CS204190B1

CS204190B1 - Activation method for hydrxyl groups containing insoluble carriers

Info

Publication number: CS204190B1
Application number: CS781125A
Authority: CS
Inventors: Jaroslav Drobnik; Jaroslav Kalal; Jiri Labsky; Vladimir Saudek; Frantisek Svec
Original assignee: Jaroslav Drobnik; Jaroslav Kalal; Jiri Labsky; Vladimir Saudek; Frantisek Svec
Priority date: 1978-02-22
Filing date: 1978-02-22
Publication date: 1981-03-31
Also published as: DD143262A1; DE2906989A1; FR2418245A1; SE7901349L; GB2015553B; GB2015553A; US4245064A

Description

Vynález se týká chemické aktivace nerozpustných nosičů obsahujících hydroxyly.

V oblasti imobilizace enzymů, inhibitorů, antigenů, protilátek nukleových kyselin a ligand obecně (dále jen ligand) bylo popsáno velmi mnoho metod chemické (kovalentní) vazby těchto ligand na nerozpustné nosiče. Nejčastěji je při těchto metodách využívána volná amínoskupina ligand, ačkoli jsou používány těž metody vazby prostřednictvím karboxylů, kopulace schopných aromatických zbytků nebo sulfhydrylových skupin. Vazba může probíhat bezprostředně na aktivovaný nosič, nebo mezi nosič a ligand je zařazena spojka (spacer). Obecný charakter těchto vazeb spočívá v tom, že nosič obsahuje elektrofilní skupinu např.

-h imidokarbonátovou —O.C (:NH).O—, karbo+ nátovou —O.CO.O—, oxiranovou aziridinovou * 4

-CH — CH. -CH—CH, /Z X / ^л0 NH aktivovanou dvojnou vazbu, například —SO2—CH==CH2, nebo — CO—CH=CH2, ak+ tivovaný halogen, například — CO—CH2B1’,

CH2—CO—Br, —C:N—Cl. Tato skupina pak reaguje s nukleofilní skupinou na navazovaném ligandu. Jejich reaktivita klesá v pořadí —SH > —NH > —OH a v tomto pořadí též stoupá pH, při kterém vazba probíhá.

Nosiče lze rozdělit do dvou skupin: nosiče aktivní, nesoucí již ve své struktuře takové skupiny, které jsou schopny prakticky spontánní reakce s ligandy, a nosiče aktivovatelné, jejichž vazebné skupiny je třeba pro reakci s ligandy předběžně aktivovat. Nejběžnějšími aktivovatelnými skupinami jsou hydroxyly. Jsou přítomny na všech nosičích založených na polysacharidech (celulosa a její deriváty, dextrany, agarosa, ap.), ale také na řadě syntetických nosičů organických založených např. na kopolymerech 2--iydroxyethylmethakrylátu (Sphe294190 roo). K aktivaci hydroxylových skupin na nosiči se nejčastěji používá jejich přeměny na . imidokarbonát pomocí bromkyanu. ' Uvádí se následující reakční schéma předpokládající na nosiči přítomnost dvou vicinálních hydroxylů:

-OH OW“ rOH

Hydrolysa bromkyanu, stejně jako tvorba nereaktivního karbamátu (II) jsou nevítané vedlejší reakce. Část imidokarbonátu (I) také tvoří příčné vazby, neboť např. agarosa se stává nerozpustnou ve vroucí vodě. Další parasitní reakcí je hydrolysa imidokarbonátu na karbonát až na ' původní matrici. Tyto vedlejší - reakce, spolu s reaktivními . a toxickými produkty hydrolysy činidla (brom, kyanid a kyanát) jsou podstatnými nevýhodami bromkyanové metody aktivace bránícími použití ve větším (zejména průmyslovém) měřítku. K aktivaci hydroxylů se používá též chlorid titaničitý, sym. trichlortriazin, diepoxidy, divinylsulfon, benzochinon, dále se využívá oxidace hydroxylů jodistanem sodným na aldehydické skupiny, které váží ligand přímo, nebo prostřednictvím spojky, - většinou acylhydrazidu. Pro zvýšení pevnosti vazby se v těchto případech redukuje vytvořený komplex borohydridem (viz - např. přehledy v Methods in Enzymology, Ed. S. P. Colowick a N. O. Kaplan, sv. 34 a 44).

