CN1961973A

CN1961973A - 一种新型纳米骨修复材料及其制备方法

Info

Publication number: CN1961973A
Application number: CN 200510110167
Authority: CN
Inventors: 汪世龙; 孙晓宇; 葛亮; 张蕤; 杨四川; 苟三怀; 姚思德
Original assignee: Tongji University
Current assignee: Tongji University
Priority date: 2005-11-09
Filing date: 2005-11-09
Publication date: 2007-05-16

Abstract

本发明提供了一种新型纳米骨修复材料，含有下列组分：半水硫酸钙100份；纳米羟基磷灰10份～40份；促凝剂0～3份，上述的骨修复材料还含有0～3.5份的甘露醇；也可以含有30份～70份的固化液。本发明还提供了这种骨修复材料的制备方法。本发明提供的这种可注射可吸收的骨修复材料生物相容性好，具有较高的压缩强度，骨引导性好，在体内可降解可吸收，其降解速度和成骨速度相匹配。

Description

一种新型纳米骨修复材料及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种新型纳米骨修复材料及其制备方法，尤其涉及一种由医用半水硫酸钙与纳米级羟基磷灰石等复合而成的骨修复材料及其制备方法，属于医用材料领域。

背景技术

近年来，骨组织工程学的发展为临床上各种原因的骨缺损，特别是长管状骨大段缺损的治疗带来了希望。广义的组织工程学研究包括三个方面的内容：①种子细胞(干细胞)的选择和诱导；②细胞支架材料的研发；③组织工程化骨的构建。干细胞方面，目前已公认骨髓基质干细胞(BMSCs)、成纤维细胞、胚胎干细胞等都具有成骨定向分化能力，然而迄今为止人们对于干细胞的大量获取、培养、移植和分化调控等重要环节尚无法进行有效的控制。因而现阶段还无法成功地构建一种具有较高成骨能力和血管诱导良好的组织工程骨。而在支架/人工骨研究方面，由于众多新材料的出现，使得支架材料先于干细胞而独立应用临床变为可能。近年已有多种人工骨制品进入市场，对缓解自体骨、异体骨或异种骨来源紧张起到了一定作用。目前已被研究的人工骨材料种类繁多，主要集中于两类：一类是以硫酸钙、碳酸钙、磷酸钙及羟基磷灰石为代表的无机盐；另一类是以壳聚糖(几丁糖)、a-2聚酯类有机高分子材料(PLA、PGA、POE、PCL等)为代表的生物陶瓷。理想的基质材料应具备以下特性：①良好的生物相容性及生物降解性；②骨传导及诱导活性；③满意的机械强度；④可塑型性；⑤能负载大量细胞的高渗透性；⑥支持骨细胞生长和功能分化的表面化学性质与微结构；⑦可与其他活性分子复合共同诱导骨发生：⑧原料来源广泛，生产廉价；⑨容易消毒。但迄今为止尚无一种材料能够满足以上所有要求。鉴于理想的骨修复材料需具备的上述具体要求，但迄今为止尚无一种材料能够满足以上所有要求。传统的人工骨需在体外预制成一定形状后经手术植入，创伤较大。人们认识到，开发微创、高效的新方法及新材料是将来发展的方向，可注射式人工骨(injectable bone substitute，IBS)于是应运而生。IBS所用的材料广泛，从上述无机钙盐到各种聚合有机物都可用作注射，它们的共性是不需手术伤害，在体内可以迅速固化为具有多孔微结构的支架材料并发挥骨传导作用。特别是对于颅面、骨囊肿等表浅病变，IBS的优势特别明显。

