JP7222924B2 - 石灰化組織代替物の製造方法 - Google Patents
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Description
粉砕された真珠層、リン酸一カルシウム、及び水を反応させてブルシャイトを生成させ、
ブルシャイトを粉砕し、
リン酸水素二ナトリウム溶液中で、粉砕された真珠層と粉砕されたブルシャイトとの反応させることを含む。
以下の非限定的な実施例を参照して本発明を説明する。
本発明は、真珠層粒子との多くの化学反応に関する。
ステップ(2)と(3)の化学反応は次のとおり。
ステップ(5)の化学反応である:
5.2CaHPO4・2H2O + 3.6CaCO3 → Ca8.8(HPO4)0.7(PO4)4.5(CO3)0.7(OH)1.3 + 2.9CO2 + 12H2O
例1の方法の概要を図1に示す。
1.実験手順
真珠層が選択され、粉末状に粉砕された。次いで、粉末は、孔径が200μm未満の選択的メッシュでふるい分けされた。真珠層粒子をリン酸一カルシウムと4:10の比率で混合し、混合物を室温で蒸留水と反応させて、ブルシャイト結晶とCO2を形成させた。ブルシャイト結晶を37℃で乾燥させた後、粉砕した。例1の場合、化学反応は次のとおり。
真珠層粒子は、5つの異なる比率(A 6:9:5、B 7:8:5、C 8:7:5、D 9:6:5、E 10:5:5)でブルシャイト粒子とリン酸四カルシウムと混合された。5つの比率は、それぞれ30%の真珠層、35%の真珠層、40%の真珠層、45%の真珠層、50%の真珠層に相当する。混合物を、4%リン酸水素二ナトリウム溶液(pH9.25)で、室温で、液体/粉末(mL/g)比1:3で反応させた。混合ペーストは、湿度100%、37℃で硬化した。化学反応は次のとおり。
5.2CaHPO4・2H2O + 3.6CaCO3 → Ca8.8(HPO4)0.7(PO4)4.5(CO3)0.7(OH)1.3 + 2.9CO2 + 12H2O
2.物理的特性
i.X線開設(XRD)
A~Eの5つの石灰化組織代替物をX線回折装置(XRD、PANanalytical X 'Pert PRO、オランダ)で分析した。各石灰化組織代替物のサンプルは、回折角(2θ)の10°から90°の範囲でステップサイズ0.0070°のステップスキャン法を使用してスキャンされ、回折計は40kV及び40mAで動作された。
機械的特性評価(表3、図2)は、湿度100%、37℃で3日間保持された円筒状試験片(直径10mmx高さ20mm)で実行され、即座にクロスヘッド速度0.1mm.min-1で1kNのロードセルを装備したインストロン試験機を使用して、圧縮試験に供された。この試験では、市販の円筒形多孔質骨代替材料(SKELITETM)がコントロール(直径5 mmx高さ5mm)として使用された。
後方散乱電子(BSE)及び二次電子(SE)モードの走査電子顕微鏡(SEM)を使用して、5つの石灰化組織代替物の微細構造と形態を分析した。
初期及び最終の硬化時間(表4及び5)は、Vicat針による水硬性セメントペーストが硬化する時間の標準的な試験方法であるVicat法によって決定された。初期硬化時間は、反応開始から針のめり込みが25mmになるまでの時間として計算される。最終硬化時間は、針が試験材料にめり込まなくなるときの経過時間として計算される。測定値を3回収集し、平均値+SDで表した(n=5)。
石灰化組織代替物の細胞適合性を調べるために、HeLa、ML0-Y4、及びMC3T3細胞株を石灰化組織代替物で培養した(図5~8)。細胞接着はレーザー共焦点走査顕微鏡により観察された。細胞増殖は、コントロールとしてヒドロキシアパタイトを使用した比色MTS法により試験された。
a.HeLa細胞株(24時間)
図5に示すHeLa細胞培養は、真珠層オルトリン酸塩粒子、すなわち石灰化組織の良好な細胞接着と細胞適合性を示した。