Jiné metody využívají oxidace až na karboxyl, který se aktivuje pomocí karbodiimina hydrazid a azid. Karboxylové skupiny na nosiči lze též převést na tzv. aktivované estery např. reakcí s di(p-nitrofenyl)sulfitem. Takto vytvořené estery reagují přímo s aminoskupinami ligand vytvářejíce amidickou vazbu. Byla též popsána aktivace hydroxylů na nosiči přímým působením fosgenu, čímž se vytvoří chloromravenčanové

-O-Cs/V

-OW

l-OCONW^ f-OW (D (ll) reaktivní skupiny. Celulosa se často modifikuje na některý ze svých derivátů, který se použije pro vazbu. Tak např. karboxymethylcelulosa (CM-celulosa) se esterifikuje, ester převede na hydrazid a vazba provede azidovou metodou.

Byla též popsána vazba na CM-celulosu pomocí isoxazoliových solí, karbodiimidů a isokyanidů. Celulosu lze také _ reagovat s bromacetyl bromidem a tím esterifikovat hydroxyly acylem kyseliny monobromoctové, který pak snadno reaguje - s aminoligandy, případně thioly. K vazbě diazotací lze celulosu modifikovat 4-chlormethylnitrobenzenem, který se redukuje po navázání na příslušný aminoderivát schopný diazotace a kopulace.

Tyto a jiné méně častěji používané metody imobilizace mají .různé nevýhody. V některých případech je to nebezpečnost používaného činidla (BrCN, bromacetyl bromid, fosgen), které činí metodu nepoužitelnou ve větším měřítku. Jindy vysoká cena (trichlortriazin), ale velmi často hlavně ne příliš dobré výtěžky (TiC14, oxidace jodistanem, příprava azidu z CM-celulosy, aj.) brání většímu rozšíření metod v praxi.

Zjistili jsme nyní, že aktivaci hydroxylových skupin nerozpustných nosičů lze provádět aktivovanými estery kyseliny chloromravenčí. Tyto estery jsou látky krystalické, stabilní, neohrožující životní prostředí. V nevodném prostředí probíhá reakce

Nosič -OH+ CCCOOR;

> HCt + Noštc -O-COORt (aktivovaný nosič) kde - Ri je zbytek aktivovaného esteru vybraný . ze skupiny zahrnující 4-nitrofenyl,

2,4-dinitrofenyl, 2,4,6-tríchlorfenyl, 2,4,5-trichlorfenyl, pentachlorfenyl, N-sukcinimidyl, N-ftalimidyl, 8-chinolinyl. Předmětem vynálezu - je - způsob aktivace nerozpustných nosičů obsahujících hydroxylové skupiny vyznačený - tím, že na tyto nosiče se v bezvodém prostředí působí aktivovaným esterem kyseliny chloromravenčí obecného vzorce ClCOORi, kde Ri je zbytek vybraný ze skupiny . - zahrnující 4-nitrofeoyl, 2,4-dinitrofeoyl, - 2,4,6-trichlorfeoyl, 2,4,5-trichlorfenyl, pentachlorfenyl, - N-sukcinimidyl, - N--ftalimi dyl, 8-chioolinyl, oezreagované látky se spolu s uvolněným chlorovodíkem odstraní promytím a vzniklý produkt se použije k přímé vazbě ligand, nebo se reaguje s oízkomolekulároí látkou . . obecného vzorce NH2—R2, kde R2 je zbytek vybraný ze skupiny zahrnující (CH2)oNH2, í chwhoc a — (CH2)oCOO(CH2)_mCH3, kde o = 0 až 6 a m = 0 až 4. Když R2 je zbytek (CH2joNH2, kde n = 0 až 6, aktivuje se teoto dále re204190 akcí s glutaraldehydem. V případě, že R2 ie podle vynálezu zbytek kde n = 0 až 6, tento se dále aktivuje diazotací nebo zreaguje s karboxyly ligandu v přítomnosti karbodiimidu.

