CN111194204A - 制造钙化组织替代物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种钙化组织替代物的制造方法，所述的方法包括：将磨碎的珍珠母、磷酸一钙和水反应生成透钙磷石；研磨所述的透钙磷石；在磷酸氢二钠溶液中磨碎的珍珠母与磨碎的透钙磷石反应。本发明还涉及通过该方法制造的钙化组织替代物，所述的钙化组织替代物在修复钙化组织中的用途和用于递送钙化组织的输送装置。
Description
领域
本发明涉及钙化组织替代物的制造。
背景
由感染、创伤、炎症和肿瘤和先天性病因引起的缺陷是最常见的骨科和牙科疾病，需要进行广泛的手术治疗。已经开发了许多骨替代物作为可注射和可植入形式使用的医疗装置，但是其中大多数缺乏足够的骨传导性和骨诱导性。尽管如此，骨替代物在骨科和牙科领域具有广泛的临床应用，每年的市场价值超过80亿美元。
珍珠母(nacre)已被证明可以诱导骨骼愈合，这可以追溯到玛雅时代。据记载，珍珠母和珍珠含有微量元素和生物活性蛋白，可以诱导骨形成。然而，珍珠母中碳酸钙的快速降解速率限制了其作为可植入或可注射的骨替代物的应用。
因此，需要用于修复钙化组织的改进的组合物。
用于修复钙化组织的多孔材料的产生是改善材料组成的基本设计标准。当前，有两种主要的多孔材料–预制多孔材料和多孔结构是在植入后原位产生的多孔材料。通常，预制的多孔材料比相应的固体材料显示出较弱的机械强度，而原位多孔材料在组分降解后可能遭受不受控制的机械破坏。
应当理解，如果在本文中引用了任何现有技术出版物，则该引用并不意味着承认该出版物构成了澳大利亚或任何其它国家的本领域公知常识的一部分。
概括
本发明利用多钙盐吸收梯度，其在钙化组织替代物中逐渐形成孔，从而在体内诱导新的骨形成，而不损害钙化组织替代物的机械性能。
因此，第一方面提供了一种制造钙化组织替代物的方法，该方法包括：
-将磨碎的珍珠母、磷酸一钙和水反应生成透钙磷石(brushite)；
-研磨所述的透钙磷石；
-在磷酸氢二钠溶液中将磨碎的珍珠母与磨碎的透钙磷石反应。
当通过第一方面的方法生产时，第二方面提供了钙化组织替代物。
第三个方面提供了磨碎的珍珠母、磷酸一钙和水在制造用于修复钙化组织的钙化组织替代物中的用途。
第四方面提供了一种修复钙化组织的方法，该方法包括使钙化组织与第二方面所述的替代物接触。
第四方面的替代形式提供了第二方面所述的替代物，其用于修复钙化组织的方法中，该方法包括使钙化组织与替代物接触。
在任一方面的实施方式中，钙化组织是牙齿或骨骼。
第五方面提供了一种输送装置，所述的装置包括第一腔室和第二腔室，所述第一腔室包括磨碎的珍珠母，所述第二腔室包括磨碎的透钙磷石，其中，通过将磨碎的珍珠母、磷酸一钙和水反应来制备磨碎的透钙磷石，研磨所述的透钙磷石，其中该装置适于将磨碎的珍珠母和磨碎的透钙磷石同时递送到反应附近，从而使磨碎的珍珠母和磨碎的透钙磷石在磷酸氢二钠溶液存在下进行反应。
附图说明
图1是实施例1的方法的示意图。
图2包括显示根据实施例2制造的钙化组织替代物的机械特性的柱状图。图2A和图2B分别显示根据实施例2制备的钙化的组织替代物(珍珠母-正磷酸钙(nacre-calciumorthophosphate)盐颗粒)和多孔市售产品(SKELITE TM)的压缩峰值载荷(N)和压缩强度(MPa)。
图3是在BSE模式下以3.39kX放大倍数收集的扫描电子显微镜(SEM)显微照片，其显示根据实施例制备的钙化组织替代物(珍珠母-正磷酸钙盐颗粒)的表面。较浅的灰色箭头指向正磷酸钙环绕的珍珠母颗粒，较深的灰色箭头指向正磷酸钙包覆的珍珠母颗粒，这种差异提供了不同的吸收速率，并有助于在钙化组织替代物中逐渐形成孔。
图4是以7.39kX的放大倍数在BSE模式下收集的SEM显微照片，其显示了根据实施例制备的钙化组织替代物(珍珠母-正磷酸钙盐颗粒)的表面。显微照片显示正磷酸钙环绕的珍珠母颗粒。可以观察到未反应的珍珠母结构。