MLO-Y4は、骨細胞様細胞株である。MLO-Y4細胞は、例2に従って調製された石灰化組織代替物A上で、真珠層粒子、ブルシャイト粒子及びリン酸四カルシウムを6:9:5の比率で使用して72時間培養した。細胞膜中のF-アクチンは、蛍光ファロイジン(赤)で標識された。レーザー共焦点走査顕微鏡は、石灰化組織代替物(ターコイズ)への細胞接着、及び石灰化組織代替物への進入する3D構造を示した。図6及び図7は、石灰化組織代替物への接着(図6)、樹状突起の成長(図6B)、及び樹状突起結合の生成(図7)を示している。
MC3T3は骨芽細胞前駆細胞株であり、培養72時間までの細胞増殖アッセイに使用された。細胞増殖アッセイの結果を図8に示す。ネガティブコントロールは細胞を含まない試薬の吸光度であり、ポジティブコントロールは一般的な骨代替物であるヒドロキシアパタイト(Sigma-Aldrich)で培養したMC3T3細胞である。図8に示すように、細胞がオルトリン酸カルシウム塩粒子、すなわち石灰化組織代替物上で培養されたとき、ヒドロキシアパタイトと比較して細胞増殖はより速かった。細胞骨形成分化の結果を図9に示す。これは、真珠層オルトリン酸カルシウム複合体に対するALP活性がヒドロキシアパタイトよりも有意に高かったことを示す。この結果は、ヒドロキシアパタイトと比較して、オルトリン酸カルシウム材料が骨芽細胞に対してより強い骨誘導性を提供することを示した。
石灰化組織代替物の生分解効率を調査するために、円筒状の石灰化組織代替物をウサギの背中の表在筋膜下に移植した。そして、石灰化組織代替物の生体適合性と骨誘導性を調べるために、石灰化組織代替物をウサギ大腿骨の遠位骨幹端領域の人工の骨欠損部位に移植した。例2に従って調製した石灰化組織代替物Cを動物実験で使用し、ヒドロキシアパタイトをコントロールとして使用した。
ニュージーランドシロウサギを、アミロバルビトン(0.03 mg/kg体重)の静脈内注射により麻酔した。円筒形の材料(直径10mm、高さ5mm、4つの真珠層リン酸カルシウム材料と4つのヒドロキシアパタイト材料)を、背側正中線アプローチ(左の真珠層カルシウムオルトリン酸塩材料、右のヒドロキシアパタイト材料)を介して動物の両側傍脊椎表層筋膜の下に移植した。各材料の1つを4つの異なる時点(3週間、6週間、9週間、又は12週間)で取り出し、重量を測定し、それぞれの重量損失の割合を計算した。テストは3回実行され、各時間経過における減量率の平均±SDを計算した。図10Aは、生分解速度を示す折れ線グラフであり、図10Bは、経時的な分解された材料の形態を示す写真を含む。図10Aの折れ線グラフは、真珠層カルシウムオルトリン酸塩材料の生分解速度がヒドロキシアパタイトよりも大幅に速いことを示している。しかし、図10Bに示すように、真珠層オルトリン酸カルシウム真珠層材料に対して、材料の侵食された表面が観察されたが、円筒形状は維持された。これは、石灰化組織代替物の生分解が、最も一般的に使用されている骨代替生体材料であるヒドロキシアパタイトよりも速いことを示している。そして、生物分解速度は、身体的支持が崩壊することなく、段階的で緩やかだった。
ニュージーランドシロウサギを、アミロバルビトン(0.03 mg/kg体重)の静脈内注射により麻酔した。動物を手術台の上に仰向けに置き、無菌状態で実験用膝(右)の毛を剃り、準備し、覆った。右大腿骨の骨幹端領域には、縦方向の内側傍膝蓋骨切開が入り、大腿骨の皮質骨を露出させるために膝蓋骨を横方向に脱臼させた。大腿骨の線骨端から2.5mm離れて、直径5mm、深さ5mmの円形の欠損を、ステンレス鋼の歯科用ドリルで作成した。次に、表5に従って、異なる石灰化組織代替物(Nacre-Orthophosphate)又はコントロール材料(hydroxyapatite)を異なる骨欠損部位に移植した。切開は層ごとに閉じた。各ウサギには、1つの大腿骨のみが手術され、33匹のウサギに合計33個の欠陥が形成された(図11)。術後、動物モデルは手術対照群のX線及びマイクロCTによって確認された(図12)。その後、ウサギはケージに戻され、自由に歩き回ることができた。手術後の最初の3日間、セファゾリン(200mg/kg)の筋肉内注射により各ウサギに抗感染症治療が行われた。