Způsob podle vynálezu je dále vyznačený tím, že R2 je — (СН2)_пСОО(СН2)_гпСНз, kde η — 1 až 6 a m = 0 až 4, který se po navázání převede na hydrazid, přičemž získaný hydrazid se může převést na azid.

Aktivovaný nosič je neomezeně stálý v suchém stavu a v nevodných rozpouštědlech a poměrně stálý i ve vodných roztocích zředěných kyselin (pod pH 5,5). Aktivovaný nosič reaguje v nevodných rozpouštědlech i ve vodných roztocích s látkami, které mají volné primární nebo sekundární alifatické aminoskupiny, nebo hydrazinové skupiny.

Výhodou aktivace podle vynálezu je snadná dostupnost a nízká cena používaných aktivujících činidel, běžné nároky na bezpečnost práce v chemické laboratoři, stálost aktivovaného nosiče a vysoké výtěžky. Obzvláště výhodný je způsob aktivace podle vynálezu ve spojení se zavedením mezičlánku (spaceru) reakcí s alkylesterem ω aminokyselin, kde alkyl je methyl, ethyl nebo propyl s výhodou 6-aminohexanové, který se převede hydrazin-hydrátem na příslušný hydrazid. Hydrazin-hydrát jednak spolehlivě odstraní případné nezreagované aktivované estery, jednak takto připravený nosič váže ve vysokém výtěžku sloučeniny obsahující cytosin, zejména nukleové kyseliny. Další výhodou je možnost obsadit nezreagované liydrazidy glukosou. Hydrazid lze pro vazbu látek obsahujících aminoskupinu převést známým způsobem na azid.

Jiný výhodný způsob aktivace podle vynálezu spočívá v zavedení mezičlánku tvořeného aromaticko-alifatickým diaminem. S aktivovaným esterem kyseliny mravenčí reaguje v tomto případě alifatická aminoskupina, čímž aromatický amin zůstává volný pro diazotaci nebo vazbu karboxylových skupin ligandu aktivovaných karbodiimidem, který s arylaminy reaguje ve vyšším výtěžku než s alkylaminy. Diazotaci a kopulací lze vázat peptidy a bílkoviny, u nichž mají být zachovány aminoskupiny. Diazotaci a kopulací lze také vázat nukleové kyseliny.

Předmětem vynálezu je způsob aktivace nerozpustných nosičů obsahujících hydroxylové skupiny vyznačený tím, že na tyto nosiče se v bezvodém prostředí působí aktivovaným esterem kyseliny chloromravenčí obecného vzorce CICOORi, kde zbytek Ri je vybraný ze skupiny zahrnující 4-nitrofenyl,

2,4-dinitrofenyl, 2,4,6-trichlorfenyl, 2,4,5-trí chlorfenyl, pentachlorfenyl, N-sukcinimidyl, N-ftalimidyl, 8-chinolinyl, čímž se získá nosič schopný vázat látky, obsahující volný prim, nebo sek. alifatický amin, nebo skupinu hydrazinovou, kterážto látka je bud požadovaným ligandem, nebo spojkou (spacerem) vhodnou pro vazbu ligandu. Předmětem vynálezu je též způsob aktivace jak výše uvedeno, po kterém následuje reakce aktivovaného nosiče buď s methyl nebo ethylesterem ω-aminokyseliny, který je po navázání převeden na hydrazid schopný přímé vazby látek obsahujících cytosin a po působení kyseliny dusité přímé vazby látek obsahujících aminoskupinu, nebo s aromaticko-alifatickým diaminem obecného vzorce kde n = 0 až 6, který se po navázání aktivuje diazotaci nebo reaguje s karboxyly ligandu aktivovaného karbodiimidem.

