CN101374549A

CN101374549A - 缀合疫苗

Info

Publication number: CN101374549A
Application number: CNA2006800529748A
Authority: CN
Inventors: J·普尔曼
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2005-12-23
Filing date: 2006-12-22
Publication date: 2009-02-25
Also published as: GB0526412D0; ZA200805298B

Abstract

本发明提供抗脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、肺炎球菌和DTPa/w的疫苗。具体地说，本发明提供基于来自多种脑膜炎球菌和/或肺炎球菌血清群的缀合荚膜糖的疫苗。本发明还提供采用这些疫苗中的两种或多种免疫人类患者的疫苗给药程序。

Description

缀合疫苗

本文引用的所有文件全文纳入作为参考。

技术领域

本发明涉及针对脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)和肺炎链球菌的疫苗。具体地说，本发明涉及以多种脑膜炎球菌血清群和/或肺炎链球菌血清群的缀合荚膜糖为基础的疫苗。

背景技术

基于生物体的荚膜多糖，已鉴定出12种脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)血清群(A、B、C、H、I、K、L、29E、W135、X、Y和Z)。A群是最常涉及撒哈拉沙漠以南非洲的流行病的病原体。血清群B和C引致美国和大多数发达国家的绝大多数病例。血清群W135和Y引致美国和发达国家的剩余病例。

多年前就己经知道血清群A、C、Y和W135的荚膜多糖四价疫苗[1，2]。尽管该疫苗在青少年和成人中有效，但其诱导不良免疫应答和短期保护，且不能用于婴儿[例如参考文献3]，因为多糖是诱导不能被加强的弱免疫应答的T细胞非依赖性抗原。该疫苗中的多糖是未缀合的[4]。

抗血清群C的缀合疫苗已获人用批准，包括Menjugate^TM[5]、Meningitec^TM和NeisVac-C^TM。已知血清群A+C的缀合物的混合物[6-8]，血清群A+C+W135+Y的缀合物的混合物己有报道[9-13]。

尽管脑膜炎球菌缀合物为人所熟知，但它们还不适用于现有的儿科免疫接种程序，该程序对于发达国家通常包括：出生时接种乙肝疫苗；并在2个月时开始接种白喉/破伤风/百日咳(D-T-P)的每一种、乙型流感嗜血杆菌(H.influenzae)(Hib)缀合物、于2个月接种灭活的脊髓灰质炎病毒和肺炎链球菌缀合物。

然而，当将缀合疫苗加入现有免疫接种程序时，必须解决载体诱导的表位抑制问题(或通常所知的“载体抑制”)，特别是由载体初免产生的抑制。“载体抑制”是载体蛋白预免疫动物阻止其以后引发针对该载体上存在的新抗原性表位的免疫应答的现象[14]。

如参考文献15所报道，当几种疫苗抗原含有相同的蛋白质组分(用作缀合物中的免疫原和/或载体蛋白)时，则那些抗原之间存在相互干扰的潜力。在参考文献15中，针对与破伤风类毒素(Tt)载体缀合的抗原的免疫应答通过针对Tt的预先存在的免疫性来抑制。

参考文献16报道了当Hib缀合物的载体与D-T-P疫苗的破伤风抗原相同时联用D-T-P疫苗与Hib缀合疫苗是如何受到不利影响的。作者得出结论：当引入包含多种缀合物的疫苗时，应考虑由共有蛋白载体的相互干扰产生的这种“载体抑制”现象。

与参考文献15和16相反，参考文献17报道了用破伤风类毒素初免对于抗后给予的Hib-Tt缀合物的免疫应答无负面影响，但在具有母体获得性抗-Tt抗体的患者中观察到抑制作用。然而，在参考文献18中，报道了基于Tt的肽缀合物在因破伤风接种而已存在抗Tt抗体的患者中有“表位抑制”作用。

在参考文献19中，提示具有CRM197(白喉毒素的已解毒突变体)作为载体的缀合物在以前还未接受作为疫苗一部分(例如作为D-T-P或D-T疫苗的一部分)的白喉毒素的儿童中可能无效。该项工作在参考文献20中进一步展开，其中观察到D-T免疫的载体初免作用持续至随后用Hib缀合物免疫。在参考文献21中，作者发现用白喉或破伤风类毒素载体蛋白预免疫降低了随后用与这些载体缀合的Hib荚膜糖免疫之后的抗-Hib抗体水平增加，IgG1和IgG2所受影响相同。

对缀合物载体部分的应答也受到抑制。此外，观察到更普遍的非表位特异性抑制，因为发现用一种缀合物预免疫影响针对载体和4周后给予的第二种缀合物的糖部分的免疫应答。

参考文献22 报道了不同载体蛋白在一种多价肺炎链球菌缀合疫苗中的应用，使用多种载体是为避免载体抑制。这些作者预计多价缀合疫苗可容许最大的载体蛋白载荷，而不产生负面干扰。参考文献23报道了包含混合的载体蛋白的肺炎链球菌缀合疫苗在激发抗肺炎链球菌应答的同时激发针对载体的无意加强应答。

参考文献24 研究了白喉和破伤风加强物是否可与单价血清群C脑膜炎球菌缀合物一起给予，发现当载体为破伤风类毒素载体并且患者已预先接受过含破伤风疫苗免疫时，针对脑膜炎球菌缀合物的效价降低。

最后，参考文献25报道，“以前接触过载体蛋白可增强或抑制针对以糖-蛋白质缀合物给予的多糖的抗体应答”。参考文献25中所用的缀合物利用破伤风类毒素或CRM197突变体作为载体蛋白。

这样就混淆了关于载体初免和/或抑制的情况，任一特定缀合物是受载体抑制所累还是从载体初免增强获益仍不清楚。该问题不解决，脑膜炎球菌缀合疫苗就处于不能整合入或加入现有儿科免疫接种程序的状态。此外，由于某些脑膜炎球菌缀合物要作为四价混合物(即四种不同缀合物)给予，那么潜在的载体抑制风险尤甚。

除了用载体初免对针对糖缀合物的免疫应答具有负面影响之外，也会发生相反的情况，即用缀合物免疫对于抗载体的免疫应答可能具有负面影响[26]。

发明公开

本发明的第一方面

现已发现，即使患者己接受过先前免疫原形式(例如在D-T-P或D-T免疫接种中)或作为先前载体蛋白(例如在Hib缀合物或肺炎链球菌缀合疫苗中)的载体蛋白，也可给予他们脑膜炎球菌缀合物(在破伤风类毒素载体上)。

本发明因此提供免疫人类患者以抵御脑膜炎奈瑟氏球菌所致疾病的方法，包括给予人类患者包含以下至少两项的组合物的步骤：(a)(i)血清群A脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素或其衍生物的缀合物；(b)(i)血清群C脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素或其衍生物的缀合物；(c)(i)血清群W135脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素或其衍生物的缀合物；和(d)(i)血清群Y脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素或其衍生物的缀合物，其中所述患者已用(a)破伤风类毒素或其衍生物和/或(b)(i)非脑膜炎奈瑟氏球菌的生物体的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素或其衍生物的缀合物预免疫。

本发明还提供免疫人类患者以抵御脑膜炎奈瑟氏球菌所致疾病的方法，包括给予人类患者包含以下至少两项的组合物的步骤：(a)(i)血清群A脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素的缀合物；(b)(i)血清群C脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素的缀合物；(c)(i)血清群W135脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素的缀合物；和(d)(i)血清群Y脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素的缀合物，其中所述患者已用(a)破伤风类毒素和/或(b)(i)非脑膜炎奈瑟氏球菌的生物体的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素的缀合物预免疫。

此外，本发明提供以下至少两项在制造用于免疫人类患者以抵御脑膜炎奈瑟氏球菌所致疾病的药物中的用途：(a)(i)血清群A脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素或其衍生物的缀合物；(b)(i)血清群C脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素或其衍生物的缀合物；(c)(i)血清群W135脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素或其衍生物的缀合物；和(d)(i)血清群Y脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素或其衍生物的缀合物，其中患者已用(a)破伤风类毒素或其衍生物和/或(b)(i)非脑膜炎奈瑟氏球菌的生物体的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素或其衍生物的缀合物预免疫。

本发明还提供以下至少两项在制造用于免疫人类患者以抵御脑膜炎奈瑟氏球菌所致疾病的药物中的用途：(a)(i)血清群A脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素的缀合物；(b)(i)血清群C脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素的缀合物；(c)(i)血清群W135脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素的缀合物；和(d)(i)血清群Y脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素的缀合物，其中患者已用(a)破伤风类毒素和/或(b)(i)非脑膜炎奈瑟氏球菌的生物体的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素的缀合物预免疫。

脑膜炎球菌疾病优选为脑膜炎，更优选为细菌性脑膜炎，最优选为脑膜炎球菌性脑膜炎。因此，本发明可用于对抗导致脑膜炎的脑膜炎球菌感染的保护作用。

当预免疫抗原为破伤风类毒素(TT)的衍生物时，该衍生物优选保留了与TT的免疫交叉反应性，优选为片段C。

预免疫的患者

待免疫的患者己用以下几项预免疫：(a)破伤风类毒素或其衍生物，和/或(b)(i)非脑膜炎奈瑟氏球菌的生物体的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素或其衍生物的缀合物。预免疫通常包括:破伤风类毒素抗原、利用破伤风类毒素载体的Hib荚膜糖缀合物和/或利用破伤风类毒素载体的肺炎链球菌荚膜糖缀合物。

患者将已接受至少1次(例如1次、2次、3次或多次)剂量的预免疫抗原，该剂量(或多次剂量中的最早一次)将在用本发明的脑膜炎球菌缀合物免疫前至少0.5、1、2、4个月或至少6个月(例如6、9、12、15、18、21、24、36、48、60、120、180、240、300或更多个月)已给予患者。在优选的一组患者中，在出生3年内，例如出生2年内、出生1年内、出生6个月内乃至出生3个月、2个月或1个月内进行预免疫。

本发明的待免疫患者通常为人。所述人通常为至少1月龄，例如至少2月龄、至少3月龄、至少4月龄、至少6月龄、至少2岁、至少5岁、至少11岁、至少17岁、至少40岁、至少55岁等。优选的患者组为至少6月龄。另一优选的患者组为2-55岁年龄组，另一优选的患者组为11-55岁年龄组。又一优选的患者组为小于11岁，例如2-11岁。然而，在所有情况中，无论年龄大小，患者都将如本文所定义的已进行预免疫。

当预免疫抗原是破伤风类毒素时，则患者通常已接受在D-T-P或D-T预免疫中作为T抗原的类毒素。该免疫接种通常给予2、3和4月龄的新生儿。当免疫接种包括百日咳疫苗时，该疫苗可为全细胞或细胞性百日咳疫苗(‘Pw’)，但优选为无细胞百日咳疫苗(‘Pa’)。预免疫Pa疫苗一般包含以下1、2或3种众所周知并已充分表征的百日咳博德特氏菌(B.pertussis)抗原：(1)通过化学方法或定点诱变解毒的百日咳类毒素(‘PT’)，例如‘9K/129G突变体’[30]；(2)丝状血凝素(‘FHA’)；(3)百日咳杆菌粘附素(也称为‘69千道尔顿的外膜蛋白’)。无细胞百日咳疫苗还可以包含凝集原2和/或凝集原3。D-T预免疫中的‘D’抗原通常是白喉类毒素。

