CN1970768A - 一种提高植物抗逆性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高植物抗逆性的方法。该方法是将SeNHX1基因和BADH基因通过植物表达载体转入植物中，筛选得到抗逆性提高的植物。本发明方法获得的含有SeNHX1的编码基因和BADH的编码基因的转基因烟草，不但抗逆性增强，而且在逆境(特别是在盐和/或氧化胁迫)下的单株产量也比野生型植株明显提高。

Description

一种提高植物抗逆性的方法

技术领域

本发明涉及一种提高植物抗逆性的方法。

背景技术

土壤的盐碱化问题已经影响到世界上的100多个国家，是限制所有半干旱地区农业发展的一个瓶颈。据统计，全世界的盐土约占陆地面积的1/4到1/3，全世界大约有20％的可耕地受到盐渍化的影响。在我国从滨海到内陆，从低地到高原都分布着不同类型的盐碱土壤。盐碱土不仅在世界上其它国家，而且在我国也是一个重要的土地资源。我国盐碱土的总面积约有5亿多亩，其中已开垦的有1亿多亩，还有3亿多亩盐荒地(约占80％)等待开发利用。由于气候条件和人类不合理耕作方式的影响，土壤盐碱化的程度和面积且还有逐年增加的趋势。我国约有1亿多亩这种次生盐碱地，约占耕地总面积的10％。国内外对盐渍土地的改良和利用已经展开了广泛的研究，并投入了大量的人力、物力和财力。过去多利用工程措施进行改良，虽取得一定成绩，但这些措施中存在一些不可克服的缺点，如费用昂贵、效果不能持久等。淡水排盐还会排走土壤中的其他养分，可谓得不偿失。而且我国淡水资源也不足，因此这个方法的应用受到很大限制。改良盐碱地的困难使得研究人员开始从另外的角度进行尝试，即对植物本身进行耐盐碱改造，以提高现有植物的耐盐性。

植物在盐胁迫下常常会合成和积累一些高浓度的平衡渗透物质，用来调节细胞的渗透势，以缓解大量盐离子而引起的渗透压力。这些渗透物质具有分子量小、水溶性好；生理pH范围内呈电中性；不改变酶结构等特点。这些渗透调节物质包括氨基酸、多元醇和糖三大类。其中较重要、研究最多的是脯氨酸和甜菜碱。

甜菜碱是目前研究较为深入、广泛存在于许多高等植物、动物和细菌中的一种细胞质相溶性物质，以往的研究表明甜菜碱主要参与细胞的渗透调节作用，保持细胞与外界环境的渗透平衡；同时还有稳定细胞内酶蛋白的结构和功能的作用。一些重要的植物如番茄、烟草和拟南芥并不积累甜菜碱，而甜菜碱的合成途经又相对简单，这自然让人们考虑到把甜菜碱合成途经中的关键基因导入一些不积累甜菜碱的植物中，使得这些植物也积累甜菜碱，以提高其抗逆性。

近几年，植物耐盐生物技术研究取得了可喜进展，特别是通过低分子量无毒有机溶质及渗透保护性蛋白等在转基因植物中的超量表达和积累，赋予了转基因植物一定的耐盐性。一般认为，植物耐盐性是受多基因控制的复合遗传性状，依赖于多个基因之间的相互作用，是多种耐盐生理性状的综合体现。因此，只是将单个基因导入植物获得的抗逆性还是远不能达到满意的效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高植物抗逆性的方法。

本发明所提供的提高植物抗逆性的方法，是将SeNHX1的编码基因和BADH的编码基因通过植物表达载体转入植物中，筛选得到抗逆性提高的植物。

所述方法中，所述SeNHX1基因的编码序列是具有自GENBANK号为AY131235的5′端第5′端第492-2174位的核苷酸序列；所述BADH基因的编码序列是具有自GENBANK号为X69770的5′端第4-1512位的核苷酸序列。

所述SeNHX1基因可通过表达载体pBI121-Se导入植物中。所述BADH基因可通过表达载体pBin438导入植物中。所述SeNHX1的编码基因和BADH的编码基因可通过双价表达载体pBinBS共同转入植物中。

所述抗逆性为抗盐性和/或抗氧化性。

本发明的方法既可提高单子叶植物，也可提高双子叶植物的抗逆性，如：烟草、番茄、水稻、小麦、玉米、黄瓜、杨树、草坪草或苜宿等。携带有SeNHX1的编码基因和/或BADH的编码基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物经组织培育成植株，获得抗逆性提高的植株。

实验证明，本发明的方法获得的含有SeNHX1的编码基因和BADH的编码基因的转基因烟草，在逆境条件下，均比野生型烟草具有较强的抗逆性，表现为具有较强的抗盐性和抗氧化性。SeNHX1和BADH功能在转SeNHX1基因和BADH基因烟草中有了较大的累加效应，而且其后代中SeNHX1和BADH可以稳定的连锁遗传。

本发明方法获得的含有SeNHX1的编码基因和BADH的编码基因的转基因烟草，不但抗逆性增强，而且在逆境(特别是在盐和/或氧化胁迫)下的单株产量也比野生型植株明显提高。

附图说明

图1为含有BADH的pBin438质粒图谱

图2为含有SeNHX1的pBI121-Se质粒图谱。

图3为双价表达载体pBinBS的构建流程示意图

图4为Xho I酶切鉴定pRTL2-Se电泳图

图5为HindIII酶切鉴定pRTL2-Se的电泳图

图6为质粒pBinBS的PCR鉴定结果

图7为转BADH基因T0代烟草的Southern杂交鉴定结果

图8为转BADH基因T0代烟草的Northern杂交鉴定结果

图9为转SeNHX1基因T0代烟草的Southern杂交鉴定结果

图10为转SeNHX1基因T0代烟草的Northern杂交鉴定结果

图11为转BADH和SeNHX1基因T0代烟草的Southern杂交鉴定结果

图12为转BADH和SeNHX1基因T0代烟草的Northern杂交鉴定结果

图13为转BADH和/或SeNHX1烟草T0代株系烟草叶盘百草枯(MV)处理24后的照片

图14为转BADH和/或SeNHX1烟草T0代株系烟草叶盘在10μM百草枯处理16h的电导率变化

图15为转BADH和/或SeNHX1烟草T0代株系烟草叶盘在20μM百草枯处理16h的电导率变化

图16为转BADH和/或SeNHX1烟草T0代株系在200mM NaCl胁迫下超氧化物歧化酶(SOD)活性变化。

图17为转BADH和/或SeNHX1烟草T0代株系在200mM NaCl胁迫下谷胱甘肽还原酶(GR)活性变化。

图18为转BADH和/或SeNHX1烟草T0代株系在200mM NaCl胁迫下过氧化氢酶(CAT)活性变化。

图19为转BADH和/或SeNHX1烟草T1代种子对卡那霉素抗性鉴定

图20为转SeNHX1基因和转BADH基因T1代植株PCR检测

图21为SeNHX1和BADH基因共转化T1代植株PCR检测

图22为T1代转BADH和SeNHX1双基因烟草种子BS15在200mM培养基上播种3周的情况

图23为T1代烟草BS23在200mM甘露醇胁迫1周后的生长情况

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、转SeNHX1和/或BADH植物的获得及其功能验证

抗生素Timentin的商品名为“特美汀”(注射用替卡西林钠-克拉维酸钾)，制造商：SmithKline Beecham Pharmaceuticals，UK，购自北京大学第三附属医院。