Příklad 1 ml Sepharosy C1-4B (perlová forma agarového gelu obsahujícího 4 % agarosy, produkt fy Pharmacia) bylo převedeno do

1,4-dioxanu, roztok upraven dioxanem na 10 mililitrů a přidáno 0,35 g p-nitrofenylchloromravenčanu. Suspense třepána za pokojové teploty 1,5 hodiny a promyta 1,4-dioxanem. 1,4-dioxan byl odsát a přidáno 5 ml 0,05 M borátového pufru pH 8,2 a 25 mg trypsinu (57 j./mg) a 10 mg CaCh, třepáno 2 hodiny při 4 °C. Promyto 0,5 M NaCl pufrovaného 0,01 M fosfátem na pH 7,0 až se preparát po alkalizaci uhličitanem nebarvil žlutě, a nakonec 0,5 % Tritonem X100. Nalezená aktivita 71 j./ml.

Příklad 2 ml sférické celulosy (připravené podle A. O. 172 640) bylo zpracováno jako v příkladě 1 s tím rozdílem, že třepáno v 1,4-dioxanu s p-nitrofenylchloromravenčanem bylo prodlouženo na 4 hodiny; navázalo se 0,036 mekv/ml nitrofenolu a výsledná aktivita imobilizovaného trypsinu byla 62 j./ml.

Příklad 3

Na 5 ml sférické celulosy byl navázán p-nitrofenylchloromravenčan jako v příkladu 2 a po promytí 1,4-dioxanem bylo přidáno 10 ml 1,4-dioxanu obsahujícího 0,3 g hydrochloridu ethylesteru kyseliny ε-aminohexanové a 0,39 ml triethylaminu. Třepáno 1 hodinu, promyto vodou a přelito 5 ml 80% hydrazinhydrátu, ponecháno 16 hodin při 60 °C a promyto. Preparát obsahoval 0,008 mekv/ml hydrazidu kyseliny s-aminohexanové.

Příklad 4

Preparát získaný postupem popsaným v příkladu 3 byl při 4 °C třepán 10 minut s 5 mililitry 1 M HC1 a 0,1 g NaNO2, zfiltrováno, promyto ledovou vodou a 50 ml ledového · borátového pufru jako v příkladu 1 a stejně jako v př. 1 vázán trypsin. Zjištěná aktivita 116 j./ml.

P ř í k 1 a d 5

Na 5 ml sférické celulosy byl navázán p-nitrofenylchloromravenčan jako v příkladu 2 a po promytí 1,4-dioxanem byl přelit 5 ml 80% hydrazinhydrátu, třepáno 1 hodinu za pokojové teploty a promyto vodou. Navázalo se 0,01 mekv/ml hydrazinu.

PříkladO

Produkt z příkladu 5 byl zpracován postupem jako v příkladu 4. Nalezená aktivita navázaného trypsinu byla 6 ' j./ml.

Příklad 7 g Spheronu P-1000 (perlový makroporesní kopolymer 2-hydroxyethylmethakrylátu a ethylendimethakrylátu, produkt fy Lachema, Brno) (20—40 jtm) bylo zpracováno postupem jako v příkladu 3 a 4. Nalezená aktivita trypsinu byla 123 j./ml.

příklad 6 g makroporesního sférického kopolymeru glycidyl methakrylát-ethylendimethakrylát [F. Švec a spol. Angew. Makromol. Chem. 63, 23 (1977)) byl převeden na hydroxylovou formu hydrolysou s 0,25 M H2SO4 (3 h/80°C) a po promytí zpracován postupem jako v příkladu 3 a 4. Nalezená aktivita trypsinu 51 j./ml.

příklad 9

Postupem jako v přílkadu 7 bylo na Spheron P-1000 vázáno 125 mg penicilinamidasy (3.5.1.11) o spec, ^: aktivitě 3,5 j./mg s tím rozdílem, že nebylo přidáváno 10 mg CaCh. Nalezená aktivita konečného produktu byla 40 j./ml.

