CN210051775U

CN210051775U - 一种检测骨桥蛋白的纳米金标记侧流免疫层析试纸条

Info

Publication number: CN210051775U
Application number: CN201920251314.7U
Authority: CN
Inventors: 曾令文; 刘雨杰
Original assignee: Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Current assignee: Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Priority date: 2019-02-28
Filing date: 2019-02-28
Publication date: 2020-02-11
Anticipated expiration: 2029-02-28

Abstract

本实用新型公开了一种检测骨桥蛋白的纳米金标记侧流免疫层析试纸条，包括底板、硝酸纤维素膜、结合垫、吸水纸以及样品垫；所述硝酸纤维素膜，粘结在所述底板的中部；所述硝酸纤维素膜的一端粘贴有结合垫，另一端粘贴有吸水纸，所述结合垫上粘贴有样品垫；所述硝酸纤维素膜上设有测试线和控制线，所述测试线上喷洒有骨桥蛋白单克隆抗体，所述控制线上喷洒有ssDNA，所述ssDNA是与骨桥蛋白适配体互补的单链DNA；所述结合垫上固定纳米金标记的链霉亲和素。本实用新型具有制备简单，特异性强，便于临床推广应用的优点。

Description

一种检测骨桥蛋白的纳米金标记侧流免疫层析试纸条

技术领域

本实用新型属于疾病检测、免疫传感技术领域，具体涉及一种检测骨桥蛋白的侧流免疫层析试纸条。

背景技术

骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)是一种磷酸化的酸性分泌型蛋白，具有多种生物学功能，广泛存在于各种组织和体液中，通过一定的信号传导途径参与细胞行为，如调节细胞黏附、迁移和信号传导等行为，且能够促进细胞的趋化、黏附和迁移。近几年的研究发现OPN在正常组织中呈现很低的表达水平，而在恶性肿瘤(乳腺癌、卵巢癌和结肠直肠癌等)中呈现高表达水平，且与肿瘤的侵袭、转移等恶性行为密切相关。因此，对骨桥蛋白进行检测在肿瘤预防和肿瘤监测方面具有重要意义。

骨桥蛋白的传统检测方法需要依靠大型仪器，尽管检测结果精准可靠、灵敏度高，但是存在仪器设备昂贵、耗时长、成本高，并且需要专业技术人员，难以实时快速检测的缺点。因此，开发出快捷、灵敏、精确、高效和低成本的检测手段显得尤为重要。

实用新型内容

本实用新型的主要目的是提供一种检测骨桥蛋白的纳米金标记侧流免疫层析试纸条，该试纸条具有方便快捷、操作简单、耗时短的特点。

为了实现上述目的，本实用新型提出的一种检测骨桥蛋白的纳米金标记侧流免疫层析试纸条，包括底板、硝酸纤维素膜、结合垫、吸水纸以及样品垫；所述硝酸纤维素膜，粘结在所述底板的中部；所述硝酸纤维素膜的一端粘贴有结合垫，另一端粘贴有吸水纸，所述结合垫上粘贴有样品垫。

优选地，所述底板为宽3.5mm的条形PVC底板；所述吸水纸、硝酸纤维素膜、结合垫和样品垫均与底板等宽，它们的长度分别为15mm、25mm、8mm和17mm。

优选地，所述吸水纸、硝酸纤维素膜、结合垫和样品垫各交叠区域的长度均为2-3mm，所述检测线和所述控制线之间的距离为8mm。

优选地，所述硝酸纤维素膜上设有检测线和控制线，所述检测线上喷洒有骨桥蛋白单克隆抗体，所述控制线上喷洒有ssDNA，所述ssDNA是与骨桥蛋白适配体互补的单链DNA。

优选地，所述结合垫上固定纳米金标记的链霉亲和素。

优选地，所述样品垫和结合垫的材质均为玻璃纤维膜，所述吸水纸的材质为滤纸。

与现有技术相比，本实用新型具有以下优点：

(1)本实用新型所述的一种检测骨桥蛋白的纳米金标记侧流免疫层析试纸条检测骨桥蛋白，检测时间仅需5分钟，能够满足现场快速检测的要求。

(2)本实用新型所述的一种检测骨桥蛋白的纳米金标记侧流免疫层析试纸条具有很高的灵敏度和特异性，其他蛋白质对检测信号不产生干扰。

(3)本实用新型所述的一种检测骨桥蛋白的纳米金标记侧流免疫层析试纸条，携带方便，操作简单，可用于乳腺癌、卵巢癌和肺癌的早期诊断，在医疗领域具有较好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本实用新型实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本实用新型的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。

