PL109707B1 - Method of producing 6-aminopenicillanic acid - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia kwasu 6-aminopenicylanowego na drodze enzy¬ matycznego odacylowania penicylin.Kwas 6-aminopenicylanowy, pólprodukt do wyt¬ warzania penicylin pólsyntetycznych nazywany * zwykle skrótowo kwasem 6-AP, wytwarza sie mie¬ dzy innymi poprzez odacylowanie penicylin. Prze¬ miane te prowadzi sie metodami chemicznymi i biochemicznymi. Przeksztalcenie chemiczne, opisa¬ ne na przyklad w opisie patentowym St. Zjedn. lt Am. nr 3 499 909, jest procesem wieloetapowym, wymagajacym stosowania energochlonnych warun¬ ków niskotemperaturowych i specjalnych urzadzen.W procesie biochemicznym wykorzystuje sie enzy¬ my, a mianowicie acylaze penicylinowa lub amida- 15 ze penicylinowa.Wedlug opisu patentowego St. Zjedn. Am. -nr 3 260 653 enzymy sa dostarczane przez rozmaite bakterie lub ekstrakty bakteryjne. Ta metoda jest niezupelnie zadowalajaca dla przemyslowego wyt¬ warzania kwasu 6-AP poniewaz otrzymuje sie pro¬ dukt zanieczyszczony enzymem i/lub komórkami drobnoustroju, które to zanieczyszczenia trzeba usu¬ wac podczas wyodrebnienia produktu, a ponadto enzym moze byc uzywany tylko jednokrotnie. Pro¬ blem zanieczyszczen i malego wykorzystania enzy¬ mu zostal w znacznym stopniu rozwiazany w spo¬ sób przedstawiony w opisie patentowym St. Zjedn.Am. nr 3 953 291, dzieki zastosowaniu unierucho¬ mionych na nosniku komórek bakteryjnych wy- 3© 20 25 twarzajacych amidaze penicylinowa. Proces, w któ¬ rym wykorzystuje sie unieruchomione komórki cha¬ rakteryzuje sie jednak w dalszym ciagu mala wy¬ dajnoscia, ze wzgledu na nieciagly, periodyczny sposób prowadzenia operacji. Wystepuje takze nad¬ mierne zuzywanie osadzonego materialu komórko¬ wego, ze wzgledu na niedostateczna kontrole war¬ tosci pH w kolumnie i mniejszy od optymalnego stopien wykorzystania enzymu.Zastosowanie cienkiego zloza dzialajacych ka- talicznie komórek bakteryjnych w procesie izome¬ ryzacji glukozy do fruktozy, zostalo przedstawione w opisach patentowych St. Zjedn. Am. nr 3 694 314 i 3 817 832. Cienka warstwe zloza stosuje sie tu w celu zmniejszenia spadku cisnienia na zlozu kata¬ lizatora i izomeryzacje prowadzi sie przepuszcza¬ jac strumien wodnego roztworu substratu przez kolejne zloza.Stwierdzono, ze penicyliny mozna przeksztalcac w kwas 6-AP w prosty i wydajny sposób poprzez szybka recyrkulacje wodnego roztworu penicyliny przez cienka warstwe zloza zawierajacego rozdrob¬ niony katalizator zawierajacy acylaze penicylino¬ wa, prowadzac proces w kontrolowanych warun¬ kach wartosci pH i temperatury. Przedmiotem wy¬ nalazku jest wiec sposób enzymatycznego prze¬ ksztalcania penicyliny w kwas 6-AP, polegajacy na tym, ze wodny roztwór penicyliny o wartos¬ ci pH wynoszacej okolo 6,5—9, utrzymywany w temperaturze okolo 15—45°C, poddaje sie recyrku- 109 707\ 109 S lacji przez warstwe zloza o grubosci do okolo 6 centymetrów, zawierajacego rozdrobniony katali¬ zator z osadzona acylaza penicylinowa, z szybkos¬ cia wynoszaca co najmniej 0,4 objetosci zloza na minute, przy czym