Příklad 10

Na 5 ml Sepharosy CL-4B byl navázán p-nitr^ol^enyl^c^t^k^i^t^n^i^t^x^en^čan jako v příkladu 1 a po promytí 1,4-dioxanem bylo přidáno 10 ml 1,4-dioxanu obsahujícího 1,5 g 1,6-diaminohexanu. Po 1 hodině třepání za pokojové teploty bylo promyto vodou. Navázalo se 0,003 mekv/ml diaminu. Produkt byl třepán v 10 ml 0,1 M fosfátového pufru pH 7, obsahujícího 1 ml destilovaného glutardialdehydu, 16 hodin za pokojové teploty. Promyto čistým pufrem a přelito 5 ml téhož pufru obsahujícího 10 mg CaC12 a 25 ml trypsinu. Třepáno 4 hodiny za pokojové teploty. Promyto jako v příkladu 1. Nalezená aktivita 47 j./ml.

Příklad 11

125 mg penicilinamidasy jako v příkladu 9 bylo použito při postupu shodném s příkladem 10 s tím rozdílem, že byl vynechán CaC12. Navázalo se 25 j./ml.

Příklad 12

Při postupu shodném s příkladem 1 bylo místo . p-nitrofenylchloromravenčanu ' použito 0,3 g N-hydroxysukcinimidového esteru kyseliny chloromravenčí. Nalezená aktivita byla 63 j./ml.

Příklad 13

Při postupu shodném s příkladem 1 bylo místo p-nitrofenylchloromravenčanu použito 0,5 g 8-hydroxychinolinového esteru kyseliny chloromravenčí. Nalezená . aktivita byla 54 j./ml.

Příklad 14

Při postupu shodném s příkladem 1 bylo místo p-nitrofenylchloromravenčanu použito pentachlorfenylového esteru kyseliny chloromravenčí. Nalezená aktivita byla 35 j./ml.

P ř í k 1 a d 15

Při postupu shodném s příkladem 1 bylo místo p-nitr^of^enyl^hio^i^c^u^^í^v^e^čanu použito 2,4,5-trichlorfenylového esteru kyseliny chloromravenčí. Nalezená aktivita byla 73 j./ml.

Příklad 16

Při postupu shodném s příkladem 1 bylo místo p-nitrofenylcho)romravenčanu použito 2,4,6-trichlorfenylového esteru kyseliny chloromravenčí. Nalezená aktivita byla 40 j./ml.

Příklad 17

Při postupu shodném s příkladem 1 bylo místo ptnitrofenylchloromravenčanu použito N-hydroxyftalimidového esteru kyseliny chloromravenčí. Nalezená aktivita byla 65 j./ml.

P říklad 16

Při postupu shodném s příkladem 1 bylo místo ptnitrofenylchloromravenčanu použito 2,4-dinitrofenylmravenčanu. Nalezená aktivita byla 65 j./ml.

Příklad 19

Na 5 ml Spheronu P-1000 byl navázán p-nitrofenylchloromravenčan jako v příkladu 2 třepáním 4 hodiny a po promytí 1,4-dioxanem bylo přidáno 10 ml 1,4-dioxanu obsahujícího 1,5 g 4-amino(2-aminoethyljbenzamid hydrochloridu a 0,55 ml triethylaminu, třepáno 1 hodinu a promyto vodou. Navázalo se 0,01 mekv/ml arylaminu.

Příklad 20

Produkt z příkladu 19 byl zpracován jako v příkladu 4 s tím rozdílem, že místo boratového pufru byl použit nasycený roztok NaHCCh v ledové vodě. Zjištěná aktivita vázaného trypsinu byla 54 j./ml.

Příklad 21

Produkt z příkladu 19 byl suspendován v 10 ml ledové vody a pH upraveno na 5,0. Bylo přidáno 50 mg penicilinamidasy (jako v příkladu 9) a za stálého chlazení ledem rozpuštěno 740 mg N-cyklohexyl-N‘[2-(4-morfolinyl jethyl] karbodiimidu methyl-p-toluensulfonátu ve třech dávkách. pH během reakce bylo udržováno na výchozí hodnotě pomocí automatického titrátoru za mírného míchání. Přidávání trvalo 2 hodiny, chlazení ledem pokračovalo další hodinu a reakce byla ukončena inkubací při pokojové teplotě další tři hodiny. Promýváno bylo jako v příkladu 1. Nalezená aktivita imobilizovaného enzymu činila 20 j./ml.