一、转基因用重组表达载体的构建

1、含有山菠菜的甜菜碱合成关键基因BADH的重组载体的构建

提取山菠菜的总RNA，用AMV反转录酶(购自Takara公司)对总RNA进行反转录，得到cDNA作为模板，用引物15′TTACCAAGCTTATGGCGTTCCCAATTCCT 3′和引物25′TTACCGAGCTCTCAAGGAGACTTGTACCA 3′进行PCR扩增，扩增体系为50μl，含10mmol/LTri-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L Mg₂Cl，200μmmol/L的各种dNTP，每种引物25pmol，200-500ng的cDNA，以及1.25U的Taq聚合酶，扩增条件是预变性95℃，10min后进入93.5℃，1min，55℃，1min，72℃，1.5min的30个循环，之后于72℃保温10min，扩增产物经1％凝胶电泳，回收目的基因片段，经测序表明该片段具有自EMBL号为X69770的5′端第1位至第1513的核苷酸序列，为BADH基因的序列。将该PCR获得的BADH基因片段，进行HindIII和SacI双酶切。将此片段插入pUC19(购自鑫佑公司)HindIII和SacI酶切位点之间，将经测序表明含有BADH基因的编码序列的重组pUC19载体命名为pUC19B。将pUC19B再用BamI和KpnI酶切，得到含有目的基因BADH的片段，将此片段插入pBin19(购自Clonetech公司)的BamHI和KpnI酶切位点之间，进行测序检测，将经测序表明含有BADH的重组表达载体命名为pBin438。BADH基因在EMBL数据库中的登录号是X69770；BADH基因的序列是具有自EMBL登陆号为X69770的5′端第1位至第1513的核苷酸序列。

2、含有盐角草液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白(anitiporter)基因SeNHX1重组载体的构建

提取盐角草地上部分的总RNA，反转录合成第一链cDNA作为模板，通过加入带有Xba I酶切位点的引物(引物35′GAGTCTAGATGGAGGGAATTTGGAGGAGC 3′和引物45′TCTTCTAGACTGCCTAACTGCCTCGGATT 3′)进行PCR扩增，扩增体系为50μl分别为10×buffer，5μl；10×dNTP(2.5mmol/L each)，5μl；引物3和引物4(10pmol/μl)各5μl；Taq聚合酶(1U/μl)，3μl；cDNA模板5μl；双蒸水22μl，扩增体系为95℃预变性4min；95℃，1min；55℃，1min；72℃，1.5min；35个循环，最后是72℃，10min。扩增得到的片段经测序表明具有自GENBANK号为AY131235的5′端第298至2201位核苷酸序列，此序列含有SeNHX1的完整表达框。将上述扩增的片段用Xba I酶切后，插入到pBI121(购自Clonetech公司)的XbaI酶识别位点，经测序后，将测序检测表明含有SeNHX1的完整表达框的重组载体命名为pBI121-Se(图2)。

3、含有BADH和SeNHX1双价表达载体pBinBS的构建(构建过程示意图如图3所示)

用XbaI酶切质粒pBI121-Se后回收1.9kb的目的基因条带，用CIAP处理后与插入到pRTL2(购自Clonetech公司)的XbaI酶切位点。由于在连接过程中载体和目的基因片断都进行了相同的单酶切，连接容易出现正反向情况，为了挑出正向连接的克隆，用载体上的XhoI和目的基因上的XhoI进行酶切鉴定。若是正向连接会切出486bp的片段，若是反向连接会切出1741bp的片段。将鉴定为正向插入的载体命名为pRTL2-Se，酶切结果如图4所示，图4中泳道1为pRTL2-Se质粒；泳道2为pRTL2-Se Xho I酶切结果，泳道3为Maker D2000(购自Takara公司)。

将pRTL2-Se用HindIII酶切后得到3342bp和2461bp的两个片段，结果如图5所示，图5中泳道1为pRTL2-Se，泳道2为HindIII酶切后的pRTL2-Se，泳道3为Maker III(购自北京天为时代公司)(图5中的箭头为从电泳图上面的第2条带)。其中3342bp片段含有SeNHX1的编码序列和其表达调控序列，回收此片段，与Hind III酶切的pBin438相连接。

挑选部分克隆进行PCR检测连接得到的重组载体。

PCR扩增的引物：检测SeNHX1的引物：

引物5：5’TCTAGATGGAGGGAATTTGGAGGAGC3’，

引物6：5’GGATCCTGCCTAACTGCCTCGGATT3’；

检测BADH的引物：

引物7：5’AGAATGGCGTTCCCAATTCCTGCTC 3’，

引物8：5’TTCAAGGAGACTTGTACCATCCCCA 3’。

结果如图6所示，结果表明，引物5和引物6扩增得到1904bp的SeNHX1全长cDNA，引物7和引物8扩增得到1513bp的BADH全长cDNA，表明目的基因SeNHX1已经连接到质粒pBin438上。对检测正确的克隆进一步的测序结果表明基因SeNHX1读码框正确无误，目的基因序列也是正确的，将鉴定正确的重组载体命名为pBinBS。图6中泳道1-7分别为重组载体pBinBS克隆1-7 SeNHX1的PCR结果；泳道M为MakerIII(购自北京天为时代公司)；泳道8-14分别为重组载体pBinBS克隆1-7 BADH的PCR结果。

二、转BADH和/或SeNHX1烟草的获得及鉴定

1、转BADH和/或SeNHX1烟草的获得

将pBI121-Se、pBin438、pBinBS通过根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)LBA 4404的介导转入烟草品种W38中。具体方法如下所述：

烟草无菌苗的制备：烟草品种W38种子用70％乙醇浸泡30s，然后用10％次氯酸钠(加两滴Tween 20)消毒15min，期间不断摇动，随后用无菌水冲洗3遍，接种于MS培养基上。置于培养间发芽(温度26±2℃，湿度60-80％)，待种子发芽后，培养25-30天。

为了确定烟草W38野生型叶片在卡那霉素选择培养基上的最低致死浓度，提高转化效率，对W38的卡那霉素敏感性进行了检测，以确定其能够耐受的临界浓度。在4个含不同浓度卡那霉素的选择培养基上(50mg/L，100mg/L，150mg/L，200mg/L)，发现卡那霉素浓度为50mg/L时候，烟草叶盘的分化和生长几乎不受到任何影响。在100mg/L的浓度时候受到一定的抑制，但大部分仍然能存活下来。而在150mg/L培养基上2周后，烟草叶盘外植体全部死亡。因此用含150mg/L卡那霉素的培养基进行转化植株的筛选。

将pBI121-Se、pBin438和pBinBS分别转入农杆菌LBA 4404中，分别得到含有pBI121-Se、pBin438和pBinBS的农杆菌工程菌。取烟草品种W38无菌苗叶片作为转化外植体，分别置于含有pBI121-Se、pBin438和pBinBS的农杆菌工程菌液中，感染5-10min。取出叶片，置于无菌干燥Whatman滤纸上，吸干残留菌液。将感染过的烟草叶片置于MS₀培养基(不含任何激素的MS培养基)上，黑暗中共培养48h。将材料转移至SIM培养基(含有1.0mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA、150mg/L卡那霉素(km)和150mg/L Timentin的MS培养基)中于25±2℃，每天光照12h。每2周换一次培养基。3-4周后有绿芽长出。待芽长到3-4cm时，将其切下移入SMS0培养基(含有150mg/L卡那霉素和150mg/L Timentin的MS培养基)中诱导生根，10天左右可看到幼根长出。待植株根系较发达后，于室温将容器口敞开炼苗3-5天。之后取出植株，洗净琼脂，移栽于温室或大田土壤中。即得到分别转pBI121-Se、pBin438和pBinBS的T0代转基因植株。共得到转BADH基因植株(转pBin438植株)23株T0代转基因植株；转SeNHX1植株(转pBI121-Se植株)11株T0代植株；BADH和SeNHX1共转化植株(转pBinBS植株)32株T0代转基因植株。

