CN1968711B - 含有低剂量hib偶联物的组合疫苗 - Google Patents
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Abstract
已知包含用于免疫以抵御白喉、破伤风、百日咳和Hib的抗原的组合疫苗(′DTP-Hib′疫苗)。本发明解决了本领域对含有低剂量Hib抗原以降低成本而且不需要重建的疫苗的需要。因此，本发明提供了包含用于保护对象以至少抵御白喉、破伤风、百日咳和Hib的抗原的组合疫苗，其中：(a)保护性抵御Hib的抗原是Hib荚膜糖偶联物；(b)所述疫苗中该Hib偶联物的浓度＜15μg/ml；和(c)该Hib偶联物从未被冻干过。已发现本发明疫苗是安全的并具有高免疫原性。
Description
本文所引用的所有文献都已完整纳入本文作为参考。
技术领域
本发明涉及组合疫苗领域，具体说是保护性抵御白喉、破伤风、百日咳和B型流感嗜血杆菌(H.influenzae b型，′Hib′)的组合疫苗领域。
背景技术
已知包含用于免疫以抵御白喉、破伤风、百日咳和Hib的抗原的组合疫苗(′DTP-Hib′疫苗)。可购得三种这样的疫苗，其商品名是TETRAMUNETM和QUATTVAXEMTM(它们采用细胞百日咳抗原′DTwP-Hib′)和INFANRIX-HibTM(它采用非细胞百日咳抗原′DTaP-Hib′)。
DTaP-Hib疫苗中包含Hib偶联组分与抗Hib应答的降低相关[1，2]。而且，Hib偶联物在水性介质中不稳定，不能以这种形式存活很长的贮存时间[3]。因此，在包含Hib偶联抗原的组合疫苗中，通常将Hib组分制成在递送时用其它抗原的液体制剂重建的冻干粉末。
Hib-偶联抗原的生产并不便宜，有担心其成本将会抑制在发展中国家的广泛应用，因此开发了使用Hib偶联物的替代方案[4-6]。扩展其应用的一种方法是给予两次剂量(如3和5月龄时[5]或4和6月龄时[6])，而非通常的三次剂量(2、4和6月龄时[7])。然而，在不同的方法中，Hib偶联物一般给予10μg/剂量，采用了较低剂量(一般为分数，如1/2、1/3、1/4等)[4，6]。在参考文献6中，例如，以5μg/剂量或3.33μg/剂量给予Hib偶联物。
相同方法已经延伸到DTP-Hib疫苗中的Hib偶联物。例如，参考文献8比较了全剂量、半剂量和1/3剂量Hib偶联物与DTwP疫苗联用，虽然与分别给予DTP和Hib相比，接受组合型DTP-Hib疫苗的患者体内抗-PRP抗体的几何平均浓度降低，但在所有病例中都能观察到可接受的保护性抗Hib免疫应答。参考文献9通过用10剂量的DTwP药瓶重建1剂量的Hib，使用10倍稀释的Hib偶联物剂量。参考文献10公开了用TRITANRIXTM DTwP-HBsAg疫苗将冻干Hib偶联物重建为全剂量、半剂量或1/4剂量。
然而，在这些情况下，Hib-偶联物是冻干形式，不得不在给药之前用水性DTP抗原重建。因此，必须用两个分开的容器提供这些疫苗(水性DTP装在一个容器中，冻干的Hib装在另一个容器中)，这种对两个容器的需求增加了额外成本，也增加了包装阶段、运输阶段、储存阶段和给药阶段的物流需求。由于剂量降低的疫苗旨在降低成本和鼓励在发展中世界销售，所以这些额外需求显然不利。需要重建步骤也意味着存在终端使用者出错的风险、非标准化给药的可能性、混合产物污染的风险和需要训练重建步骤的操作人员。所有这些问题都阻碍其进入预计目标市场，即发展中世界。
因此，仍然需要包含低剂量Hib偶联抗原而不需要分别包装该Hib抗原的组合疫苗。
发明内容
本发明提供了包含用于保护对象以至少抵御白喉(′D′)、破伤风(′T′)、百日咳(P′)和B型流感嗜血杆菌(′Hib′)的抗原的组合疫苗，其中：(a)用于保护性抵御Hib的抗原是Hib荚膜糖的偶联物；(b)疫苗中该Hib偶联物的浓度＜15μg/ml；和(c)该Hib偶联物从未被冻干过。已发现与参考文献6、8和9中观察到的免疫应答相比，本发明疫苗是安全的，并具有高免疫原性。
本发明也提供了包含用于保护对象以至少抵御白喉(′D′)、破伤风(′T′)、百日咳(P′)和B型流感嗜血杆菌(′Hib′)的抗原的组合疫苗，其中：(a)用于保护性抵御Hib的抗原是Hib荚膜糖的偶联物；(b)疫苗中该Hib偶联物的浓度＜15μg/ml；和(c)该疫苗(i)不含氢氧化铝佐剂和/或(ii)不含硫酸铝钾佐剂。相信氢氧化铝参与了糖偶联物的降解，因此作为佐剂，该疫苗优选包含磷酸铝佐剂。当存在铝佐剂(如磷酸铝佐剂)时，优选Hib偶联物不吸附于该佐剂。
本发明也提供装有可刺穿密封物并含有组合疫苗的药瓶，所述组合疫苗包含用于保护对象以至少抵御白喉、破伤风、百日咳和B型流感嗜血杆菌(′Hib′)的抗原，其中所述保护性抵御Hib的抗原是Hib荚膜糖的偶联物，其中(a)所述疫苗中Hib偶联物的浓度＜15μg/ml，(b)药瓶的可刺穿密封物未被刺穿过。
本发明也提供含有组合疫苗的密封容器，所述组合疫苗包含用于保护对象以至少抵御白喉、破伤风、百日咳和B型流感嗜血杆菌(′Hib′)的抗原，其中所述保护性抵御Hib的抗原是Hib荚膜糖的偶联物，所述疫苗中Hib偶联物的浓度＜15μg/ml。
本发明也提供包含用于保护对象以至少抵御白喉(′D′)、破伤风(′T′)、百日咳(P′)和B型流感嗜血杆菌(′Hib′)的抗原的组合疫苗的制备方法，其中用于保护性抵御Hib的抗原是Hib荚膜糖的偶联物，疫苗中该Hib偶联物的浓度＜15μg/ml，其中(a)该方法包括混合用于保护性抵御D、T、P和Hib的所述抗原的步骤，和(b)该方法(i)不包括冻干Hib偶联物抗原的步骤，和/或(ii)不包括将白喉、破伤风和百日咳抗原包装到与Hib偶联物抗原分开的混合形式中的步骤。
本发明也提供将组合疫苗注入容器的方法，其中：(a)该疫苗包含用于保护对象以至少抵御白喉、破伤风、百日咳和B型流感嗜血杆菌(′Hib′)的抗原；(b)用于保护性抵御Hib的抗原是Hib荚膜糖的偶联物；和(c)疫苗中该Hib偶联物的浓度＜15μg/ml。
本发明也提供将标记贴在容器上的方法，其中：(a)该容器含有包含用于保护对象以至少抵御白喉、破伤风、百日咳和B型流感嗜血杆菌(′Hib′)的抗原的组合疫苗；(b)用于保护性抵御Hib的抗原是Hib荚膜糖的偶联物；和(c)疫苗中该Hib偶联物的浓度＜15μg/ml。该标记可说明该容器含有疫苗。
本发明也提供将组合疫苗注入容器然后从容器中取出该疫苗的方法，其中：(a)该疫苗包含用于保护对象以至少抵御白喉、破伤风、百日咳和B型流感嗜血杆菌(′Hib′)的抗原；(b)用于保护性抵御Hib的抗原是Hib荚膜糖的偶联物；和(c)疫苗中该Hib偶联物的浓度＜15μg/ml。
DTP组分
白喉抗原优选为白喉类毒素。已经详细记载了白喉类毒素的制备[如参考文献11的第13章]。可采用任何合适的白喉类毒素。白喉类毒素的浓度通常为5-100Lf/ml。优选浓度为10-50Lf/ml。更优选的浓度为20-40Lf/ml。最优选的浓度约为30Lf/ml。或者，优选浓度为5-25Lf/ml，更优选的浓度为10-20Lf/ml，最优选的浓度约为15Lf/ml。然而，当采用无细胞百日咳抗原时，白喉类毒素的优选浓度约为50Lf/ml。