本発明の様々な実施形態を以下に示す。
1.石灰化組織代替物の製造方法であって、
粉砕された真珠層、リン酸一カルシウム、及び水を反応させてブルシャイトを生成し、
ブルシャイトを粉砕し、
リン酸水素二ナトリウム溶液中で、粉砕された真珠層と粉砕されたブルシャイトとを反応させることを備える方法。
2.粉砕された真珠層が、400μm以下又は200μm以下の粒径を有する、上記1に記載の方法。
3.粉砕された真珠層が、50μm以上の粒径を有する、上記1又は上記2に記載の方法。
4.粉砕された真珠層が、50μm~400μm又は50μm~100μmの粒径を有する、上記1~3のいずれかに記載の方法。
5.粉砕されたブルシャイトが10μm~100μmの粒径を有する、上記1~4のいずれかに記載の方法。
6.粉砕された真珠層とリン酸一カルシウムとを4:10の比で反応させる、上記1~5のいずれかに記載の方法。
7.リン酸水素二ナトリウム溶液が8.2から9.5のpHを有する、上記1~6のいずれかに記載の方法。
8.リン酸水素二ナトリウム溶液が2.5%から4%の溶液である、上記1~7のいずれかに記載の方法。
9.粉砕された真珠層とリン酸一カルシウムとを反応させ、及び/又は粉砕された真珠層と粉砕されたブルシャイトとを室温又はで約37℃反応させる、上記1~8のいずれかに記載の方法。
10.さらに、ブルシャイトを粉砕する前にブルシャイトを乾燥させることを含む上記1~9のいずれか1項に記載の方法。
11.さらに、10μmから100μmの粒径を有する粉砕されたブルシャイトを分離することを含む上記1~10のいずれかに記載の方法。
12.粉砕された真珠層と粉砕されたブルシャイトとが4:10の比率で反応する、上記1~11のいずれかに記載の方法。
13.リン酸水素二ナトリウム溶液中で、粉砕された真珠層と粉砕されたブルシャイトとの反応が、リン酸四カルシウムをさらに含む、上記1~11のいずれか記載の方法。
14.粉砕された真珠層、粉砕されたブルシャイト、及びリン酸四カルシウムが、リン酸水素二ナトリウム溶液中で、6:9:5、7:8:5、8:7:5、9:6:5、又は10:5:5の比率で反応する、上記13記載の方法。
15.リン酸水素二ナトリウム溶液が、溶液中の他の反応物と反応する反応物比が25%、33%、40%又は50%である、上記1~14のいずれかに記載の方法。
16.組成物の硬化時間を変更する薬剤、任意にヘクトライト、ラポナイト又はアルファ硫酸カルシウムを添加することをさらに含む上記1~15のいずれかに記載の方法。
17.上記1~16のいずれかに記載の方法により製造された石灰化組織代替物。
18.粒子状であり、粒子表面にヒドロキシアパタイトを含む、上記17に記載の代替物。
19.湿度100%及び37℃で硬化する、上記17又は18に記載の代替物。
20.45Nより大きいピーク荷重、又は2.3MPaより大きい圧縮強度を有する、上記17~19のいずれかに記載の代替物。
21.移植可能又は注射可能である、上記17~20のいずれかに記載の代替物。
22.30分~90分の初期硬化時間(Ti)を有する、上記17~21のいずれかに記載の代替物。
23.60分~120分の最終硬化時間(Tf)を有する、上記17~21のいずれかに記載の代替物。
24.石灰化組織を修復するための石灰化組織代替物の製造における、粉砕された真珠層、リン酸一カルシウム、及び水の使用。
25.石灰化組織を修復するための方法であって、石灰化組織を上記17~23のいずれかに記載の代替物と接触させることを含む方法。
26.石灰化組織が歯又は骨である、上記1~16又は上記25のいずれかに記載の方法、又は上記24に記載の使用。