2、转BADH和/或SeNHX1烟草的T0代转基因植株的分子检测

1)的PCR检测

提取上述得到的转pBI121-Se、pBin438和pBinBS的T0代植株幼嫩叶片中的DNA，分别进行下述的PCR检测：

A、BADH基因的PCR扩增

分别以转pBin438和pBinBS的T0代植株幼嫩叶片中的DNA作为模板，进行PCR扩增检测BADH cDNA，以野生型烟草W38为对照，检测的引物为：

引物9：5′AGAATGGCGTTCCCAATTCCTGCTC 3′，

引物10：5′TTCAAGGAGACTTGTACCATCCCCA 3′。

反应体系为：共50μl，10×buffer 5μl，10×dNTP(2.5mmol/L each)5μl，引物9(10pmol/μl)5μl，引物10(10pmol/μl)5μl，模板DNA(0.1μg/μl)，5μl，Taq polymerase(1U/μl)3μl，无菌水22μl。

PCR反应程序：先95℃ 4min；然后95℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1.5min，共35循环；最后72℃ 10min。

结果表明转pBin438和pBinBS T0代植株均全部扩增出1513bp(自GENBANK号为X69770的5′端第1位核苷酸序列至第1513的BADHcDNA全长，而野生型没有扩增出任何片段。

B、SeNHX1基因的PCR扩增

分别以转pBI121-Se和pBinBS的T0代植株幼嫩叶片中的DNA作为模板，进行PCR扩增检测SeNHX1 cDNA，以野生型烟草W38为对照，检测的引物为：

引物11：5’TCTAGATGGAGGGAATTTGGAGGAGC3’，

引物12：5’GGATCCTGCCTAACTGCCTCGGATT3’。

PCR反应程序和反应体系同步骤A。

结果表明转pBI121-Se T0代植株和转pBinBS T0代植株均全部扩增出1904bp(自GENBANK号为AY131235的5′端第304位到第2208位)SeNHX1 cDNA全长)，而野生型植株没有扩增出任何片段。

2)Southern杂交分析

对部分PCR检测阳性的植株进行了Southern杂交分析。

A、转BADH基因植株的检测

对获得的23株转pBin438的T0代植株中的6株进行了进一步的Southern检测。用KpnI和EcoRI双酶切各转pBin438株系以及野生型烟草W38对照的基因组DNA后，以α-32P标记的BADH cDNA为探针，进行Southern杂交。结果如图7所示，结果表明转pBin438的T0代株系B1为双拷贝；其T0代株系B8、B15、B19、B23为单拷贝，其T0代株系B5没有相应的杂交信号。图7中泳道1为pBin438质粒对照；泳道2为野生型烟草W38对照；泳道3-8分别为转pBin438的T0代株系B1、B5、B8、B15、B19和B23。

同时对Southern检测阳性的株系进行了Northern检测，提取转pBin438的T0代株系RNA，以α-32P标记的BADHcDNA为探针，进行Northern杂交，结果如图8所示，结果表明株系B1、B8和B23的表达较高，由于B1是双拷贝，在以后的功能分析中选择了单拷贝的B8和B23进行研究。图8中，泳道1为野生型烟草W38对照；泳道2-6分别为转pBin438 T0代株系B1，B8，B15，B19和B23；rRNA作为上样量对照。

B、转SeNHX1基因植株的检测

对得到的11株转SeNHX1基因植株中的5株Southern检测，用BamHI/EcoRI完全酶切转pBI121-Se T0代5株植株以及野生型烟草W38对照的基因组DNA后，以α-32P标记的SeNHX1 cDNA为探针进行了Southern杂交。结果如图9所示，结果表明在这5个植株中，目的基因均整合到了烟草基因组中，且均为单拷贝插入。图9中，泳道1为质粒对照；泳道2为野生型对照；泳道3-7分别为转pBI121-Se T0代植株S1、S8、S11、S15和S21。

提取转pBI121-Se T0代植株的总RNA，进行Northern检测，结果如图10所示，结果表明目的基因已经在转录水平得到了正确的表达，但是各个转基因株系的表达量是不同的。图10中，1为野生型烟草W38对照；2-6分别为转基因株系S1、S8、S11、S15和S21；rRNA作为上样对照。

C、BADH和SeNHX1双基因共转化植株(转pBinBS植株)的检测

对BADH和SeNHX1共转化得到的32株阳性苗中的5株进行了Southern检测。将5株PCR检测为阳性转pBinBS的T0植株以及野生型烟草W38对照的基因组DNA分别用KpnI/EcoRI(图11中A)或BamHI/EcoRI(图11中B)酶切，分别以α-32P-dCTP标记SeNHX1 cDNA(图11中B)或BADH cDNA(图11中A)为探针进行杂交。结果如图11所示，结果表明，目的基因BADH和SeNHX1已经整合到了烟草基因组中。其中株系BS1(图11中A和B的泳道3)的两个基因均是两个拷贝，表明有可能是多位点插入，其余株系两个基因均为单拷贝。在同一株系中目的基因BADH和SeNHX1的拷贝数相同说明在转化过程中T-DNA上的目的基因没有发生重组或丢失，是作为一个整体整合到烟草基因组中的。图11中A和B的泳道1分别为pBinBS质粒对照；泳道2分别为野生型对照；泳道3-7分别为转pBinBS T0代植株BS1、BS5、BS15、BS21和BS23。

提取转pBinBS的T0植株以及野生型烟草W38对照叶片总mRNA进行Northern检测，分别以α-32P-dCTP标记SeNHX1 cDNA(图11中B)或BADH cDNA(图11中A)为探针进行杂交，结果如图12所示，结果表明转pBinBS T0代植株BS1、BS5、BS15、BS21和BS23均能够检测到表达信号，说明这几个植株中的外源基因BADH和SeNHX1能够正常表达，但表达水平有较大的差异，且与拷贝数不成正比，选择两个基因均表达量高的株系BS5和BS15进行以后的功能分析。图12的A和B中，泳道1分别为野生型烟草W38对照；泳道2-6分别为转pBinBST0代植株BS1，BS5，BS15，BS21和BS23；rRNA为上样量对照。

通过Southern和Northern检测表明已经得到3种类型的转基因烟草，分别是转SeNHX1基因烟草(转pBI121-Se烟草)、转BADH基因烟草(转pBin438烟草)以及SeNHX1和BADH基因共转化烟草(转pBinBS烟草)。目的基因已经整合到烟草基因组中，并得到了正确的表达。

三、转BADH和/或SeNHX1烟草的功能鉴定

1、BADH活性和甜菜碱含量的检测

为了检测外源BADH基因插入烟草基因组的表达情况，对转pBin438(B8、B23)和pBinBS(BS5、BS15)的T0代植株或野生型烟草(WT)在无盐胁迫及200mmol/L盐胁迫条件下叶片内的BADH酶活性和甜菜碱含量进行了测定。

1)BADH酶活性测定

A.酶液的提取

取2g上述转pBin438(B8、B23)、转pBin438BS(BS5、S15)的T0代植株和野生型烟草(WT)植物叶片在液氮中速冻研磨后，分别在室温下加入蛋白抽提缓冲液(含有50mmol/L Hepes/KOH(pH 8.0)、1.0mmol/L EDTA(pH8.0)和5.0mmol/L DTT的溶液)抽提5min。4℃，12000rpm离心10min，取上清保存于4℃。酶液经适当稀释后，于紫外分光光度计280nm处测定酶蛋白浓度

B.酶活性测定

反应体系(1ml)：抽提缓冲液(Extraction buffer)0.85ml，20×甜菜碱醛母液(20mmol/L)0.05ml，20×NAD⁺母液(20 mmol/L)0.05ml，步骤A得到的酶提取液0.05ml。