下面结合附图说明对本实用新型作进一步说明。

图1为本实用新型所述的一种检测骨桥蛋白的纳米金标记侧流免疫层析试纸条的侧面结构示意图；

其中1为底板，2为硝酸纤维素膜，3为样品垫，4为结合垫，5为检测线，6为控制线，7为吸水纸。

图2为本实用新型所述的一种检测骨桥蛋白的纳米金标记侧流免疫层析试纸条检测原理示意图。

具体实施方式

下面将结合本实用新型实施例中的附图，对本实用新型实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本实用新型的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本实用新型中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本实用新型保护的范围。

实施例1制备一种检测骨桥蛋白的纳米金标记侧流免疫层析试纸条

如图1所示，一种检测骨桥蛋白的纳米金标记侧流免疫层析试纸条，包括底板1、硝酸纤维素膜2、结合垫4、吸水纸7以及样品垫3；所述硝酸纤维素膜2粘结在所述底板1的中部；所述硝酸纤维素膜2的一端粘贴有结合垫4，另一端粘贴有吸水纸7，所述结合垫4上粘贴有样品垫3；所述硝酸纤维素膜2上设有检测线5和控制线6，所述检测线5上喷洒有骨桥蛋白单克隆抗体，所述控制线6上喷洒有ssDNA，所述ssDNA是与骨桥蛋白适配体互补的单链DNA；所述结合垫4上固定纳米金标记的链霉亲和素；检测时，所述样品垫3上滴加生物素适配体化的待测骨桥蛋白溶液样品。

其中，一种检测骨桥蛋白的纳米金标记侧流免疫层析试纸条检测原理(图2)是将待测骨桥蛋白溶液样品与生物素化的适配体结合后滴加到样品垫3，通过与结合垫4上的纳米金-链霉亲和素特异性结合，结合物层析到包被有骨桥蛋白单克隆抗体区域(在硝酸纤维素膜2上的检测线5)后，骨桥蛋白-适配体-生物素与纳米金-链霉亲和素复合物被检测线5上的骨桥蛋白单克隆抗体捕获，样品中骨桥蛋白浓度越高，检测线5红色越深；当样品中不含骨桥蛋白时，生物素化适配体与结合垫4上胶体金标记链霉亲和素的耦合物不会被检测线5上的骨桥蛋白单克隆抗体捕获，而会被控制线6上的ssDNA捕获，控制线6显红色，检测线5不显色。

本实施例中，一种检测骨桥蛋白的纳米金标记侧流免疫层析试纸条是通过以下方法制备的：

A、制备纳米金-链霉亲和素AuNP-SA探针，其方法包括以下步骤：

(1)纳米金AuNP的制备：在250mL的圆底烧瓶中加入100mL 0.01％的氯金酸溶液，磁力搅拌加热至沸腾；然后向上述溶液中加入5mL 1％柠檬酸三钠，溶液变为酒红色后，继续煮沸10min，停止加热继续搅拌15min，得到纳米金AuNP(胶体金)溶液，4℃避光保存；

(2)向1mL的胶体金溶液中加入0.1mol L^-1K₂CO₃(5μL)混匀，5min后加入8μg的SA(链霉亲和素)，室温震荡30min。加入10％BSA(100μL)封闭30min，4℃离心(10×10³rpm，10min)，得到AuNP-SA(纳米金-链霉亲和素)探针。弃清液，用100μL硼酸缓冲液(0.2mol L^-1，pH9.0)重悬AuNP-SA探针。

B、构建一种检测骨桥蛋白的纳米金标记侧流免疫层析试纸条，其方法如下：

将骨桥蛋白的单克隆抗体OPN antibody(0.67mg mL^-1，30μL)和ssDNA(与骨桥蛋白aptamer互补的单链DNA)(0.67mg mL^-1，30μL)同时喷洒在硝酸纤维素(NC，nitrocellulose)膜上，分别形成检测线(Test Line)和控制线(Control Line)。将玻璃纤维浸泡在含有1％BSA，2％Triton，2％PEG4000，20mmol L^-1Tris-Ac和50mmol L^-1NaAc的溶液中，晾干后形成样品垫。将纳米金-链霉亲和素溶液喷在结合垫上(9μL cm^-1)。所述样品垫，结合垫，硝酸纤维素膜和吸水纸依次贴在具有粘性的底板上，各部分有2-3mm的重叠。所述底板为宽3.5mm的条形PVC底板；吸水纸、硝酸纤维素膜、结合垫和样品垫均与底板等宽，它们的长度分别为15mm、25mm、8mm和17mm。所述检测线和所述控制线之间的距离为8mm。