破伤风抗原优选为破伤风类毒素。已经良好地描述了破伤风类毒素的制备[如参考文献11的第27章]。可采用任何合适的破伤风类毒素。破伤风类毒素的浓度通常为1-50Lf/ml。优选浓度为2-9Lf/ml。更优选的浓度为5-8Lf/ml。最优选的浓度约为6.5Lf/ml。然而，当采用无细胞百日咳抗原时，白喉类毒素的优选浓度约为20Lf/ml。
用于本发明的百日咳抗原可以是细胞(如全细胞)或无细胞的。已经详细记载了两种抗原类型的制备[如参见参考文献11的第21章；也参见参考文献12]。对于细胞百日咳抗原，百日咳抗原的浓度通常为5-50OU/ml。优选浓度为10-40OU/ml。更优选的浓度为25-35 OU/ml。最优选的浓度约为30OU/ml。当采用无细胞抗原时，优选采用百日咳全毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)，更优选与百日咳杆菌黏附素(pertactin)(也称为PRN或69kDa抗原)混合，任选地与凝集原(也称为菌毛)2和3混合[13]。每个疫苗剂量(如每0.5ml)的百日咳抗原水平一般为：10μg PT、5μgFHA、3μg或5μgPRN，5μg混合的菌毛。PT是有毒蛋白，当存在于百日咳抗原中时，优选脱毒。可通过化学和/或遗传方法脱毒。优选的脱毒突变体是9K/129G双突变体[14]。
Hib偶联物
用于本发明疫苗的B型流感嗜血杆菌抗原包含Hib荚膜糖抗原。B型流感嗜血杆菌的糖抗原是熟知的[如参考文献11的第14章]。将Hib糖偶联于运载体蛋白以增强其免疫原性，尤其是在儿童中的免疫原性。已经详细记载了Hib荚膜糖的制备[如参考文献15-24]。本发明可采用任何合适的Hib偶联物。上面描述了合适的运载体蛋白，Hib糖的优选运载体是CRM197(′HbOC′)、破伤风类毒素(′PRP-T′)与脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitides)的外膜复合物(′PRP-OMP′)。
该偶联物的糖部分可以是多糖(如全长聚核糖基核糖醇磷酸(PRP))，但优选采用寡糖(如MW约为1-5kDa)。它们可通过片段化纯化PRP(如通过水解)、然后通常纯化所需大小的片段而方便地形成。当本发明组合物包含偶联的寡糖时，寡糖制备应该在偶联之前。
用于共价偶联的优选运载体蛋白是细菌毒素或类毒素，如白喉类毒素或破伤风类毒素。尤其优选CRM197白喉毒素突变体[25-27]。其它合适的运载体蛋白包括脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白[28]、合成肽[29，30]、热激蛋白[31，32]、百日咳蛋白[33，34]、细胞因子[35]、淋巴因子[35]、激素[35]、生长因子[35]、包含来自各种病原体衍生抗原的多个人CD4+T细胞表位的人造蛋白[36]、流感嗜血杆菌的蛋白D[37，38]、肺炎球菌表面蛋白PspA[39]、摄铁蛋白[40]、艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B[41]等。优选运载体是白喉类毒素、破伤风类毒素和CRM197。
可采用糖∶蛋白比(w/w)为1∶5(即蛋白过量)-5∶1(即糖过量)，如1∶2-5∶1和1∶1.25-1∶2.5的偶联物。
偶联物可与游离的运载体蛋白联用[42]。当本发明组合物中给定运载体蛋白既有游离形式又有偶联形式时，全部组合物中未偶联形式优选不多于运载体蛋白总量的5％，更优选小于2重量％。
可采用任何合适的偶联反应，需要时采用任何合适接头。
一般在偶联之前将糖活化或官能化。活化可包括例如，氰化试剂如CDAP(如1-氰基-4-(二甲基氨基)-四氟硼酸吡啶[43，44等])。其它合适技术采用碳二亚胺、酰肼、活化酯、降冰片烷、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU；也参见参考文献22的引言)。
可用任何已知方法，例如参考文献45和46所述方法通过接头基团连接。一种连接类型包括多糖的还原性胺化，将得到的氨基与己二酸接头基团的一端偶联，然后将蛋白质偶联于己二酸接头基团的另一端[20、47、48]。其它接头包括B-丙酰胺基[49]、硝基苯基-乙基胺[50]、卤代酰基卤化物[51]、糖苷键[52]、6-氨基己酸[53]、ADH[54]、C4-C12基团[55]等。作为采用接头的替代方式，可采用直接连接。与蛋白质直接连接可包括氧化多糖，然后用蛋白质还原性胺化，例如参考文献56和57所述。
一种方法包括：将氨基引入糖(如通过用-NH2取代末端＝O基团)，然后用己二酸二酯(如己二酸N-羟基琥珀酰亚胺二酯)衍生化，优选与运载体蛋白反应。另一优选反应采用CDAP活化和蛋白D运载体。
偶联后，可分离游离糖和偶联糖。有许多合适方法可用于此分离，包括疏水层析、切线式超滤，透析等。[也参见参考文献58和59等]。如果疫苗包含游离形式和偶联形式的给定糖，全部组合物中未偶联形式优选不多于该糖总量的20重量％(如≤15％、≤10％、≤5％、≤2％、≤1％)。
优选偶联物包含通过己二酸接头共价偶联于CRM197的Hib寡糖[60，61]。破伤风类毒素也是优选的运载体。
给予Hib抗原优选使抗-PRP抗体浓度≥0.15μg/ml，更优选≥1μg/ml。这些是标准的可接受应答阈值。
本发明疫苗中Hib偶联物的浓度为＜15μg/ml，如≤14μg/ml、≤12μg/ml、≤10μg/ml、≤7.5μg/ml、≤5μg/ml、≤4μg/ml、≤3μg/ml、≤2μg/ml、≤1μg/ml等。当运载体蛋白不是OMPC时，可能采用稍高的剂量，如＜20μg/ml、≤19μg/ml、≤18μg/ml、≤17μg/ml、≤16μg/ml等。然而，本发明疫苗中Hib偶联物的浓度通常为至少0.1μg/ml，如≥0.2μg/ml、≥0.3μg/ml、≥0.4μg/ml、≥0.5μg/ml、≥0.6μg/ml、≥0.7μg/ml、≥0.8μg/ml、≥0.9μg/ml、≥1.0μg/ml、≥1.25μg/ml、≥1.5μg/ml、≥2.0μg/ml、≥3.5μg/ml等。因此，所述疫苗中Hib偶联物浓度的优选范围是d1-d2μg/ml，其中：(i)d1＜d2；(ii)d1选自0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.25、2.5、2.75、3.0、3.5和4.0；和(iii)d2选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15。
在说明书和权利要求书中根据糖量定义Hib偶联物的浓度(即作为整体的偶联物(运载体+糖)剂量高于所述剂量)，以避免由于运载体的选择而引起的变化。
本发明组合物中Hib偶联物抗原不是冻干的并且从未被冻干过。
佐剂
相信氢氧化铝参与Hib糖偶联物的降解[62]，因此疫苗优选包含磷酸铝佐剂作为佐剂。
当存在磷酸铝佐剂时，与参考文献63相反，Hib偶联物优选不吸附于该佐剂。可通过选择生产期间的正确混合顺序，通过选择抗原/佐剂混合期间的合适pH，和/或通过选择具有合适零电点(PZC)的佐剂[64]来实现不吸附(见下)。