图5包括HeLa细胞的激光共聚焦扫描显微镜显微照片，所述HeLa细胞在根据实施例2使用比例为6：9：5的珍珠母颗粒、透钙磷石颗粒和磷酸四钙制备的钙化组织替代物A(青绿色)上培养了24小时。细胞膜中的F-肌动蛋白用荧光鬼笔环肽标记(红色)，细胞核用Hoechst(蓝色)标记。A.细胞的表面形态。B.细胞粘附于钙化组织替代物的3D结构，白色箭头标识细胞，细胞核和钙化组织替代物。C.附着在钙化组织替代物上的单个细胞的升高，用白色箭头标识该细胞、细胞核和钙化组织替代物。
图6包括MLO-Y4细胞的激光共聚焦扫描显微镜显微照片和分析，所述MLO-Y4细胞在根据实施例2使用比例为10：5：5的珍珠母颗粒、透钙磷石颗粒和磷酸四钙制备的钙化组织替代物E(青绿色)上培养了72小时。用荧光鬼笔环肽标记细胞膜中的F-肌动蛋白(红色)。A.细胞粘附于钙化组织替代物的3D结构。B.显示骨细胞的树突过程(dendritic process)的单个细胞对钙化组织替代物的粘附的3D结构，白色箭头标识了该细胞、树突过程和钙化组织替代物。
图7是MLO-Y4细胞的激光共聚焦扫描显微镜显微照片和分析，所述MLO-Y4细胞在根据实施例2使用比例为6：9：5的珍珠母颗粒、透钙磷石颗粒和磷酸四钙制备的钙化组织替代物A(青绿色)上培养了72小时。用荧光鬼笔环肽标记细胞膜中的F-肌动蛋白(红色)。显微照片显示了骨细胞的树突状连接(网络)。白色箭头标识树突状连接和细胞。
图8显示了在根据实施例2制备的钙化组织替代物(珍珠母-正磷酸钙材料)上培养最长72小时的MC3T3细胞的细胞活力的柱状图。使用比色MTS测定法测定细胞活力。
图9显示在根据实施例2(分别以6:9:5,8:7:5和10:5:5的比例)制备的钙化组织替代物A，C和E(珍珠母-正磷酸钙材料)上培养7天和14天的MC3T3细胞的细胞ALP活性的柱状图。根据制造商的说明，使用ALP微孔板检测试剂盒(南京建诚生物工程研究所，南京，中国)定量测定对硝基苯酚(对硝基苯酚磷酸酯水解的黄色终产物)的含量来确定成骨细胞分化标志物碱性磷酸酶(ALP)的活性。
图10包括显示羟基磷灰石和珍珠母-正磷酸钙的体内生物降解率(随时间的重量损失百分比)的折线图(A)，和羟基磷灰石和珍珠母-正磷酸钙的降解材料的裸眼形态(B)。*表示珍珠母-正磷酸钙和羟磷灰石之间的统计学差异(P<0.05)。
图11包括显示实施例2的第4部分的兔股骨皮质骨上的骨缺损的动物模型的外科手术过程的照片。图11A示出了麻醉兔子的手术位置和剃刮。图11B显示了兔子的术前准备。图11C示出了在干骺端区域远端的股骨皮质骨的暴露。图11D示出了钻孔以制造人造骨缺损。图11E示出了骨缺损的基本形状，其是圆形且固定的皮质骨缺损。图11F示出了骨缺损的直径为5mm。图11G显示了珍珠母-正磷酸钙植入的骨缺损。图11H显示了羟基磷灰石植入的骨缺损。图11I示出了缝合切口。
图12包括动物模型的成像确认。圆圈突出显示了骨缺损部位。图12A是珍珠母-正磷酸钙植入组的X射线图像。图12B是羟基磷灰石植入组的X射线图像。图12C是空白对照组的X射线图像。图12D是手术对照组的样品的Micro-CT扫描，其清晰地显示出骨缺损的直径为5mm。
图13包含显示从动物模型中提取的样品形态的照片。黑色箭头指向残留在骨缺损部位的珍珠母-正磷酸钙颗粒。白色箭头指向残留在骨缺损部位的羟磷灰石颗粒。圆圈表示对照组的骨缺损部位。
图14包括显示本发明的钙化组织替代物刺激的有效成骨细胞活性的一系列图像。图14A至14F包括下组的矢状面2D Micro-CT图像和3D重建图像：
A-NO4(珍珠母-正磷酸钙植入4周的组)-黑色箭头指向新的骨小梁结构；
B-HA4(羟基磷灰石植入4周的组)；
C-BC4(4周空白对照组)；
D-NO8(珍珠母-正磷酸钙植入8周的组)；
E-HA8(羟基磷灰石植入8周的组)；和
F-BC8(8周空白对照组)。