在适于骨修复治疗的无机物中，碳酸钙因其降解速度太快，已经被淘汰。而硫酸钙与磷酸钙近年来得到了很高的重视，其优点是：(1)来源广泛，能在实验室或工厂大规模制备；(2)骨传导活性强。医用硫酸钙为半水结晶物(CaSO₄·1/2H₂O，CSH)，该物质无毒，异物反应小，自身虽无骨诱导活性，但在骨膜存在下有成骨效应。体外实验表明，该物质植入体内，由破骨细胞吸收而形成生物降解。3周降解50％，6周留存少许，24周完全消失；(3)具有良好的微孔性，作为支架材料可吸附干细胞、成骨细胞、生物因子或化疗药物。Bai将其与骨形态发生蛋白复合，治疗16例股骨干骨折，取得了良好效果[Bai MH，LiuXY，GE BF et al.IntSurg，1996；81(4)：390～392]。Mousset研究认为，该支架材料可作为糖蛋白、氨基甙类抗生素的载体，在3周内释放药物浓度可以达到治疗水平[Mousset B，Benoit MA，Delloye C et al.IntOrthop，1995；19(3)：157～161]。实验及临床测试证明，硫酸钙不干扰成骨细胞系的增殖分化，单独应用或与自体松质骨混合，形成新生骨质量与植自体髂骨相接近。美国Wright公司专利产品Osteo-set是用α结晶技术改造的手术级半水硫酸钙颗粒，其结构有利于成骨细胞附着、扩散，并能有效地阻止软组织向缺损部位生长。Osteo-set已于1996年6月获FDA及CE批准上市，在骨折修复、脊柱融合等领域获得广泛应用，证明为安全有效。在此基础上又开发出了可注射半水硫酸钙(Minimally Invasive Injectable Graft，MIIG115)，也已获准上市。该剂型使用前用水性溶剂调和成凝胶状，直接注射于缺损部，5分钟左右硬化并转变成二水硫酸钙(CaSO₄·2H₂O，CSD)，后者经10～12周完全吸收。使用该注射剂型治疗表浅颅面骨缺损及骨囊肿，缺损修复速度明显提高。硫酸钙的缺点是质地较脆，体内机械强度欠佳。近年出现的新型强化型注射式硫酸钙，用于椎体缺损填补，强度与骨水泥接近，但它不具备生物降解及新生骨替代等一系列生物活性。

硫酸钙人工骨可以与多种成骨因子复合，提高成骨能力。目前主要的市售制剂是含脱钙骨基质(DBM)的Osteo-set颗粒，Urban等曾以此成功修复犬的大段肱骨缺损，新生骨小梁的面积、强度符合要求[Urban RM，Turner TM，Hall DJ et al.Orthopedics，2003；26(5)：581～584]。相应的临床试验也已展开，但复合DBM的硫酸钙用于人体，其免疫原性及潜在的传播疾病危险性也有一些争议。

混合IBS的机械强度和人体松质骨相当，适合于椎体、囊性空洞等部位的治疗。混合型人工骨的强度主要取决于三个因素：溶剂-粉末(L/P)比例、羟基磷灰石理化性质和羟基磷灰石的含量。低L/P比有助于提高固化后的机械强度，但会降低整体注射性能。HA的形貌和粒径影响强度。硫酸钙/羟基磷灰石混合IBS的研究一直是近年来的热点。人体骨组织的主要成分是纳米级的羟基磷灰石(Hydroxyapatite，HA)，其化学式是Ca₁₀(P0₄)₆(OH)₂。本发明的立足点就是将医用硫酸钙与纳米级的羟基磷灰石复合，再加入其他组分或者调整配比来改变凝固时间和压缩强度，制成了效果比较理想的可注射可吸收的复合骨修复材料。

