CN103920193B - 一种载生物活性因子的类骨陶瓷复合材料的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种载生物活性因子的类骨陶瓷复合材料的制备方法,包括以下步骤:步骤1,制备改性煅烧骨材料;步骤2,用三蒸水配制10～30mg/ml的羧甲基壳聚糖水溶液,并调节其pH在5.8～6.5的范围;步骤3,取调pH后的羧甲基壳聚糖水溶液、改性煅烧骨材料、骨形态发生蛋白并混合，均匀混合后塑型，然后在50℃～60℃干燥即制得载生物活性因子的类骨陶瓷复合材料。利用本发明方法制备的载生物活性因子的类骨陶瓷复合材料的降解周期符合骨形成和骨改建的过程，其降解性能适合作为人工骨替代材料。该材料与两种组织工程种子细胞骨髓间充质干细胞共培养无细胞毒性，能促进细胞的增殖与分化。

Description

一种载生物活性因子的类骨陶瓷复合材料的制备方法

技术领域

本发明属于生物活性复合陶瓷领域，特别是涉及一种载生物活性因子BMP-2类骨陶瓷复合材料的制备方法。

背景技术

虽然骨缺损修复重建的方法很多，但骨缺损后修复重建尤其是大块骨缺损后的修复重建一直是骨科面临的难题。寻求理想的骨修复替代材料一直是骨科及相关学科亟待解决的关键问题。

多年的研究成果表明，在磷灰石陶瓷家族成员中，纳米羟基磷灰石（HA）的晶体结构与骨组织中的矿物质微粒结构基本相同，磷酸钙（TCP）在骨组织中也占有一定比例，其降解速率远大于HA，在体内易于降解。降解速率除与化学组分有关外，还与其与体液间的接触面积相关。多孔磷灰石陶瓷的最佳设计原则在于兼顾降解速率及有利于新生骨组织的长入，即既要300μm-500μm的大孔、又要微米级的微孔结构。尽管钙磷陶瓷的成型制作技术有了大的发展，如计算机控制的三维陶瓷打印技术。然而在读取天然骨组织的结构信息时，仍受到测量表征技术及加工技术的限制，缩短与天然骨组织的差距仍是一个长期的努力目标。

煅烧骨是现有骨修复材料之一，既保留了无机钙磷矿物质，又基本保留了骨组织的多孔结构，在临床应用中得到了较好的评价。但强度较差，由于经高温烧成，完全失去了胶原蛋白，纳米晶体发生了改变，不易降解。

在骨诱导理论提出以及成功地提取出具有高效诱导成骨能力的骨形态发生蛋白(BMP)以后，为骨修复替代材料的研制与开发开拓了一个新的领域。骨形成是一个复杂而连续的过程，许多骨生长因子参与了骨形成的局部调节。从胚胎发育到老年，骨组织始终在进行新陈代谢，即骨的改建过程。参与骨形成的细胞主要有成骨细胞(osteoblast)和软骨细胞(chrondrocyte)。正常情况下，局部发生的骨形成和骨吸收是交替循环的，即新骨取代旧骨。细胞因子的生物学活性是由受体介导的。骨和软骨中存在着与各种细胞因子相对应的特异性受体。与其它组织一样，骨和软骨内细胞因子的受体也多为分子量较大的糖蛋白。BMP是一种酸性多肽，在酸性条件下较为稳定，pH大于8.5则易失活，BMP可耐受55℃-75℃的温度，但对放射线较为敏感，0.002mGy的放射线可使其失活。BMP的主要生物学作用是诱导未分化的间充质细胞不可逆的分化形成软骨和骨，从而导致新骨的形成。

近年来的研究已经阐明这些细胞因子主要作用的生化和分子基础，同时也提供了有关它们之间相互作用的机理。随着对细胞因子在骨代谢中作用机制的认识，预示着这些细胞因子在骨折愈合及骨缺损修复以及某些骨吸收性疾病的诊断和治疗中有着乐观的应用前景。