图15包括的柱状图显示4周后NO4、HA4和BC4组的Micro-CT分析。显示了骨体积/总体积(BV/TV)、骨表面/骨体积(BS/BV)、皮质厚度(Ct.Th)、分形维数(Fractal dimension，FD)#显示珍珠母-正磷酸钙和羟基磷灰石之间的统计学显著差异(P<0.05)。
图16包含的柱状图显示在8周后NO8、HA8和BC8组的Micro-CT分析。显示了骨体积/总体积(BV/TV)、骨表面/骨体积(BS/BV)、皮质厚度(Ct.Th)、分形维数(FD)。#表示珍珠母-正磷酸钙和羟基磷灰石之间的统计学显著差异(P<0.05)。
图17包括的柱状图显示了4周后NO4、HA4和BC4组和8周后NO8、HA8和BC8组的骨缺损部位孔隙率的Micro-CT分析。#表示珍珠母-正磷酸钙和羟基磷灰石之间的统计学显著差异(P<0.05)。
详细说明
发明人已经开发了用于修复钙化组织的改进的钙化组织替代物和用于制造钙化组织替代物的方法。本发明利用主要组分的不同降解时间在体内将固体材料转化为多孔结构。即在组分中，剩余的珍珠母颗粒具有最快的降解速率，其通过与体液接触而开始生物降解。一旦珍珠母溶解，生物活性基质将释放，增强细胞整合并诱导骨形成。同时，产生孔，使细胞向内生长。作为本公开的钙化组织替代物的其它组分的透钙磷石(或莫奈石(monetite))、碳酸磷灰石和锶取代的羟基磷灰石与珍珠母相比具有不同的溶解度，并且这些组分将在2至8个月内被生物降解。这些不同的正磷酸钙将通过吞噬作用和体液-固体反应被巨噬细胞、破骨细胞和其它细胞类型的细胞活性逐渐吸收，从而增加孔隙率和细胞向内生长。最后，钙化组织替代物中的羟基磷灰石可以作为骨传导支架在体内保存长达2年，然后通过细胞介导的吸收完全被新骨替代。如果使用，生物惰性药物载体钠基蒙脱土(laponite)将保留在体内。
表1提供了珍珠母-正磷酸钙组分的生物降解率，这些成分能够在材料表面原位生成多孔结构，从而使细胞和组织向内生长，用于钙化组织修复。
表1.骨替代物组合物中珍珠母-正磷酸钙的生物降解。
*脱水磷酸二钙(DPCD)或无水磷酸二钙(DPCA)
本发明通过提供一种在珍珠母颗粒的表面上涂覆正磷酸钙的方法和通过提供用该方法制备的涂覆正磷酸钙的珍珠母颗粒，克服了珍珠母缺乏足够的骨传导性和骨诱导性和快速吸收的问题。本发明还提供了负载在适当的添加剂颗粒(例如钠基蒙脱土)上带正电荷的抗体或分子从正磷酸钙包覆的珍珠母颗粒上受控共释放。
不希望被理论所束缚，钙化组织替代物中未反应的珍珠母包含生物活性化合物，从而增强骨诱导性。此外，暴露的珍珠母比其它正磷酸钙吸收更快。四种主要不同成分的吸收梯度提供了逐渐形成孔的过程，该过程伴随着植入后新骨的形成。与传统上由钙盐材料制成的现有多孔骨替代物相比，本发明的钙化组织替代物的孔是在体内产生的，从而在钙化组织修复的早期阶段提供了更强的机械支撑和增强了骨传导性。
在使用中，由于珍珠母相对于正磷酸钙的吸收较快，钙化组织替代物在体内形成孔，从而解决了阻碍成骨的基于磷酸钙的商业产品的吸收缓慢问题。
在本发明的任何方面，钙化组织可以是骨骼或牙齿。
如本文所用，“修复”包括修补、恢复、重建或修复钙化组织。
由于感染、创伤、炎症、肿瘤或先天性病因可能需要修复。
如本文所用，“修复钙化组织”涵盖最终治疗另一组织或器官的实践，例如，脊柱融合，其目的是减轻脊椎管狭窄和脊髓和/或脊神经挤压。
如本文所用，钙化组织“替代物”是这样的材料，其与钙化组织接触，从而通过成骨、骨传导和/或骨诱导以促进钙化组织修复。钙化组织“替代物”也可以称为珍珠母-正磷酸钙或钙化组织移植物。在一个实施方式中，钙化组织替代物用于填充空隙。
如本文所用，术语“成骨”是指钙化组织的发育和形成。成骨过程可能涉及骨传导和/或骨诱导。
术语“骨传导”是指被动过程，通过该过程，植入部位附近的骨形成细胞移动穿过支架，即钙化组织替代物，并随时间用新的钙化组织代替支架。骨传导材料允许成骨细胞和破骨细胞附着、迁移、生长和/或分裂。