发明内容

本发明提供了一种新型纳米骨修复材料及其制备方法，这种骨修复材料生物相容性好，具有较高的压缩强度，骨引导性好，在体内可降解可吸收，其降解速度和成骨速度相匹配。

本发明提供了一种新型纳米骨修复材料，其含有下列组分：

半水硫酸钙 100份

纳米羟基磷灰石 10份～40份

促凝剂 0～3份

进一步的，本发明提供的新型纳米骨修复材料，其含有下列组分：

半水硫酸钙 100份

纳米羟基磷灰石 20～30份

促凝剂 1～2份

进一步的，本发明提供的新型纳米骨修复材料，还含有0～3.5份甘露醇，当上述的可注射可吸收的骨修复材料中含有甘露醇时，所述的骨修复材料为疏松的多孔性骨材料，孔隙率在30～70％之间。这是因为甘露醇在体内可以逐渐溶解，并且其溶解的速度比骨材料的吸收速度快，所以原来甘露醇所在的部位就成为孔隙，调整骨材料中甘露醇的含量，就可以得到不同空隙率的骨材料。

更进一步，本发明所提供的新型纳米骨修复材料，还含有30份～70份的固化液。

上述的新型纳米骨修复材料中的促凝剂为二水硫酸钙，还可以是硫酸钾、硫酸铵或氯化钠等。

上述的新型纳米骨修复材料中的固化液为PH值为7.35～7.45的缓冲液，可以是磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液，也可以是柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，也可以是磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，还可以是上面几种缓冲液的混合溶液。骨修复材料中含有这种缓冲溶液的作用在于使得材料的初凝和终凝时间间隔缩短并可以提高骨材料硬化后的强度，要调节固化液的PH值为7.35～7.45是因为人体体液的PH值范围介于7.35～7.45之间，使其与人体的PH值范围相符。

上述的新型纳米骨修复材料中所用的半水硫酸钙为sigma公司生产的，纯度为98％。通过透射电子显微镜观察此半水硫酸钙可以发现：单晶的晶粒尺寸为60～100nm，结构是方块状，通过透射电子显微镜得到的照片如图1所示。所使用的透射电子显微镜为日本电子公司生产的JEP1200透射电子显微镜。由于纳米级材料具有表面能大，高静电场和强极化力等特殊理化性质，用做骨修复材料的时候更能吸附氨基酸和蛋白质、葡聚糖等多糖，材料的亲和力好，有助于大大提升材料的修复效果，所以，本发明采用纳米级的半水硫酸钙，得到的修复效果也比使用普通的半水硫酸钙好。

上述的新型纳米骨修复材料中所用的纳米羟基磷灰石其化学式是Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂，其晶体的制备方法如下：

1.称取14.4g Ca(NO₃)₂·4H₂O和6g Na₃PO₄，控制钙磷摩尔比在1.7左右，Ca(NO₃)₂·4H₂O和Na₃PO₄都为分析纯。

2.沉淀方法：将Ca(NO₃)₂·4H₂O在搅拌状态下加入到15g分析纯二甲基乙酰胺中，配成溶液A；将Na₃PO₄溶解于500ml去离子水中，配成溶液B。加热溶液B到70℃，在不断搅拌的状态下缓缓将溶液A滴入溶液B中，滴定完后继续搅拌2h，温度控制在70℃，而后在室温陈化24h，离心，弃上层的清液，用去离子水(或无水乙醇)清洗3次，得磷灰石沉积物的浆液。

3.结晶：向此浆液中逐渐加入4ml二甲基乙酰胺，在100℃加热2h，即可制得纳米羟基磷灰石晶体。

将本试验制备的纳米羟基磷灰石晶体做红外光谱图，得到的光谱图如图3所示，将此光谱图与羟基磷灰石的标准图谱对照，发现与羟基磷灰石的标准图谱完全一致，所以本试验所制备的确实是羟基磷灰石晶体。

将本方法所得到的纳米羟基磷灰石晶体通过透射电子显微镜观察可以发现：单晶的平均晶粒尺寸为70～80nm，结构是短棒状。通过透射电子显微镜得到的照片如图2所示。所使用的透射电子显微镜为日本电子公司生产的JEP1200透射电子显微镜。