将分光光度计波长调至340nm反应从加入酶液开始计时，记录初始OD₃₄₀及5min(或10min)时的OD₃₄₀。

酶的比活 $(\mathrm{nmol}\·{\min }^{-1}\·{\mathrm{mg}}^{-1}\mathrm{protein})=\frac{\mathrm{\ΔOD}\×{10}^{-3}}{{\mathrm{\ϵ}}_{\max }\×C}\×{10}^9$ 式中：ΔOD为340nm下吸光值每min增加的平均值；ε_max为NADH摩尔消光系数，等于6.22×10³；C为测定所加入的酶蛋白的量，单位为mg；10^-3为1ml反应体系转化为升的系数；10⁹为mol转化为nmol的系数。

2)甜菜碱含量的检测

参照陈少良等(2000)的方法(陈少良，毕望富，李金克等.2000.反相HPLC离子对色谱法测定植物组织中的甜菜碱.植物学报，42；1014-1018)对转pBin438(B8、B23)、pBinBS(BS5、BS15)的T0代植株或野生型烟草(WT)进行甜菜碱的提取和纯化以及测定。

液相色谱测定条件：美国TSP公司液相色谱系统P4000泵，SCM1000真空仪，SN4000控制仪，UV3000紫外检测器。用C18反相色谱柱(10μm，4.6mm×250mm，Irregular-H添料)，流动相为50mmol/L的K₂HPO₄(pH 4.45)和0.1％PIC-8(辛烷磺酸，Waters公司)，流速0.7ml/min。

结果如表1所示，结果表明，不论NaCl胁迫存在与否，野生型烟草的BADH活性都很低，几乎检测不到。而4个带有BADH外源基因的植株(B8、B23、BS5、BS15)在盐胁迫下都可以检测到明显的BADH活性(5.63-8.87U)，与野生型对照相比达极显著水平。但在正常条件下只有植株B8和B23表现出了相对较高的BADH活性；株系BS5和BS15与野生型的BADH活性没有显著性差别。甜菜碱含量也表现出了与BADH活性类似的趋势。不管盐胁迫与否，野生型植株中甜菜碱含量均很低，几乎检测不到，在正常灌溉条件下野生型植株甜菜碱含量与各转基因株系含量差别未达显著水平，但在盐分胁迫下B8、B23、BS5、BS15的甜菜碱含量均极显著的高于野生型。

上述实验表明，带有BADH外源基因的植株在盐分胁迫下BADH活性和甜菜碱含量比野生型植株要明显提高。

表1.T0代各转基因株系在盐分胁迫下的BADH活性和甜菜碱含量

指标	NaCl浓度	株系
							WT	B8	B23	BS5	BS15
		BADH    酶  活(nmol/min.mg蛋白)	0	0.17±0.04B	0.71±0.14A	0.81±0.27A						0.26±0.06B	0.17±0.07B
200mM	0.21±0.03D						7.40±1.01AB	5.63±0.54C	8.87±0.66A	5.62±0.68BC
			甜菜碱含量(μmol/gDW)	0	0.18±0.06ABC	0.17±0.04BC					0.13±0.02C	0.27±0.07AB	0.30±0.05A
200mM	0.21±0.04C	7.16±0.25A					4.77±0.51B	5.93±0.38AB	5.15±1.01B

表中数值3个重复的平均数，每行中标有不同字母者为LSD检验在P≤0.01水平上差异显著。

2、T0代的耐盐性和抗氧化性鉴定

通过扦插的方法对Southern和Northern检测得到的一部分阳性转pBI121-Se、pBin438和pBinBS的T0代苗进行扩繁，建立克隆群体。

1)光合效率和荧光诱导动力学参数的测定

盐分胁迫对植物造成的伤害之一就是光合效率的降低，从而降低了植物同化物质的积累，不利于植物的生长。除此之外，盐分胁迫还会导致光合器官的破坏，反应在PSII活性的下降，具体表现为Fv/Fm的下降。将上述阳性转pBI121-Se、pBin438和pBinBS的T0代的扩繁株系移栽到温室的花盆中，在移栽4周后，对扩繁株系或野性型烟草W38对照(WT)分别进行正常灌溉或灌溉200mM NaCl溶液胁迫，6周后，测定光合速度和PSII活性，结果如表2所示，结果表明在正常条件下转pBI121-Se、pBin438和pBinBS的T0代的扩繁株系与野生型(WT)对照的光合速度没有达到显著性差异，盐分胁迫降低了所有株系的光合速度。相对野生型(WT)对照而言，转pBI121-Se、pBin438和pBinBS的T0代的扩繁株系光合速度受盐胁迫的影响要小，在200mM盐分胁迫下各转基因株系的光合速度均显著高于野生型对照(WT)。其中BS5株系的光合速度最高为8.5μmol CO₂m^-2S^-1，而野生型仅为4.9μmol CO₂m^-2S^-1。转pBI121-Se、pBin438和pBinBS的T0代的扩繁株系盐分胁迫下较高的光合速度，保证了其同化物的积累，从而使其能持续的生长。

在正常灌溉条件下转pBI121-Se、pBin438或pBinBS的T0代的扩繁株系及野生型对照的Fv/Fm在0.86左右，且各转基因株系之间以及它们与对照之间没有显著差异；在盐分胁迫下转pBI121-Se、pBin438和pBinBS的T0代的扩繁株系材料的Fv/Fm均显著高于野生型对照，相同类型转基因株系间的Fv/Fm没有达显著差异。野生型在200mM NaCl下的Fv/Fm为0.71，仅为正常条件下的83％，各转pBI121-Se、pBin438和pBinBS的T0代的扩繁株系虽在盐分胁迫下都较正常条件有下降，但都高于0.8，株系S15的Fv/Fm最高为0.84。以上结果表明转pBI121-Se、pBin438和pBinBS的T0代的扩繁株系在盐分胁迫下光合器官受到的破坏要低于野生型，PSII有相对较高的活性。

其中，表2中WT为野生型；S1，S15为转pBI121-Se T0代的扩繁株系；B8，B23为转pBin438 T0代的扩繁株系；BS5，BS15为转pBinBS T0代的扩繁株系。

表2.转基因烟草在200mM NaCl下的光合速度和Fv/Fm

株系Lines	光合速度(umol CO2m-2s-1)		Fv/Fm
					0mM	200mM	0mM	200mM
	WTS1S15B8B23BS5BS15	9.07±0.38a8.57±0.21a8.77±0.64a8.97±0.60a8.90±0.26a9.0±0.56a8.93±0.25a	4.90±0.44d7.03±0.42c7.37±0.45bc7.27±0.40bc7.33±0.85bc8.50±0.26a8.00±0.26ab	0.86±0.01a0.85±0.01a0.87±0.01a0.87±0.01a0.86±0.01a0.86±0.01a0.86±0.02a					0.71±0.02c0.83±0.01ab0.84±0.01a0.82±0.01ab0.82±0.02ab0.81±0.02b0.83±0.01ab

表中数值为3个重复的平均数，每列中标有不同字母者为LSD检验在P≤0.05水平上差异显著

2)百草枯抗性检测

百草枯(paraquat)又名甲基紫精(methyl viologen，MV)，是一种双吡啶化合物。对转pBI121-Se(S1、S15)、pBin438(B8、B23)、pBinBS(BS5、BS15)的T0代的扩繁株系材料或野生型烟草W38对照(WT)，用百草枯(10μM或20μM)或水处理叶片24小时，测定处理后的电导率和丙二醛(MDA)含量，以确定不同材料抗氧化胁迫的能力。结果表明在10μM MV胁迫24h后，野生型叶盘边缘已经出现萎黄，并开始变白；各个转基因烟草虽然较对照颜色出现褐化，但受到的胁迫程度明显低于野生型。20μM MV胁迫24h后，野生型几乎全部变白，完全坏死；而各个转基因株系仅叶盘的边缘部分出现了较严重的褐化(图13)。

