentu USA č. 3 260 653 se aktivní enzym. dodává prostřednictvím určitých bakterií nebo bakteriálních extraktů. Tento přístup není ’ zcela uspokojivý pro průmyslovou výrobu 6-APA, poněvadž proud . . produktu je znečištěn enzymem a/nebo. 'mikrobiálními buňkami, které je pak nutno odstraňovat během izolace produktu a enzymu lze použít pouze jednou. Obtíže se znečištěním· produktu a nízkým využitím enzymu jsou překonány při postupu podle patentu . USA. č. . .3 953 .291 . za . použití immobilizovaných mikrobiálních buněk produktujících penicillinamidázu.

Takový postup využívající ' .immobilizovaných . buněk vykazuje však stále nízkou produktivitu, poněvadž když se pracuje po dávkách, je nevýhodou diskontinuální povaha provozu a. nadbytečná manipulace s hmotou immobilizovaných buněk a když se pracuje v kolonách, je nevýhodou špatná kontrola pH a horší využití enzymu než je optimální.

V patentech USA č. 3 694 314 a 3 817 832 je popsáno. použití mělkého lože mikrobiálních buněk, jako katalyzátoru kontinuální isomerizace glukózy na fruktózu. Mělkého* lože se údajně používá proto, aby se minimalizovala tlaková ztráta v katalyzátoru. Požadované konverze se dosahuje tím, že se vodný . zpracovávaný proud vede několika loži zapojenými do . série.

Nyní se zjistilo, že penicillin lze převést na 6-APA jednoduchým a účinným způsobem. tak, že se rychle recirkuluje vodný roztok penicillinů mělkým ložem, obsahujícím katalytickou penicillinacylázu ve formě částic, za regulovaných teplotních podmínek a podmínek pH. Předmětem. vynálezu je způsob přípravy 6-aminopenicillanové kyseliny enzymatickou hydrolýzou penicillinu, při kterém· se vodný roztok tohoto penicillinů uvádí do styku s penicillinacylázou immobilizovanou ve formě částic, jako. katalyzátorem· při teplotě 15 až 45 °C a pH 6,5! až 9,0, vyznačující se tím, že se vodný roztok penicillinů recirkuluje ložem, o. hloubce 1 až 6 cm. obsahujícím tento. katalyzátor ve formě částic rychlostí toku 0,4 až 3 objemy lože za minutu. Přednostně se jako.

penicillinů používá draselné soili penicillinu G, lože má hloubku asi 2 až 3 cm, částice katalyzátoru obsahují immobilizované buňky Próteus rettgeri, obsahující enzym, teplota je asi 35 až 40 °C a pH je asi 7,5 až 8,2.

Způsob podle vynálezu, spočívající v rychlé recirkulaci zpracovávaného proudu mělkým. . ložem částic katalyzátoru, optimalizuje konverzi penicillinů na 6-APA, poněvadž překonává až dosud neřešitelné obtíže s regulací pH a regulací toku, které byly typické pro kontinuální deacylaci v koloně a obtíže s nadměrnou manipulací s katalyzátorem při deacylaci po dávkách. Možnost regulace pH při způsobu podle vynálezu je zvláště významná, poněvadž při deacylaci vzniká karboxylová kyselina, kterou je nutno* neutralizovat, jelikož enzym je optimálně aktivní . v úzkém rozmezí pH a jak reakční činidlo, tak produkt jsou citlivé na extrémní hodnoty pH. Poněvadž se této. regulace dosahuje . při minimální tlakové ztrátě v loži, má postup další výhodu v tom, že lze použít standardního výrobního zařízení.

Způsob podle vynálezu se hodí pro· deacylaci jakéhokoli penicillinů rozpustného. ve vodě. Jako příklady těchto penicillinů, na které se však vynález neomezuje, lze uvést penicillin G (benzylpenicillin), penicillin X (p-hydroxybenzylpenicillin) a penicillin V (fenoxymethylpenicillin). Přednost se dává penicillinů G ve formě draselné nebo sodné soli. Koncentrace penicillinového . substrátu ve vodném roztoku nemá rozhodující význam. a normálně leží od asi 1 do. 20 g/ /100 ml roztoku.