当存在磷酸铝时，白喉类毒素一般吸附在磷酸铝上。吸附优选为部分吸附，如组合物中全部白喉类毒素的大约30-80重量％是吸附的(如约40％-70％、约50％-60％等)。当储存于约37℃时，白喉类毒素的吸附随时间增加。破伤风类毒素一般吸附在磷酸铝上。吸附优选为部分吸附，如组合物中全部破伤风类毒素的不多于40重量％是吸附的(如不多于30％、不多于20％、不多于10％等)。破伤风类毒素吸附水平可以约为0％。Hib-偶联物仍然不吸附于铝佐剂。组合物中优选不多于15重量％的Hib-偶联物应吸附于磷酸铝(如至多10％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％或至多1％)。
本文所用术语″磷酸铝″包括磷酸铝、羟基磷酸铝和羟基磷酸硫酸铝。用于本发明的磷酸铝优选形式是羟基磷酸盐。
磷酸铝的PO4/Al3+摩尔比通常为0.3-1.2，优选0.8-1.2，更优选0.95+0.1。佐剂一般为无定形羟基磷酸铝，其中PO4/Al摩尔比为0.84-0.92，包括0.6mg Al3+/ml。磷酸铝通常是无定形的，尤其是羟基磷酸盐。磷酸铝通常是颗粒。抗原吸附后其颗粒的直径一般为0.5-20μm(如约5-10μm)。
磷酸铝的PZC与用磷酸根取代羟基的程度成反比，这种取代程度可随着用于通过沉淀制备盐的反应条件和反应物浓度而改变。也可通过改变溶液中游离磷酸根离子的浓度来改变PZC(更多磷酸根＝更酸性的PZC)，或通过加入缓冲液如组氨酸缓冲液(使PZC的碱性更强)。用于本发明的磷酸铝的PZC通常为5.0-7.0，更优选5.5-6.0，如约5.7。
优选以加入抗原的水性溶液形式使用磷酸铝(注：一般将磷酸铝水溶液称为″溶液″，但是从严格的物理化学观点来看，该盐不可溶，形成的是悬液)。优选将磷酸铝稀释到所需浓度，以保证在加入抗原组分之前是均一溶液。
在加入抗原之前Al3+的浓度通常为0-10mg/ml。优选浓度为2-6mg/ml。更优选的浓度为4-5mg/ml，如4.4mg/ml(对应的磷酸铝浓度是20mg/ml)。本发明疫苗中Al3+的最终浓度通常为0.1-2.0mg/ml。优选浓度为0.2-1.5mg/ml。更优选的浓度为0.3-1.0mg/ml。最优选的浓度约为0.6mg/ml。
用于制备本发明疫苗的磷酸铝溶液可(但不必须)含有缓冲液(如磷酸盐或组氨酸缓冲液)。磷酸铝溶液优选无菌和无热原。磷酸铝溶液可包含游离的水性磷酸根离子，如浓度为1.0-20mM，优选为5-15mM，更优选约为10mM。磷酸铝溶液也可包含氯化钠。氯化钠浓度优选为0.1-100mg/ml(如0.5-50mg/ml，1-20mg/ml，2-10mg/ml)，更优选约为3±1mg/ml。存在NaCl有助于在吸附于抗原之前正确测定pH。
虽然通常可以采用铝盐作为单独的佐剂，但本发明疫苗可包含的其它佐剂包括但不限于：
A.含矿物质的组合物
含矿物质的组合物适合用作本发明佐剂，包括无机盐，如铝盐和钙盐。发明包括无机盐如氢氧化物(例如羟基氧化物)、磷酸盐(例如羟磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等[例如参见参考文献65的第8和9章]或不同无机化合物的混合物，化合物采用任何合适的形式(例如凝胶、晶体、无定形等)，优选吸收。含矿物质的组合物可制成金属盐的颗粒[66]。
本发明疫苗组合物优选基本上不含氢氧化铝(如羟基氧化铝)。组合物中氢氧化铝的浓度通常小于100μg/ml，优选小于50μg/ml，更优选小于10μg/ml，最优选小于1μg/ml。具体说，Hib-偶联物抗原优选不吸附在氢氧化铝上。
可采用磷酸钙佐剂。
B.油乳剂
适合用作本发明佐剂的油乳剂组合物包括鲨烯-水乳剂，如MF59[参考文献65的第10章；也参见参考文献67](5％鲨烯、0.5％吐温80和0.5％Span85，用微流化机制成亚微米颗粒)。也可使用完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。
C.皂苷制剂[参考文献65的第22章]
皂苷制剂也能用作发明的佐剂。皂苷是甾醇糖苷和三萜糖苷的异种组，在广范围的植物种类的树皮、叶、茎干、根和甚至花中发现。来自皂树(Quillaiasaponaria)Molina树皮的皂苷作为佐剂已广泛研究。皂苷也能商业获得自丽花菝葜(Smilax ornata)(墨西哥菝葜)、满天星(Gypsophilla paniculata)(婚纱花)和肥皂草(Saponaria officianalis)(皂根)。皂苷佐剂制剂包括纯化制剂如QS21以及脂质制剂如ISCOM。QS21以StimulonTM出售。
皂苷组合物用HPLC和RP-HPLC纯化。已鉴定出使用这些技术特别纯化的部分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。皂苷优选是QS21。生成QS21的方法示于参考文献42。皂苷制剂也可包括甾醇，如胆固醇[69]。
皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为免疫刺激复合体(ISCOM)的独特颗粒[参考文献65的第23章]。ISCOM通常也包括磷脂如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷可用于ISCOM。ISCOM优选包括1种或多种QuilA、QHA和QHC。ISCOM进一步描述于参考文献69-71。ISCOM任选可不含另外的去垢剂[72]。
开发以皂苷为基础的佐剂的综述可见参考文献73和74。
D.病毒体和病毒样颗粒
病毒体和病毒样颗粒(VLP)也可用作发明的佐剂。这些结构一般包含1种或多种来自病毒的蛋白，病毒任选结合磷脂或用磷脂配制。它们通常不致病、不复制且一般不包含任何天然病毒基因组。病毒蛋白可重组生成或从全病毒中分离。这些适用于病毒体或VLP的病毒蛋白包括衍生自流感病毒(如HA或NA)、乙肝病毒(如核心或衣壳蛋白)、戊型肝炎病毒、麻疹病毒、辛德比斯病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、诺沃克病毒、人乳头瘤病毒、HIV、RNA-噬菌体、Qβ-噬菌体(如外被蛋白)、GA-噬菌体、fr-噬菌体、AP205噬菌体和ty(如反转录转座子Ty蛋白p1)的蛋白。VLP进一步讨论于参考文献75-80。病毒体进一步讨论于例如参考文献81。
E.细菌或微生物衍生物
适合用于发明的佐剂包括细菌或微生物衍生物，如肠细菌脂多糖(LPS)的非毒性衍生物、脂质A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素和其去毒衍生物。
LPS的非毒性衍生物包括单磷酰脂质A(MPL)和3-O-脱酰MPL(3d MPL)。3d MPL是3-O-脱酰单磷酰脂质A与4、5或6条酰化链的混合物。3-O-脱酰单磷酰脂质A的优选“小颗粒”形式示于参考文献82。这种“小颗粒”3d MPL小到足以经0.22μm膜无菌过滤[82]。其它非毒性LPS衍生物包括单磷酰脂质A模拟物，如氨烷基氨基葡糖苷磷酸衍生物，例如RC-529[83，84]。
脂质A衍生物包括来自大肠杆菌的脂质A衍生物，如OM-174。OM-174描述于例如参考文献85和86。