各材料的MDA含量随着MV浓度的加大呈现出明显的上升的趋势，野生型上升的幅度最大，在0μM、10μM、20μM MV下的MDA含量分别为98.50nmol/g，522.83nmol/g和840.70nmol/g。转pBI121-Se、pBin438和pBinBS的T0代的扩繁株系虽然也有较大程度的上升，但是无论在上升的幅度还是在MDA绝对含量上均要小于野生型。但是不同类型的转基因材料有较大的差异，转SeNHX1和BADH双基因(转pBinBS株系)株系的MDA含量要低于单基因转化株系(转pBI121-Se和pBin438株系)；转SeNHX1基因株系要低于转BADH基因株系。说明了转双基因株系(转pBinBS株系)受到的氧化胁迫程度最低，其次为转BADH基因株系和转SeNHX1基因株系，野生型对照受到的氧化胁迫程度最严重(具体结果如表3所示)。

表3.转基因烟草叶盘百草枯处理24h后丙二醛的含量

株系	丙二醛的含量(nmol/g FW)
				0μM MV	10μM MV	20μM MV
	WTS1S15B8B23BS5BS15	98.50±11.23a95.53±8.75a95.13±5.84a97.80±11.30a97.77±12.94a100.37±12.21a100.87±11.00a	522.83±26.66a217.23±15.30b218.00±18.10b211.80±22.60bc212.80±11.95bc192.17±17.29bc182.10±6.61c				840.70±36.96a519.53±18.70b519.73±28.70b500.40±11.52bc488.63±11.70bcd461.60±27.80cd460.10±6.67d

表中数值为3个重复的平均数，每列中标有不同字母者为LSD检验在P≤0.05水平上差异显著。

百草枯处理后，转pBI121-Se(S1)、pBin438(B8)、pBinBS(BS15)的T0代的扩繁株系以及野生型对照的电导率与在MV中浸泡时间的关系如图14、15所示，各株系的电导率均随着MV胁迫的延长呈现出明显的上升趋势，但野生型上升的速度要高于转基因株系。在10μM MV处理下(图14)，在开始的4h内各材料的电导率没有大的差异，从8h开始野生型要高于各转基因株系。在20μM MV处理下(图15)，第12h是一个转折点。12h以前，各材料的电导率没有大的差异，在12h以后，野生型的电导率明显的高于各转基因株系。

BADH在提高转基因植物抗盐性，很可能是通过稳定一些酶的高级结构和保持膜的完整性起作用的，在10μM和20μM的MV均导致MDA含量的急剧上升，但是在转BADH的转基因烟草中，MDA含量要显著低于野生型对照，且转BADH烟草电导率的上升也要低于野生型，说明BADH在降低过氧化和保持膜的完整性方面的确起到了显著的作用。

3)抗氧化酶活性检测

将上述阳性转pBI121-Se(S1、S15)、pBin438(B8、B23)和pBinBS(BS5、BS15)的T0代的扩繁株系移栽到温室的花盆中，在移栽4周后，对扩繁株系和野性型烟草W38对照(WT)分别进行正常灌溉或灌溉200mM NaCl溶液胁迫，处理6周后，测定与氧化有关的酶(超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽还原酶(GR)和过氧化氢酶(CAT))在高盐胁迫下的活性。超氧化物歧化酶(SOD)活性检测结果如图16所示，结果表明，正常条件下植物体内的超氧化物歧化酶(SOD)活性比较低，都低于6U，但是在200mM NaCl下各转基因株系SOD酶活性有大幅度的上升，各转基因株系均显著高于野生型对照，其中SeNHX1基因和BADH基因共转化(转pBinBS株系)的BS5和BS15株系的酶活最高，分别为28.2U和28.5U，较其正常处理对照上升了4.9倍和4倍。转BADH基因株系B8和B23的SOD酶活要显著高于转SeNHX1基因株系S1和S15。

谷胱甘肽还原酶(GR)的活性检测如图17所示，结果表明转pBI121-Se(S1、S15)、pBin438(B8、B23)、pBinBS(BS5、BS15)的T0代的扩繁株系以及野生型对照(WT)在正常灌溉条件下的谷胱甘肽还原酶(GR)的活性均没有达到显著水平；在盐分胁迫下转pBI121-Se(S1、S15)、pBin438(B8、B23)和pBinBS(BS5、BS15)的T0代的扩繁株系均显著高于野生型对照。但是不同的转基因株系间GR酶活有大的差别，转SeNHX1和BADH双基因株系BS5和BS15要显著高于各转单基因株系；BADH基因株系显著高于转SeNHX1基因株系。过氧化氢酶(CAT)活性检测结果如图18所示，结果表明，虽然野生型烟草的过氧化氢酶(CAT)在盐分胁迫下的酶活要高于正常条件，但是仍显著低于各转基因株系。转SeNHX1和BADH双基因株系BS5的CAT酶活最高，但转BADH基因株系B8和B23的酶活显著高于单转SeNHX1基因株系S1和S15。

图16-18中，图中数值为3个重复的平均数，图中相同处理中标有不同字母的株系在P≤0.05水平上差异显著。

从盐分胁迫下与氧化密切相关的3种酶的酶活来看，转双基因株系(转pBinBS株系)的酶活要显著高于转单基因(BADH基因和SeNHX1基因)株系，转BADH基因株系(转pBin438株系)显著高于转SeNHX1基因株系(转pBI121-Se株系)。说明SeNHX1和BADH基因均能提高抗氧化酶的活性，两个基因有累加效应，但是BADH基因起的作用要显著高于SeNHX1基因。

在200mMNaCl胁迫下BADH积累显著提高了CAT、SOD、GR的酶活，说明转BADH基因烟草在清除活性氧类物质的效率上要高于野生型。由此看来，BADH在方面很可能是通过提高一些抗氧化酶的活性有效的保持了细胞中的还原态，从而降低质膜的过氧化，而要行使这一功能只需要少量的甜菜碱就可以了。

4)ATPase和PPase活性测定

SeNHX1基因是定位在液胞膜上的Na⁺/H⁺逆向运转蛋白，其主要功能是逆着Na⁺浓度梯度，将细胞质内的Na⁺区隔化到液泡中，减少盐离子对细胞质中细胞器膜系统和酶类的毒害，同时还降低了细胞的渗透势，减轻细胞的渗透胁迫。主要以液泡上的H⁺-ATPase(V-ATPase)及其产生的跨膜质子梯度为驱动力。液胞膜焦磷酸化酶PPase普遍存在于高等植物的液胞膜上，水解PPi，将细胞质中的H⁺运送到液胞内；质膜上的H⁺-ATPase(P-ATPase)起着与V-ATPase类似的功能。以上3种酶提供了细胞跨膜运输的能量，而跨膜质子梯度是维持Na⁺/H⁺逆向运转蛋白正常的功能所必需的，外源Na⁺/H⁺基因的导入很可能要影响到这些酶的活性，为此，测定了V-ATPase、P-ATPase和PPase的活性。细胞膜的提取和3种相关酶活性的测定参照Vera-Estrella等(2005)的方法进行(Vera-Estrella R，Barkla B J，García-RamírezLa.et al.2005.Salt stress in Thellungiella halophila activates Na⁺ transport mechanismsrequired for salinity tolerance.Plant Physiol，9：1507-1517)。