当预免疫抗原是破伤风类毒素时，则患者也可接受或者已接受类毒素作为蛋白质-糖缀合物的载体蛋白。此缀合物包括‘PRP-T’Hib缀合物。

当预免疫抗原是破伤风类毒素时，则患者通常已用Hib缀合物和/或多价肺炎链球菌缀合物预免疫。此预免疫通常给予2、3和4月龄的新生儿。Hib缀合物众所周知(参考文献32)。肺炎链球菌缀合物还可以使用用于一种或多种糖的破伤风类毒素载体。患者还可以已用血清群C脑膜炎球菌(‘MenC’)缀合物预免疫。MenC缀合物使用破伤风类毒素作为载体。然而，优选地，患者已用Hib和/或肺炎链球菌缀合物而非MenC缀合物预免疫。如果患者己用MenC缀合物预免疫，则根据本发明给予的疫苗可以含有或不含有血清群C缀合物。

破伤风类毒素是众所周知并充分表征的蛋白质，其可以通过用灭活性化学物质如福尔马林或甲醛处理毒素获得。

预免疫的结果是患者的免疫系统已与预免疫抗原接触。对于用破伤风类毒素(Tt)预免疫，这一般意味着患者将已产生抗Tt抗体应答(通常产生>0.01IU/ml的抗Tt滴度)，并将具有对Tt特异性的记忆B和/或T淋巴细胞，即用Tt预免疫通常足以在患者中引发回忆抗Tt免疫应答。对于其中Tt(或衍生物)为缀合物中的糖载体的预免疫，那么预免疫将已产生抗糖应答，患者将具有对糖特异性的记忆B和/或T淋巴细胞，即预免疫通常足以在患者中引发回忆抗糖免疫应答。预免疫优选足以在患者中引发例如针对破伤风疾病的保护性免疫力。

因此，要按照本发明免疫的患者不同于普通患者，因为他们是其免疫系统己针对预免疫抗原建立免疫应答的普通人群亚组成员，使得依据本发明用包含破伤风类毒素(或其衍生物)载体的脑膜炎球菌缀合物免疫在所述亚组中激发的免疫应答不同于以前尚未建立针对预免疫抗原的免疫应答的患者。优选已用Tt(或衍生物)作为缀合物(特别是Hib缀合物)载体预免疫的患者。特别优选的患者已用Tt(或衍生物)作为缀合物载体以及用Tt作为未缀合免疫原预免疫。

患者不但可以用缀合或非缀合形式的破伤风类毒素(或衍生物)预免疫，而且可以用其它抗原预免疫。这些抗原包括但不限于：百日咳抗原—参见上文；白喉类毒素—参见上文；乙型流感嗜血杆菌—参见上文；乙型肝炎表面抗原(HBsAg)；脊髓灰质炎病毒，例如灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗(IPV)；肺炎链球菌—参见上文；流感病毒；BCG；甲型肝炎病毒抗原；麻疹病毒；腮腺炎病毒；风疹病毒；水痘病毒等。患者可用或可不用一种或多种脑膜炎球菌荚膜糖缀合物预免疫。

在某些优选实施方案中，在患者首次接受脑膜炎球菌缀合物之时，他们己用Tt(或衍生物)预免疫。在其它实施方案中，将脑膜炎球菌缀合物给予已用(i)Tt或衍生物和(ii)脑膜炎球菌缀合物这二者预免疫的患者。

缀合物

本发明用缀合的糖免疫患者。缀合用于增强糖的免疫原性，因为缀合将糖从T细胞非依赖性抗原转化为T细胞依赖性抗原，从而可以激发免疫记忆。缀合对儿科疫苗特别有用[例如参考文献37]，是众所周知的技术[例如综述于参考文献38-46]。

本发明所用组合物含有至少两种脑膜炎球菌缀合物，其中每种缀合物均含有破伤风类毒素(或其衍生物)载体蛋白和荚膜糖。荚膜糖选自血清群A、C、W135和Y脑膜炎球菌，使得组合物含有这四种血清群的2种、3种或所有4种糖。具体的组合物含有得自以下的糖：血清群A和C；血清群A和W；血清群A和Y；血清群C和W135；血清群C和Y；血清群W135和Y；血清群A和C和W135；血清群A和C和Y；血清群A和W135和Y；血清群C和W135和Y；血清群A和C和W135和Y。最优选含有所有四种血清群的糖的组合物。

这四种血清群中每一种的荚膜糖都己被充分表征。血清群A脑膜炎球菌的荚膜糖是在C3和C4位中有部分O-乙酰化的(α1→6)-连接的N-乙酰基-D-甘露糖胺-1-磷酸的均聚物。乙酰基可被保护基团置换，以防水解[47]，这种修饰的糖仍是本发明意义上的血清群A糖。血清群C荚膜糖是(α2→9)-连接的唾液酸(N-乙酰基神经氨酸或‘NeuNAc’)的均聚物。大多数血清群C菌株在唾液酸残基的C-7和/或C-8具有O-乙酰基，但约15％的临床分离株没有这些O-乙酰基[48，49]。糖结构被写为:→9)-Neu p NAc 7/8 OA(α2→。血清群W135糖是唾液酸半乳糖二糖单元的均聚物。与血清群C糖相似，它具有可变的O-乙酰化，但在唾液酸7和9位[50]。其结构被写为：→4)-D-Neu p5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)D-Gal-α-(1→。血清群Y糖与血清群W135糖类似，只是二糖重复单元含有葡萄糖而非半乳糖。与血清群W135相似，它在唾液酸7和9位具有可变的O-乙酰化[50]。血清群Y的结构被写为：→4)-D-Neu p5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)D-Glc-α-(1→。

本发明所用的糖如上所述可被O-乙酰化(例如与在天然荚膜糖中观察到的O-乙酰化模式相同)，或者它们可在糖环的一个或多个位置部分或全部脱O-乙酰化，或者相对于天然荚膜糖它们可以超O-乙酰化。

本发明所用的糖可比在细菌中观察到的天然荚膜糖短。因此，这些糖可被解聚，解聚发生在纯化后但在缀合前。解聚降低了糖链长度。一种解聚方法涉及利用过氧化氢[9]。向糖中加入过氧化氢(例如得到1％的最终H₂O₂浓度)，然后温育混合物(例如在约55℃)，直至已实现所需的链长降低，另一解聚方法涉及酸水解[10]。技术人员已知其它解聚方法。用于制备本发明所用缀合物的糖可以通过任何这些解聚方法获得。可以利用解聚来为免疫原性提供最佳链长和/或为糖的物理可控性降低链长。

用于缀合物的典型载体蛋白是细菌毒素或类毒素，例如白喉毒素(或其CRM197突变体)和破伤风毒素。其它已知的载体蛋白包括脑膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白、合成肽、热激蛋白、百日咳蛋白、细胞因子、淋巴因子、激素、生长因子、包含来自各种病原体衍生抗原的多种人CD4+T细胞表位的人工蛋白、非分型流感嗜血菌的D蛋白、肺炎链球菌表面蛋白PspA、铁摄取蛋白、艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B等。然而，按照本发明，脑膜炎球菌缀合物含有破伤风类毒素(或其衍生物，例如片段C)载体蛋白。优选共价缀合。

组合物中可能利用一种以上的载体蛋白。因此，不同的载体蛋白可用于不同的血清群，例如血清群A糖可以与破伤风类毒素缀合，而血清群C糖可以与白喉类毒素缀合。还有可能对特定糖抗原使用一种以上的载体蛋白，例如血清群A糖可分为两部分，一些与破伤风类毒素缀合，另一些与白喉类毒素缀合。然而，一般来说，优选对组合物中的所有脑膜炎球菌糖、更优选对所有糖(即包含可能存在的任何非脑膜炎球菌缀合物)利用同一载体蛋白。优选本发明该方面的组合物/药物不含有任何白喉破伤风类毒素或CRM197载体蛋白。

一种载体蛋白可以携带一种以上的糖抗原[51]。例如，一种载体蛋白可以与血清群A和C的糖缀合。为实现该目标，可以在缀合反应之前混合糖。然而，一般来说，优选每种血清群具有单独的缀合物。优选混合缀合物，以得到基本上1:1:1:1的比例(以糖的质量测定)，例如每种血清群的糖的质量在彼此的10％之内。组合物中每种血清群的脑膜炎球菌抗原的典型量在1μg和20μg之间，例如每种血清群在2和10μg之间，或约4或5μg。作为1:1:1:1比例的替代，可利用双血清群A剂量(2:1:1:1)。

糖:蛋白之比(重量/重量)在1:15(即过量的蛋白)和15:1(即过量的糖)之间、优选在1:10和10:1之间、更优选在1:5和5:1之间的缀合物是优选的。可使用例如1:3的过量载体蛋白。

缀合物可以与游离载体蛋白联用[52]。然而，当给定的载体蛋白在本发明组合物中以游离和缀合的形式同时存在时，未缀合的形式优选不超过整体组合物中载体蛋白总量的5％，更优选以小于2％(重量)存在。类似地，未缀合的糖以重量计优选不超过糖总量的15％。

可利用任何合适的缀合反应，必要时可利用任何合适的接头。

糖在缀合前通常可被活化或官能化。活化可涉及例如氰化试剂，如CDAP(例如四氟硼酸1-氰基-4-二甲基氨基吡啶鎓[53，54等])。其它合适的技术利用碳二亚胺、酰肼、活性酯、正硼烷、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU；另参见参考文献44的引言)。

可利用任何已知的方法，例如参考文献55和56中描述的方法，经接头基团形成键。一类键涉及多糖的还原性胺化，将得到的氨基与己二酸接头基团的一端偶联，然后将蛋白质与该己二酸接头基团的另一端偶联[42，57，58]。其它接头包括B-丙酰胺基[59]、硝基苯基-乙胺[60]、卤代酰卤(haloacyl halide)[61]、糖苷键[62]、6-氨基己酸[63]、ADH[64]、C4到C12部分[65]等。作为对使用接头的替代，可利用直接连接。蛋白质的直接连接可包括如参考文献66和67所述的多糖氧化，然后与蛋白质进行还原性胺化。

一种方法包括将氨基引入糖中(例如通过用-NH₂置换末端＝O基团)，然后用己二酸二酯(例如己二酸N-羟基琥珀酰亚胺二酯)衍生化，并可与载体蛋白进行反应。

在一种缀合方法中，糖与己二酸二酰肼反应。就血清群A而言，还可以在此阶段加入碳二亚胺。反应一段时间后，加入氰基硼氢化钠。然后可通过例如超滤制备衍生化糖。然后将衍生化糖与载体蛋白(例如与破伤风类毒素)混合，并加入碳二亚胺。反应一段时间后，回收缀合物。该缀合方法的其它细节可见于参考文献10。可通过此方法得到的缀合物可按照本发明使用，例如含有破伤风类毒素载体和己二酸接头的缀合物。优选分开制备缀合物，然后混合。混合后，可用例如无菌无热原磷酸缓冲盐水调节混合缀合物的浓度。混合前，每种缀合物优选含有不超过15μg载体。