适合用作发明佐剂的免疫刺激性寡核苷酸包括含CpG基序(二核苷酸序列，含通过磷酸键连接鸟苷的未甲基化胞嘧啶)的核苷酸序列。含回文或聚(dG)序列的双链RNAs和寡核苷酸也显示是免疫刺激性的。
CpG可包括核苷酸修饰/类似物如硫代磷酸修饰且可以是双链或单链。参考文献87、88和89揭示可能的类似物取代，如用2’-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。CpG寡核苷酸的佐剂效果进一步讨论于参考文献90-95。
CpG序列可指向TLR9，如基序GTCGTT或TTCGTT[96]。CpG序列可对诱导Th1免疫反应特异，如CpG-A ODN，或它可对诱导B细胞反应更特异，如CpG-BODN。CpG-A和CpG-B ODN讨论于参考文献97-99。CpG优选是CpG-A ODN。
优选构建CpG寡核苷酸，使5’末端易接受受体识别。2种CpG寡核苷酸序列可任选在其3’末端附着以形成“免疫聚体”(immunomers)。参见例如参考文献96和100-102。
细菌ADP-核糖基化毒素和其去毒衍生物可用作发明的佐剂。蛋白优选获得自大肠杆菌(大肠杆菌热不稳定性肠毒素“LT”)、霍乱(“CT”)或百日咳(“PT”)。使用去毒ADP-核糖基化毒素作为粘膜佐剂描述于参考文献103且用作肠胃外佐剂描述于参考文献104。毒素或类毒素优选以全毒素形式，包括A和B亚基。A亚基优选包含去毒突变；B亚基优选不突变。佐剂优选是去毒LT突变体，如LT-K63、LT-R72和LT-G192。使用ADP-核糖基化毒素和其去毒衍生物，特别是LT-K63和LT-R72作为佐剂可见参考文献105-112。关于氨基酸取代的数字参考优选基于参考文献113所列ADP-核糖基化毒素的A和B亚基排列，参考文献113特别全部纳入本文供参考。
F.人免疫调节剂
适合用作发明佐剂的人免疫调节剂包括细胞因子如白介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[114]等)[115]、干扰素(例如干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。
G.生物粘合剂和粘膜粘合剂
生物粘合剂和粘膜粘合剂也可用作发明的佐剂。合适的生物粘合剂包括酯化透明质酸微球体[116]或粘膜粘合剂如聚(丙烯酸)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素的交联衍生物。壳聚糖和其衍生物也可用作发明的佐剂[117]。
H.微粒
微粒也可用作发明的佐剂。优选从可生物降解和无毒性物质(如聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己酸内酯等)材料形成的颗粒(即～100nm到～150nm直径的颗粒，更优选～200nm到～30μm直径，最优选～500nm到～10μm直径)，优选具有聚交酯聚乙交酯共聚物，任选处理的以具有带负电的表面(例如用SDS)或带正电的表面(例如用阳离子去垢剂，如CTAB)。
I.脂质体(参考文献65的第13和14章)
适合用作佐剂的脂质体制剂的例子描述于参考文献118-120。
J.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂
适用于发明的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[121]。这种制剂进一步包括组合辛苯昔醇的聚氧乙烯山梨聚糖酯表面活性剂[122]以及组合至少1种另外非离子表面活性剂如辛苯昔醇的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂[123]。优选的聚氧乙烯醚选自下组：聚氧乙烯-9-月桂醚(laureth9)、聚氧乙烯-9-硬脂基醚、聚氧乙烯-8-硬脂基醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。
K.聚磷腈(PCPP)
PCPP制剂描述于例如参考文献124和125。
L.胞壁酰肽
适合用作发明佐剂的胞壁酰肽的例子包括N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)。
M.咪唑喹诺酮(imidazoquinolone)化合物
适合用作发明佐剂的咪唑酮化合物的例子包括咪喹莫特和其同源物(例如“瑞喹莫德3M”)，它们进一步描述于参考文献126和127。
发明也可包括1种或多种上面鉴定的佐剂的组合。例如，下列佐剂组合物能用于发明：(1)皂苷和水包油乳剂[128]；(2)皂苷(例如QS21)+非毒性LPS衍生物(例如3dMPL)[129]；(3)皂苷(例如QS21)+非毒性LPS衍生物(例如3dMPL)+胆固醇；(4)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IL-12(任选+甾醇)[130]；(5)3dMPL与例如QS21和/或水包油乳剂的组合[131]；(6)SAF，含10％鲨烯、0.4％吐温80TM、5％普朗尼克(Pluronic)-嵌段共聚物L121和thr-MDP，微流化成亚微米乳剂或涡旋产生较大粒度乳剂；(7)RibiTM佐剂体系(RAS)(Ribi Immunochem)，含2％鲨烯、0.2％吐温80和1种或多种来自单磷酰脂A(MPL)、海藻糖二霉菌酸(TDM)和细胞壁骨架(CWS)的细菌细胞壁成分，优选MPL+CWS(DetoxTM)；(8)1种或多种无机盐(如铝盐)+非毒性LPS衍生物(如3dMPL)。
其它用作免疫刺激剂的物质示于参考文献65的第7章。
其它抗原
本发明组合物包含D、T、P和Hib抗原。它们也可包含其它抗原，如：
-脑膜炎奈瑟球菌血清组A、C、W135和/或Y的糖抗原，如参考文献132中公开的血清组C的寡糖，或参考文献133的寡糖。该疫苗优选含有血清组A、C、W135和Y的2、3或4的偶联物。
-肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的糖抗原[如参考文献134-136]。
-甲肝病毒抗原，如灭活病毒[如137，138]。
-乙肝病毒抗原，如表面抗原和/或核心抗原[如138，139]。
-从脑膜炎奈瑟球菌血清组B制备的外膜囊泡(OMV)或疱(bleb)，如参考文献140、141、142、143等所述。
-脑膜炎奈瑟球菌血清组B的蛋白抗原，如参考文献144-150所述，尤其优选蛋白′287′(见下)和衍生物(如′ΔG287′)。
-脊髓灰质炎抗原[如151，152]，如IPV。
组合物可包含这些其它抗原中的一种或多种。各抗原的浓度一般是至少1μg/ml。通常，任何给定抗原的浓度都足以引发对抗该抗原的免疫应答。优选通过组合并不去除单个糖抗原的保护效力，但实际上可能降低免疫原性(如ELISA滴度)。
当采用糖抗原时，优选将其偶联于运载体蛋白以增强免疫原性。