按照上述方法对转pBI121-Se(S1、S15)、pBin438(B8、B23)、pBinBS(BS5、BS15)的T0代的扩繁株系或野性型烟草W38对照(WT)分别进行正常灌溉或灌溉200mM NaCl溶液胁迫，处理6周后，测定V-ATPase、P-ATPase和PPase的活性，结果如表4所示，结果表明，在200mM NaCl下，各个转基因株系和野生型对照液胞膜PPase活性比正常灌溉条件有所上升，各转基因株系上升的幅度要大一些。但是，无论在盐分胁迫还是在正常灌溉条件下各转基因株系和野生型的PPase酶活性没有显著的差异。在正常灌溉条件下转基因株系和野生型植株的P-ATPase酶活性的差异没有达显著水平；在200mM NaCl下所有转基因株系的P-ATPase酶活均显著高于非转基因对照，且所有株系的P-ATPase酶活性在较正常灌溉有所提高。

在各个转基因株系中，V-ATPase强烈地受到了盐分的诱导，其中株系BS15(转pBinBS株系)在正常灌溉条件下的酶活性是14.13U，盐分胁迫下的酶活性是33.07U，上升了1.34倍，其余各转基因株系酶活均上升了1倍多，但在野生型烟草中盐胁迫下的酶活性较正常灌溉条件仅略有上升。在没有盐胁迫的条件下各转基因株系的V-ATPase酶活性和野生型相比没有任何差异，但在盐胁迫下，均显著高于野生型。以上结果表明SeNHX1基因的导入强烈的增强了各个转基因株系在盐分胁迫下的V-ATPase酶活性。

表4.T0代转基因烟草在200mM NaCl胁迫下ATPase和PPase的酶活性

酶类型	NaCl浓度mM	株系
							WT	S1	S15	BS5	BS15

PPase	0200	13.27±1.07a14.43±0.91a	14.17±1.31a16.57±0.95a	14.87±1.01a15.50±0.95a	13.37±2.64a16.67±2.73a	14.63±1.6a17.20±1.67a
							P-ATPase	0200	9.57±0.76a9.63±0.83b	9.80±1.35a10.57±0.76a	9.70±0.85a10.53±0.75a	10.90±1.87a11.63±0.70a	9.60±0.70a11.53±0.85a
V-ATPase	0200	14.27±0.80a15.93±0.25b	14.80±0.46a30.80±1.59a	15.00±0.26a30.87±2.12a	14.53±0.95a30.83±3.25a	14.13±0.64a33.07±1.72a

表中数值为3个重复的平均数，每行中标有不同字母者为LSD检验在P≤0.05水平上差异显著。

5)离子含量测定

对于大多数植物来说，盐分胁迫的主要伤害之一就是大量Na⁺离子积累在细胞质中，造成对植物膜系统的破坏和胞质中酶的毒害作用。由于根和嫩叶的液胞化程度比较低，而且根是首先接触盐的器官，而茎起到把地下部分盐向地上部分运输的功能，老叶的液胞化程度比较高，初步估计在这四种器官中其盐分含量可能具有很大的差异，而过量盐分的积累往往又会影响到K⁺的积累。因此测定了盐胁迫下(200mM NaCl)转BADH基因(B8、B23)和SeNHX1基因(S1、S15)烟草根、茎、嫩叶、老叶中Na⁺和K⁺离子的含量(表5、表6)。

盐胁迫下Na⁺离子的含量测定结果如表5所示，结果表明烟草幼叶中在正常情况下仅积累微量的Na⁺，但在盐分胁迫下Na⁺含量急剧上升，在野生型中上升了38.6倍，各转基因株系也表现出了相同的趋势。在正常情况下，各株系的Na⁺含量的差异没有达显著水平；但在盐分胁迫下转SeNHX1的两个株系S1和S15的Na⁺含量显著高于野生型，其中株系S1的Na⁺含量达17.85mg/g，转BADH基因的两个株系B8和B23的Na⁺含量显著低于野生型。

在正常情况下，烟草老叶中的Na⁺含量比嫩叶中要高的多，说明老叶可能作为Na⁺库的作用。盐分胁迫下转SeNHX1株系和BADH株系老叶Na⁺含量要高于嫩叶，与嫩叶中钠的含量趋势相同，转SeNHX1株系Na⁺含量显著高于野生型，转BADH基因株系显著低于野生型。

所有株系在正常灌溉条件下根中的Na⁺含量差异没有达显著水平；但在200mMNaCl胁迫下各转基因株系均显著低于野生型对照，且转SeNHX1株系和BADH株系的Na⁺含量没有达显著水平。在转SeNHX1株系中根中的钠离子有可能运输到地上部的叶子，进而区隔到液胞中，引起了根中Na⁺含量的下降。各株系在正常灌溉条件下茎中的Na⁺含量差异也没有达显著水平；但在盐分胁迫下转SeNHX1株系Na⁺含量要显著高于野生型对照，转BADH株系与野生型的差异没有达显著水平。说明外源BADH基因的转入能降低植物盐分胁迫下的Na⁺含量，减少了Na⁺的毒害作用，从而提高了耐盐性。而在转入SeNHX1烟草T0世代叶和茎中的Na⁺含量却显著高于对照，这似乎与分别转入这两个基因的株系的耐盐性的提高是相矛盾的。但是，在本试验中所测定的Na⁺含量是植物细胞各个亚细胞器中的总含量，对于植物细胞来说，只有在细胞质中的Na⁺对植物遭成的伤害最大。BADH很可能在调节细胞膜的Na⁺离子运输方面起着积极的作用，降低了细胞膜对Na⁺离子的通透性，从而降低了植物总的Na⁺含量。而在转入SeNHX1烟草中，定位在液胞膜上的Na⁺/H⁺逆向运转蛋白，可以把细胞质中的Na⁺运输到液胞中，降低了细胞质中的Na⁺含量，使植物能够耐受较高的盐分胁迫，由于过量Na⁺在液胞中的积累导致了总的Na⁺含量的升高。

表5.T0代转基因烟草不同部位中的Na⁺含量(mg/g DW)

部位	NaCl浓度mM	Na+含量(mg/g DW)
							WT	S1	S15	B8	B23
		嫩叶	0200	0.31±0.03a11.96±1.50c	0.32±0.04a17.85±1.03a	0.37±0.07a16.10±0.29a						0.30±0.04a9.81±0.96b	0.31±0.05a8.86±1.02b
老叶	0200						4.03±0.64b18.30±0.94b	6.54±1.03a25.18±0.96a	6.45±0.47a25.69±1.60a	3.92±0.35b15.38±1.17c	3.47±0.16b15.24±0.93c
		根	0200	7.22±0.50a13.41±0.78a	6.69±0.54a11.06±1.07b	7.10±0.56a10.28±0.84b						6.08±0.24b11.14±0.89b	6.16±0.93a11.18±0.96b
茎	0200						0.70±0.13a11.63±0.95b	0.97±0.19a19.79±1.65a	1.02±0.49a20.75±1.28a	0.58±0.16a9.89±1.38b	0.78±0.10a9.45±0.78b

表中数值为3个重复的平均数，每行中标有不同字母者为LSD检验在P≤0.05水平上差异显著。

K⁺含量测定结果如表6所示，结果表明，各转基因株系嫩叶中的K⁺含量在正常灌溉条件下的差异没有达显著水平；在盐分胁迫下各转基因株系K⁺含量比无盐略有降低，但都显著高于野生型。盐分胁迫对烟草嫩叶中K⁺含量影响不大，可能与嫩叶是植物的生长中心有关，植物要维持盐分胁迫下的持续生长必需要保证幼嫩组织营养的供应。与嫩叶相比，老叶中的K⁺含量较大程度的受到了盐分胁迫的影响。野生型的下降最大，由正常灌溉条件下的24.60mg/g下降到11.17mg/g，下降了54.6％，盐胁迫下株系S15的K⁺含量最高，为20.23mg/g.盐分胁迫下老叶中K⁺含量的下降可能与K⁺的重复利用有关，老叶中的K⁺转运到嫩叶中，使得老叶中的K⁺含量变化较大，而嫩叶中的变化较小。这可能是植物在盐分胁迫下所形成的一种适应机制。