就每种所给予的血清群而言，给予本发明的脑膜炎球菌缀合物的结果优选为：患者产生血清杀细菌抗体(SBA)应答；SBA效价增加(与接受混合的脑膜炎球菌缀合物之前的预免疫患者相比)达至少4倍，优选至少8倍。SBA检验是对脑膜炎球菌保护作用的标准关联。脑膜炎球菌疫苗的血清学相关性的其它细节在参考文献68中给出。

本发明所用组合物的其它抗原性组分

除了脑膜炎球菌缀合物以外，本发明所用组合物可任选含有以下的1、2或3种其它抗原：

1.肺炎链球菌的缀合荚膜糖[例如参考文献32的第23章；参考文献69-71]。

优选含有一种以上血清型的肺炎链球菌的糖。例如，23种不同血清性的多糖的混合物是已知的，含有5到11种不同血清型的多糖的缀合疫苗也是已知的[72]。例如，PrevNar^TM[31]含有7种血清型(4、6B、9V、14、18C、19F和23F)的抗原，每种糖都通过还原性胺化单独地与CRM197缀合，每0.5ml剂量含2μg的每种糖(4μg血清群6B)，缀合物吸附在磷酸铝佐剂上。当本发明所用组合物含有肺炎链球菌缀合物时，该组合物优选至少含有血清型6B、14、19F和23F。可将一种或多种血清型与破伤风类毒素缀合。

2.乙型流感嗜血杆菌的缀合荚膜糖[例如参考文献32的第14章]。

用于缀合物的载体蛋白可为CRM197、Dt、破伤风类毒素或脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜复合物。缀合物的糖部分可以是多糖(例如全长的聚核糖基核糖醇磷酸酯(PRP)(polyribosylribitol phosphate))，但也可以进行荚膜多糖解聚，以形成寡糖(例如1-5kD分子量)。一种Hib缀合物含有经己二酸接头与CRM197共价连接的寡糖[73，74]。另一种使用破伤风类毒素代替。给予Hib抗原优选产生>0.15μg/ml、更优选大于>1μg/ml的抗PRP抗体浓度。当组合物含有Hib糖抗原时，其优选还不含有氢氧化铝佐剂。如果组合物含有磷酸铝佐剂，则Hib抗原可以吸附到佐剂上[75]，或者其可以是非吸附性的[27]。可通过选择在抗原/佐剂混合期间恰当的pH、具有合适零电荷点的佐剂和组合物中各种不同抗原的合适混合顺序来防止吸附[76]。

3.血清群B脑膜炎奈瑟氏球菌的蛋白质抗原[例如参考文献77]。

组合物可含有一种或多种这些其它抗原。其可为外膜囊泡制备物。

这些抗原可以吸附或不吸附到铝盐上。

如果以一系列剂量给予脑膜炎球菌缀合物，则这些剂量中没有、有一些或全部可含有这些额外的抗原。

含有脑膜炎球菌缀合物的组合物优选不含有白喉类毒素，也不含CRM197。

它们优选不含有百日咳抗原。它们优选不含有乙肝病毒表面抗原。它们优选不含有脊髓灰质炎病毒。组合物优选在每种脑膜炎球菌缀合物中含有不超过50μg的破伤风类毒素，更优选对于所有组合的脑膜炎球菌缀合物含有不超过50μg的破伤风类毒素。

本发明的第二方面

如上所报告，肺炎链球菌接种现在趋向于与首次初免接种(约2月龄)相伴进行。本发明人认为，对于肺炎链球菌缀合疫苗所用的一种或多种载体预免疫可能有用。

因此，在本发明的又一方面，提供免疫人类患者以抵御肺炎链球菌所致疾病的方法，包括给予人类患者组合物的步骤，所述组合物含有至少7、10、11、13或14种不同肺炎链球菌荚膜糖血清型的缀合物，其中至少一种缀合物与白喉类毒素或CRM197或其衍生物缀合，其中所述患者已用(a)白喉类毒素或其衍生物和/或(b)(i)非肺炎链球菌的生物体的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或CRM197或其衍生物的缀合物预免疫。

本发明还提供免疫人类患者以抵御肺炎链球菌所致疾病的方法，包括给予人类患者组合物的步骤，所述组合物含有至少7、10、11、13或14种不同肺炎链球菌荚膜糖血清型的缀合物，其中至少一种缀合物与破伤风类毒素或其衍生物缀合，其中所述患者已用(a)破伤风类毒素或其衍生物和/或(b)(i)非肺炎链球菌的生物体的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素或其衍生物的缀合物预免疫。

在本发明的一个实施方案中，提供免疫人类患者以抵御肺炎链球菌所致疾病的方法，包括给予人类患者组合物的步骤，所述组合物含有至少7、10、11、13或14种不同肺炎链球菌荚膜糖血清型的缀合物，其中至少一种缀合物与破伤风类毒素或其衍生物缀合，以及其中至少一种缀合物与白喉类毒素或CRM197或其衍生物缀合，其中所述患者已用(a)破伤风类毒素或其衍生物和/或(b)(i)非肺炎链球菌的生物体的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素或其衍生物的缀合物和(c)白喉类毒素或其衍生物和/或(d)(i)非肺炎链球菌的生物体的荚膜糖和(ii)和白喉类毒素或CRM197或其衍生物的缀合物预免疫。

还提供对应的用途:至少7、10、11、13或14种不同肺炎链球菌荚膜糖血清型的缀合物在制造用于免疫人类患者以抵御肺炎链球菌所致疾病的药物中的用途，其中至少一种缀合物与白喉类毒素或CRM197或其衍生物缀合，其中所述患者已用(a)白喉类毒素或其衍生物和/或(b)(i)非肺炎链球菌的生物体的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或CRM197或其衍生物的缀合物预免疫；至少7、10、11、13或14种不同肺炎链球菌荚膜糖血清型的缀合物在制造用于免疫人类患者以抵御肺炎链球菌所致疾病的药物中的用途，其中至少一种缀合物与破伤风类毒素或其衍生物缀合，其中所述患者已用(a)破伤风类毒素或其衍生物和/或(b)(i)非肺炎链球菌的生物体的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素或其衍生物的缀合物预免疫；以及至少7、10、11、13或14种不同肺炎链球菌荚膜糖血清型的缀合物在制造用于免疫人类患者以抵御肺炎链球菌所致疾病的药物中的用途，其中至少一种缀合物与破伤风类毒素或其衍生物缀合，以及其中至少一种缀合物与白喉类毒素或CRM197或其衍生物缀合，其中所述患者已用(a)破伤风类毒素或其衍生物和/或(b)(i)非肺炎链球菌的生物体的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素或其衍生物的缀合物和(c)白喉类毒素或其衍生物和/或(d)(i)非肺炎链球菌的生物体的荚膜糖和(ii)和白喉类毒素或CRM197或其衍生物的缀合物预免疫。

当预免疫抗原为白喉类毒素的衍生物时，则该衍生物优选保留与Dt的免疫交叉反应性，优选为CRM197。当预免疫抗原为破伤风类毒素的衍生物时，则该衍生物优选保留与Tt的免疫交叉反应性，优选为片段C。

预免疫的患者

待免疫的患者己用以下几项物质预免疫：(a)白喉类毒素或其衍生物，和/或(b)(i)非肺炎链球菌的生物体的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或其衍生物的缀合物和/或(c)破伤风类毒素或其衍生物和/或(d)(i)非肺炎链球菌的生物体的荚膜糖和(ii)和破伤风类毒素或其衍生物的缀合物。预免疫通常包括：白喉类毒素抗原、破伤风类毒素抗原、利用白喉类毒素或CRM197载体或破伤风类毒素载体的Hib荚膜糖缀合物，和/或利用白喉类毒素或CRM197载体或破伤风类毒素的脑膜炎球菌荚膜糖缀合物。

患者将接受至少1次(例如1次、2次、3次或更多次)剂量的预免疫抗原，该剂量(或多次剂量中的最早一次)在用本发明的脑膜炎球菌缀合物免疫前至少0.5、1、2、4或至少6个月(例如6、9、12、15、18、21、24、36、48、60、120、180、240、300或更多个月)给予患者。在优选的一组患者中，在出生3年内，例如出生2年内、出生1年内、出生6个月内乃至出生3个月、2个月或1个月内进行预免疫。

当预免疫抗原为白喉类毒素或破伤风类毒素时，则患者通常已接受在D-T-P或D-T预免疫中分别作为‘D’或‘T’抗原的类毒素。所述免疫接种通常给予2、3和4月龄的新生儿。当免疫接种包括百日咳疫苗时，该疫苗可为全细胞或细胞性百日咳疫苗(‘Pw’)，但优选为无细胞百日咳疫苗(‘Pa’)。预免疫Pa疫苗一般包含以下1、2或3种众所周知并已充分表征的百日咳博德特氏菌(B.pertussis)抗原：(1)通过化学方法或定点诱变解毒的百日咳类毒素(‘PT’)，例如‘9K/129G’突变体[30]；(2)丝状血凝素(‘FHA’)；(3)百日咳杆菌粘附素(也称为‘69千道尔顿的外膜蛋白’)。无细胞百日咳疫苗还可以包含凝集原2和/或凝集原3。

当预免疫抗原是白喉类毒素或破伤风类毒素时，则患者也可接受或者已接受类毒素作为蛋白质-糖缀合物的载体蛋白。这些缀合物包括‘PRP-D’或‘PRP-T’Hib缀合物[参见参考文献32的表14-7]，例如ProHIBIT^TM产品。

当预免疫抗原为CRM197时，则患者通常已用Hib缀合物和/或多价肺炎链球菌缀合物预免疫。这些预免疫通常给予2、3和4月龄的新生儿。使用CRM197载体的Hib缀合物包括‘HbOC’缀合物[参见参考文献32的表14-7]，例如HibTITER^TM产品。使用CRM197载体的肺炎链球菌缀合物包括7价PCV7混合物，例如PrevNar^TM疫苗[31]。患者还可以已用血清群C脑膜炎球菌(‘MenC’)缀合物预免疫。使用CRM197载体的MenC缀合物包括Meninvact^TM/Menjugate^TM[5]和Meningitec^TM。然而，优选地，患者已用Hib和/或肺炎链球菌缀合物而非MenC缀合物预免疫。如果患者己用MenC缀合物预免疫，则按照本发明给予的疫苗可以含有或不含有血清群C缀合物。

白喉和破伤风类毒素是众所周知并充分表征的蛋白质[例如参见参考文献32的第13章]，其可以通过用灭活性化学物质如福尔马林或甲醛处理毒素获得。CRM197也是众所周知并充分表征的[33-36]，已广泛用作缀合糖疫苗中的载体。