recyrkulacja trwa az do prawie calkowitego przeksztalcenia penicyliny; w kwas 6- -AP. Korzystnie, jako penicyline stosuje sie sól potasowa penicyliny G, grubosc zloza wynosi okolo 2—3 cm, rozdrobniony katalizator zawiera unieru¬ chomione komórki Proteus rettgeri, zawierajace en¬ zym, temperatura wynosi okolo 35—40°C i wartosc pH wynosi okolo 7,5—8,2.Sposób wedlug wynalazku, w którym stosuje sie szybka recyrkulacje strumienia roztworu penicyli¬ ny przez zloze rozdrobnionego katalizatora, poz¬ wala na optymalizacje procesu przeksztalcenia pe¬ nicylin w kwas 6-AP, gdyz. rozwiazuje on nieroz¬ wiazany dotychczas problem kontrolowania wartos¬ ci pH i problem kontrolowania szybkosci przeply¬ wu, które to problemy zwiazane sa z odacylowa- niem kolumnowym, a z drugiej strony zapobiega nadmiernemu zuzywaniu katalizatora, co ma miej¬ sce w odacylowaniu periodycznym. Szczególne zna¬ czenie ma mozliwosc kontrolowania wartosci pH, gdyz podczas odacylowania .uwalnia sie kwas kar- • boksylowy, który musi byc zobojetniany. Z drugiej strony, enzym wykazuje najwieksza aktywnosc w waskim przedziale wartosci pH, a zarówno substra- ty jak i produkt sa wrazliwe na krancowe wartos¬ ci pH. Regulowanie wartosci pH osiaga sie przy mi¬ nimalnym spadku cisnienia na zlozu, co jest kolej¬ na zaleta tego procesu, gdyz pozwala na wykorzys¬ tanie typowych urzadzen.Srtosujac sposób wedlug wynalazku mozna oda- cylowac kazda rozpuszczalna w wodzie penicyline, np. penicyline G (benzylowa), penicyline X (p — hydroksybenzylowa) lub penicyline V (fenoksyme- tylowa). Korzystna penicylina jest sól sodowa lub potasowa penicyliny G. Stezenie penicyliny w wod¬ nym roztworze nie jest wielkoscia krytyczna i zwy¬ kle moze sie zmieniac w granicach 1—20 g/100 ml roztworu.Okreslenie — rozdrobniony katalizator zawiera¬ jacy unieruchomiona acylaze penicylinowa, ozna¬ cza acylaze penicylinowa lub drobnoustrój wytwa¬ rzajacy acylaze penicylinowa, osadzony na nieroz¬ puszczalnym w wodzie odpowiednim podlozu po¬ chodzenia organicznego lut) nieorganicznego, w ta¬ ki sposób, ze zachowana jest aktywnosc enzyma¬ tyczna. Odpowiednimi drobnoustrojami wytwarza¬ jacymi acylaze penicylinowa sa drobnoustroje z rodzajów Proteus, Escherichia, Streptomyces, No- cardia, Micrococcus, Pseudomonas, Alkaligenes i Aerobacter, opisane w opisach patentowych St.Zjedn. Am. nr 3 260 653 i 3 953 291. Enzymy lub komórki drobnoustrojów osadza sie na nosnikach stosujac zwykle sposoby, takie jak zwiazane wia¬ zaniem kowalentnym z podlozem, wylapywanie przez podloze, adsorbcja na podlozu i sieciowanie z dwufunkcyjnym reagentem z wytworzeniem pod^ loza. Przyklady sposobów osadzania znalezc mozna w opisach patentowych St. Zjedn. Am. nr nr 3 645 852, 3 708 397, 3 736 231, 3 779 869, 3 925 157 3 953 291 i 3 957 580. Jak wynika z tych zródel, ja- 707 4 ko podloze stosuje sie zwykle polimery lub kopo¬ limery takich monomerów, jak metakrylan glicy- dylu, bezwodnik kwasu metakrylowego, akroilo- amid, akryloamid, styren, dwuwinylobenzen lub glu- 5 koza, lub podlozem moga byc takie substancje, jak bentonit, sproszkowany wegiel, tlenek tytanu, tle¬ nek glinu lub szklo. Korzystnym katalizatorem jest taki, w którym komórki Proteus rettgeri zawieraja¬ ce acylaze penicylinowa osadzone sa w sposób L0 przedstawiony w opisie patentowym St. Zjedn. Am. nr 3 957 580. Odpowiedni katalizator takiego typu wykazuje zwykle aktywnosc 200—5 000 jednostek (mikromili penicyliny G odacylowanych w ciagu 1 godziny) w gramie suchego katalizatora. 