盐分胁迫也降低了根中的K⁺含量，但是与老叶相比，根中K⁺的含量变化不是很大。但是各转基因株系K⁺的含量同样显著高于野生型对照，转SeNHX1基因株系的K⁺含量要高于转BADH基因株系。

表6.T0代转基因烟草不同部位中的K⁺含量(mg/g DW)

部位	NaCl浓度(mM)	K+含量(mg/g DW)
							WT	S1	S15	B8	B23
		嫩叶	0200	27.52±1.18a23.07±0.51b	27.10±1.81a26.85±0.47a	26.80±2.04a26.20±1.04a						27.99±0.86a25.94±1.43a	26.21±1.74a25.28±0.70a
老叶	0200						24.60±1.05a11.17±0.53c	25.97±1.38a18.30±0.93ab	25.79±1.11a20.23±0.97a	24.67±2.10a17.82±0.89b	24.59±1.51a16.91±1.70b
		根	0200	24.59±1.13a20.20±0.22c	24.13±1.08a23.80±0.55a	25.43±0.61a24.40±0.86a						24.07±1.14a23.12±0.90ab	23.97±0.66a22.39±0.78b
茎	0200						61.63±2.94a39.09±1.49c	59.50±1.65a46.42±0.76a	61.65±1.87a46.48±1.77a	61.27±3.64a42.96±2.54b	62.30±1.99a43.87±1.99ab

表中数值为3个重复的平均数，每行中标有不同字母者为LSD检验在P≤0.05水平上差异显著。

与嫩叶、老叶和根相比，茎中K⁺含量的绝对值最高，正常灌溉条件下各株系K⁺的平均含量为61.27mg/g，分别为嫩叶、老叶和根中平均含量的2.26倍、2.44倍和2.51倍。即使在200mM NaCl胁迫下烟草茎中K⁺的含量也维持在较高的水平，其平均含量为43.76mg/g DW，远高于其它部位的平均含量。盐分胁迫下茎中较高的K⁺含量在维持植株茎杆的韧性和硬度方面可能起着重要的作用。盐胁迫下各株系茎中的K⁺含量都显著高于野生型对照，在正常条件下各株系K⁺含量的差异并没有达显著水平。说明外源基因SeNHX1和BADH的导入显著的提高了盐分胁迫下烟草植株内的K⁺含量，在所测定的4个部位中转SeNHX1基因烟草K⁺的平均含量要比相应的转BADH基因烟草要高一些，表明在改善盐分胁迫下K⁺的营养状况方面SeNHX1比BADH起的作用更大一些，这似乎与SeNHX1直接参与离子的转运有关。

6)T0代转基因单株产量的测定

对在200mM NaCl下胁迫6周后不同转基因类型烟草(转pBI121-Se(S1、S15)、pBin438(B8、B23)和pBinBS(BS5、BS15)的T0代的扩繁株系)的生物量进行了测量，以野生型烟草W38为对照，结果如表7所示，结果表明，在正常灌溉条件下所有株系间的单株干重的差异均没有达显著水平；盐分胁迫下3种不同转基因类型植株的单株干重均显著高于野生型对照，但是单基因转化(转pBI121-Se株系和转pBin438株系)和双基因共转化(转pBinBS株系)以及不同的单基因转化之间又有较大的差别。双基因转化植株的单株产量最高，其次为SeNHX1单基因转化植株(转pBI121-Se株系)。SeNHX1和BADH双基因转化株系(转pBinBS株系)BS5的单株干重最高达13.91g，为野生型的1.51倍，而在正常灌溉条件下两者间仅有微小的差别。

表7.T0转基因烟草在200mMNaCl胁迫下的生物量(g/株干重)

株系	生物量(g/株干重)
			0mMNaCl	200mM NaCl
	WTS1S15B8B23BS5BS15	15.00±0.66a14.79±1.07a14.93±1.28a15.23±1.06a14.47±1.09a15.18±0.88a14.75±1.06a			9.21±1.00d12.61±0.96abc12.36±1.53bc11.57±0.91c11.85±0.74bc13.91±1.56a13.11±0.84ab

表中数值为6个重复的平均数，每列中标有不同字母者为LSD检验在P≤0.05水平上差异显著。

同时对各类型转基因植株相对于其各自正常灌溉下的相对减产率和对200mMNaCl胁迫的敏感性进行了比较(表8)。单株的相对减产率(％)＝[1-(盐分胁迫下产量/该株系正常灌溉下产量)]×100.用多重比较的(LSD)方法在P＝0.05水平上对各处理和株系差异的显著性进行了比较，比较前先进行了整个试验的方差分析。所用统计软件为SPSS10.0。结果表明转SeNHX1和BADH双基因株系BS5相对于其正常灌溉对照的减产率仅为8.4％，而野生型减产率达到了38.6％，单基因转化植株的减产率居中，但是同一种类型转基因烟草的不同株系间减产率也有较大的差别。参照Jain等(1990)的方法(Jain R K，Sunita J，Nainawatee H S.et al.1990.Salt-tolerance in Brassicajuncea L.I.In vitro selection，agronomic evaluation and geneticstability.Euphytica，48：141-152)对烟草的单株干重进行了数据转换，计算其各自的盐胁迫敏感指数(Salinity stress susceptibility index，S)。具体计算公式为：S＝(1-YD/YP)/D。公式中各项的具体意义：YD＝某性状盐胁迫下的平均表现值，YP＝该性状对照下的平均表现值，D＝1-(所有参试基因型该性状的平均YD)/(所有参试基因型该性状的平均YP)。

S的大小反映了某一基因型某性状对盐胁迫的敏感程度，D的大小反映了某一实验处理的胁迫强度。该计算法考虑了某一实验处理的胁迫强度，能较为客观的反映不同材料间对同一处理的敏感程度。若某个性状在盐分胁迫下和对照情况下具有相同的表现，则该性状的盐胁迫敏感指数S为0，否则为大于0的某一数值。由表8的结果表明野生型烟草的盐胁迫敏感指数S为2.04，各转基因植株除了B8为1.27外，其余的盐胁迫敏感指数均小于1，进一步表明野生型烟草对200mM的NaCl更为敏感，此胁迫强度已经强烈的影响到了其正常的生长。从盐胁迫敏感指数和减产率反应的各株系的耐盐性强弱是一致的，株系BS5的耐盐性最强，依次为BS15、S1、S15、B23、B8、WT。

表8.T0代转基因烟草在200mM NaCl胁迫下的减产率和盐胁迫敏感指数(S)

植株	减产率(％)	盐胁迫敏感指数S
			WTS1S15B8B23BS5BS15	38.614.717.224.118.18.411.1	2.040.780.911.270.960.440.59

3、T1代的转基因植株的分子检测及的抗逆性初步鉴定

转基因当代植株移栽入花盆和室外大田中，充分保证水肥供应，并做好病虫害的防治。虽然烟草是严格自交物种，但仍需采取一定的隔离措施。待种子成熟后，收集种子进行子代(T1代)分析。由于试验规模所限，故仅对其中部分株系进行了分析。