壳聚糖(chitosan，CS)是由甲壳素经脱乙酰化反应而得到，是目前已知的天然多糖中唯一的碱性多糖，它具有良好的生物相容性、生物降解性、无毒及抗菌性等特点，受到医学界广泛的关注。羧甲基壳聚糖（CMCS）是新型的壳聚糖衍生物，由甲壳质在碱性条件下与氯乙酸反应而得到。与甲壳质相比，其物理、化学性质均得到优化，具有完全水溶性、成膜性及极强的与钙离子的螯合作用，大大拓展了其在医学领域的应用。

在骨缺损的修复治疗中，磷灰石陶瓷具有与骨组织无机成分相同的组分，生物相容性好，但性脆强度不高，临床应用受到大的限制。随着研究的不断深入，特别是理想的骨组织工程支架材料的提出，尽力模仿骨组织的天然结构成为了当今骨修复材料设计与制作的重要原则。支架材料的研究是骨组织工程研究的关键问题，骨组织工程支架材料不仅要有良好的生物相容性、一定的机械强度及三维多孔的立体结构，有力于新生骨组织的长入，还要有合适的降解速率维持新生组织的生长。壳聚糖具有无毒性，良好的生物相容性，可被体内多种生物酶降解，降解产物无毒且能被生物体吸收，壳聚糖已经被证明了是适宜的缓释控载体。羧甲基壳聚糖与壳聚糖相比具有更强的水溶性、成膜性和与钙离子的鳌合作用，拓宽了其作为缓控释载体的应用范围，当其与生物陶瓷复合制作支架材料时，显示了优越的修饰能力。

此外，通过体外试验证明羧甲基壳聚糖能明显缩短组织创面出血时间，具有良好的凝血性，分析原因为CMCS是一种两性聚电解质，在溶液中，氨基能质子化生成阳离子，羧基能电离生成阴离子，两种离子共同作用加速凝血过程缩短了凝血时间。感染也是诱导术后粘连的因素之一，细菌有不同的致粘连能力，如大肠杆菌能引发纤维蛋白分子及白细胞渗出，产生较广泛的粘连。临床上常使用抗生素来控制术区感染，

仅靠单一材料，很难满足以上各项性能的要求，因此人们通常模仿天然骨的成分和结构特征进行仿生制备无机复合或有机杂化支架，壳聚糖的膜结构在模仿天然骨的应用中常常受到重视。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种载生物活性因子类骨陶瓷复合材料的制备方法。本发明将针对现有骨粉强度较差，难于降解，生物活性较差等不足，选用改性煅烧骨粉或颗粒为基体，以羧甲基壳聚糖溶液进行交联，加入骨形态发生蛋白BMP-2，制作成强度较高，易于降解同时具有骨诱导特性的新型骨修复材料。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种载生物活性因子的类骨陶瓷复合材料的制备方法,包括以下步骤:

步骤1,制备改性煅烧骨材料;

步骤2,选用分子量在5000～50000的羧甲基壳聚糖，用三蒸水配制10～30mg/ml的羧甲基壳聚糖水溶液,并调节其pH在5.8～6.5的范围;

步骤3,取调pH后的羧甲基壳聚糖水溶液、改性煅烧骨材料、骨形态发生蛋白混合，使羧甲基壳聚糖:改性煅烧骨材料:骨形态发生蛋白的重量配比在1000:100～300:0.1～0.4，这样可以使复合材料具有最低有效浓度和最高释放浓度。所述原料均匀混合后塑型，在50℃～60℃干燥即制得载生物活性因子的类骨陶瓷复合材料。优选的，羧甲基壳聚糖:改性煅烧骨材料:骨形态发生蛋白的重量配比在1000:100～300:0.15～0.3，使生长因子有效释放。