CRM197和Dt共有许多载体表位。

预免疫的结果是患者的免疫系统已与预免疫抗原接触。对于用白喉类毒素(Dt)或破伤风类毒素预免疫，这一般意味着患者将已产生抗Dt或Tt抗体应答(通常产生>0.01IU/ml的抗Dt效价)，并将具有对Dt或Tt特异性的记忆B和/或T淋巴细胞，即用Dt或Tt预免疫通常足以在患者中引发回忆抗Dt或Tt免疫应答。对于其中Dt或Tt(或衍生物)为缀合物中的糖载体的预免疫，那么预免疫将已产生抗糖应答，患者将具有对糖特异性的记忆B和/或T淋巴细胞，即预免疫通常足以在患者中引发回忆抗糖免疫应答。预免疫优选足以在患者中引发例如针对白喉或破伤风疾病的保护性免疫力。

因此，要按照本发明免疫的患者不同于普通患者，因为他们是其免疫系统己针对预免疫抗原建立免疫应答的普通人群亚组成员，使得按照本发明用包含白喉类毒素和/或破伤风类毒素(或其衍生物)载体的肺炎链球菌缀合物免疫在所述亚组中引发的免疫应答不同于以前尚未建立针对预免疫抗原的免疫应答的患者。优选已用Dt和/或Tt(或衍生物)作为缀合物(特别是Hib缀合物)载体预免疫的患者。特别优选的患者已用Dt和/或Tt(或衍生物)作为缀合物载体以及用Dt和/或Tt作为未缀合免疫原预免疫。

患者不但可以用缀合或非缀合形式的白喉类毒素和/或破伤风类毒素(或衍生物)预免疫，而且可以用其它抗原预免疫。这些抗原包括但不限于:百日咳抗原—参见上文；乙型流感嗜血杆菌—参见上文；乙型肝炎表面抗原(HBsAg)；脊髓灰质炎病毒，例如灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗(IPV)；脑膜炎球菌荚膜糖缀合物—参见上文；流感病毒；BCG；甲型肝炎病毒抗原；麻疹病毒；腮腺炎病毒；风疹病毒；水痘病毒等。患者可以用或不用一种或多种肺炎链球菌荚膜糖缀合物预免疫。

在某些优选实施方案中，在患者首次接受肺炎链球菌缀合物之时，他们己用Dt和/或Tt(或衍生物)预免疫。在其它实施方案中，将肺炎链球菌缀合物给予已用(i)Dt和/或Tt或衍生物和(ii)肺炎链球菌缀合物这二者预免疫的患者。

缀合物

本发明用缀合的糖免疫患者。缀合用于增强糖的免疫原性，因为缀合将糖由T细胞非依赖性抗原转化为T细胞依赖性抗原，从而可以激发免疫记忆。缀合对儿科疫苗特别有用[例如参考文献37]，是众所周知的技术[例如在参考文献38-46中综述]。

通常，本发明的肺炎链球菌组合物/药物(或在本文描述的任一种本发明免疫原性组合物中)将含有缀合的糖抗原，其中糖来源于选自以下的至少4种肺炎链球菌血清型：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F。优选地，4种血清型包括6B、14、19F和23F。更优选地，组合物中包含至少7种血清型，例如来源于4、6B、9V、14、18C、19F和23F的那些血清型。更优选地，组合物中包含比7种更多的血清型，例如至少10、11、12、13或14种血清型。例如，在一个实施方案中，组合物包含来源于1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F以及任选的3种(全部是缀合的)的10或11种荚膜糖。在本发明的一个优选实施方案中，包含至少13种糖抗原(优选全部是缀合的)，尽管本发明还涉及其它糖抗原，例如23价(例如1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F)。例如，广泛使用23种不同血清型的多糖混合物，具有5-11种不同血清型的多糖的缀合疫苗也被广泛使用[72]。例如，PrevNar^TM[31]含有7种血清型的抗原(4、6B、9V、14、18C、19F和23F)，每种糖都通过还原性胺化单独与CRM197缀合，每0.5ml剂量含2μg的每种糖(4μg血清群6B)，缀合物吸附在磷酸铝佐剂上。组合物优选至少含有血清群6B、14、19F和23F。

这些血清型每一种的荚膜糖都众所周知。脑膜炎球菌糖也众所周知(参见上文对本发明的糖和设想的血清群糖组合的描述)。

本发明所用的糖可被O-乙酰化(例如与在天然荚膜糖中观察到的O-乙酰化模式相同)，或者它们可在糖环的一个或多个位置部分或全部脱O-乙酰化，或者相对于天然荚膜糖它们可以超O-乙酰化。

本发明所用的糖可比在细菌中观察到的天然荚膜糖短。因此，这些糖可被解聚，解聚发生在纯化后但在缀合前。解聚降低了糖链长。一种可能的解聚方法涉及利用过氧化氢[9]。向糖中加入过氧化氢(例如得到1％的最终H₂O₂浓度)，然后温育混合物(例如在约55℃)，直至已实现所需的链长降低，另一解聚方法涉及酸水解[10]。技术人员已知其它解聚方法。用于制备本发明所用缀合物的糖可以通过任何这些解聚方法获得。可以利用解聚来为免疫原性提供最佳链长和/或为糖的物理可控性降低链长。

用于缀合物的典型载体蛋白是细菌毒素或类毒素，例如白喉毒素(或其CRM197突变体)和破伤风毒素。其它已知的载体蛋白包括脑膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白、合成肽、热激蛋白、百日咳蛋白、细胞因子、淋巴因子、激素、生长因子、包含来自各种病原体衍生抗原的多种人CD4+T细胞表位的人工蛋白、非分型流感嗜血杆菌的D蛋白、肺炎链球菌表面蛋白PspA、铁摄取蛋白、艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B等。然而，按照本发明，肺炎链球菌缀合物含有白喉类毒素和/或破伤风类毒素(或其衍生物，例如CRM197)载体蛋白。优选共价缀合。

组合物中可能利用一种以上的载体蛋白。因此，不同的载体蛋白可用于不同的血清型，例如血清型7F可以与D蛋白缀合，而血清型18C糖可以与破伤风类毒素缀合。还有可能对特定糖抗原使用一种以上的载体蛋白，例如血清型7F糖可分为两部分，一些与CRM197缀合，另一些与D蛋白缀合。然而，一般来说，优选对组合物中的所有或大部分肺炎链球菌糖使用同一载体蛋白。糖组合物可与Dt和Tt、Dt和Crm197、CRM197和Tt以及Dt、CRM197和Tt缀合。D蛋白可加至所列出的这些用于缀合(大部分)糖的载体的任一个中。在一个实施方案中，只有1种血清型与Dt或CRM197缀合，和/或仅有1种血清型与Tt缀合。

一种载体蛋白可以携带一种以上的糖抗原[51]。例如，一种载体蛋白可以与血清型7F和18C的荚膜糖缀合。为实现该目标，可以在缀合反应之前混合糖。然而，一般来说，优选每种血清型具有单独的缀合物。混合缀合物，以得到基本上1:1:1:1的比例(以糖的质量测定)，例如每种血清群的糖的质量在彼此的10％之内。组合物中每种血清群的脑膜炎球菌抗原的典型量在1μg和20μg之间，例如每种血清群在2和10μg之间。

可利用糖:蛋白之比(重量/重量)在1:15(即过量的蛋白)和15:1(即过量的糖)之间、优选在1:10和10:1之间、更优选在1:5和5:1之间的缀合物。

可利用任何合适的缀合反应，必要时采用任何合适的接头(参见上文其中关于可用于本发明的各个方面的典型缀合反应的参考文献)。如果使用接头，则在一个实施方案中其为ADH(己二酸二酰肼)。可通过这些方法获得的缀合物是按照本发明使用的优选缀合物，例如含有白喉类毒素和/或破伤风类毒素载体(以及任选的己二酸接头)的缀合物。缀合物优选单独制备，然后混合。混合后，可用例如无菌无热原磷酸缓冲盐水调节混合缀合物的浓度。混合前，每种缀合物优选含有不超过15μg载体。

本发明所用组合物的其它抗原性组分

除了肺炎链球菌缀合物以外，本发明所用组合物可任选含有以下的1、2或3种其它抗原：

1.脑膜炎奈瑟氏球菌的缀合荚膜糖[参考文献69-71；参见上文]。

在一个实施方案中，本发明的组合物/药物不包含任何脑膜炎球菌糖缀合物。优选地，破伤风类毒素作为载体提供。

用于缀合物的载体蛋白可为CRM197、Dt、破伤风类毒素或脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜复合物。缀合物的糖部分可以是多糖(例如全长的聚核糖基核糖醇磷酸酯(PRP))，但优选解聚荚膜多糖，以形成寡糖(例如1-5kDa分子量)。优选的Hib缀合物含有经己二酸接头与CRM197或破伤风类毒素共价连接的寡糖[73，74]。给予Hib抗原优选产生>0.15μg/ml、更优选大于>1μg/ml的抗PRP抗体浓度。当组合物含有Hib糖抗原时，其优选还不含有氢氧化铝佐剂。如果组合物含有磷酸铝佐剂，则Hib抗原可以吸附到佐剂上[75]，或者其可以是非吸附性的[27]。可通过选择在抗原/佐剂混合期间恰当的pH、具有合适零电荷点的佐剂和组合物中各种不同抗原的合适混合顺序来防止吸附[76]。

3.血清群B脑膜炎奈瑟氏球菌的蛋白质抗原[例如参考文献77]。

组合物可含有一种或多种这些其它抗原。其可为分离的外膜蛋白形式，或者为亚单位抗原制备物形式。

这些抗原可以吸附或不吸附到铝盐上。

如果以一系列剂量给予肺炎链球菌缀合物，则这些剂量中没有、有一些或全部可含有这些额外的抗原。

在一个实施方案中，含有肺炎链球菌缀合物的组合物不含有脑膜炎球菌荚膜糖缀合物。

在一个实施方案中，它们不含有百日咳抗原。在一个实施方案中，它们不含有乙肝病毒表面抗原。在一个实施方案中，它们不含有脊髓灰质炎病毒。组合物优选在每种肺炎链球菌缀合物中含有不超过50μg的白喉类毒素/CRM197，更优选所有组合的肺炎链球菌缀合物含有不超过50μg的白喉类毒素/CRM197。组合物优选在每种肺炎链球菌缀合物中含有不超过50μg的破伤风类毒素，更优选所有组合的肺炎链球菌缀合物含有不超过50μg的破伤风类毒素。

本发明的第三方面

在本发明的第三个方面，本发明人已设计了给予使用破伤风类毒素和/或DT(和/或CRM197)的多种疫苗的方法。以上所撰写的本发明第一和第二方面的描述以及前面的权利要求45也是相关的，通过引用结合到本发明的此第三方面中。

还提供用于免疫人类患者以抵御脑膜炎奈瑟氏球菌、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、白喉杆菌(Corynenacterium diphtheriae)和肺炎链球菌所致疾病的方法，包括按照以下给药程序给予人类患者以下疫苗的步骤：