作为在本发明组合物中采用蛋白质抗原的替代方式，可采用编码该抗原的核酸[如参考文献153-161]。因此，本发明组合物的蛋白组分可被编码该蛋白的核酸取代(优选DNA如质粒形式的DNA)。类似地，本发明组合物可包含模拟糖抗原的蛋白如模拟表位[162]或抗-独特型抗体。它们可取代单独的糖组分，或可补充糖组分。例如，疫苗可包含MenC[163]或MenA[164]荚膜多糖的肽模拟物以取代糖本身。
当本发明疫苗包括乙肝表面抗原(′HBsAg′)时，可用两种方式制备此抗原。第一种方法包括从慢性乙肝载体的血浆中纯化颗粒形式的抗原，因为在HBV感染期间大量HbsAg在肝中合成并释放到血流中。第二种方式是优选方式，它包括通过重组DNA方法表达蛋白。优选通过酿酒酵母表达来制备HBsAg。可将HbsAg基因注入质粒中，可用启动子如′GAPDH′启动子(来自甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因)控制质粒中HbsAg基因的表达。可在合成培养基中培养该酵母。然后，可采用包括以下步骤的方法纯化HbsAg：例如沉淀、离子交换层析和超滤。纯化后，可对HbsAg进行透析(如用半胱氨酸)。可使用颗粒形式的HBsAg。
当本发明疫苗包括脊髓灰质炎抗原时，优选采用三种脊髓灰质炎病毒抗原-1型脊髓灰质炎病毒(如Mahoney毒株)、2型脊髓灰质炎病毒(如MEF-1毒株)和3型脊髓灰质炎病毒(如Saukett毒株)。可在细胞培养物中培养脊髓灰质炎病毒。优选的培养物采用VERO细胞系，该细胞系是衍生自猴肾的连续细胞系。可方便地培养VERO细胞作为微运载体。在病毒感染前和感染期间VERO细胞培养物可包括采用来自牛的材料，如小牛血清，该材料应该获自未患牛海绵状脑炎(BSE)的来源。培养物也可包括诸如乳清蛋白水解产物等材料。培养后，可用诸如超滤、透析和层析等技术纯化病毒粒子。在给予患者之前，必须灭活病毒，可通过甲醛处理达到这个目的。优选单独地培养、纯化和灭活病毒，然后混合它们以产生大量混合物，用于加入吸附的白喉和破伤风抗原中。
本发明疫苗中的抗原应该以“免疫有效量”存在，即以单剂量或一系列剂量的一部分给予个体该量能有效治疗或预防疾病。该量依待治疗个体的健康和身体状况、年龄、待治疗个体的分类组(如人、灵长类等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需保护的程度、疫苗的制剂、主治医生对医学状况的评价和其它相关因素而不同。预计该量属于由常规试验确定的相对宽的范围。剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案(如包括加强剂量)。
本发明疫苗的非免疫组分
除了上述抗原和佐剂组分以外，本发明疫苗一般包含一种或多种′药学上可接受的运载体′，包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何运载体。合适的运载体一般是大且代谢慢的大分子如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、蔗糖[165]、海藻糖[166]、乳糖和脂质聚集体(如油珠或脂质体)。本领域普通技术人员熟知这些运载体。疫苗也可含有稀释剂，如水、盐水、甘油等。此外，也可存在辅助物质，如湿润剂或乳化剂、pH缓冲物质等。无菌无热原的磷酸盐缓冲生理盐水是典型的运载体。对药学上可接受的赋形剂的充分讨论参见参考文献167。
本发明组合物是水性形式即溶液或悬液。这种类型的液体制剂可以使组合物直接以其包装形式给药而无需用水性介质重建，因此这种液体制剂是理想的注射剂。可将组合物装在药瓶中，或者可装在预先充满的注射器中。注射器可装有或不装针头。注射器将包含单剂量的组合物，而药瓶可包含单剂量或多剂量。
本发明液体疫苗也适合用于重建冻干形式的其它疫苗。当准备以此种临用前重建的形式应用疫苗时，本发明提供了一种药盒，该药盒可包括两个药瓶，或可包括一个预先充满的注射器和一个药瓶，在注射前用注射器内容物活化药瓶内容物。
可将本发明疫苗包装成单剂形式或多剂形式。对于多剂形式，药瓶比预先充满的注射器更优选。可常规地建立有效剂量体积，但注射组合物的人用剂量的体积一般为0.5ml。
本发明疫苗的pH通常为6.0-8.0，更优选6.3-6.9如6.6+0.2。优选在此pH下缓冲疫苗。可用缓冲液维持稳定的pH。如果组合物包含氢氧化铝盐，优选采用组氨酸缓冲液[168]。该组合物可以是无菌和/或无热原的。磷酸铝和全细胞百日咳抗原不适合过滤除菌，因此当本发明组合物包含这些成分之一时，优选用高压蒸气法对本发明组合物灭菌和/或采用生产中无菌的组分。
本发明组合物可与人体等渗。
本发明疫苗可包含抗微生物剂，特别是包装在多剂形式中时。许多抗微生物剂是基于汞的(如硫柳汞)，但优选避免采用含汞防腐剂，如可采用2-苯氧基乙醇。防腐剂优选以低水平(如0.01体积％)存在。防腐剂可以是外源性加入的和/或可以是混合形成该组合物的大量抗原的组分(如存在的百日咳抗原作为防腐剂)。
本发明疫苗可包含去污剂如吐温(聚山梨酸酯)，如吐温80。去污剂通常以低水平存在，如＜0.01％。
本发明疫苗可包含钠盐(如氯化钠)，以产生张力。该组合物可包含氯化钠。该组合物中氯化钠的浓度优选0.1-100mg/ml(如1-50mg/ml、2-20mg/ml、5-15mg/ml)，更优选10±2mg/ml NaCl如约9mg/ml。
本发明疫苗通常包含缓冲液。一般是磷酸盐或组氨酸缓冲液。
本发明疫苗的溶液中可包含游离的磷酸根离子(如通过采用磷酸盐缓冲液)，以帮助抗原不吸附。本发明组合物中游离磷酸根离子的浓度通常为0.1-10.0mM，优选为1-5mM，更优选约2.5mM。
包装本发明疫苗
本发明疫苗可包装到多种类型的容器中，如药瓶、注射器等。
对于需要重建冻干Hib组分的现有DTP-Hib疫苗，将DTP抗原水溶液从第一个密封药瓶中吸入注射器，然后注入含有冻干物质的第二个密封药瓶中。然后将重建的疫苗吸入同一注射器中，给予患者。相反，本发明疫苗中的Hib偶联物在水溶液中稳定，不需要冻干。因此，本发明能够提供装有可刺穿密封物并含有DTP-Hib疫苗的药瓶，其中可刺穿封口未被刺穿过。类似地，本发明能够提供含有本发明疫苗的密封容器。需要重建冻干Hib组分的现有DTP-Hib疫苗必须包装到两个独立容器中。相反，本发明可以提供将已经包含DTP-Hib抗原的形式的本发明疫苗注入容器的方法。注入优选不通过容器中的密封物。
类似地，在制造过程中对疫苗包装进行标记，然后当它们是分开的DTP和Hib形式时标记现有疫苗DTP-Hib，而本发明可标记最终DTP-Hib形式的疫苗。
而且，将现有重建的DTP-Hib疫苗以DTP-Hib形式从其容器中抽出，但它们不是以这种形式注入容器的。然而，根据本发明，这种DTP-Hib疫苗可以混合的DTP-Hib形式注入和抽出。注入和抽出之间的时间可以至少为n周，其中n选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多。抽出通常要通过针头(如无菌递送装置如注射器的针头)，但注入容器中通常是在生产线上而非递送装置中进行。
制备本发明疫苗
本发明疫苗含有至少DTP-Hib抗原，因此，它们的制备包括混合这四种抗原。不像现有重建的DTP-Hib疫苗的制备那样，本发明可提供不包括冻干Hib偶联物的步骤的制备方法。类似地，本发明能够提供不包括将混合的DTP抗原与Hib抗原分开包装的步骤的制备方法。