15 Katalizator stosuje sie w postaci cienkiej warst¬ wy zloza, przez które recyrkuluje strumien roztwo¬ ru penicyliny. Za cienka uwaza sie warstwe o grubosci do okolo 6 cm. Kazdorazowa grubosc zloza wyznaczana jest w zaleznosci od pozadanej ! wydajnosci przeksztalcenia, aktywnosci danego ka¬ talizatora a takze w. przypadku osadzonych ko¬ mórek bakteryjnych, od stezenia tych komórek w katalizatorze. Grubosc zloza powinna byc wystar¬ czajaco duza dla zapewnienia wymaganej aktyw¬ nosci enzymatycznej i nie za duza dla zapewnie¬ nia utrzymania odpowiedniej szybkosci przeplywu.Niekiedy moze byc wskazane zmieszanie kataliza¬ tora z odpowiednim materialem, takim jak ziemia okrzemkowa, perlit lub sproszkowana cejuloza, do¬ dawanym w ilosci do 80% objetosciowych, dla zwiekszenia porowatosci zloza. Zloza o grubosci 1—6 cm odpowiadaja na ogól wymaganej wydaj¬ nosci i szybkosci przeplywu. Do szczególnie przy- 5 datnych urzadzen do przygotowywania takich zlóz naleza typowe urzadzenia filtracyjne, takie jak po¬ ziomy tarczowy filtr cisnieniowy lub plytowo-ra- mowa prasa filtracyjna.Przemiane prowadzi sie w kontrolowanych wa- M runkach temperatury i wartosci pH w celu uzys¬ kania najlepszej wydajnosci i zmniejszenia do mi¬ nimum degradacji substratu, produktu i kataliza¬ tora. Temperatura procesu wynosi 15—45°C, korzys¬ tnie 35—40°C. W temperaturze znacznie nizszej niz ^5 15°C aktywnosc katalizatora znacznie spada, na¬ tomiast w temperaturze znacznie wyzszej od 45?C nastepuje wyrazny rozklad penicyliny i kwasu 6-AP oraz zauwazalna denaturacja katalizatora.Jak wspomniano uprzednio wlasciwa wartosc pH 50 jest krytyczna dla uzyskania wysokiego stopnia konwersji penicyliny w kwas 6-AP i dlatego war¬ tosc pH w czasie procesu powinna wynosic 6,5— —9,0. Przy wartosci pH znacznie ponizej 6,5 spa¬ da wyraznie aktywnosc enzymu i wzrasta rozklad 55 penicyliny, natomiast przy wartosci pH znacznie powyzej 9,0 nastepuje nie tylko przyspieszona de¬ gradacja penicyliny ale równiez denaturacja en¬ zymu. Jesli jako katalizator stosuje.sie enzym wy¬ twarzany przez Proteus rettgeri, korzystna wartosc 60 pH wynosi 7,5—8,2.W praktyce, porcje roztworu penicyliny przyjmu¬ je sie w wymaganej temperaturze i przy wlasci¬ wej wartosci pH, mieszajac ja w zbiorniku. Mala porcje roztworu przepuszcza sie w sposób ciagly •i przez katalizator a nastepnie szybko nawraca do5 109 707 6 zbiornika, w którym kwas powstajacy podczas przejscia przez zloze zobojetnia sie za pomoca od¬ powiedniej zasady, takiej jak wodorotlenek sodo¬ wy, w celu utrzymania wartosci pH na odpowied¬ nim poziomie. Taki sposób mozna stosowac do pro¬ cesu periodycznego, pólciaglego )lub ciaglego.. Równiez