	第1次就诊	第2次就诊	第3次就诊	第4次就诊
	第1次就诊	第2次就诊	第3次就诊	第4次就诊	DTP	X		X
Strep		X		X	DTP	X		X
Strep		X		X	MenC		X		X

其中就诊全部发生在生命的前8个月，

其中每次连续就诊之间有至少2周，

其中DTP包含DT、TT以及全细胞(Pw)或无细胞(Pa)百日咳抗原，

其中Strep为含有至少7、10、11、13或14种缀合血清型的多价肺炎链球菌荚膜糖缀合疫苗，

其中MenC包含缀合的血清群C脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖，

其中在每个Strep和MenC疫苗中的至少一种缀合糖与DT或CRM197缀合，或者在每个Strep和MenC疫苗中的至少一种缀合糖与TT缀合。

在又一方面，提供用于免疫人类患者以抵御脑膜炎奈瑟氏球菌、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、破伤风梭菌(Clostridiumtetani)、白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)和肺炎链球菌所致疾病的方法，包括按照以下给药程序给予人类患者以下疫苗的步骤：

	第1次就诊	第2次就诊	第3次就诊	第4次就诊
	第1次就诊	第2次就诊	第3次就诊	第4次就诊	DTP	X	X	X
Strep	X		X		DTP	X	X	X
Strep	X		X		MenC		X		任选地X

其中就诊全部发生在生命的前8个月，

其中每次连续就诊之间有至少2周，

其中DTP包含DT、TT以及全细胞(Pw)或无细胞(Pa)百日咳抗原，

其中MenC包含缀合的血清群C脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖，

	第1次就诊	第2次就诊	第3次就诊
	第1次就诊	第2次就诊	第3次就诊	DTP	X	X	X
Strep	X	X		DTP	X	X	X
Strep	X	X		MenC		X	X

其中就诊全部发生在生命的前8个月，

其中每次连续就诊之间有至少2周，

其中DTP包含DT、TT以及全细胞(Pw)或无细胞(Pa)百日咳抗原，

其中MenC包含缀合的血清群C脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖，

本发明各方面的一般性考虑因素

疫苗组合物

本发明所用的组合物通常含有药学上可接受的载体。这些载体包括本身不诱导对接受组合物的个体有害的抗体产生的任何载体。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的大分子，例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、蔗糖、海藻糖、乳糖和脂质聚集体(例如油滴或脂质体)。本领域一般技术人员熟知这些载体。

疫苗也可以含有稀释剂，例如水、盐水、甘油等。此外，可以存在辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。无菌无热原的磷酸缓冲生理盐水是典型载体。对药学上可接受的载体和赋形剂的充分讨论可见于参考文献78。

本发明所用组合物可含有抗微生物剂，特别是如果以多剂量形式包装的话。

本发明所用组合物可含有洗涤剂，例如吐温(聚山梨醇酯)，例如吐温80。洗涤剂一般以低水平存在，例如<0.01％。

本发明所用组合物可含有钠盐(例如氯化钠和/或磷酸钠)。这些钠盐可用于渗透性。NaCl浓度一般为10±2mg/ml，例如约8.8mg/ml。磷酸钠的浓度一般为1.2mg/ml。

本发明所用组合物一般含有缓冲液，例如磷酸盐缓冲液。

本发明所用组合物可含有例如约15-30mg/ml(例如25mg/ml)的糖醇(如甘露醇)或二糖(如蔗糖或海藻糖)，特别是对于组合物要冻干或者组合物含有由冻干材料重配的物质的情况。然而，某些组合物可能不冻干，即脑膜炎球菌或肺炎链球菌缀合物从包装阶段至给药阶段可以水性形式存在。组合物通常直接给予患者。可通过胃肠外注射(例如皮下、腹膜内、静脉内、肌内或注射入组织的间质间隙)或通过直肠、口服、阴道、局部、透皮、鼻内、眼、耳、肺部或其它粘膜给药进行直接递送。优选肌内给予(例如给予到大腿或上肢)。可通过针头注射(例如皮下注射针)，但可替代地利用无针注射。典型的肌内剂量为0.5ml。

多种血清群/血清型的脑膜炎球菌或肺炎链球菌缀合物混合在一种组合物中给予。组合物可以单剂量给予，或者可以在多剂量程序中多次给予。多剂量可用于初免程序和/或加强免疫程序。初免剂量程序后可进行脑膜炎球菌或肺炎链球菌缀合物的加强剂量程序。可常规测定初免剂量之间(例如4-16周之间)以及初免和加强之间的合适时间。缀合物可以方便地与其它疫苗同时给予，例如与D-T-P疫苗同时给予，或者与肺炎链球菌或脑膜炎球菌缀合疫苗同时给予，或者与流感疫苗同时给予，或者与MMR或MMRV疫苗同时给予。这些疫苗一般分开给予，但要在同一次就诊期间。

细菌感染可影响身体的各个区域，因此组合物可以制备成各种形式。例如，可将组合物制备成为液体溶液剂或混悬剂的注射剂。也可制备成适合于在注射前溶解于或悬浮于液体溶媒中的固体形式(例如冻干组合物)。可将组合物制备成局部给药形式，例如软膏、乳膏或粉末。可将组合物制备为口服给药形式，例如片剂或胶囊或糖浆(任选调味的)。可利用细粉或喷雾将组合物制备为肺部给药形式，例如吸入剂。可将组合物制备为栓剂或阴道栓剂。可将组合物制备为鼻部、耳部或眼部给药形式，例如喷雾剂、滴剂、凝胶或粉末[参考文献79和80]。然而，一般将脑膜炎球菌或肺炎链球菌缀合物配制成用于肌内注射。

本发明所用组合物可含有或不含有疫苗佐剂。可用于本发明组合物的佐剂包括但不限于：

A.含有矿物质的组合物

适合用作本发明佐剂的含矿物质组合物包括矿物盐，例如铝盐和钙盐。本发明包括矿物盐，例如氢氧化物(例如羟基氧化物)、磷酸盐、硫酸盐等[例如参见参考文献81的第8章和第9章]，或不同矿物化合物与采用任何合适形式(例如凝胶、晶体、无定形等)的化合物的混合物，优选是吸附的。也可将含有矿物质的组合物配制为金属盐的颗粒[82]。

在本发明组合物中可使用磷酸铝，典型的佐剂为PO4/Al摩尔比率在0.84-0.92之间、含有约0.6mg Al³⁺/ml的无定形羟基磷酸铝。

可采用低剂量磷酸铝吸附，例如每剂每种缀合物为50-100μgAl³⁺。当组合物含有多个细菌种的缀合物时，则无需吸附所有的缀合物。

B.油性乳剂

适合用作本发明佐剂的油性乳剂组合物包括角鲨烯-水乳剂、例如MF59[参考文献81的第10章；另参见参考文献83](5％角鲨烯、0.5％吐温80和0.5％司盘85，利用微流化剂配制成亚微米颗粒)。也可利用完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。

C.皂苷制剂[参考文献81的第22章]

皂苷制剂也可用作本发明的佐剂。皂苷是在许多植物物种的树皮、叶子、茎、根乃至花中存在的固醇糖苷和三萜系糖苷的异质群。奎拉雅属皂树(Quillaia saponaria Molina)树皮中的皂苷已作为佐剂被广泛研究。皂苷也可由棕菝契(Smilax ornata)(墨西哥菝契(sarsaprilla))、锥花丝石竹(Gypsophilla paniculata)(婚纱花(brides veil))和肥皂草(Saponaria officianalis)(皂根(soap root))大量获得。皂苷佐剂制剂包括纯化的制剂，例如QS21，以及液体制剂，例如ISCOM。QS21的商品名为Stimulon^TM。

已经利用HPLC和RP-HPLC纯化皂苷组合物。已经鉴定了利用这些技术具体纯化的级分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。皂苷优选为QS21。参考文献84公开了QS21的生产方法。

皂苷制剂也可含有固醇，例如胆固醇[85]。可以联用皂苷和胆固醇来形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒[参考文献81的第23章]。ISCOM一般还含有磷脂，例如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何己知的皂苷都可用于ISCOM。ISCOM优选含有QuilA、QHA和QHC中的一种或多种。参考文献85-87进一步描述了ISCOM。ISCOM任选地可不含其它洗涤剂[88]。

开发基于皂苷的佐剂的综述可见于参考文献89和90。

D.病毒体和病毒样颗粒

病毒体和病毒样颗粒(VLP)也可用作本发明的佐剂。这些结构通常含有一种或多种任选地与磷脂联用或用磷脂配制的病毒蛋白。它们通常是非致病性的、非复制性的且通常不含有任何天然病毒基因组。可重组产生或从完整病毒分离病毒蛋白。适用于病毒体或VLP的这些病毒蛋白包括来源于流感病毒(例如HA或NA)、乙肝病毒(例如核心或衣壳蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德毕斯病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、诺瓦克病毒、人乳头瘤病毒、HIV、RNA-噬菌体、QJ3-噬菌体(例如外壳蛋白)、GA-1噬菌体、fr-噬菌体、AP205噬菌体和Ty(例如逆转录转座子Ty蛋白pi)的蛋白质。参考文献91-96进一步讨论了VLP。病毒体进一步讨论于例如参考文献97。

E.细菌或微生物衍生物

适用于本发明的佐剂包括细菌或微生物衍生物，例如肠细菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物、脂质A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素和它们的解毒衍生物。

LPS的无毒衍生物包括单磷酰脂质A(MPL)和3-O-脱酰MPL(3dMPL)。3dMPL是具有4、5或6条酰化链的3脱-O-酰化单磷酰脂质A的混合物。参考文献98公开了3脱-O-酰化单磷酰脂质A的优选“小颗粒”形式。3dMPL的这种“小颗粒”小得足以通过0.22μμm膜除菌过滤[98]。

其它无毒的LPS衍生物包括单磷酰脂质A模拟物，例如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯衍生物，例如RC-529[99，100]。

脂质A衍生物包括大肠杆菌的脂质A的衍生物，例如OM-174。OM-174描述于例如参考文献101和102。

适合用作本发明佐剂的免疫刺激性寡核苷酸包括含有CpG基序(含有通过磷酸酯键与鸟苷键合的未甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)的核苷酸序列。含有回文或聚(dG)序列的双链RNA和寡核苷酸也已显示出是免疫刺激性的。

CpG可包括核苷酸修饰/类似物，例如硫代磷酸酯修饰，且可以是双链或单链的。参考文献103、104和105公开了可能的类似物取代，例如用2′-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。参考文献106-111进一步讨论了CpG寡核苷酸的佐剂作用。

CpG序列可涉及TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[112]。CpG序列如CpG-A ODN可特异性地诱导Th1免疫应答，或者例如CpG-B ODN可更特异性地诱导B细胞应答。参考文献113-115讨论了CpG-A和CpG-B ODN。CpG优选是CpG-A ODN。