实施例2本实用新型所述的一种检测骨桥蛋白的纳米金标记侧流免疫层析试纸条，其检测方法如下：

A、制备骨桥蛋白-适配体-生物素(Aptamer-OPN complex)溶液：将100μL的生物素化的适配体和500μL待测骨桥蛋白溶液样品混合均匀，室温反应30min后，4℃离心3次(12×10³rmp，10min)，弃上清液，用100μL硼酸缓冲液(0.2mol L^-1，PH9.0)重悬骨桥蛋白-适配体-生物素，得Aptamer-OPN complex。

B、取待测骨桥蛋白溶液样品所制备的骨桥蛋白-适配体-生物素溶液60μL，分别滴加到样品垫上。5min后，观察实验结果。

实验结果表明，随着骨桥蛋白浓度的增加，T区的红色逐渐加深。当样品中不含骨桥蛋白时，只有C区显色，T区不显色。。

实施例3本实用新型所述的一种检测骨桥蛋白的纳米金标记的侧流免疫层析试纸条，其特异性检测方法如下：

按照上述骨桥蛋白的检测方法，分别使用人血清白蛋白，人附睾蛋白4和癌胚抗原作为对照，分析本试纸条检测骨桥蛋白的特异性。检测结果表明，分别对照蛋白(人血清白蛋白，人附睾蛋白4和癌胚抗原)制备的蛋白-适配体-生物素溶液滴加到本试纸条的样品垫上时，T区不显色，只有C区显色。而使用骨桥蛋白制备的骨桥蛋白-适配体-生物素溶液，用肉眼在T区就可以看到明显的红色条带。说明试纸条特异性好，检测结果不受其他蛋白的干扰。

以上所述仅为本实用新型的优选实施例，并非因此限制本实用新型的专利范围，凡是在本实用新型的实用新型构思下，利用本实用新型说明书及附图内容所作的等效变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本实用新型的专利保护范围内。

Claims

1.一种检测骨桥蛋白的纳米金标记侧流免疫层析试纸条，包括底板、硝酸纤维素膜、结合垫、吸水纸以及样品垫；所述硝酸纤维素膜，粘结在所述底板的中部；所述硝酸纤维素膜的一端粘贴有结合垫，另一端粘贴有吸水纸，所述结合垫上粘贴有样品垫。

2.根据权利要求1所述一种检测骨桥蛋白的纳米金标记侧流免疫层析试纸条，其特征在于，所述底板为宽3.5mm的条形PVC底板；吸水纸、硝酸纤维素膜、结合垫和样品垫均与底板等宽，它们的长度分别为15mm、25mm、8mm和17mm。

3.根据权利要求1所述一种检测骨桥蛋白的纳米金标记侧流免疫层析试纸条，其特征在于，所述硝酸纤维素膜上设有检测线和控制线，所述吸水纸、硝酸纤维素膜、结合垫和样品垫各交叠区域的长度均为2-3mm，所述检测线和所述控制线之间的距离为8mm。

4.根据权利要求1所述一种检测骨桥蛋白的纳米金标记侧流免疫层析试纸条，其特征在于，所述硝酸纤维素膜上设有检测线和控制线，所述检测线上喷洒有骨桥蛋白单克隆抗体，所述控制线上喷洒有ssDNA，所述ssDNA是与骨桥蛋白适配体互补的单链DNA。

5.根据权利要求1所述一种检测骨桥蛋白的纳米金标记侧流免疫层析试纸条，其特征在于，所述结合垫上固定纳米金标记的链霉亲和素。

6.根据权利要求1所述一种检测骨桥蛋白的纳米金标记侧流免疫层析试纸条，其特征在于，所述样品垫和结合垫的材质均为玻璃纤维膜，所述吸水纸的材质为滤纸。