在制备期间，加入的抗原通常未吸附在铝盐上(即它们不是‘预吸附的’)。因此，对于加入的各个抗原来说，优选不多于5重量％(优选为0)已经吸附于铝盐(如至多4％、至多3％或至多2％)。然而，在一些情况下，可加入预吸附的抗原。
制备大量本发明疫苗的方法一般是将Hib组分加入D、T和P组分的混合物中即在加入Hib组分之前混合DTP组分。此混合顺序可在使得加入Hib组分之前调节组合物的离子强度和/或pH(如pH＜7)，以防止吸附于可能存在的任何铝佐剂。
优选在15℃-30℃(如19℃-27℃，或23±4℃)制备本发明疫苗。
给予本发明疫苗
本发明提供了在哺乳动物中产生抗体应答的方法，该方法包括将本发明疫苗给予该哺乳动物。给予疫苗可以是预防性目的(即预防感染)或治疗性目的(即治疗感染后的疾病)。本发明提供了在哺乳动物中产生免疫应答的方法，该方法包括给予有效量的本发明疫苗的步骤。该免疫应答优选为保护性，优选涉及抗体。该方法可产生加强应答。
该哺乳动物优选为人。当该疫苗用于预防性目的时，人优选为儿童(如幼儿或婴儿)或青少年；当该疫苗用于治疗性目的时，人优选为成人。用于儿童的疫苗也可给予成人，(例如)以评价安全性、剂量、免疫原性等。
本发明也提供用作药物的本发明组合物。该药物优选能够在哺乳动物中产生免疫应答(即它是免疫原性组合物)，更优选为疫苗。
本发明也提供至少白喉、破伤风、百日咳和B型流感嗜血杆菌(′Hib′)抗原在生产用于免疫患者的组合疫苗中的应用，其中(a)保护性抵御Hib的抗原是Hib荚膜糖的偶联物；(b)疫苗中Hib偶联物的浓度＜15μg/ml；(c)生产不包括冻干Hib偶联物。
这些应用和方法优选用于预防和/或治疗白喉杆菌(C.diphtheriae)、破伤风杆菌(C.tetani)、百日咳杆菌(B.pertussis)和流感嗜血杆菌的感染和由这些感染引起的疾病，如预防白喉、破伤风、百日咳、细菌性脑膜炎等。
检测治疗性治疗效果的一种方式包括在给予本发明组合物后监测细菌感染。检测预防性治疗效果的一种方式包括在给予该组合物后监测对抗原的免疫应答。可通过将本发明组合物给予受试对象(如12-16月龄的儿童，或动物模型[169])，然后测定标准免疫学参数来测定它们的免疫原性。通常在给予组合物约4周后测定这些免疫应答，并与给予组合物之前测定的值作比较。除了评价在患者、标准动物和体外模型中的实际保护效果，评价Hib和DTP疫苗效果的保护相关性也是熟知的。
通常将本发明组合物直接给予患者。可通过胃肠道外注射(如皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或给予组织间隙)，或通过直肠、口腔、阴道、局部、透皮、鼻内、眼内、耳内、肺部或其它粘膜给药完成直接递送。优选肌肉内给予股或上肢。可通过针头(如皮下注射器针头)进行注射，但也可采用无针注射。肌肉内剂量一般是0.5ml。可用本发明引发全身性免疫和/或粘膜免疫。
剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。多剂量可用于初次免疫方案和/或加强免疫方案。初次剂量方案后，可进行加强剂量方案。可常规地测定初敏剂量之间的合适时间(如4-16周)以及初敏和加强免疫之间的合适时间。
细菌感染会影响身体的各个区域，因此本发明组合物可制备成各种形式。例如，该组合物可制备成液体溶液或悬液的可注射剂。可将该组合物制备成用于以细粉或喷雾肺部给药的(如)吸入剂。可将该组合物制备成栓剂或阴道栓剂。可将该组合物制备成用于鼻内、耳内或眼内给药的(如)喷雾剂、滴剂、凝胶剂或粉末剂[如参考文献170和171]。已经报道了成功的Hib多糖[172]和DTP疫苗[173，174]的鼻内给药。
概要
术语“含有”包括“包含”以及“由...组成”，例如“含有”X的组合物可仅由X组成或可包含其它的物质，例如X+Y。
与数值x相关的术语“约”表示，例如x±10％。
术语“基本上”不排除“完全”，例如“基本上不含”Y的组合物可完全不含Y。“基本上”可视需要从本发明定义中省去。
附图简要说明
图1显示抗-PRP GMT和疫苗组A、B、C和D的95％置信区间。
实施本发明的方式
制备了四种DTwP-Hib疫苗制剂，其不同之处仅在于Hib-CRM197偶联物的剂量。疫苗制备成0.5ml剂量，其抗原组成如下：
主要生产方法如下：从wfi开始；加入磷酸铝佐剂；加入D组分；加入T组分；加入wP组分；加入NaCl；检测和调节pH；加入Hib组分。与参考文献175所述相反，Hib组分不吸附于佐剂。
稳定性
进行了两项稳定性研究：一项是在2-8℃的正常贮存条件下贮存2年，另一项是在37℃的加速条件下贮存14天。竖直或倒转位置保贮存后测定疫苗。通过测定pH和游离糖评价稳定性。
第一项研究的结果如下：
加速稳定性研究的结果如下：
因此，该疫苗在延长时间内稳定。以相同的时间量程测定吸附性，Hib偶联物在贮存期间保持不吸附。
临床测试
共征集了261名婴儿，在双盲试验中随机分组接受四种疫苗之一，以评价安全性和免疫原性(参考：参考文献6、8和9中的研究，它们是部分盲法或开放式试验)。征集妊娠37周以上出生、出生体重至少2500g并适合局部EPI的三月龄婴儿，以66∶65∶65∶65A∶B∶C∶D比例随机分组，在3、4和5月龄接受三次单独的肌肉内给药，给予以上疫苗之一。根据局部EPI，对象在2、4和6月龄平行接受口服脊髓灰质炎疫苗(OPV)。
征集时的平均年龄为94(范围69-108)天，4个疫苗组在性别、种族、体重和身高分布上没有差异。按月随访患者的注射后反应和副反应。安全性分析中共包括260名对象(四个疫苗组各自65名)，免疫原性分析中包括251名对象(组A61名，组B和C各64名，组D62名)。9名对象没有完成该研究，因为他们的父母/法定监护人在研究完成之前收回了他们的同意(组A5名对象，组B1名对象，组D3名对象)。
在基线和第三次给药一个月后获得血样。测定抗-PRP、抗-百日咳、抗-白喉和抗-破伤风抗体。用由FDA ELISA法修饰而来的ELISA测定IgG抗-PRP抗体[176]。用ELISA定量IgG抗-白喉毒素抗体和IgG抗-破伤风毒素抗体。还用ELISA测定百日咳杆菌的血清学标记(抗-百日咳杆菌黏附素和抗-凝集原2-3)。
安全性和免疫原性
在每次疫苗给药30分钟后，由研究人员监测对象。要求父母在每次注射后7天在日记上记录每天的直肠温度以及局部和全身反应。此外，研究人员在每次疫苗接种后第二天和第七天主动电话联系父母/法定监护人，以获得副作用的详细情况。在整个研究期间严格检查和记录副作用的出现，或严重副作用和需要医生访问的情况和/或任何医学情况。安全性分析中包括接受至少一次疫苗接种的对象。
大部分局部和全身反应是轻微和暂时的。最常见的是局部反应引起的压痛、红斑和硬结，以及全身反应引起的烦躁、嗜睡和非正常啼哭：
| A：1.25μg | B：2.5μg | C：5μg | D：10μg | |
| 局部反应 | ||||
| 压痛-任何(当移动注射肢时啼哭) | 48(74％)16(25％) | 53(82％)19(29％) | 52(80％)16(25％) | 49(75％)15(23％) |