优选构建使5′端易于为受体识别的CpG寡核苷酸。任选地，两个CpG寡核苷酸序列在它们的3′末端相连，形成“免疫聚合体(immunomer)”。参见例如参考文献112和116-118。

细菌ADP-核糖基化毒素及其解毒衍生物可用作本发明的佐剂。蛋白质优选来源于大肠杆菌(大肠杆菌热不稳定肠毒素“LT”)、霍乱(“CT”)或百日咳(“PT”)。参考文献119描述了作为粘膜佐剂的解毒ADP-核糖基化毒素的应用，参考文献120描述了作为胃肠外佐剂的解毒ADP-核糖基化毒素的应用。毒素或类毒素优选为含有A和B这两种亚基的全毒素形式。优选地，A亚基含有解毒突变；优选地，B亚基未突变。优选地，佐剂为解毒的LT突变体，例如LT-K63、LT-R72和LT-G192。ADP-核糖基化毒素及其解毒衍生物(特别是LT-K63和LT-R72)作为佐剂的应用可见于参考文献121-128。用于氨基酸取代的数值基准优选基于参考文献129中陈述的ADP-核糖基化毒素的A和B亚基比对，参考文献129特地整体纳入本文作为参考。

F.人免疫调节剂

适合用作本发明佐剂的人免疫调节剂包括细胞因子，例如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[130]等)[131]、干扰素(如干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。

G.生物粘合剂和粘膜粘合剂

生物粘合剂和粘膜粘合剂也可用作本发明的佐剂。合适的生物粘合剂包括酯化的透明质酸微球[132]，或者粘膜粘合剂，例如聚(丙烯酸)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素的交联衍生物。壳多糖及其衍生物也可用作本发明的佐剂[133]。

H.微粒

微粒也可用作本发明的佐剂。从生物可降解和无毒的材料(例如聚(α-羟基酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己酸内酯等)、优选聚(丙交酯-共-乙交酯)形成微粒(即100nm到150nm直径、更优选200nm至30μm直径，最优选约500nm至10μμm直径的颗粒)，任选地将微粒处理成具有带负电的表面(例如用SDS)或带正电的表面(例如用阳离子洗涤剂，如CTAB)。

I.脂质体(参考文献81的第13和14章)

适合用作佐剂的脂质体制剂的实例描述于参考文献134-136。

J.聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯制剂

适用于本发明的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[137]。这种制剂还包括组合辛苯聚醇的聚氧乙烯山梨糖醇酐酯表面活性剂[138]以及组合至少一种其它非离子表面活性剂如辛苯聚醇的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂[139]。优选的聚氧乙烯醚选自以下基团:聚氧乙烯-9-月桂酰醚(laureth 9)、聚氧乙烯-9-硬脂酰醚、聚氧乙烯-8-硬脂酰醚、聚氧乙烯-4-月桂酰醚、聚氧乙烯-35-月桂酰醚和聚氧乙烯-23-月桂基醚。

L胞壁酰肽

适合用作本发明佐剂的胞壁酰肽的实例包括N-乙酰基胞壁酰基-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲胞壁酰基(normuramyl)-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)和N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)。

K.聚磷睛(PCPP)

PCPP制剂描述于例如参考文献140和141。

M.咪唑并喹诺酮化合物

适合用作本发明佐剂的咪唑并喹诺酮化合物的实例包括参考文献142和143中进一步描述的咪喹莫特(Imiquamod)及其同系物(例如“雷西莫特(Resiquimod)3M”)。

N.缩氨基硫脲化合物

缩氨基硫脲化合物的实例以及配制、制造和筛选所有适合用作本发明佐剂的化合物的方法包括在参考文献144中所描述的那些。缩氨基硫脲对于刺激人外周血单核细胞产生细胞因子如TNF-α特别有效。

O.色胺酮化合物

色胺酮化合物的实例以及配制、制造和筛选所有适合用作本发明佐剂的化合物的方法包括在参考文献145中所描述的那些。色胺酮化合物对刺激人外周血单核细胞产生细胞因子如TNF-α特别有效。

本发明还可以包括一种或多种以上鉴定的佐剂的各方面的组合。例如，以下佐剂组合物可用于本发明：(1)皂苷和水包油乳剂[146]；(2)皂苷(例如QS21)+无毒的LPS衍生物(例如3dMPL)[147]；(3)皂苷(例如QS21)+无毒的LPS衍生物(例如3dMPL)+胆固醇；(4)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IL-12(任选地+固醇)[148]；(5)3dMPL与例如QS21和/或水包油乳剂的组合[149]；(6)含有10％角鲨烯、0.4％吐温80^TM、5％普朗尼克嵌段聚合物L121和thr-MDP的SAF，其或者被微流化为亚微米乳剂，或者漩涡产生较大粒度的乳剂；(7)Ribi^TM佐剂系统(RAS)，(Ribi Immunochem)，其含有2％角鲨烯、0.2％吐温80和一种或多种来自单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二分枝酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)的细菌细胞壁组分，优选MPL+CWS(Detox^TM)；(8)一种或多种矿物盐(例如铝盐)+LPS的无毒衍生物(例如3dMPL)；和(9)一种或多种矿物盐(例如铝盐)+免疫刺激寡核苷酸(例如含有CpG基序的核苷酸序列)。

参考文献81的第7章公开了用作免疫刺激剂的其它物质。

优选利用氢氧化铝或磷酸铝佐剂，缀合物通常吸附到这些盐上[例如参考文献9的实施例7和8；参考文献10的实施例J]。也可能与铝盐混合而无吸附[27，76]。磷酸钙是另一种优选佐剂。缀合物可以分别与佐剂混合(并任选吸附到佐剂上)，然后将缀合物混合在一起，或者可将缀合物混合在一起，然后再与佐剂混合。

本发明所用组合物的pH优选在6和8之间，更优选约7。可通过利用缓冲液维持稳定的pH。当组合物含有氢氧化铝盐时，优选利用组氨酸缓冲液[150]。组合物可以是无菌和/或无热原的。组合物相对于人体可为等渗的。

组合物可含有防腐剂(例如硫柳汞、2-苯氧基乙醇)，或者可以不含防腐剂。本发明的优选组合物不含任何汞物质，例如它们是无硫柳汞的。

为防止抗原、特别是缀合抗原之间相互干扰，可以包含聚阴离子聚合物，例如聚-L-谷氨酸[151]。

组合物可存在于小瓶中，或者它们可以存在于预填充注射器中。注射器可装有或不装有针头。注射器含有单剂量的组合物，而小瓶可以含有单剂量或多次剂量。可注射的组合物通常可以是液体溶液或混悬液。或者，它们可以固体形式(例如冻干的)存在，在注射前用液体溶媒配制成溶液或混悬液。

组合物可以包装为单位剂量或多剂量形式。就多剂量形式而言，小瓶优于预填充注射器。可常规制定有效的剂量体积，但用于注射的组合物的典型人用剂量为0.5ml体积。

当组合物要在使用前临时配制(例如当组分以冻干形式存在时)并以药盒形式提供时，试剂盒可含有两个小瓶，或者可以含有一个预填充注射器和一个小瓶，在注射前利用注射器的内含物再活化小瓶的内含物。就包含血清群A荚膜糖的组合物而言，则可冻干血清群A糖，而其它血清群的糖可以液体形式存在。

组合物含有免疫有效量的脑膜炎球菌缀合物以及任何其它组分(如有需要的话)。所述“免疫有效量”表示将该量以单剂量或一系列剂量的一部分给予个体在患者中激发抗脑膜炎球菌或抗肺炎链球菌的保护性免疫应答。该量随待治疗个体的健康和身体状况、待治疗个体的年龄、分类学组别(例如非人灵长类、灵长类等)、个体的免疫系统合成抗体的能力、所需保护的程度、疫苗制剂、治疗医生对医学情况的评估以及其它相关因素而变化。期望该用量落在可通过常规试验确定的相对较宽的范围内，每剂中的每种脑膜炎球菌抗原的典型用量为每种血清群/血清型1μg至20μg(根据糖测定)，例如每种血清群/血清型2-10μg。可使用每种血清群/血清型约4μg的剂量(即四价MenACWY混合物中共16μg)。

组合物中载体蛋白的总量优选不超过100μg/剂量，例如≤90μg/剂、≤80μg/剂量、≤70μg/剂量、≤60μg/剂量、≤50μg/剂量等。组合物中载体蛋白的总量通常为至少10μg/剂量。

一般而言，术语“含有”包括“包括”以及“包含”，例如“含有”X的组合物可排它性地由X组成，或者可以包括其它物质，例如X+Y。与数值x相关的术语“约”表示例如x±10％。

词汇“基本上”不排除“完全地”，例如“基本上不含”Y的组合物可以完全不含Y。如有需要，词汇“基本上”可从本发明的定义中省去。

在整个本说明书中，术语“糖”可表示多糖或寡糖，并包括这二者。多糖分离自细菌，或者分离自细菌并通过已知方法、优选通过微流化将尺寸调整至某种程度(参见例如EP497524和EP497525)。多糖可进行尺寸调整，以便降低多糖样品的粘度和/或改善缀合产物的可过滤性。寡糖具有低数量的重复单元(通常5-30个重复单元)，通常为水解的多糖。

参考文献(其内容通过引用结合到本文中)

[1]Armand等，(1982)J.Biol.Stand.10：335-339。

[2]Cadoz等，(1985)Vaccine 3：340-342。

[3]MMWR(1997)46(RR-5)1-10。

[4]Baklaic等，(1983)Infect.I7nmun.42：599-604。

[5]Jones(2001)Curr Odin Investig Drugs 2：47-49。

[6]Costantino等，(1992)Vaccine 10：691-8。

[7]Lieberman等，(1996)JAMS 275：1499-503。

[8]WO2005/000345。

[9]WO02/058737。

[10]WO03/007985。

[11]Rennels等，(2002)Pediatr Infect Dis J21：978-979。

[12]WO2004/013400。

[13]Campbell等，(2002)JInfectDis 186：1848-1851。

[14]Herzenberg等，(1980)Nature 285：664-667。

[15]Schutze等，(1985)JImmunol 135：2319-2322。

[16]Dagan等，(1998)Infectlmmun 66：2093-2098。

[17]Barington等，(1994)Infectlmmun 62：9-14。

[18]Di John等，(1989)lances 2(8677)：1415-8。

[19]Granoff等，(1993)Vaccine增刊：S46-51。

[20]Granoff等，(1994)JAMA 272：1116-1121。

[21]Barington等，(1993)Infect Immun 61：432-438。

[22]澳大利亚专利748716(从WO98/51339授权)。

[23]Olander等，(2001)Vaccine 20 336-341。

[24]Burrage等，(2002)Infect Immun 70：4946-4954。

[25]Peeters等，(1999)InfectImmun 59：3504-3510。

[26]Hoppenbrouwers等，(1999)Vaccine 17：2588-98。

[27]WO02/00249。

[28]WO00/56360。

[29]Reddin等，(2001)FEMSImmunol Med Microbiol 31：153-162。

[30]Podda等，(1991)Vaccine 9：741-745。

[31]Darkes和Plosker(2002)Paediatr Drugs 4：609-630。

[32]Vaccine，(Plotkin和Orenstein编辑)，第4版，2004，ISBN：0-7216-9688-0。

[33]Del Guidice等，(1998)Molecular Aspects of Medicine 19：1-70。

[34]作者不详(2002年1月)Research Disclosure，453077。

[35]Anderson(1983)Infect lmmun 39(1)：233-238。

[36]Anderson等，(1985)J Clin Invest 76(1)：52-59。

[37]Ramsay等，(2001)Lances 357(9251)：195-196。

[38]Lindberg(1999)Vaccine 17增刊2：S28-36。

[39]Buttery和Moxon(2000)JR Coll Physicians Lond 34：163-168。

[40]Ahmad和Chapnick(1999)Infect Dis Clin North Am 13：113-33，vii。

[41]Goldblatt(1998)J.Med.Microbiol.47：563-567。

[42]欧洲专利0477508。

[43]美国专利5,306,492。

[44]WO98/42721。

[45]Dick等，载于Conjugate Vaccine(Cruse等编辑，)Karger，Basel，1989，10：48-114。

[46]Hermanson Bioconjugate Techniques，Academic Press，SanDiego(1996)ISBN：0123423368。