由于普通羟基磷灰石存在着在体内长期不能降解完的缺点，而且复合材料里用普通羟基磷灰石，注射性能也不理想。所以本发明尝试采用了纳米级的羟基磷灰石晶体，由于纳米级羟基磷灰石尺寸极小，具有很强的表面能、高静电场、强极化力等特殊理化性质，和普通羟基磷灰石相比亲和力更好，更能吸附氨基酸和蛋白质、葡聚糖等多糖的作用，并且更有利于吸附成骨细胞，取得了比传统的修复材料更好的修复效果。

本发明还提供了上述的新型纳米骨修复材料的制备方法，本方法包括下列步骤：

(1)将100份半水硫酸钙、10份～40份纳米羟基磷灰石和0～3份促凝剂分别研磨，然后加入0～3.5份甘露醇并进行混和；

(2)加入30份～70份固化液，搅拌均匀使其成糊状。

在使用时，将所述的骨修复材料加入固化液并搅拌成糊状，然后将糊状的骨修复材料注射入骨缺损部位，糊状物在4～8min左右初凝，30min内终凝，固化物强度达到最大。也可以直接膏体填充，或者预先固化成型后在手术中植入。

本发明将上述的新型纳米骨修复材料做了材料的降解和吸收试验、MTT细胞毒性实验、压缩强度实验，以评价本发明所提供的骨修复材料的性能，试验方法如下所示：

1.材料的降解和吸收试验

使用模拟人体体液SBF 9#(Simulated Body Fluid)来模拟人体内环境浸泡复合材料以此考察本材料在体内的降解和吸收情况。利用本发明所提供的骨修复材料和普通羟基磷灰石分别制得底面直径8mm，高16mm的圆柱体试样在真空干燥箱中干燥24h，测初重(M₀)，灭菌后(121℃，20min)，在无菌条件下分别浸泡于装有100ml SBF溶液的锥形瓶中，密闭后置于生化培养箱中((37±0.5)℃，试样于每天取样，然后将试样放置于50℃恒温的热风烘干箱中烘干至恒重。称重(精确至0.001g)，记为m₁，，将试样置于新换的模拟液中。重复以上操作，每隔24h测量一次，重量分别记为m₂，m₃，m₄……

由M₀，m₁，m₂，m₃，m₄……可以计算出本材料试样的每天失重量(DWL)、每天失重率(PDWL)，累积失重百分率(CPDWL)以及平均吸收速度(AAR)。然后分别以本材料试样每天失重量(即日失重)、每天失重率(即日失率)和累积失重百分率(即累积失重率)为纵坐标，以时间为横坐标作图。再以平均吸收速度AAR为纵坐标，本复合材料和普通羟基磷灰石做横坐标比较其吸收速度。

其中DWLn＝m_n-1，-m_n，PDWLn＝(DWLn/m₀)*100，

CPDWLn＝PDWLn+CPDWL_n-1，AAR＝M₀/t

材料的降解和吸收曲线如图4，图5，图6所示，从图中可以看出：随着时间的推移，复合材料逐渐降解，降解速度刚开始很快，后来变慢。图7显示本材料降解速度明显要比普通羟基磷灰石快。

除了进行体外模拟浸泡实验之外，还进行了体内肌肉埋植实验。于兔子背部做切口，分离肌肉成一肌袋，植入5mm的柱状凝固样品。于指定观察时间点摄片、取动物宰杀后了解肌肉内埋植物周围炎性反应，术后动物恢复状况良好，埋植周围组织无明显炎症。

2.MTT细胞毒性实验

细胞使用L929小鼠成纤维细胞株，用含10％小牛血清的DMEM(Dulbecco，s ModifiedEagle Medium)培养液，以2.5×10⁴个/孔的浓度接种于96孔板中，每孔体积200μl。所用MTT[溴化-3-(4，5二甲基噻唑-2)-2，5二苯基四唑]为Sigma公司产品。酶标仪ELX 800uv，UNIVERSAL MICROPLATE READER BIO-TEK INSTRUMENTS.INC。