| 红斑-任何(＞50mm) | 31(48％)6(9％) | 29(45％)5(8％) | 37(57％)7(11％) | 31(48％)4(6％) |
| 硬结-任何(＞50mm) | 27(42％)3(5％) | 21(32％)4(6％) | 25(38％)6(9％) | 24(37％)3(5％) |
| 全身反应 | ||||
| 皮疹 | 3(5％) | 4(6％) | 3(5％) | 3(5％) |
| 饮食习惯改变 | 20(31％) | 16(25％) | 26(40％) | 27(42％) |
| 嗜睡 | 41(63％) | 49(75％) | 44(68％) | 39(60％) |
| 非正常啼哭 | 29(45％) | 23(35％) | 32(49％) | 29(45％) |
| 持续啼哭 | 10(15％) | 8(12％) | 10(15％) | 7(11％) |
| 烦躁 | 47(72％) | 53(82％) | 50(77％) | 49(75％) |
| 呕吐 | 5(8％) | 6(9％) | 9(14％) | 7(11％) |
| 腹泻 | 17(26％) | 24(37％) | 22(34％) | 18(28％) |
| 其它 | ||||
| 直肠温度≥38.5℃-＜40.5℃≥40.5℃ | 14(22％)0(0％) | 21(32％)0(0％) | 10(15％)0(0％) | 12(18％)0(0％) |
| 使用止痛药/退热药 | 33(51％) | 43(66％) | 28(43％) | 33(51％) |
在这4个疫苗组中没有观察到显著性差异，解决了所有疫苗接种后反应，没有后遗症。未报道与研究疫苗相关的严重副作用。
免疫原性
抗-PRP血清转化率(％血清转化患者)如下：
通过查看(a)抗百日咳杆菌黏附素和抗-凝集原2-3应答的增加和(b)GMT评价抗-百日咳血清转化率。结果(％患者)如下：
| 1.25μg | 2.5μg | 5μg | 10μg | |
| 抗百日咳杆菌黏附素 | ||||
| ％增加2倍的患者 | 91％ | 95％ | 88％ | 94％ |
| ％增加4倍的患者 | 80％ | 83％ | 78％ | 89％ |
| 抗百日咳杆菌黏附素GMT(μg/ml) | 19 | 21 | 24 | 20 |
| 抗凝集原2-3 |
| ％增加2倍的患者 | 81％ | 81％ | 83％ | 80％ |
| ％增加4倍的患者 | 70％ | 80％ | 78％ | 71％ |
| 抗凝集原2-3GMT(μg/ml) | 87 | 77 | 66 | 76 |
抗-白喉和抗-破伤风GMT如下：
| 1.25μg | 2.5μg | 5μg | 10μg | |
| 抗白喉GMT(μg/ml) | 1.33 | 1.65 | 1.49 | 4.70 |
| 抗破伤风GMT(μg/ml) | 4.89 | 5.10 | 5.24 | 5.16 |
因此，在四个疫苗组中抗PRP滴度≥0.15μg/mL的对象比例相似，但组C和D的抗PRP滴度≥1.0μg/mL的对象比例(分别为97％和95％)高于组A和B(分别为90％和88％)。抗-PRP GMT显示出明显的剂量依赖效应，组A(6.94μg/ml)和B(7.82μg/ml)相似，组C(17μg/mL)和D(18μg/mL)相似，但与C和D组相比，组A和B显著较低(图1)。
第三次接种疫苗1个月后，这四个疫苗组各组中的所有对象血清转化为针对白喉和破伤风(抗体水平≥0.1IU/mL)。在这四个疫苗组中没有检测到GMT差异。
在这四个疫苗组中，没有观察到与基线相比抗百日咳杆菌黏附素和抗凝集原2-3抗体增加2倍或4倍的对象分数的差异。在这四个疫苗组中GMT也相似。
结论
分剂量为5、2.5或1.25μgHib-偶联物/剂量的DTwPHib疫苗制剂与参比10μg剂量的免疫原性相同，血清转化率也是如此。用10μg或5μg偶联物的制剂引发了高水平和相同水平的抗PRP GMT。虽然2.5μg和1.25μg偶联物/剂量的制剂引发的抗-PRP GMT水平较低，但它们也有足够的免疫原性。
因此，本研究证实了在含有DTP疫苗的合适剂型中Hib抗原量可降低到低至1.25μg/剂量，而不会影响其它疫苗组分的保护效果。
DTP-Hib疫苗的所有四种剂型都是安全的，并且所有疫苗组分都有免疫原性。就抗PRP血清保护速率而言，这四种剂型的免疫原性对于短期(滴度≥0.15μg/mL)和长期(滴度≥1μg/mL)来说都是相当的。含有5μg偶联物的剂型与含有10μg的参比剂型的免疫原性相同，这两种剂型引起的抗PRP GMT特别高(17和18μg/mL)。与采用分剂量Hib疫苗的其它研究中观察到的免疫应答相比，含有1.25和2.5μg偶联物的剂型具有高免疫原性[6，8，9]。
其它信息可参见参考文献177。
应理解，仅以举例的方式描述了本发明，可在保持在本发明范围和精神内的情况下进行修改。
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Claims (50)
1.一种用于保护对象以至少抵御白喉(′D′)、破伤风(′T′)、百日咳(′P′)和B型流感嗜血杆菌(′Hib′)的抗原的组合疫苗，其中：(a)用于保护性抵御Hib的抗原是Hib荚膜糖的偶联物；(b)所述疫苗中该Hib偶联物的浓度＜15μg/ml；(c)所述Hib偶联物从未被冻干过；和(d)不多于15重量％的Hib-偶联物应吸附于磷酸铝。
2.如权利要求1所述的的组合疫苗，所述疫苗不含硫酸铝钾佐剂。
3.如权利要求1所述的疫苗，至多5重量％的Hib-偶联物应吸附于磷酸铝。
4.如权利要求1所述的疫苗，至多1重量％的Hib-偶联物应吸附于磷酸铝。
5.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述白喉抗原包含白喉类毒素，所述破伤风抗原包含破伤风类毒素，所述百日咳抗原包含细胞百日咳组分。
6.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述偶联物包含CRM197运载体、破伤风类毒素运载体或脑膜炎奈瑟球菌运载体的外膜复合物。
7.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述偶联物包含Hib聚核糖基核糖醇磷酸的寡糖片段。
8.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述组合疫苗还包含乙肝病毒的表面抗原。
9.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述组合疫苗还包含脊髓灰质炎抗原。
10.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述组合疫苗还包含脑膜炎奈瑟球菌血清组A、C、W135和/或Y的糖抗原。
11.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述偶联物的糖：蛋白比是1∶5-5∶1。
12.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述组合疫苗的抗-PRP抗体浓度≥0.15μg/ml。