术语“骨诱导”是指钙化组织替代物或移植物将骨形成细胞募集到植入部位并诱导它们形成新骨的活动过程。骨诱导是指早期谱系细胞(early-lineage cells)(例如间充质干细胞或骨祖细胞)被吸引、增殖和分化成骨形成细胞，从而形成新的钙化组织。
用于制造钙化组织替代物的方法使用珍珠母作为起始材料和另外的反应物，和所制造的钙化组织替代物包括珍珠母。珍珠母是文石(aragonite)矿物的有机/无机生物复合材料，其包含碳酸钙(CaCO3)和生物活性剂。
将珍珠母磨碎或研磨至特定的粒度分布，然后与磷酸一钙(任选为水合物(Ca(H2PO4)2.H2O))反应，形成透钙磷石晶体。将透钙磷石晶体研磨或研磨至特定的粒度分布。在研磨或研磨之前任选地将透钙磷石晶体干燥。在一个实施方式中，磨碎的透钙磷石的粒度小于磨碎的珍珠母的粒度。
不希望受到理论的束缚，珍珠母的粒径在制造钙化组织替代物中很重要。粒径会影响固化时间-研磨的珍珠母越细，钙化组织替代物的固化时间越快。因此，磨碎的珍珠母的粒径和因此钙化组织替代物的固化时间可以根据钙化组织所需的修复进行调整，因为不同的修复应用需要不同的固化时间。
珍珠母和透钙磷石可以通过球磨，任选地高能球磨或星球磨来研磨或磨碎。
在一个实施方式中，磨碎的珍珠母的粒径为约1000μm或更小，约900μm或更小，约800μm或更小，约700μm或更小，约600μm或更小，约500μm或更小，约400μm或更小，约300μm或更小，约200μm或更小，约100μm或更小，约50μm或更小或约10μm或更小。
在一个实施方式中，磨碎的珍珠母的粒径为约1μm或更大，约5μm或更大，约10μm或更大，约15μm或更大，约20μm或更大，约30μm或更大，约40μm或更大。约50μm或更大，约50μm或更大，约60μm或更大，约70μm或更大，约80μm或更大，约100μm或更大。
在一个实施方式中，磨碎的珍珠母的粒度为约50μm至约100μm，约50μm至约200μm，约50μm至约300μm，约50μm至约400μm或约50μm至约500μm。
在一个实施方式中，磨碎的透钙磷石粒度为约500μm或更小，约400μm或更小，约300μm或更小，约200μm或更小，约100μm或更小，约90μm或更小，约80μm或更小。小于，约70μm或以下，约60μm或以下，约50μm或以下，约40μm或以下，约30μm或以下，约20μm或以下，约10μm或以下，约9μm或以下，约8μm或更小，约7μm或更小，约6μm或更小，约5μm或更小，约4μm或更小，约3μm或更小，约2μm或更小或约1μm或更小。
在一个实施方式中，磨碎的透钙磷石粒度为约1μm或更大，约2μm或更大，约3μm或更大，约4μm或更大，约5μm或更大，约6μm或更大，约7μm或更大，约8μm或更大，约9μm或更大，约10μm或更大，约15μm或更大，约20μm或更大，约30μm或更大，约40μm或更大，约50μm或更大，约60μm或更大以上，约70μm或更大，约80μm或更大，约90μm或更大，或约100μm或更大。
在一个实施方式中，磨碎的透钙磷石粒度为约10μm至约20μm，约10μm至约30μm，约10μm至约40μm，约10μm至约50μm，约10μm至约60μm，约10μm至约70μm，约10μm至约80μm，约10μm至约90μm，约10μm至约100μm，约10μm至约150μm或约10μm至约200μm。
在一个实施方式中、钙化组织替代物具有约5mm的粒度。在另一个实施方式中，钙化组织替代物具有约1μm、约5μm、约10μm、约50μm、约100μm、约500μm、约1mm、约2mm、约3mm、约4mm、约5mm、约6mm、约7mm、约8mm、约9mm或约10mm的粒径。
如本文所用，“颗粒”和“粒子”是指分开的组成单元，但不排除颗粒被融合成固体。因此，“颗粒”和“粒子”是指磨碎的珍珠母和磨碎的透钙磷石以及包括被正磷酸钙包覆或环绕的熔融珍珠母颗粒的钙化组织替代物。颗粒可以是粉末。