将复合材料的SBF浸泡液按100％、50％、10％、1％的浓度稀释，阴性对照为细胞培养液。细胞经贴壁培养24h后，去除培养液，磷酸缓冲液(PBS)洗，加入20μl不同浓度的SBF浸泡液，37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养。72h后，每孔加入20μl 5mg/ml MTT，37℃培养4h，去除原液，加入150μl二甲基亚砜(DMSO)，震荡10min。用酶标仪测其吸光度值(OD值)，实验波长为490nm。

以阴性对照组的OD值作为100％细胞增殖率，则材料组的细胞增殖率(proliferation％)可用下式计算：

按表1将各浓度组的细胞增殖率转化为0～5级细胞毒性。

表1细胞增殖率与细胞毒性级的对应关系

细胞增殖率(％)	细胞毒性级
细胞增殖率(％)	细胞毒性级	≥100	0
75-99	1	≥100	0
75-99	1	50-74	2
25-49	3	50-74	2
25-49	3	1-24	4
0	5	1-24	4

材料各浓度浸提液与细胞作用后的细胞增殖率与细胞毒性级别见表2

表2材料各浓度浸提液与细胞作用后细胞增殖率(X±SD)

浸提液浓度	1％	10％	50％	100％
浸提液浓度	1％	10％	50％	100％	细胞增殖率(％)	110±0.02	101±0.08	106±0.08	100±0.06

结果显示各浸提液浓度的细胞增殖率均高于100％，细胞毒性均为0级，则可认为该材料具有良好的细胞相容性。

3.压缩强度实验

试样制成底面直径为8mm，高12mm的圆柱体，使用Universal Testing Machine(Instron8511.20)以1mm/min的速度把试样压碎，从而得到试样的压缩强度在20～30Mpa之间，说明本发明所提供的骨修复材料具有很好的压缩强度。

综上所述，本发明的有益效果为：

(1)制备工艺简单，工艺参数容易控制；

(2)原料易得，成本低；

(3)用于手术使用方便快捷，减少病人痛苦；

(4)骨材料生物相容性好，具有较高的压缩强度，骨引导性好；

(5)在体内可降解可吸收，释放的Ca元素为新骨提供Ca源。

附图说明

图1医用半水硫酸钙透射电镜图片

图2纳米羟基磷灰石透射电镜图片

图3纳米羟基磷灰石红外谱图

图4本发明所提供的骨修复材料的日失重与时间的关系曲线

图5本发明所提供的骨修复材料的每天失重率与时间的关系曲线

图6本发明所提供的骨修复材料的累积失重百分率与时间的关系曲线

图7普通的羟基磷灰石与本发明提供的纳米羟基磷灰石的平均吸收速率

具体实施方式

实施例1

将2g半水硫酸钙(CaSO₄·1/2H₂O)，0.2g纳米羟基磷灰石，0.005g二水硫酸钙分别研磨，过400目筛，然后加入0.8g甘露醇，进行混合，充分搅拌，装入注射器针桶中，并将针头处用塞子塞住，向注射器中加入0.6ml磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，搅拌均匀使其成为糊状。将其注射入底面直径为8mm，高为12mm的圆柱形模具里固化，测初凝时间为4min，终凝时间为10min，测得其压缩强度24.5Mpa，细胞毒性实验显示无毒性，体外SBF9#浸泡10天降解完全。

实施例2

将2g半水硫酸钙(CaSO₄·1/2H₂O)，0.8g纳米羟基磷灰石，0.02g二水硫酸钙分别研磨，过400目筛，然后进行混合，充分搅拌，装入注射器针桶中，并将针头处用塞子塞住，向注射器中加入1ml磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液与柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的混合溶液，搅拌均匀使其成为糊状。将其注射入底面直径为8mm，高为12mm的圆柱形模具里固化，测初凝时间5min，终凝时间16min，测得其压缩强度28Mpa，细胞毒性实验显示无毒性，体外SBF9#浸泡14天降解完全。