1)T1代的筛选和分子检测

将收获的转pBI121-Se、pBin438和pBinBS T0代的种子，即T1代种子，充分晒干后，按照常规的种子消毒方法种在MS0+100mg/L Km(卡那霉素)的培养基中，进行筛选。转pBI121-Se、pBin438和pBinBST1种子和野生型种子在加Km的培养基上在第5天同时开始发芽，到第8天基本上都达到100％的发芽率。此时，转pBI121-Se、pBin438和pBinBS种子和野生型种子，在芽势和生长状况上都看不出任何差别。更换了不同批次的卡那霉素，都得到了类似的结果，排除了卡那霉素失效的原因。但是随着不同类型种子在加卡那霉素培养基上生长时间的延长，我们发现卡那霉素强烈的抑制了野生型幼苗的生长，而转基因幼苗似乎没有受到任何的影响，其生长3周后的情况如图19。图19中A为转pBinBS T1代种子在100mg/L卡那霉素培养上播种后3周的状况；B为野生型种子在100mg/L卡那霉素培养基上播种后3周的状况；C为转pBinBS T1代种子在无卡那霉素培养基上播种后3周的状况；D为野生型种子发在无卡那霉素培养基上播种后3周的状况。

为了进一步检测外源基因在T1代中存在的可靠性，分别对3种转基因类型(转pBI121-Se、pBin438和pBinBS烟草)烟草的部分植株进行了PCR检测，部分结果如图20中A，B和图21所示。结果表明，在检测的S15、B23和BS15的T1代株系中，大部分植株均扩出了1.5Kb的BADH基因或/和1.9Kb的SeNHX1，而另一部分植株检测不到目的条带。其中在BADH基因和SeNHX1基因共转化植株BS15的T1代株系中，两目的基因表现出相同的分离趋势，说明这两个基因共同插入了烟草基因组上的同一位点，这也与转化时候此两个基因在同一载体上是相符的。其中图20中A的泳道1-7为转SeNHX1基因S15的T1代株系，泳道8为MarkerIII；图20中B的泳道1-8转BADH基因B23的T1代株系，泳道9为MarkerIII。图21中泳道1和11；2和12；3和13；4和14；5和15；6和16；7和17；8和18；分别对应同一BADH基因和SeNHX1基因共转化植株BS15的T1代株系单株，泳道1-9，为SeNHX1基因PCR结果；泳道10为MarkerIII；泳道11-19为BADH基因PCR结果。

2)芽期耐盐性鉴定

将转pBI121-Se、pBin438和pBinBS的T1代种子经消毒后播于含0或200mM NaCl的MS培养基上培养3周，观察种子发芽和幼苗的生长情况，以野生型烟草W38为对照。结果如图22所示，结果表明，200mM NaCl已经强烈的抑制了野生型烟草种子的发芽，几乎所有的种子在露白后即停止生长，直到腐烂死亡。相比之下，有少量的转pBI121-Se、pBin438和pBinBS的T1代幼苗能存活下来，并长出细长的根。对这部分存活下来的幼苗进行PCR检测，均能扩增出目的基因，说明转pBI121-Se、pBin438和pBinBS的T1代植株能够在200mM NaCl培养基上生长的确是由外源基因的导入引起的。而在无NaCl的培养基上转基因幼苗和野生型幼苗并看不出任何差别。对单转SeNHX1(转pBI121-Se株系)、BADH基因(转pBin438株系)以及SeNHX1和BADH基因共转化(转pBinBS株系)的T1代种子进行了相同的发芽试验，均得到了类似的结果，但是双基因转化(转pBinBS株系)的幼苗在200mM NaCl培养基上生长状况要比单基因转化(转pBI121-Se和转pBin438株系)要好些。由于幼苗有限并没有进行相关生长指标的测定和比较。其中图22中，A为野生型(左)和转BADH和SeNHX1双基因种子BS15(右)在无NaCl培养上的播种生长情况；B为野生型(左)和转BADH和SeNHX1双基因种子BS15(右)含在200mM NaCl培养基上的播种生长情况。

3)T1代的渗透胁迫试验

甘露醇作为一种多元糖醇，具有很高的水溶性，是一种常用的渗透压调节剂。为了进一步验证各转基因植株的耐盐性，对3种转基因类型的植株进行了甘露醇的胁迫试验。

对PCR检测得到的转pBI121-Se、pBin438和pBinBS的T1代阳性苗或野生型烟草W38，利用水培的方法在1/2Hoagland营养液中水培2周。待植株长到4cm左右后，挑选大小和生长状况一致的幼苗，进行甘露醇胁迫，胁迫处理时向营养液中加入200mM的甘露醇，在此浓度下胁迫1周后再转移到1/2 Hoagland营养液中培养1周看其恢复情况，对照一直培养在1/2 Hoagland营养液中。结果如图23所示，结果表明，200mM的甘露醇已经对烟草遭成了严重的伤害，所有材料均因渗透胁迫失水出现了干枯的叶子，在一些叶子的边缘还有一些白色物质析出，是植株体内过量甘露醇随蒸腾作用运到了叶子表面引起的。但是转到1/2 Hoagland营养液中生长1周后，各转pBI121-Se、pBin438或pBinBS的T1代苗恢复情况明显好于野生型对照，均有新的叶子长出，并且在根基部长出了有少量白色的根，而野生型的大部分根都腐烂，而且也没有新的根长出。说明了转pBI121-Se、pBin438和pBinBS的T1代株系在渗透胁迫消除后能较快的恢复生长，而野生型却不能。图23中A为野生型(左)和转BADH和SeNHX1双基因种子BS23(右)在甘露醇胁迫前的生长情况；B为野生型(左)和转BADH和SeNHX1双基因种子BS23(右)在200mM甘露醇胁迫1周后，又转移到1/2 Hoagland营养液中生长1周后的情况。

检测各株系在渗透胁迫消除后在营养液中生长1周后的生物量，结果如表9所示，结果表明，转pBI121-Se、pBin438和pBinBS的T1代株系均显著高于野生型。但是不同类型的转基因材料间差别较大，双基因转化显著高于单基因转化，SeNHX1单基因转化显著高于BADH单基因转化。如双基因转化株系BS5(转pBinBS的T1代株系)的单株鲜重是5.63g，分别是SeNHX1单基因转化株系S15(转pBI121-Se的T1代株系)、BADH单基因转化B23(转pBin438的T1代株系)和野生型的1.33倍、1.55倍和2.01倍。但是在对照情况下，各株系间的生物量并没有显著的差异，说明了外源抗盐基因的导入的确提高了烟草的抗渗透胁迫的能力。

表9.T1代转基因株系在200mM甘露醇胁迫1周后的生物量

株系	生物量(g/株，鲜重)
			0mM	200mM
	WTS1S15B8B23BS5BS15	15.07±1.02a15.07±1.24a15.19±1.26a15.71±1.81a14.94±1.99a14.97±1.21a15.50±1.91a			2.65±0.21e4.37±0.21c4.23±0.30c3.56±0.21d3.37±0.20d5.63±0.22a5.23±0.33b

表中数值6个重复的平均数，每列中标有不同字母者为LSD检验在P≤0.05水平上差异显著。

Claims (8)

1、一种提高植物抗逆性的方法，是将SeNHX1基因和BADH基因通过植物表达载体共同转入植物中，筛选得到抗逆性提高的植物。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述SeNHX1基因的编码序列是自GENBANK号为AY131235的5′端第492位至2174位的核苷酸序列；所述BADH基因的编码序列是自GENBANK号为X69770的5′端第4位至第1512的核苷酸序列。

3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述SeNHX1基因和BADH基因通过一个植物表达载体共同转入植物中的。

4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述SeNHX1基因和BADH基因是通过pBinBS共同转入植物中的。

5、根据权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：所述抗逆性为抗盐性。

6、根据权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：所述抗逆性为抗氧化性。

7、根据权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：所述抗逆性为抗盐性和抗氧化性。

8、根据权利要求1至7中任一所述的方法，其特征在于：所述植物为烟草。

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