Příklad 22

Imobilizovaný preparát získaný v příkladu 9 byl smíchán s 25% roztokem sacharosy v poměru 1:5a lyofilizován. Byl uchováván v zatavené ampuli při pokojové tep lotě 1 měsíc. Po této době kontrolována aktivita. Nalezeno 93 % původní aktivity.

Příklad 23

Produkt z příkladu 3 byl suspendován v 10 ml acetátového pufru 0,2 M pH 4,2 a přidáno 10 ml roztoku kyselin desoxyribonukleové v 1 M NaCl obsahující 1,7 mg DNA/ /ml. Bylo třepáno při 60 °C po aobu 24 hodin. Po této době byla suspenze promyta 1 M NaCl a vodou a přidáno 70 ni? acetátového pufru pH 5 obsahujícího 5 % glukosy. Opět třepáno 2 hodiny při 60 °C, promyto jako dříve. Preparát obsahc-val 12 mg DNA na ml a nedával reakci na volné hydrazldy.

Příklad 24

Při postupu shodném у příkladem 23 byl místo roztoku DNA použit roztok cytosinu v dávce 8,9 mg na 1 ml použitého nosiče. Bylo navázáno 0,7 mg cytosinu na 1 ml preparátu.

Příklad 25

Na sférický makroporesní nosič jako v příkladu 8 byl navázán imunoglobin IgG. К aktivovanému nosiči bylo přidáno 25 mg IgG na 1 g nosiče. Navázalo se 85 % přidané bílkoviny, která si zachovala imunologickou specifitu jak bylo ověřeno vazbou příslušného antigenu.

Příklad 26

Produkt z příkladu 19 byl zpracován jako v příkladu 20 s tím rozdílem, že místo trypsinu byl použit pankreatický inhibitor trypsinu. К aktivovanému nosiči bylo přidáno 15 mg/g inhibitoru. Navázalo se 6 % přidaného polypeptidu, který byl použit к afinitnímu čištění trypsinu.

Claims

1. Způsob aktivace nerozpustných nosičů obsahujících hydroxylové skupiny vyznačený tím, že na tyto nosiče se v bezvodém prostředí působí aktivovaným esterem kyseliny chloromravenčí obecného vzorce CICOORi, kde Ri je zbytek vybraný ze skupiny zahrnující 4-nitrofenyl, 2,4-dinitrofenyl, 2,4,6-trichlorfenyl, 2,4,5-trichlorfenyl, pentachlorfenyl, N-sukcinimidyl, N-ftalimidyl, 8-chinolinyl, nezreagované látky se spolu s uvolněným chlorovodíkem odstraní promytím a vzniklý produkt se použije к přímé vazbě ligand, nebo se reaguje nízkomolekulární látkou obecného vzorce

NHž—R2, kde R2 je zbytek vybraný ze skupiny zahrnující (CH2)_nNH2, a —(СН2)_пСОО(СН2)_тСНз, kde n = 0 až 6 a m = 0 až 4.

2. Způsob podle bodu 1 vyznačený tím, že R2 je zbytek (CH2)_nNH2, kde n = 0 až 6, který se dále aktivuje reakcí s glutaraldehydem.

3. Způsob podle bodu 1 vyznačený tím, že R2 je zbytek obecného vzorce í CH^NHOC kde n = 0 až 6, který se dále aktivuje diazotací nebo zreaguje s karboxyly ligandu v přítomnosti kárbodiimidu.

4. Způsob podle bodu 1 vyznačený tím, že R2 je — (СН2]_пСОО(СН2)_гпСНз, kde η = 1 až 6 a m = 0 až 4, který se po navázání převede na hydrazid.

5. Způsob podle bodu 4 vyznačený tím, že získaný hydrazid se převede na azid.