13.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述白喉类毒素吸附在磷酸铝上。
14.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，用于在哺乳动物中产生抗体应答。
15.一种装有可刺穿密封物并含有组合疫苗的药瓶，所述组合疫苗包含用于保护对象以至少抵御白喉、破伤风、百日咳和B型流感嗜血杆菌(′Hib′)的抗原，其中所述保护性抵御Hib的抗原是Hib荚膜糖的偶联物，其中(a)所述疫苗中Hib偶联物的浓度＜15μg/ml，(b)药瓶的可刺穿密封物未被刺穿过；(c)所述Hib偶联物从未被冻干过；和(d)不多于15重量％的Hib-偶联物应吸附于磷酸铝。
16.如权利要求15所述的药瓶，至多5重量％的Hib-偶联物应吸附于磷酸铝。
17.如权利要求15所述的药瓶，至多1重量％的Hib-偶联物应吸附于磷酸铝。
18.如权利要求15所述的药瓶，其特征在于，所述白喉抗原包含白喉类毒素，所述破伤风抗原包含破伤风类毒素，所述百日咳抗原包含细胞百日咳组分。
19.如权利要求15所述的药瓶，其特征在于，所述偶联物包含CRM197运载体、破伤风类毒素运载体或脑膜炎奈瑟球菌运载体的外膜复合物。
20.如权利要求15所述的药瓶，其特征在于，所述偶联物包含Hib聚核糖基核糖醇磷酸的寡糖片段。
21.如权利要求15所述的药瓶，其特征在于，所述组合疫苗还包含乙肝病毒的表面抗原。
22.如权利要求15所述的药瓶，其特征在于，所述组合疫苗还包含脊髓灰质炎抗原。
23.如权利要求15所述的药瓶，其特征在于，所述组合疫苗还包含脑膜炎奈瑟球菌血清组A、C、W135和/或Y的糖抗原。
24.如权利要求15所述的药瓶，其特征在于，所述偶联物的糖∶蛋白比是1∶5-5∶1。
25.如权利要求15所述的药瓶，其特征在于，所述组合疫苗的抗-PRP抗体浓度≥0.15μg/ml。
26.如权利要求15所述的药瓶，其特征在于，所述白喉类毒素吸附在磷酸铝上。
27.一种含有组合疫苗的密封容器，所述组合疫苗包含用于保护对象以至少抵御白喉、破伤风、百日咳和B型流感嗜血杆菌(′Hib′)的抗原，其中(a)所述保护性抵御Hib的抗原是Hib荚膜糖的偶联物，(b)所述疫苗中Hib偶联物的浓度＜15μg/ml；(c)所述Hib偶联物从未被冻干过；和(d)不多于15重量％的Hib-偶联物应吸附于磷酸铝。
28.如权利要求27所述的容器，至多5重量％的Hib-偶联物应吸附于磷酸铝。
29.如权利要求27所述的容器，至多1重量％的Hib-偶联物应吸附于磷酸铝。
30.如权利要求27所述的容器，其特征在于，所述白喉抗原包含白喉类毒素，所述破伤风抗原包含破伤风类毒素，所述百日咳抗原包含细胞百日咳组分。
31.如权利要求27所述的容器，其特征在于，所述偶联物包含CRM197运载体、破伤风类毒素运载体或脑膜炎奈瑟球菌运载体的外膜复合物。
32.如权利要求27所述的容器，其特征在于，所述偶联物包含Hib聚核糖基核糖醇磷酸的寡糖片段。
33.如权利要求27所述的容器，其特征在于，所述组合疫苗还包含乙肝病毒的表面抗原。
34.如权利要求27所述的容器，其特征在于，所述组合疫苗还包含脊髓灰质炎抗原。
35.如权利要求27所述的容器，其特征在于，所述组合疫苗还包含脑膜炎奈瑟球菌血清组A、C、W135和/或Y的糖抗原。
36.如权利要求27所述的容器，其特征在于，所述偶联物的糖∶蛋白比是1∶5-5∶1。
37.如权利要求27所述的容器，其特征在于，所述组合疫苗的抗-PRP抗体浓度≥0.15μg/ml。
38.如权利要求27所述的容器，其特征在于，所述白喉类毒素吸附在磷酸铝上。
39.一种包含用于保护对象以至少抵御白喉、破伤风、百日咳和B型流感嗜血杆菌(′Hib′)的抗原的组合疫苗的制备方法，其中(a)用于保护性抵御Hib的抗原是Hib荚膜糖的偶联物；(b)所述疫苗中Hib偶联物的浓度＜15μg/ml；(c)所述Hib偶联物从未被冻干过；和(d)不多于15重量％的Hib-偶联物应吸附于磷酸铝，其特征在于该方法不包括以下步骤的一个或两个：(a)冻干Hib偶联物抗原的步骤，(b)将白喉、破伤风和百日咳抗原包装到与Hib偶联物抗原分开的混合形式中的步骤。
40.如权利要求39所述的方法，至多5重量％的Hib-偶联物应吸附于磷酸铝。
41.如权利要求39所述的方法，至多1重量％的Hib-偶联物应吸附于磷酸铝。
42.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述白喉抗原包含白喉类毒素，所述破伤风抗原包含破伤风类毒素，所述百日咳抗原包含细胞百日咳组分。
43.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述偶联物包含CRM197运载体、破伤风类毒素运载体或脑膜炎奈瑟球菌运载体的外膜复合物。
44.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述偶联物包含Hib聚核糖基核糖醇磷酸的寡糖片段。
45.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述组合疫苗还包含乙肝病毒的表面抗原。
46.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述组合疫苗还包含脊髓灰质炎抗原。
47.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述组合疫苗还包含脑膜炎奈瑟球菌血清组A、C、W135和/或Y的糖抗原。
48.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述偶联物的糖∶蛋白比是1∶5-5∶1。
49.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述组合疫苗的抗-PRP抗体浓度≥0.15μg/ml。
50.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述白喉类毒素吸附在磷酸铝上。
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| Jacob Amir et al.Immunogenicity and safety of a liquid combination ofDT-PRP-T vs lyophilized PRP-T reconstituted with DTP.Vaccine15 2.1997,15(2),摘要. |
| Jacob Amir et al.Immunogenicity and safety of a liquid combination ofDT-PRP-T vs lyophilized PRP-T reconstituted with DTP.Vaccine15 2.1997,15(2),摘要. * |
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