如上所述的载生物活性因子的类骨陶瓷复合材料的制备方法,优选的,步骤1，选用新生小牛关节头或胫骨的骨骺端作为骨原料，经去离子水充分荡洗后利用改性剂对骨原料行改性，使骨基质的Ca/P原子比降至1.66～1.5；然后在800℃～1100℃温度条件下煅烧改性后的骨原料彻底去除骨材料的免疫抗原性，获得改性煅烧骨材料。采用该优选步骤的的有益效果是：有效提高β磷酸三钙的含量，获得的改性煅烧骨材料中羟基磷灰石（HA）:β磷酸三钙（βTCP）=1:3,提高最终产品的亲水性。

如上所述的载生物活性因子的类骨陶瓷复合材料的制备方法,优选的,所述改性剂选自磷酸氢二铵、磷酸二氢铵和磷酸中的一种或几种。

如上所述的载生物活性因子的类骨陶瓷复合材料的制备方法,优选的,步骤2中,用盐酸或乙酸调节羧甲基壳聚糖水溶液pH至5.8～6.5范围。

如上所述的载生物活性因子的类骨陶瓷复合材料的制备方法,优选的,所述骨形态发生蛋白为BMP-2。

本发明的有益效果是：

1、载生物活性因子的类骨陶瓷复合材料的抗压强度高于煅烧骨材料，更适合用作人工骨替代材料。

2、本发明方法制备材料的凝胶在扫描电镜下成三维多孔结构，壳聚糖大分子交联形成中空的支架，孔隙均匀，结构稳定。

3、在添加改性煅烧骨材料后，最终制品材料的亲水性得到较大提高，是未添加改性煅烧骨材料前空载CS/BMP材料的5倍。

4、载生物活性因子的类骨陶瓷复合材料的降解周期符合骨形成和骨改建的过程，其降解性能适合作为人工骨替代材料。

5、本发明方法制备的载生物活性因子的类骨陶瓷复合材料与两种组织工程种子细胞骨髓间充质干细胞(BMSC)共培养无细胞毒性，能促进细胞的增殖与分化。

附图说明

图1为本发明实施例1制备的载生物活性因子的类骨陶瓷复合材料表面扫描形貌；

图2为本发明实施例1制备的载生物活性因子的类骨陶瓷复合材料断面扫描形貌；

图3为本发明实施例1的载生物活性因子的类骨陶瓷复合材料浸泡液吸光度变化图；

图4为发明实施例1的载生物活性因子的类骨陶瓷复合材料生物相容性检测结果图；

图5为本发明骨块煅烧前后的X射线衍射图谱；

图6为发明实施例1的骨缺损区有新生骨样组织生成图。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1

步骤1,制备改性煅烧骨材料;选用新生小牛关节头作为骨原料，经去离子水充分荡洗并以物理或生物化学的方法基本去除胶原蛋白；然后利用磷酸氢二铵按照化学反应平衡方程配比对骨的基质（骨盐）进行改性，使骨基质的Ca/P原子比降至1.66；然后在1000℃温度条件下煅烧改性后的骨原料彻底去除骨材料的免疫抗原性，获得改性煅烧骨材料。

由骨块煅烧前后的XRD图谱(X射线衍射图谱，图5)可见骨基质晶相由HA改变为HA/β-TCP(Hydroxyapatite/β-tricalcium phosphate，羟基磷灰石:β-磷酸三钙)的双相结构，骨基质晶相羟基磷灰石:β-磷酸三钙=1:3。SEM观察表明，煅烧骨粉既含有300μm-500μm的大孔、又含有微米级的微孔结构。

步骤2,选用分子量在25000的羧甲基壳聚糖，用三蒸水配制20mg/ml的羧甲基壳聚糖水溶液,并用盐酸调节其pH为6.2;

步骤3,取调pH后的羧甲基壳聚糖水溶液、改性煅烧骨材料、骨形态发生蛋白并混合，使羧甲基壳聚糖:改性煅烧骨材料:骨形态发生蛋白的重量配比在1000:200:0.25；均匀混合后塑型，然后在50℃～60℃干燥即制得实施例1的载生物活性因子的类骨陶瓷复合材料，其抗压强度为0.3Mpa。