zasadnicze znaczenie dla uzyskania op¬ tymalnej przemiany penicylin w kwas 6-AP ma szybkosc przeplywu strumienia roztworu przez zlo¬ ze katalizatora. Korzystna szybkosc wynosi co naj¬ mniej 0,4 objetosci zloza na minute. Szybkosc prze¬ plywu znacznie mniejsza od podanej powyzej nie tylko wyraznie zmniejsza wykorzystanie kataliza¬ tora ze wzgledu na gorsza dyfuzje srfbstratu i pro¬ duktu przez zloze katalizatora, ale takze sprzyja degradacji substratu, produktu i katalizatora na skutek lokalnego zwiekszenia- kwasowosci zloza.Obieg strumienia roztworu penicyliny przez zlo¬ ze katalizatora prowadzi sie do czasu az co naj¬ mniej 80% penicyliny ulegnie przemianie. Powsta¬ jacy kwas 6-AP izoluje sie lub poddaje bezposred¬ nio przerobowi na odpowiednia penicyline przy za¬ stosowaniu znanych sposobów.Ponizsze przyklady ilustruja sposób wedlug wy¬ nalazku nie ograniczajac jego zakresu.Przyklad I. Brzeczke fermentacyjna z hodow¬ li. Proteus rettgeri, szczep ATCC 31052 (ATCC 9250), Pfizer -Culture 18470-76-60, otrzymana w warun¬ kach hodowli podpowierzchniowej z napowietrza¬ niem, ^w temperaturze 28°C i przy wartosci pH 6,8—7,0, w pozywce kazeiny mlecznej, odwirowu¬ je sie i oddzielone komórki przemywa woda. Do zawiesiny 317 kg przemytych komórek w ^2120 litrach wody dodaje sie 16,3 kg 25% (wagowo) roz¬ tworu wodnego aldehydu glutarowego i calosc mie¬ sza w ciagu "17 minut w temperaturze 21°C, po czym dodaje sie w atmosferze azotu 162,6 kg me- takrylanu glicydylu i znów miesza w ciagu 2 go¬ dzin w temperaturze 22°C. Nastepnie dodaje sie 30,4 kg N,N'-metyleno-dwu-(akryloamidu), 27,6 kg dwumetyloaminopropionitrylu i 3,3 kg nadsiarczanu amonowego i calosc miesza w ciagu 2, godzin w temperaturze 25—33°C. Mieszanine reakcyjna sam¬ czy sie i przemywa osad woda, otrzymujac odpo-' wiedni wilgotny katalizator odacylowania, zawiera¬ jacy 918 jednostek acylazy penicylinowej w 1 gra¬ mie suchego katalizatora.Mieszaniwe zawierajaca 5,1 kg, w przeliczeniu na sucha mase, wilgotnego katalizatora i 7,1 kg zie¬ mi okrzemkowej rozciencza sie wode, otrzymujac zawiesine zawierajaca okolo 160 kg/litr substancji stalych. Poziomy tarczowy filtjL cisnieniowy po¬ siadajacy 8 tarczy o srednicy 46 cm wypelnia sie woda pod cisnieniem 2,7 atmosfery, po czym zala¬ dowuje sie zawiesine katalizatora z szybkoscia okolo 20 litrów na minute, zawracajac przesacz az do uzyskania calkowitej klarownosci. Otrzymuje sie zloza katalizatora równomiernie rozlozone na tarczach filtracyjnych, przy czym grubosc zloza na górnej tarczy wynosi 2,3 cm a na pozostalych siedmiu 2,8 cm. Objetosc zlóz wynosi okolo 37 litrów a calkowita aktywnosc ladunku 4,32 X 106 jednostek.Roztwór wodny soli potasowej penicyliny G przy¬ gotowuje sie rozpuszczajac 3,0 kg penicyliny o czystosci 97,1% w odpowiedniej ilosci wody i mie¬ szajac w zbiorniku na nastepnie dopelniajac woda do objetosci 130 litrów. Roztwór ten poddaje sie 5 recyrkulacji przez zloze katalizatora i zbiornik. W zbiorniku utrzymuje sie temperature 37—39°C, sto¬ sujac zewnetrzny wymiennik ciepla na linii pow¬ rotnej. Wartosc