如本文所用，“粒度”是指颗粒通过选择性筛孔的孔径。因此，可以通过使用一个或多个具有限定孔径的筛孔筛分来选择具有限定粒径的磨碎的珍珠母和磨碎的透钙磷石。筛分和筛网是本领域已知的。
在一个实施方式中，磨碎的珍珠母和磷酸一钙以约4:10的比例反应。在另一个实施方式中，磨碎的珍珠母和磷酸钙以约4：5、约4：6、约4：7、约4：8、约4：9、约4:11、约4:12、约4:13、约4:14、约4:15、约0.5：10、约1:10、约2:10、约3:10、约5:10、约6:10、约7:10、约8:10或约9:10的比例反应。
在一个实施方式中，磨碎的珍珠母和磷酸一钙在室温下反应。在另一个实施方式中，将磨碎的珍珠母和磷酸一钙在约4℃、约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约37℃、约40℃、约42℃、约50℃或约60℃下反应。。
如果在研磨前干燥，可以将透钙磷石晶体进行风干或冷冻干燥。
在该方法的第二阶段，将额外的珍珠母与磨碎的透钙磷石混合，并在磷酸氢二钠(Na2HPO4)溶液中反应。
在一个实施方式中、磷酸氢二钠溶液的pH为约8.2至约9.5。在一个实施方式中、磷酸氢二钠溶液的pH为约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8、约8.1、约8.2、约8.3、约8.4、约8.5、约8.6、约8.7、约8.8、约8.9、约9、约9.1、约9.2、约9.3、约9.4、约9.5、约9.6、约9.7、约9.8、约9.9、约10、约10.2、约10.4、约10.6、约10.8或约11。在一个实施方式中，磷酸氢二钠溶液的pH为约9.25。
在一个实施方式中，磷酸氢二钠溶液是2.5％至4％的溶液。在另一个实施方式中，磷酸氢二钠溶液为约1％、约1.5％、约2％、约2.5％、约3％、约3.5％、约4％、约4.5％、约5％、约5.5％、约6％、约6.5％、约7％、约7.5％、约8％、约8.5％、约9％、约9.5％或约10％。
在一个实施方式中，磨碎的珍珠母和磨碎的透钙磷石以约4:10的比例反应。在另一个实施方式中，磨碎的珍珠母和磨碎的透钙磷石以约4：5、约4：6、约4：7、约4：8、约4：9、约4:11、约4:12、约4:13、约4:14、约4:15、约0.5：10、约1:10、约2:10、约3:10、约5:10、约6:10、约7:10、约8:10或约9:10的比例反应。
在该方法的第二阶段的另一个实施方式中，磨碎的珍珠母与磨碎的透钙磷石在磷酸氢二钠溶液中的反应体系还包含磷酸四钙(Ca4(PO4)2O)。在此阶段使用磷酸四钙具有三个优点：它与透钙磷石快速反应形成羟基磷灰石，从而导致初始固化；它可能催化珍珠母和透钙磷石之间的反应；它提供不同于珍珠母、透钙磷石和碳酸磷灰石的吸收速率。吸收梯度有助于植入后在钙化组织替代物中逐渐形成孔。
在一个实施方式中，使用磷酸三钙(α-TCP)代替磷酸四钙，因为α-TCP通过水合反应转化为羟基磷灰石。
在一个实施方式中，磨碎的珍珠母、磨碎的透钙磷石和磷酸四钙以6：9：5、7：8：5、8：7：5、9：6：5或10：5：5的比例在磷酸氢二钠溶液中反应。
如实施例2所示，改变磨碎的珍珠母、磨碎的透钙磷石和磷酸四钙的比例会改变钙化组织替代物的特性。如X射线衍射(XRD)所示，改变磨碎的珍珠母的比例将改变钙化组织替代物中珍珠母的比例，这具有明显的优势。例如，与珍珠母比例较低的钙化组织替代物相比，珍珠母比例较高的钙化组织替代物，例如钙化组织替代物E，还将具有最高比例的生物活性剂，因此具有最高水平的骨诱导性。
因此，与珍珠母比例较高的钙化组织替代物相比，珍珠母比例较低的钙化组织替代物，例如钙化组织替代物A，将具有最高比例的磷灰石，因此具有最高水平的骨传导性。即，珍珠母比例较低和磷灰石比例较高的钙化组织替代物将具有较慢的吸收速率，从而在更长的时间内提供支架或机械支撑。因此，可以根据钙化组织所需的特定修复来改变钙化组织替代物的组成。