Pod označením. „katalyzátor tvořený . immobilizovanou penicillinacylázou . ve . formě částic” se rozumí enzym penicillinacyláza, nebo jakýkoli mikroorganismus produktující penicillinacylázu zapouzdřený v matrici organického nebo anorganického původu ve formě částic nebo k takové matrici připojený a to takovým způsobem, že si zachovává svou enzymatickou aktivitu. Vhodnými . mikroorganismy produkujícími penicillinacylázu jsou mikroorganismy druhu Próteus, Escherichia, Streptomyces, Nocardia, Micrococcus,' . Pseudomonas, Alkaligenes a Aero-bacter jako jsou mikroorganismy uvedené . v patentech USA č. 3 260 653 a 3 953 291. Běžnými způsoby, kterých . se používá pro takovou immobilizaci enzymů a mikrobiálních buněk jsou kovalentní vazba k matrici, zapouzdření v matrici, fyzikální adsorpce na matrici a zesíťování s bifunkčním reakčním činidlem za vzniku matrice. Ilustrativní příklady těchto způsobů immobilizace jsou postupy uvedené v patentech USA č. 3 645 852, 3 708 397, 3 737 231, 3 779 869, 3 925 157, 3.953 291 a 3 957 580. Jak je uvedeno v těchto citacích, matrici tvoří typicky polymer nebo kopolymer takových monomerů jako je glycidylmethakrylát, anhydrid kyseliny methakrylové, akryloylamid, akrylamid, styren, divinylbenzen nebo> glukóza nebo· mohou matrici tvořit takové látky, jako je bentonit, práškovitý uhlík, kysličník titaničitý kysličník hlinitý nebo sklo. Přednostními katalyzátory jsou katalyzátory obsahující buňky Próteus rettgeri obsahující penicillinacylázu immobilizované postupem· podle US patentu č. 3 957 580. Takové částice katalyzátoru mají obvykle aktivitu od asi 200 do 5000 jednotek (mikromolů penicillinu G deacylovaného za hodinu) na gram suchého katalyzátoru.

Částice katalyzátoru se upraví do· podoby mělkého lože, kterým se zpracovávaný proud rychle recirkuluje. Pod označením mělké lože se rozumí lože o hloubce až do· asi 6 cm. Skutečná hloubka lože je určována požadovanou produktivitou konverzní jednotky, aktivitou částic katalyzátoru a v případě katalyzátoru tvořeného immobilizovanými mikrobiálními buňkami, koncentrací buněk v částicích katalyzátoru. Lože má být dostatečně hluboké, aby poskytovalo dostatečnou aktivitu enzymu pro požadovanou produktivitu jednotky, ale ne tak hluboké, aby se zabránilo· požadovanému toku, jak je uvedeno dále. Někdy je vhodné smísit katalyzátor s jinou látkou ve formě částic, jako s infusoriovou hlinkou, perlltem· nebo práškovou celulózou, která se přidává v množství až do asi 80 % obj. vztaženo · na lože. Přídavkem těchto látek se dodá loži poréznější charakter. Požadavkům· na vhodnou produktivitu a tokové vlastnosti obvykle vyhovuje lože o hloubce asi 1 až 6 cm·. Obzvláště vhodnými jednotkami pro přípravu takových loží jsou standardní filtrační zařízení, jako je horizontální tlakový listový filtr nebo rámový kalolis.

Konverze se provádí za regulované teploty a regulovaného pH, aby se co nejvíce zvýšila produktivita za současné minimalizace degradace substrátu, produktu a katalyzátoru. Teplota je omezena přibližně na rozsah 15 až 45 °C, s výhodou asi na 35 až 40 °C. Aktivita katalyzátoru značně klesá při teplotě příliš nižší než je 15 °C, zatímco příliš vyšší teplota než je 45 °C má za následek značný rozklad penicillinu a 6-APA a rovněž značnou denaturaci katalyzátoru. Jak již bylo· uvedeno regulace pH je rozhodujícím· faktorem pro dosažení · vysoké konverze penicillinu na 6-APA a pH postupu proto= je omezeno· přibližně na rozmezí 6,5 až 9,0. Hodnota. pH příliš nižší než 6,5 má za následek značně snížení aktivity enzymu a zvýšenou degradaci penicillinu a pH příliš vyšší než 9,0 urychluje nejen degradaci penicillinu, ale rovněž denaturaci enzymu. Když se používá katalyzátoru odvozeného od mikroorganismu Próteus rettgeri, udržuje se· pH přednostně v přibližném rozmezí 7,5 až 8,2.

V praxi se postupuje tak, že se většina zpracovávaného· proudu udržuje při poža dované· teplotě a pH v míchané nádrži nebo: zásobníku. Ložem katalyzátoru se kontinuálně vede malé množství tohoto proudu a rychle se vrací zásobníku, kde se kyselina vzniklá během průchodu ložem neutralizuje vhodnou zásadou, jako je hydroxid sodný, aby se pH udrželo v požadovaném rozmezí. Takový systém se může upravit, jak pro· provoz po dávkách, tak pro provoz semikontinuální nebo· kontinuální.