如图1所示，实施例1的载生物活性因子的类骨陶瓷复合材料的凝胶在扫描电镜下成三维多孔结构，壳聚糖大分子交联形成中空的支架，孔隙均匀，结构稳定。

由于材料的亲水性对于材料的生物相容性影响极大。壳聚糖类材料存在的缺点即其表面为疏水性表面，将阻碍细胞的贴附和增殖。在添加改性骨粉后，人工骨的亲水性得到较大提高，是未添加改性骨粉前空载CS/BMP材料的5倍。

如图3所示，实施例1的载生物活性因子的类骨陶瓷复合材料浸泡液在最初的2周内吸光度变化较小，吸光度值低，从第14天开始材料的吸光度增加加快。表明材料在最初2周内较为稳定，而随着时间增加，材料中壳聚糖形成的网状交联结构解链，松散，材料发生逐渐降解。随后降解度增加，到第6周时可观察到浸泡材料的生理缓冲液中出现明显的絮状凝胶降解产物，到第8周时材料完全松散降解，此后吸光度基本维持不变。

如图4所示，生物相容性检测证明实施例1的载生物活性因子的类骨陶瓷复合材料与两种组织工程种子细胞骨髓间充质干细胞(BMSC)共培养无细胞毒性，能促进细胞的增殖与分化。

按照人工骨植入材料的生物相容性评价方法进行体内试验，证实实施例1的载生物活性因子的类骨陶瓷复合材料有良好的生物相容性，骨诱导性及好的强度。如图6所示，体内试验表明，其植入体内后，在第2周骨缺损区开始有显微血管长入，三周即可形成新生的骨样组织，骨小梁间富于血管，骨髓腔形成，并出现大量的编织骨，新生骨样组织的钙含量明显增高。因此，实施例1的载生物活性因子的类骨陶瓷复合材料的降解周期符合骨形成和骨改建的过程，其降解性能适合作为人工骨替代材料。

实施例2

步骤1,制备改性煅烧骨材料;选用新生小牛关节头作为骨原料，经去离子水充分荡洗并以物理或生物化学的方法基本去除胶原蛋白；然后利用磷酸二氢铵按照化学反应平衡方程配比对骨的基质（骨盐）进行改性，使骨基质的Ca/P原子比降至1.55；然后在1000℃温度条件下煅烧改性后的骨原料彻底去除骨材料的免疫抗原性，获得改性煅烧骨材料。

步骤2,选用分子量在10000的羧甲基壳聚糖，用三蒸水配制10mg/ml的羧甲基壳聚糖水溶液,并用乙酸调节其pH为6.5;

步骤3,取调pH后的羧甲基壳聚糖水溶液、改性煅烧骨材料、骨形态发生蛋白并混合，使羧甲基壳聚糖:改性煅烧骨材料:骨形态发生蛋白的重量配比在1000:100:0.1；均匀混合后塑型，然后在50℃～60℃干燥即制得实施例2的载生物活性因子的类骨陶瓷复合材料，其抗压强度为0.3Mpa。

实施例2的载生物活性因子的类骨陶瓷复合材料的凝胶在扫描电镜下成三维多孔结构，壳聚糖大分子交联形成中空的支架，孔隙均匀，结构稳定。

生物相容性检测证明实施例2的载生物活性因子的类骨陶瓷复合材料与两种组织工程种子细胞骨髓间充质干细胞(BMSC)共培养无细胞毒性，能促进细胞的增殖与分化。

按照人工骨植入材料的生物相容性评价方法进行体内试验，证实实施例2的载生物活性因子的类骨陶瓷复合材料有良好的生物相容性，骨诱导性及好的强度。因此，实施例2的载生物活性因子的类骨陶瓷复合材料的降解周期符合骨形成和骨改建的过程，其降解性能适合作为人工骨替代材料。