实施例3

取实施例2配比所制得样品同时行骨内植入实验和肌肉内植入实验。取健康新西兰白兔12只，随机分成4组，每组3只。根据观察时间不同，分别称为A组(半个月组)、B组(1个月组)、C组3个月组)和D组(6个月组)。麻醉、固定后于股骨外侧髁处纵行切开皮肤，显露股骨外侧髁，用4.5mm的钻头从外髁向内侧髁横行钻孔。钻穿后，冲净骨屑，测量骨洞的距离，然后将实施例3中制备的骨材料调和后注射入骨洞内，逐层缝台切口。骨内植人后，于同侧肢体的臀外侧部另做切口，分离肌肉成一肌袋，植入5mm的柱状凝固样品。于指定观察时间点摄片、取动物宰杀后了解肌肉内埋植物周围炎性反应。术后动物均未见化脓或异常渗出，生物相容性好。术后半个月材料表面开始降解，一个月新骨向材料内生长，三个月后材料的降解和新骨的生长更为明显；六个月后材料基本上完全降解并被新生骨替代。

实施例4

取实施例1样品行骨缺损植入实验。取健康新西兰白兔12只，随机分成2组，每组6只。分别称为A组(本复合材料)、B组(普通羟基磷灰石材料)，每组动物均为左右侧自身对照。麻醉、固定后于两侧尺骨外作纵行短切口，切开软组织，显露尺骨骨干，于骨干中部截断，测量骨端距离(1～2mm左右)，左侧缝合，将指定样品调和后注射右侧骨折间隙内，逐层缝合切口。术后动物均未见化脓或异常渗出，生物相容性好。A组术后半个月材料表面开始降解，一个月新骨向材料内生长，三个月后材料的降解和新骨的生长更为明显；六个月后材料基本上完全降解并被新生骨替代。B组一个月材料表面开始降解，12个月材料还有些残余。成骨速度A组最快，B组次之，空白最慢。

Claims

1.一种新型纳米骨修复材料，其特征在于含有下列组分：

半水硫酸钙 100份

纳米羟基磷灰石 10份～40份

促凝剂 0～3份。

2.根据权利要求1所述的新型纳米骨修复材料，其特征在于含有下列组分：

半水硫酸钙 100份

纳米羟基磷灰石 20～30份

促凝剂 1～2份。

3.根据权利要求1所述的新型纳米骨修复材料，其特征在于还含有0～3.5份的甘露醇。

4.根据权利要求1所述的新型纳米骨修复材料，其特征在于还含有30份～70份的固化液。

5.根据权利要求4所述的新型纳米骨修复材料，其特征在于所述的固化液可以是磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，还可以是上面几种缓冲液的混合溶液。

6.根据权利要求1～4所述的新型纳米骨修复材料，其特征在于所述的促凝剂为二水硫酸钙、硫酸钾、硫酸铵或氯化钠。

7.根据权利要求1～4所述的新型纳米骨修复材料，其特征在于所述的半水硫酸钙单晶的晶粒尺寸为60～100nm，结构是方块状。

8.根据权利要求1～4所述的新型纳米骨修复材料，其特征在于所述的纳米羟基磷灰石的化学式为Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂。

9.根据权利要求1～4所述的新型纳米骨修复材料，其特征在于所述的纳米羟基磷灰石单晶的平均晶粒尺寸为70～80nm，结构是短棒状。

10.根据权利要求1～9所述的新型纳米骨修复材料的制备方法，包括下列步骤：

(1)将100份半水硫酸钙、10份～40份纳米羟基磷灰石、0～3份促凝剂和0～3.5份甘露醇进行混和；

(2)加入30份～70份固化液。