Rovněž rychlost toku zpracovávaného proudu ložem katalyzátoru má rozhodující význam pro zajištění optimální konverze penicillinu · na 6-APA a měla by být alespoň 0,4 objemu lože za minutu. Rychlosti toku příliš · nižší než je tato hodnota způsobují nejen značné snížení využití katalyzátoru, což je způsobeno horší difúzí substrátu a produktu ložem katalyzátoru, ale rovněž zvětšují rozsah degradace substrátu, produktu a katalyzátoru v důsledku zvýšení místní kyselosti lože.

V recyklování zpracovávaného proudu ložem· katalyzátoru se pokračuje až do· té doby, kdy je konvertován v podstatě všechen (alespoň 80 %) penicillin. 6-APA v proudu se pak bud' může izolovat, nebo nechat reagovat běžným způsobem na požadovaný penicillin.

Následující příklady slouží pro bližší ilustraci vynálezu. Příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu vymezený definicí předmětu vynálezu, nijak neomezují.

Přikladl

Fermentační půda obsahující Próteus rettgeri [ATCC 3'052 [ATCC 9250) Pfizerova kultura 18470—76—60], fermentovaná za aerobních podmínek v ponořeném stavu při 28 °C a pH 6,8 až 7,0 na substrátu z mléčného kaseinu se odstředí a oddělené buňky se promyjí vo-dou. Na suspenzi 3'7 kg promytých buněk ve 2'20 litrech vody se působí '6,3 kg vodného glutaraldehydu o koncentraci 25 % hmot, a směs se míchá 17 minut při 21 °C. K takto· zpracované suspenzi se přidá 162,6 kg glycidylmethakrylátu a suspenze se 2 hodiny míchá při 22 stupních Celsia. Pak se ke směsi přidá 30,4 kg N,N-mothylenbisakrylamidu, 27,6 kg dimethylamino-propionitrilu a 3,3 kg peroxosulfátu amonného a směs se při pH 7,' míchá · 2 hodiny při 25 až 33 °C. Reakční suspenze se přefiltruje a promyje vodou. Získá se deacylační katalyzátor ve formě vlhkých částic, který obsahuje 9'8 jednotek penicillinacylázy v 1 g suchého katalyzátoru.

Smiěs vlhkého katalyzátoru (5,1 kg) sušiny) a křemelinové pomocné filtrační látky (7,1 · kg) se zředí vodou za vzniku suspenze s obsahem pevných látek asi '60 g/ /litr. Horizontální listový tlakový filtr obsahující 8 listů o· průměru 46 cm se natlakuje vodou na přetlak 0,27 MPa. Pak se suspenze katalyzátoru uvádí na filtr rychlostí asi 20 lltrů/min, přičemž filtrát se. recykluje do nádrže se suspenzí, až je v podstatě čirý. Výsledná katalytická leže jsou rovnoměrně upravena na listech filtru, přičemž hloubky lože jsou 2,8 cm kromě vrchního listu, který má hloubku lože 2,3 cm. Objem. loží je asi 37 litrů, přičemž celková aktivita náplně je 4,32 x 10^G jednotek.

Vodný roztok draselné soli, penicillinu G se připraví rozpuštěním 3,0 kg penicillinu (o· čistotě 97,1 %) v dostatečném množství vody v míchané nádrži na celkový objem 130 litrů. Roztok se pak recirkuluje ložem katalyzátoru a vrací se do zásobní nádrže. Reakční roztok v nádrži se udržuje při teplotě 37 až 39 °C za použití vnějšího výmě níku tepla ve zpětném potrubí a při pH 7,8 až 8,1 postupným přidáváním 1 N hydroxidu sodného. V recyklování se pokračuje tak dlouho, až je penicillin více· než z 90 % převeden na 6-APA, což se zjistí n,a základě množství přidaného hydroxidu sodného. Pak se systém. vypustí a propláchne asi 12 litry vody, připraví se· čerstvý penicillinový roztok a znovu se zahájí recyklování. Vzorek spojeného proudu produktu a proplachovací vody z prvního· cyklu se dvakrát extrahuje při pH 2,3 a 10 °C 0,25 objemu ethylacetátu a v extrahovaném vzorku se určuje 6-APA.

Tabulka I souhrnně uvádí výsledky provozu systému v několika po sobě následujících cyklech. ,

T Tabulka I

Cyklus ď)	1
násada — draselná sůl
penicillinu G (kg)	3,0
Tlaková ztráta v loži
(kPa)
začátek	290
konec	290
Rychlost recirkulace
litr/min
začátek	66
konec	58
Reakční doba h/mol	0,83
Konverze ·%	93
Výtěžek 6-APA % (2)	94

4 5 6

3,0	3,0	3,0	2,0
300	290	280	280
300	280	280	280
50	50	50	50
50	50	48	48
0,86	1,01	1,03	1,20
96	96	93	96
82	89	94	86

(1) Cyklus 2 byl narušen výpadkem· elektrického proudu, jeho výsledky nejsou proto reprezentativní.