pH roztworu w zbiorniku utrzy¬ muje sie na poziomie 7,8—8,1 za pomoca dodawa- 10 nia In roztworu wodorotlenku sodowego. Obieg roztworu kontynuuje sie do cz;asu przeksztalcenia wiecej niz 90% penicyliny w kwas 6-AP, co okre¬ sla sie na podstawie ilosci dodanego wodorotlen¬ ku sodowego. Uklad opróznia sie i przemywa oko¬ lo 12 litrami wody i prowadza sie swiezy roztwór penicyliny, powtarzajac operacje.Próbke roztworu i wody z przemywania ukladu ekstrahuje sie dwukrotnie 0,25 objetosciami octa¬ nu etylu# przy wartosci pH 2,3 w temperaturze 10°C i oznacza zawartosc kwasu 6-AP w ekstrakcie.W tablicy I zestawiono wyniki uzyskane w kil¬ ku kolejnych cyklach pracy.Ekstrakty organiczne mozna zatezac w tempe¬ raturze 40°C, przy wartosci pH = 7 i krystalizo- 25 wac kwas 6-AP przy wartosci pH ¦= 3,6 lub pod¬ dawac go acylowaniu do odpowiedniej penicyliny.Proces mozna takze prowadzic przy wartosci pH =""9,0 i w temperaturze 45°C lub przy wartos- 30 ci pH = 6,5 w temperaturze 15°C, stosujac zloze katalizatora o grubosci 1—6 cm i szybkosc prze¬ plywu wynoszaca 0,4 lub wiecej objetosci zloza na minute.Przyklad II. 5,1 kg (w przeliczeniu na sucha 35 mase) wilgotnych komórek Proteus rettgeri, unie¬ ruchomionych w sposób podany w przykladzie I i zawierajacych 690 jednostek acylazy penicylino¬ wej w 1 gramie suchego katalizatora, miesza sie z 5,1 kg ziemi okrzemkowej w takiej ilosci wody 40 aby otrzymac zawiesine zawierajaca okolo 90 g /litr substancji stalych. , Plytowo-ramowa prase filtracyjna skladajaca sie z 16 ram, kazda o glebokosci 2,54 cm, powierzchni 723 cm2 i calkowitej objetosci komór 29,4 litra, na- 45 pelnia sie woda pod cisnieniem 1,4—1,7 atmosfery.Nastepnie do prasy filtracyjnej wprowadza sie ze stala szybkoscia zawiesine katalizatora az do cal¬ kowitego uformowania sie zloza i cisnienie w fil¬ trze zwieksza sie do 2,7 atmosfery. Przesacz recyr- 50 kruiuje slie az do uzyskania calkowitej klarownosci.Uzyskuje sie równomaerne zaladowanie kaidej z komór i wypelnianie wynoszace 85—90%. Calko¬ wita aktywnosc ladunku wynosi 3,5 Xl O6 jednostek.Wodny roztwór penicyliny przygotowuje sie w 15 sposób podany w przykladzie I, stosujac sól po¬ tasowa penicyliny G o czystosci 96,7%. Objetosc roztworu wynosi 50 litrów, temperatura robocza 37—39°C, wartosc pH 7,8—8,0. Po zakonczeniu re¬ cyrkulacji uklad przemywa sie 20 litrami wody. •o W tablicy II podano wyniki opisanych powyzej doswiadczen.Zamiast komórek Proteus rettgeri mozna stoso¬ wac komórki Escherichia coli ATCC 9637, zawiera¬ jace acylaze penicylinowa, w Zamiast osadzonych komórek bakteryjnych opi-109 707 Tablica 1 | Cykl1) Ilosc soli potasowej penicyliny G w kg Spadek cisnienia w zlozu, w atmosferach Poczatek Koniec Szybkosc obiegu, w litrach na minute Poczatek Koniec 1 Czas reakcji, godzina/mol % przemiany Wydajnosc kwasu 6-AP w %2) 1 3,0 2,9 2,9 66 58 0,83 93 94 3 3,0 3,0 3,0 50 50 0,86 96 82 ~4 3,0 2,9 2,8 50 50 1,01 96 89 5 3,0 2,8 2,8 50 48 1,03 93 94 6 1 2,0 | 2,8 | 2,8 | 50 | 48 | 1,20 | 96, | 86 *) Cykl 2 nieudany na skutek awarii pradowej, wyniki niepewne. 