在一个实施方式中，磷酸氢二钠溶液与其它反应剂以约1：4、约1：3、约1：2、约1：1、或约10％、约20％、约25％、约30％、约33％、约40％、约50％或约60％的溶液:反应剂比例反应。
在一个实施方式中，磨碎的珍珠母和磨碎的透钙磷石，和任选的磷酸四钙在约37℃下反应。该实施例特别适合于钙化组织替代物反应并允许其原位固化并硬化的手术。如果将钙化组织替代物用于在体温不是37℃的非人类动物的修复，则磨碎的珍珠母和磨碎的透钙磷石，和任选的磷酸四钙可在体温下反应。
在另一个实施方式中，将磨碎的珍珠母和磨碎的透钙磷石和任选的磷酸四钙在室温或在约4℃，约10℃，约15℃，约20℃，约25℃，约10℃下反应。30℃，约35℃，约37℃，约40℃，约42℃，约50℃或约60℃下反应。高于或低于约37℃的反应温度适合于制备钙化组织替代物，该替代物打算被植入、预先固化和预先硬化。
在一个实施方式中，该方法进一步包括添加改变组合物固化时间的试剂，任选地水辉石(hectorite)、钠基蒙脱土或α-硫酸钙。
这样的添加剂还可以用于提供负载在适当的添加剂颗粒(例如钠基蒙脱土颗粒)上带正电荷的抗体或分子从钙化组织替代物(珍珠母-正磷酸钙颗粒)中受控共释放。这种受控共释放在本领域中是已知的(例如，Xiao等人.材料科学与工程生物材料(Mater SciEng C Mater Biol Appl)(2016)60:348-56；Ordikhan等人.材料科学杂志(J Mater SciMater Med)(2015)26(12):269；Li等人.ACS应用材料和界面(ACS Appl MaterInterfaces)(2014)6(15):12328-34；Wang等人.ACS应用材料和界面(ACS Appl MaterInterfaces)(2014)6(19):16687-95))
在一个实施方式中，当通过本发明的方法生产钙化组织替代物时，所述钙化组织替代物是颗粒的并且在颗粒表面上包含正磷酸钙。
如本文所用，“正磷酸盐”是指阴离子PO4 3-，并且“正磷酸钙”涵盖包括具有不同化学计量比的钙和正磷酸根的多种化合物。在一个实施方式中，正磷酸钙可以是羟基磷灰石。
在一个实施方式中，如果将钙化组织替代物用于在体温不是37℃的非人类动物中进行修复，则将钙化组织替代物在100％湿度和37℃，或100％湿度和体温下固化。该实施方式特别适用于钙化组织替代物反应并允许其原位固化并硬化的手术。在另一个实施方式中，将钙化组织替代物在约4℃、约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约37℃、约40℃、约42℃、约50℃或约60℃固化。在另一个实施方式中，钙化组织替代物在约99％、约98％、约97％、约96％、约95％、约94％、约93％、约92％、约91％、约90％、80％、约70％、约60％或约50％的湿度下固化。在另一个实施方式中，将钙化组织替代物在上述温度和湿度的任意组合下固化。
在一个实施方式中，钙化组织替代物的峰值负荷大于约45N。在另一实施方式中，钙化组织替代物的峰值负荷大于约50N，大于约100N，大于约150N，大于约200N，大于约250N，大于约300N，大于约350N，大于约400N，大于约450N，大于约500N，大于约550N，大于约600N，大于约650N，大于约700N，大于约750N，大于约800N，大于约850N，大于约900N，大于约950N或大于约1000N。
在一个实施方式中，钙化组织替代物的抗压强度大于约2.3MPa。在另一个实施方式中，钙化组织替代物的抗压强度大于约2.5MPa，大于约3MPa，大于约3.5MPa，大于约4MPa，大于约4.5MPa，大于约5MPa，大于约5.5MPa，大于约6MPa，大于约6.5MPa，大于约7MPa，大于约7.5MPa，大于约8MPa，大于约8.5MPa，大于约9MPa，大于约9.5MPa，大于约10MPa，大于约10.5MPa，大于约11MPa，大于约11.5MPa或大于约12MPa。