[47]WO03/080678。

[48]Glode等，(1979)Jlnfect Dis 139：52-56。

[49]WO94/05325；美国专利5,425,946。

[50]英国专利申请0323103.2。

[51]WO99/42130

[52]WO96/40242。

[53]Lees等，(1996)Vaccine 14：190-198。

[54]WO95/08348。

[55]美国专利4,882,317。

[56]美国专利4,695,624。

[57]Porro等，(1985)Mol Immunol 22：907-919。

[58]EP-A-0208375。

[59]WO00/10599。

[60]Gever等，Med.Microbiol.Immunol，165：171-288(1979)。

[61]美国专利4,057,685。

[62]美国专利4,673,574、4,761,283、4,808,700。

[63]美国专利4,459,286。

[64]美国专利4,965,338。

[65]美国专利4,663,160。

[66]美国专利4,761,283。

[67]美国专利4.356,170。

[68]Balmer和Borrow(2004)Expert Rev Vaccines 3：77-87。

[69]Watson(2000)Pediatr infect Dis J 19：331-332。

[70]Rubin(2000)Pediatr Clin North Am 47：269-285，v。

[71]Jedrzejas(2001)Alicrobiol Mol Biol Rev 65：187-207。

[72]Zielen等，(2000)Infect.Immun.68：1435-1440。

[73]Kanra等，(1999)The Turkish Journal of Paediatrics42：421-427。

[74]Ravenscroft等，(2000)Dev Biol(Basel)103：35-47。

[75]WO97/00697。

[76]WO96/37222；美国专利6,333,036。

[77]WO2004/032958

[78]Gennaro(2000)Remington：The Science and Practice ofPharmacy第20版，ISBN：0683306472。

[79]Almeida和Alpar(1996)J.Drug Targeting 3：455-467。

[80]Agarwal和Mishra(1999)Indian JExp Biol 37-6-16。

[81]Vaccine Design(1995)Powell和Newman编辑，ISBN：030644867X.Plenum。

[82]WO00/23105。

[83]WO90/14837。

[84]美国专利5,057,540。

[85]WO96/33739。

[86]EP-A-0109942。

[87]WO96/11711。

[88]WO00/07621。

[89]Barr等，(1998)Idvanced Drug Delivey Reviews 32：247-271。

[90]Sjolanderet等，(1998)Advanced Drug Delivery Reviews32：321-338。

[91]Nilkura等，(2002)Virology 293：273-280。

[92]Lenz等，(2001)Jlmmunol 166：5346-5355。

[93]Pinto等，(2003)J 1nfect Dis 188：327-338。

[94]Gerber等，(2001)Virol 75：4752-4760。

[95]WO03/024480。

[96]WO03/024481。

[97]Gluck等，(2002)Vaccine 20：B10-B16。

[98]EP-A-0689454。

[99]Johnson等，(1999)BioorgMed Chem Lett 9：2273-2278

[100]Evans等，(2003)Expert Rev Vaccines 2：219-229。

[101]Meraldi等，(2003)Vaccine 21：2485-2491。

[102]Pajak等，(2003)Vaccine 21：836-842。

[103]Kandimalla等，(2003)Nucleic Acids Research 31：2393-2400。

[104]WO02/26757。

[105]WO99/62923。

[106]Krieg(2003)Nature Medicine 9：831-835。

[107]McCluskie等，(2002)FEMS Immunology and MedicalMicrobiology 32：179-185。

[108]WO98/40100。

[109]美国专利6,207,646。

[110]美国专利6,239,116。

[111]美国专利6,429,199。

[112]Kandimalla等，(2003)Biochemical Society Transactions 31(第3部分)：654-658。

[113]Blackwell等，(2003)JImmunol 170：4061-4068。

[114]Krieg(2002)Trends Immunol 23：64-65。

[115]WO01/95935。

[116]Kandimalla等，(2003)BBRC 306：948-953。

[117]Bhagat等，(2003)BBRC 300：853-861。

[118]WO03/035836。

[119]WO95/17211。

[120]WO98/42375。

[121]Beignon等，(2002)Infectlmmun 70：3012-3019。

[122]Pizza等，(2001)Vaccine 19：2534-2541。

[123]Pizza等，(2000)Int JMed Microbiol 290：455-461。

[124]Scharton-Kersten等，(2000)Infect lmmun 68：5306-5313。

[125]Ryan等，(1999)lnfectlmmun 67：6270-6280。

[126]Partidos等，(1999)Immunol Lett 67：209-216。

[127]Peppoloni等，(2003)Expert Rev Vaccines 2：285-293。

[128]Pine等，(2002)J Control Release 85：263-270。

[129]Domenighini等，(1995)Mol Microbiol 15：1165-1167。

[130]WO99/40936。

[131]WO99/44636。

[132]Singh等(2001)J Cont Release 70：267-276。

[133]WO99/27960。

[134]美国专利6,090,406。

[135]美国专利5,916,588。

[136]EP-A-0626169。

[137]WO99/52549。

[138]WO01/21207。

[139]WO01/21152。

[140]Andrianov等，(1998)Biomaterials 19：109-115。

[141]Payne等，(1998)AdvDrugDeliveryReview 31：185-196。

[142]Stanley(2002)Clin Exp Dermatol 27：571-577。

[143]Jones(2003)Curr Opin Investig Drugs 4：214-218。

[144]WO04/60308。

[145]WO04/64759。

[146]WO99/11241。

[147]WO94/00153。

[148]WO98/57659。

[149]欧洲专利申请0835318、0735898和0761231。

[150]WO03/009869。

[151]WO2004/110480。

[152]Olander等，(2002)Vaccine 20：336-41。

[153]McVernon等，(2003)Vaccine 21：2573-9。

[154]Chippaux等，(2004)Vaccine 22：3303-11。

Claims

1.一种用于免疫人类患者以抵御脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)所致疾病的方法，所述方法包括给予人类患者包含以下至少两项的组合物的步骤：(a)(i)血清群A脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素或其衍生物的缀合物；(b)(i)血清群C脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素或其衍生物的缀合物；(c)(i)血清群W135脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素或其衍生物的缀合物；和(d)(i)血清群Y脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素或其衍生物的缀合物，其中所述患者已用以下物质预免疫：(a)破伤风类毒素或其衍生物和/或(b)(i)非脑膜炎奈瑟氏球菌的生物的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素或其衍生物的缀合物。

2.一种用于免疫人类患者以抵御脑膜炎奈瑟氏球菌所致疾病的方法，所述方法包括给予人类患者包含以下至少两项的组合物的步骤：(a)(i)血清群A脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素的缀合物；(b)(i)血清群C脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素的缀合物；(c)(i)血清群W135脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素的缀合物；和(d)(i)血清群Y脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素的缀合物，其中所述患者已用以下物质预免疫：(a)破伤风类毒素和/或(b)(i)非脑膜炎奈瑟氏球菌的生物的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素的缀合物。

3.以下的至少两项在制造用于免疫人类患者以抵御脑膜炎奈瑟氏球菌所致疾病的药物中的用途：(a)(i)血清群A脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素或其衍生物的缀合物；(b)(i)血清群C脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素或其衍生物的缀合物；(c)(i)血清群W135脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素或其衍生物的缀合物；和(d)(i)血清群Y脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素或其衍生物的缀合物，其中所述患者已用以下物质预免疫：(a)破伤风类毒素或其衍生物和/或(b)(i)非脑膜炎奈瑟氏球菌的生物的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素或其衍生物的缀合物。

4.以下的至少两项在制造用于免疫人类患者以抵御脑膜炎奈瑟氏球菌所致疾病的药物中的用途：(a)(i)血清群A脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素的缀合物；(b)(i)血清群C脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素的缀合物；(c)(i)血清群W135脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素的缀合物；和(d)(i)血清群Y脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素的缀合物，其中所述患者已用以下物质预免疫：(a)破伤风类毒素和/或(b)(i)非脑膜炎奈瑟氏球菌的生物的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素的缀合物。

5.权利要求1或2的方法，其中所述组合物包含(a)和(b)、(b)和(d)、或者(a)、(b)、(c)和(d)全部4种。

6.权利要求3或4的用途，其中所述用途为(a)和(b)、(b)和(d)、或者(a)、(b)、(c)和(d)全部4种的用途。

7.任一项前述权利要求的方法或用途，其中所述患者已用包含破伤风类毒素的疫苗预免疫。

8.任一项前述权利要求的方法或用途，其中所述患者已用包含Hib缀合物的疫苗预免疫。

9.任一项前述权利要求的方法或用途，其中所述患者已用包含至少一种肺炎球菌缀合物的疫苗预免疫。

10.任一项前述权利要求的方法或用途，其中所述患者在所述方法或用途前至少0.5、1、2、4或6个月已被预免疫。

11.权利要求10的方法或用途，其中所述患者在所述方法或用途前至少8年已被预免疫。

12.任一项前述权利要求的方法或用途，其中所述预免疫发生在患者出生后1年内。

13.任一项前述权利要求的方法或用途，其中在脑膜炎球菌缀合物(a)至(d)中的糖短于在脑膜炎球菌中观察到的天然荚膜糖。

14.任一项前述权利要求的方法或用途，其中所述脑膜炎球菌缀合物包含破伤风类毒素载体和己二酸接头。

15.权利要求14的方法或用途，所述方法或用途包含不超过50μg的破伤风类毒素载体。

16.任一项前述权利要求的方法或用途，其中所述组合物或药物还包含肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的缀合荚膜糖。

17.任一项前述权利要求的方法或用途，其中所述组合物或药物还包含乙型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type B)的缀合荚膜糖。

18.任一项前述权利要求的方法或用途，其中所述组合物或药物还包含脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B的蛋白质抗原。