2) Wydajnosc obliczono w stosunku do ilosci przeksztalconej penicyliny.Tablica II I Cykl i 1 Ilosc soli potasowej penicyliny G w kg Spadek cisnienia w zlozu, w atmosferach Poczatek Koniec Szybkosc obiegu w litrach na minute Poczatek Koniec Czas reakcji godzina/mol % przemiany Wydajnosc kwasu 6-AP w % 2,0 1,2 1,8 25 24 0,77 95 93 2 1 31) 4 ? 3,0 2,0 3,1 26 23 0,78 95 89 2,0 3,9 4,5 22 20 0,97 96 94 3,0 2,2 3,1 25 24 | 0,87 | 93 902) 1) Po zakonczeniu cyklu 3 katalizator zostal usuniety z filtra, zawieszony ponownie w wodzie i zaladowany przed rozpoczeciem cyklu 4. 2) Wydajnosc wyizolowanego kwasu 6-AP wynosi 91%. sanych w powyzszych przykladach mozna stoso¬ wac acylaze penicylinowa wyizolowana z komórek drobnoustrojów wytwarzajacych acylaze, takich jak Proteus rettgeri ATCC 31052 i Escherichia coli ATCC 9637, i osadzona na nosnikach w sposób po¬ dany w opisie patentowym St. Zjedn. Am. nr 3 925 157.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania kwasu 6-aminopenicyla- nowego na drodze enzymatycznego przeksztalca¬ nia penicyliny, polegajacy na tym, ze wodny roz¬ twór penicyliny poddaje sie zetknieciu z rozdrob¬ nionym katalizatorem zawierajacym osadzona acy¬ laze penicylinowa, w temperaturze 15—45°C i war¬ tosc pH 6,5—9, znamienny tym, ze wodny roztwór 50 55 penicyliny recyrkuluje sie przez zloze o grubosci 1—6 cm, zawierajace rozdrobniony katalizator, z szybkoscia co najmniej 0,4 objetosci zloza na mi¬ nute. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako penicyline stosuje sie sól potasowa penicy¬ liny G. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie zloze katalizatora o grubosci 2—3 cm. 4. Sposób wedlug- zastrz. 1, znamienny tym, ze jako rozdrobniony katalizator stosuje sie unieru¬ chomione komórki Proteus rettgeri zawierajace acylaze penicylinowa. 5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze proces prowadzi sie w temperaturze 35—40°C i przy wartosci pH wynoszacej 7,5—8,2.WZGraf. Z-d 2, zam. 20/82 n. 90 Cena zl 45 PL

Claims (5)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania kwasu 6-aminopenicyla- nowego na drodze enzymatycznego przeksztalca¬ nia penicyliny, polegajacy na tym, ze wodny roz¬ twór penicyliny poddaje sie zetknieciu z rozdrob¬ nionym katalizatorem zawierajacym osadzona acy¬ laze penicylinowa, w temperaturze 15—45°C i war¬ tosc pH 6,5—9, znamienny tym, ze wodny roztwór 50 55 penicyliny recyrkuluje sie przez zloze o grubosci 1—6 cm, zawierajace rozdrobniony katalizator, z szybkoscia co najmniej 0,4 objetosci zloza na mi¬ nute.
2. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako penicyline stosuje sie sól potasowa penicy¬ liny G.
3. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie zloze katalizatora o grubosci 2—3 cm.
4. 4. Sposób wedlug- zastrz. 1, znamienny tym, ze jako rozdrobniony katalizator stosuje sie unieru¬ chomione komórki Proteus rettgeri zawierajace acylaze penicylinowa.
5. 5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze proces prowadzi sie w temperaturze 35—40°C i przy wartosci pH wynoszacej 7,5—8,2. WZGraf. Z-d 2, zam. 20/82 n. 90 Cena zl 45 PL