如上所述，机械强度的增加，例如，峰值负荷增加，部分反映了骨传导的改善和延长。
在一个实施方式中，钙化组织替代物是可植入的或可注射的。
在一个实施方式中，钙化组织替代物的初始固化时间(Ti)为30分钟至90分钟。在另一个实施方式中，Ti为约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约75分钟、约80分钟、约85分钟或约90分钟。
在一个实施方式中，钙化组织替代物的最终固化时间(Tf)为60分钟至120分钟。在另一个实施方式中，Tf为约60分钟、约65分钟、约70分钟、约75分钟、约80分钟、约85分钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约105分钟、约110分钟，约115分钟或约120分钟。
可植入的钙化组织替代物可以在植入之前或之后固化并硬化。相反，可注射的钙化组织替代物可在注射后固化或硬化。
第五方面的输送装置促进钙化组织替代物的注射。输送装置为将钙化组织替代物的固化和硬化延迟到修复之时，通常手术之时提供了手段。通过在装置的不同腔室中提供磨碎的透钙磷石和磨碎的珍珠母，可以实现固化和硬化的延迟，其中装置的启动导致磨碎的透钙磷石和磨碎的珍珠母发生反应。
在一个实施方式中，第五方面的输送装置的第一腔室和/或第二腔室还包含磷酸氢二钠溶液。在另一个实施方式中，输送装置包括第三腔室，该第三腔室包含磷酸氢二钠溶液。
在一个实施方式中，从输送装置的输送包括混合磨碎的珍珠母和磨碎的透钙磷石。
在一个实施方式中，输送装置是注射器。
如本文所用，“反应附近”是指足以允许磨碎的珍珠母与磨碎的透钙磷石反应的空间关系，并且可能需要将磨碎的珍珠母与磨碎的透钙磷石混合以反应。
钙化组织替代物用于修复对象的钙化组织。
本文使用的“对象”可以是人或非人动物，例如“家养动物，动物园或伴侣动物。在一个实施方式中，所述对象是哺乳动物。哺乳动物可以是有蹄类动物和/或可以是例如马、牛、鹿、绵羊、犬或猫。在一个实施方式中，对象是灵长类动物。在一个实施方式中，对象是人。因此，本发明具有人类医学应用，和兽医和畜牧应用，包括治疗例如马、牛和羊等家畜和例如狗和猫等伴侣动物。
本领域技术人员将将理解，向对象施用治疗有效量的钙化组织替代物的确切方式将由医师根据所需的修复来决定。施用方式(包括与其它药物的联合，施用时间等)可能会受到对象对治疗的反应程度和对象的病情和病史的影响。
钙化组织替代物将按照良好作业规范进行制造和使用。在本文中要考虑的因素包括要修复的特定钙化组织、正在修复钙化组织的特定对象、对象的临床状况，施用部位、施用方法、施用时间表、可能的副作用和其医生执业者已知的其它因素。钙化组织替代物的治疗有效量将由这些因素决定。
术语“治疗有效量”是指有效修复对象钙化组织的钙化组织替代物的量。
在本说明书的整个说明书和权利要求书中，术语“包括”和该词的变体，例如“含有”和“包含”，意指“包括但不限于”，并不旨在排除其它添加剂、组分或步骤。
现在将参考以下非限制性实施例描述本发明。
实施例
实施例1
本发明涉及与珍珠母颗粒的许多化学反应。
1)选择珍珠母并磨成粉末状(磨碎的珍珠母)。然后用50至400μm不同孔径的选择性筛网对粉末进行筛分。
2)选择颗粒粒径为50-100μm的珍珠母颗粒与磷酸一钙按4:10的比例在室温下混合30分钟。
3)在室温下，珍珠母颗粒与磷酸一钙在蒸馏水中反应形成透钙磷石晶体和CO2。反应在几分钟内发生。将晶体在室温下风干3天或冷冻干燥2-3小时。
4)将透钙磷石晶体研磨成粒径在10至100μm之间的粉末(磨碎的透钙磷石)。
5)在室温下，将结晶透钙磷石粉末与粒径为50至400μm的珍珠母颗粒以4：10的比例在磷酸氢二钠溶液(pH 8.2-9.5)中混合。该反应使混合物在37℃100％湿度下硬化90分钟