实施例3

步骤1,制备改性煅烧骨材料;选用新生小牛关节头作为骨原料，经去离子水充分荡洗并以物理或生物化学的方法基本去除胶原蛋白；然后利用磷酸按照化学反应平衡方程配比对骨的基质（骨盐）进行改性，使骨基质的Ca/P原子比降至1.5；然后在1000℃温度条件下煅烧改性后的骨原料彻底去除骨材料的免疫抗原性，获得改性煅烧骨材料。

步骤2,选用分子量在40000的羧甲基壳聚糖，用三蒸水配制30mg/ml的羧甲基壳聚糖水溶液,并用乙酸调节其pH为6;

步骤3,取调pH后的羧甲基壳聚糖水溶液、改性煅烧骨材料、骨形态发生蛋白并混合，使羧甲基壳聚糖:改性煅烧骨材料:骨形态发生蛋白的重量配比在1000:300:0.4；均匀混合后塑型，然后在50℃～60℃干燥即制得实施例3的载生物活性因子的类骨陶瓷复合材料，其抗压强度为0.3Mpa。

实施例3的载生物活性因子的类骨陶瓷复合材料的凝胶在扫描电镜下成三维多孔结构，壳聚糖大分子交联形成中空的支架，孔隙均匀，结构稳定。

生物相容性检测证明实施例2的载生物活性因子的类骨陶瓷复合材料与两种组织工程种子细胞骨髓间充质干细胞(BMSC)共培养无细胞毒性，能促进细胞的增殖与分化。

按照人工骨植入材料的生物相容性评价方法进行体内试验，证实实施例3的载生物活性因子的类骨陶瓷复合材料有良好的生物相容性，骨诱导性及好的强度。因此，实施例3的载生物活性因子的类骨陶瓷复合材料的降解周期符合骨形成和骨改建的过程，其降解性能适合作为人工骨替代材料。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种载生物活性因子的类骨陶瓷复合材料的制备方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:

步骤1,制备改性煅烧骨材料；步骤1，选用新生小牛关节头或胫骨的骨骺端作为骨原料，经去离子水充分荡洗后利用改性剂对骨原料进行改性，使骨基质的Ca/P原子比降至1.66～1.5；然后在800℃～1100℃温度条件下煅烧改性后的骨原料以彻底去除骨材料的免疫抗原性，获得改性煅烧骨材料；

步骤2,选用分子量在5000～50000的羧甲基壳聚糖，用三蒸水配制10～30mg/ml的羧甲基壳聚糖水溶液,并调节其pH在5.8～6.5的范围；

步骤3,取调pH后的羧甲基壳聚糖水溶液、改性煅烧骨材料及骨形态发生蛋白并混合，使羧甲基壳聚糖:改性煅烧骨材料:骨形态发生蛋白的重量配比在1000:100～300:0.1～0.4；均匀混合后塑型，然后在50℃～60℃干燥即制得载生物活性因子的类骨陶瓷复合材料。

2.根据权利要求1所述的载生物活性因子的类骨陶瓷复合材料的制备方法,其特征在于,所述改性剂选自磷酸氢二铵、磷酸二氢铵和磷酸中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的载生物活性因子的类骨陶瓷复合材料的制备方法,其特征在于,步骤2中,用盐酸或乙酸调节羧甲基壳聚糖水溶液pH至5.8～6.5范围。

4.根据权利要求1所述的载生物活性因子的类骨陶瓷复合材料的制备方法,其特征在于,所述羧甲基壳聚糖:所述改性煅烧骨材料:所述骨形态发生蛋白的重量配比在1000:100～300:0.15～0.3。

5.根据权利要求1至4任一项所述的载生物活性因子的类骨陶瓷复合材料的制备方法,其特征在于,所述骨形态发生蛋白为BMP-2。