,2)· Stechiometrický výtěžek, vztažený na převedený penicillin.

Proud produktu extrahovaný rozpouštědlem se může zkoncentrovat při 40 °C a pH 7 a 6-APA obsažená v koncentrátu se může buď nechat vykrystalovat při pH 3,6, nebo se může acylovat na požadovaný penicillin. Shora uvedený systém se může nechat .pracovat při pH 9,0 a 45 ^CC nebo při pH 6,5 a 15 °C za použití lože katalyzátoru o hloubce 1 až 6 cm, přičemž recirkulace se provádí rychlostí toku ložem- 0,4 objemu lože/min nebo rychlostí větší.

Příklad 2

Vlhké částice s immobilizovanýmí buňkami Próteus rettgeri (5,1 kg sušiny), vyrobené jako v příkladě 1 a obsahující 690 jednotek penicillinacylázy v 1 g suchého katalyzátoru se smísí s 5,1 kg pomocné filtrační látky na bázi · křemeliny v dostatečném množství vody, aby vznikla suspenze s obsahem pevných látek asi 90 g/litr.

Rámový kalolis s 16 rámy, přičemž hloubka komor je 2,54 cm, plocha komor je 723 cm² a celkový objem komor je 29,4 litru se natlakuje vodou do přetlaku 140 až 170 kPa. Pak se na filtr konstantní průtokovou rychlostí · uvádí suspenze katalyzátoru tak dlouho, až je lože plně vytvořeno. Tlaková ztráta na filtru se zvýší na 270 kPa a filtrát se recykluje tak dlouho, až je čirý. Získá se rovnoměrně· povrstvený filtr se stupněm . naplnění každé z komor 85 až 90 proč. Celková aktivita náplně je 3,5 x 10⁶ jednotek.

Vyrobí se vodné roztoky penicillinu a systém recyklování se upraví . jako v · příkladě 1 .Používá se draselné soli penicillinu G (o čistotě 96,7 %), objem roztoku je 50 litrů, pracovní teplota 37 až 39 °C, pH 7,8 až 8,0 a objem proplachovací vody 20 litrů. Tabulka II souhrnně uvádí výsledky dosažené za provozu této jednotky:

Tabulka II

Cyklus	1
Násada — draselná sůl
penicillinu G (kg)	2,0
Tlaková ztráta v loži (kPa)
začátek	. 120
konec	180
Rychlost recirkulace litr/min
začátek	25
konec	24
Reakční doba h/mol	0,77
Konverze %	95
Výtěžek 6-APA %	93
(1) Po provedení cyklu 3	se katalyzátor
vyjme z filtru, znovu se	suspenduje ve
vodě a naplní se jím filtr pro· cyklus 4

⁽²⁾ Výtěžek izolované 6-APA 91 %.

Místo· buněk Próteus rettgeri se při ' této· konverzi může stejně dobře použít buněk escherichia coli ATCC 9637, které . rovněž obsahují penicillinacylázu.

Místo, katalyzátoru obsahujícíhoi immobi10

2	3(1)	4
3,0	2,0	3,0
200	390	220
310	450	310
26	22	25
23	20	24
0,78	0,97	0,87
95	96	93
89	94	90‘2’

lizované mikrobiální buňky se může též použít' částic deacylačního katalyzátoru s ekvivalentní aktivitou, vyrobených immobilizací penicillinacylázy izolované z mikrobiálních buněk produkujících penicillinacylázu, jako je Próteus rettgeri ATCC 31052 a Escherichia coli ATCC 9637 způsobem immobilizace· popsaným v patentu USA č. 3 925 157.

Claims (3)

1. PŘEDMĚT VYNALEZU

   1. Způsob přípravy 6-aminopenicillanové kyseliny enzymatickou hydrolýzou penicillinu, při kterém se vodný roztok tohoto penicillinu uvádí do styku s penicillinacylázou immoibilizoVanou ve formě částic, jako katalyzátorem při teplotě 15 až 45 °C a pH 6,5 až 9,0, vyznačující se tím, že se vodný roztok penicillinu recirkuluje ložem o hloubce 1 až 6 cm obsahujícím tento katalyzátor ve formě částic rychlostí toku 0,4 až 3 objemy lože za minutu.
2. 2. Způsob podle bodu . 1, vyznačující se tím, že se používá lože katalyzátoru o hloubce 2 až 3 cm.
3. 3. Způsob podle bodů 1 až 2, .vyznačující se tím, že se pracuje při teplotě 35 až 40 °C a pH od 7,5 do 8,2.