27.第1チャンバ及び第2チャンバを備える送達装置であって、第1チャンバは、粉砕された真珠層を含み、第2チャンバは、粉砕されたブルシャイトを含み、粉砕されたブルシャイトは、粉砕された真珠層と、リン酸一カルシウムと、水とを反応させ、得られたブルシャイトを粉砕することにより生成され、装置は、反応近接状態で粉砕された真珠層と粉砕されたブルシャイトを同時に送達し、それにより、粉砕された真珠層と粉砕されたブルシャイトとをリン酸水素二ナトリウム溶液の存在下で反応させるように適合される装置。
28.第1のチャンバ及び/又は第2のチャンバは、リン酸水素二ナトリウム溶液をさらに含む、上記27に記載の装置。
29.装置が、リン酸水素二ナトリウム溶液を含む第3チャンバを含む、上記27に記載の装置。
30.送達が、粉砕された真珠層と粉砕されたブルシャイトを混合することを含む、上記27~29のいずれかに記載の装置。
31.シリンジである、上記27~30のいずれかに記載の装置。
Claims (14)
- 石灰化組織代替物の製造方法であって、
粉砕された真珠層、リン酸一カルシウム、及び水を反応させてブルシャイトを生成し、
ブルシャイトを粉砕し、
リン酸水素二ナトリウム溶液中で、粉砕された真珠層と粉砕されたブルシャイトとを反応させることを含む方法。 - 粉砕された真珠層が、400μm以下又は200μm以下の粒径を有する、請求項1に記載の方法。
- 粉砕された真珠層が、50μm以上の粒径を有する、請求項1又は請求項2に記載の方法。
- 粉砕された真珠層が、50μm~400μm又は50μm~100μmの粒径を有する、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 粉砕されたブルシャイトが10μm~100μmの粒径を有する、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 粉砕された真珠層とリン酸一カルシウムとを4:10の重量/重量比で反応させる、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- リン酸水素二ナトリウム溶液が8.2から9.5のpHを有する、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 粉砕された真珠層とリン酸一カルシウムとを室温又は約37℃で反応させ、及び/又は粉砕された真珠層と粉砕されたブルシャイトとを室温又は約37℃で反応させる、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
- さらに、ブルシャイトを粉砕する前にブルシャイトを乾燥させることを含む請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
- さらに、10μmから100μmの粒径を有する粉砕されたブルシャイトを分離することを含む請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
- 粉砕された真珠層と粉砕されたブルシャイトとが4:10の重量/重量比率で反応する、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
- リン酸水素二ナトリウム溶液中で、粉砕された真珠層と粉砕されたブルシャイトとの反応が、リン酸四カルシウムをさらに含む、請求項1~10のいずれか一項記載の方法。
- リン酸水素二ナトリウム溶液が、1:4、1:3、1:2、又は1:1の重量/重量反応物比で溶液中の他の反応物と反応する、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法。
- 組成物の硬化時間を変更する薬剤、任意にヘクトライト又はアルファ硫酸カルシウムを添加することをさらに含む請求項1~13のいずれか一項に記載の方法。
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