19.任一项前述权利要求的方法或用途，其中所述组合物或药物包含氢氧化铝佐剂和/或磷酸铝佐剂。

20.任一项前述权利要求的方法或用途，其中所述脑膜炎奈瑟氏球菌所致疾病为脑膜炎球菌性脑膜炎。

21.权利要求1-6的方法或用途，其中：

-所述患者在所述方法或用途前至少5年已用包含破伤风类毒素的疫苗预免疫；

-脑膜炎球菌缀合物包含破伤风类毒素载体和任选的己二酸接头；

-脑膜炎球菌缀合物以2-15μg/ml(以脑膜炎球菌糖检测)/血清群存在；

-至少一种缀合物的糖:载体重量比率为约1:3；以及

-所述药物包含20-50μg/ml破伤风类毒素。

22.一种用于免疫人类患者以抵御肺炎链球菌所致疾病的方法，所述方法包括给予人类患者包含至少7、10、11、13或14种不同肺炎链球菌荚膜糖血清型的缀合物的组合物的步骤，所述缀合物中的至少一种与白喉类毒素或CRM197或其衍生物缀合，其中所述患者已用以下物质预免疫：(a)白喉类毒素或其衍生物和/或(b)(i)非肺炎链球菌的生物的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或CRM197或其衍生物的缀合物。

23.一种用于免疫人类患者以抵御肺炎链球菌所致疾病的方法，所述方法包括给予人类患者包含至少7、10、11、13或14种不同肺炎链球菌荚膜糖血清型的缀合物的组合物的步骤，所述缀合物中的至少一种与破伤风类毒素或其衍生物缀合，其中所述患者已用以下物质预免疫：(a)破伤风类毒素或其衍生物和/或(b)(i)非肺炎链球菌的生物的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素或其衍生物的缀合物。

24.一种用于免疫人类患者以抵御肺炎链球菌所致疾病的方法，所述方法包括给予人类患者包含至少7、10、11、13或14种不同肺炎链球菌荚膜糖血清型的缀合物的组合物的步骤，所述缀合物中的至少一种与破伤风类毒素或其衍生物缀合，以及所述缀合物中的至少一种与白喉类毒素或CRM197或其衍生物缀合，其中所述患者已用以下物质预免疫：(a)破伤风类毒素或其衍生物和/或(b)(i)非肺炎链球菌的生物的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素或其衍生物的缀合物和(c)白喉类毒素或其衍生物和/或(d)(i)非肺炎链球菌的生物的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或CRM197或其衍生物的缀合物。

25.至少7、10、11、13或14种不同肺炎链球菌荚膜糖血清型的缀合物在制造用于免疫人类患者以抵御肺炎链球菌所致疾病的药物中的用途，所述缀合物中的至少一种与白喉类毒素或CRM197或其衍生物缀合，其中所述患者已用以下物质预免疫：(a)白喉类毒素或其衍生物和/或(b)(i)非肺炎链球菌的生物的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或CRM197或其衍生物的缀合物。

26.至少7、10、11、13或14种不同肺炎链球菌荚膜糖血清型的缀合物在制造用于免疫人类患者以抵御肺炎链球菌所致疾病的药物中的用途，所述缀合物中的至少一种与破伤风类毒素或其衍生物缀合，其中所述患者已用以下物质预免疫：(a)破伤风类毒素或其衍生物和/或(b)(i)非肺炎链球菌的生物的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素或其衍生物的缀合物。

27.至少7、10、11、13或14种不同肺炎链球菌荚膜糖血清型的缀合物在制造用于免疫人类患者以抵御肺炎链球菌所致疾病的药物中的用途，所述缀合物中的至少一种与破伤风类毒素或其衍生物缀合，并且所述缀合物中的至少一种与白喉类毒素或CRM197或其衍生物缀合，其中所述患者已用以下物质预免疫：(a)破伤风类毒素或其衍生物和/或(b)(i)非肺炎链球菌的生物的荚膜糖和(ii)破伤风类毒素或其衍生物的缀合物和(c)白喉类毒素或其衍生物和/或(d)(i)非肺炎链球菌的生物的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或CRM197或其衍生物的缀合物。

28.权利要求22-27的方法或用途，其中脑膜炎球菌荚膜糖缀合物不存在于所述组合物或药物中。

29.权利要求22-28的方法或用途，其中所述患者已用包含白喉类毒素的疫苗预免疫。

30.权利要求22-29的方法或用途，其中所述患者已用包含破伤风类毒素的疫苗预免疫。

31.权利要求22-30的方法或用途，其中所述患者已用包含Hib缀合物的疫苗预免疫。

32.权利要求22-31的方法或用途，其中所述患者已用包含至少一种脑膜炎球菌荚膜糖缀合物的疫苗预免疫。

33.权利要求22-32的方法或用途，其中所述患者在所述方法或用途前至少0.5、1、2、4或6个月被预免疫。

34.权利要求33的方法或用途，其中所述患者在所述方法或用途前至少8年被预免疫。

35.权利要求22-34的方法或用途，其中所述预免疫在患者出生的1年内发生。

36.权利要求22-35的方法或用途，其中在肺炎链球菌缀合物中的至少一种糖短于在肺炎链球菌中观察到的天然荚膜糖。

37.权利要求22-36的方法或用途，其中至少一种肺炎链球菌缀合物包含白喉类毒素载体和任选的己二酸接头。

38.权利要求22-37的方法或用途，其中至少一种肺炎链球菌缀合物包含CRM197载体和任选的己二酸接头。

39.权利要求22-38的方法或用途，其中至少一种肺炎链球菌缀合物包含破伤风类毒素载体和任选的己二酸接头。

40.权利要求37或38的方法或用途，所述方法或用途包含不超过60μg的白喉类毒素或CRM197载体。

41.权利要求39的方法或用途，所述方法或用途包含不超过50μg的破伤风类毒素载体。

42.权利要求22-41的方法或用途，其中所述组合物或药物还包含乙型流感嗜血杆菌的缀合荚膜糖。

43.权利要求22-42的方法或用途，其中所述组合物或药物还包含脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B的蛋白质抗原。

44.权利要求22-43的方法或用途，其中所述组合物或药物包含氢氧化铝佐剂和/或磷酸铝佐剂。

45.一种用于免疫人类患者以抵御脑膜炎奈瑟氏球菌、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)和肺炎链球菌所致疾病的方法，所述方法包括按照以下给药程序给予人类患者以下疫苗的步骤：

第1次就诊第2次就诊第3次就诊第4次就诊 DTP X X Strep X X MenC X X

其中就诊全部发生在生命的最初8个月，

其中每次连续就诊之间有至少2周，

其中DTP包含DT、TT以及全细胞(Pw)或无细胞(Pa)百日咳抗原，

其中MenC包含缀合的血清群C脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖，

46.一种用于免疫人类患者以抵御脑膜炎奈瑟氏球菌、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)和肺炎链球菌所致疾病的方法，所述方法包括按照以下给药程序给予人类患者以下疫苗的步骤：

第1次就诊第2次就诊第3次就诊第4次就诊 DTP X X X Strep X X MenC X 任选X

其中就诊全部发生在生命的最初8个月，

其中每次连续就诊之间有至少2周，

其中DTP包含DT、TT以及全细胞(Pw)或无细胞(Pa)百日咳抗原，

其中MenC包含缀合的血清群C脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖，

47.一种用于免疫人类患者以抵御脑膜炎奈瑟氏球菌、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)和肺炎链球菌所致疾病的方法，所述方法包括按照以下给药程序给予人类患者以下疫苗的步骤：

第1次就诊第2次就诊第3次就诊 DTP X X X Strep X X

MenC X X

其中就诊全部发生在生命的最初8个月，

其中每次连续就诊之间有至少2周，

其中DTP包含DT、TT以及全细胞(Pw)或无细胞(Pa)百日咳抗原，

其中MenC包含缀合的血清群C脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖，

48.权利要求45-47的方法，其中第1、2、和3次就诊发生在2、3、4月龄；3、4、5月龄；2、4、6月龄；或6、10、14周龄。

49.权利要求45-48的方法，其中第4次就诊发生在5月龄。

50.权利要求45-49的方法，其中DTP、MenC和Strep作为单独注射于任何一次就诊时给予。

51.权利要求45-49的方法，其中DTP、MenC和Strep作为联合疫苗于任何一次就诊时给予。

52.权利要求45-51的方法，其中MenB、脑膜炎奈瑟氏球菌亚单位蛋白疫苗或脑膜炎奈瑟氏球菌外膜囊泡疫苗(优选由血清群B株分离)在第1次就诊和第3次就诊时给予。

53.权利要求52的方法，其中MenB作为加强剂量在11-15月龄再一次就诊时给予。

54.权利要求45-53的方法，其中DTP作为加强剂量在11-15月龄再一次就诊时给予。

55.权利要求45-54的方法，其中MenC作为加强剂量在11-15月龄再一次就诊时给予。

56.权利要求45-55的方法，其中Strep作为加强剂量在11-15月龄再一次就诊时给予。

57.权利要求45-56的方法，其中DTP还包含HepB表面抗原(任选吸附到磷酸铝上)。

58.权利要求45-57的方法，其中DTP还包含失活的脊髓灰质炎病毒。

59.权利要求45-58的方法，其中MenC还包含缀合的血清群A脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖，所述荚膜糖任选地与MenC一样缀合至相同蛋白载体。

60.权利要求45-59的方法，其中MenC还包含缀合的血清群Y脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖，所述荚膜糖任选地与MenC一样缀合至相同蛋白载体。

61.权利要求45-60的方法，其中MenC还包含缀合的血清群W135脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖，所述荚膜糖任选地与MenC一样缀合至相同蛋白载体。

62.权利要求45-61的方法，其中MenC还包含缀合的乙型流感嗜血杆菌荚膜糖，所述荚膜糖任选地与MenC一样缀合至相同蛋白载体。

63.权利要求45-61的方法，其中DTP还包含缀合的乙型流感嗜血杆菌荚膜糖，所述荚膜糖任选地与MenC一样缀合至相同蛋白载体。

64.权利要求45-63的方法，其中至少一种荚膜糖与MenC和Strep疫苗中的TT缀合。

65.权利要求45-64的方法，其中至少一种荚膜糖与MenC和Strep疫苗中的DT缀合。

66.权利要求45-65的方法，其中至少一种荚膜糖与MenC和Strep疫苗中的CRM197缀合。

67.权利要求45-66的疫苗在制造用于免疫人类患者以抵御脑膜炎奈瑟氏球菌、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)和肺炎链球菌所致疾病的药物中的用途，其中所述患者按照权利要求45-67的接种程序给予疫苗。

68.一种药盒，所述药盒含有权利要求45-67中第1次就诊疫苗给予所需的所有疫苗及其使用说明书。

69.一种药盒，所述药盒含有权利要求45-67中第2次就诊疫苗给予所需的所有疫苗及其使用说明书。

70.一种药盒，所述药盒含有权利要求45-67中第3次就诊疫苗给予所需的所有疫苗及其使用说明书。