6)可添加包括合成的水辉石(钠基蒙脱土)或α-硫酸钙在内的添加剂，以控制可注射或可植入装置在不同应用中的固化时间。
7)固化后，观察到珍珠母颗粒在其表面上具有羟基磷灰石。
步骤(2)和(3)的化学反应为：
CaCO3+Ca(H2PO4)2·H2O+2H2O→2CaHPO4·2H2O+CO2
步骤(5)的化学反应为：
5.2CaHPO4·2H2O+3.6CaCO3→Ca8.8(HPO4)0.7(PO4)4.5(CO3)0.7(OH)1.3+2.9CO2+12H2O
图1提供了实施例1的方法的概述。
实施例2
1.实验方法
选择珍珠母并研磨成粉末形式。然后用孔径小于200μm的选择性筛网筛分粉末。将珍珠母颗粒与磷酸一钙以4:10的比例混合，混合物在室温下与蒸馏水反应，形成透钙磷石晶体和CO2。将透钙磷石晶体在37℃下干燥，然后研磨。如同实施例1，化学反应为：
CaCO3+Ca(H2PO4)2·H2O+2H2O→2CaHPO4·2H2O+CO2
将珍珠母颗粒与透钙磷石颗粒和磷酸四钙以五种不同的比例混合(A 6：9：5，B7：8：5，C 8：7：5，D 9：6：5，E 10：5：5)。这五个比例分别相当于30％珍珠母、35％珍珠母、40％珍珠母、45％珍珠母和50％珍珠母。该混合物在4％磷酸氢二钠溶液(pH 9.25)中以1：3的液/粉(mL/g)比在室温下反应。混合的糊状物在37℃的100％湿度下固化并硬化。化学反应是：
2CaHPO4+2Ca4(PO4)2O→Ca10(PO4)6(OH)2
5.2CaHPO4·2H2O+3.6CaCO3→Ca8.8(HPO4)0.7(PO4)4.5(CO3)0.7(OH)1.3+2.9CO2+12H2O
2.物理特性
i.X射线衍射(XRD)
用X射线衍射仪(XRD，PANanalytical X’Pert PRO，荷兰)对五个钙化组织替代物A-E进行分析。使用逐步扫描法以0.0070°的步长在衍射角(2θ)的10°至90°的范围内扫描每种钙化组织替代物的样品，在40kV和40mA下衍射仪操作。
XRD结果(表2)显示珍珠母-正磷酸钙颗粒，即钙化组织替代物的无机化学组成。
表2通过XRD确定根据实施例2制造的钙化组织替代物的组成。
XRD数据显示钙化组织替代物E具有最高的珍珠母百分比，相应的生物活性成分百分比最高，因此骨诱导率最高。钙化组织替代物A的珍珠母百分比最低，磷灰石百分比最高。因此，钙化组织替代物A的吸收速率最慢，因此可以在更长的时间内提供机械支持，和有利于大的钙化组织缺损。
ii.抗压测试
对圆柱形试样(直径10毫米x高20毫米)进行机械特性测定(表3，图2)，该试样在100％湿度和37℃下保持3天并立即使用Instron试验机进行抗压试验，该试验机配有1千牛的称重传感器，十字头速度为0.1mm.min-1。在该测试中，使用圆柱形多孔市售骨替代材料(SKELITE TM)作为对照(5mm直径x 5mm高)。
抗压强度的计算公式如下：
σ是抗压强度
F是在压缩下施加在物体上的力；
A是施加力的实际横截面积；
其中，
A0是物体的原始样本区域
ΔL是物体长度变化的量；
L0是物体的原始长度。
表3.根据实施例2制造的钙化组织替代物的机械特性
珍珠母-正磷酸钙盐颗粒，即钙化组织替代物的抗压强度抗压强度是商业产品的2-3倍。因此，钙化组织替代物为钙化组织缺损提供了更强的机械支持。
iii.扫描电子显微镜(SEM)
使用反向散射电子(BSE)和二次电子(SE)模式的扫描电子显微镜(SEM)分析了5种钙化组织替代物的微观结构和形态。
图3和图4的SEM显微照片清楚地显示了珍珠母-正磷酸钙盐颗粒(即钙化组织替代物)的表面形态，并显示了正磷酸钙环绕的珍珠母颗粒和涂覆有正磷酸钙的珍珠母颗粒，其中未反应的珍珠母提供了生物活性成分以增强骨诱导性，暴露的珍珠母具有快速的吸收速率，可在植入体内几周后产生孔。孔促进了新钙化组织的形成-在早期阶段，正磷酸钙提供了机械支撑，但在后期阶段将被钙化组织替代。
iv.固化时间
初始固化时间和最终固化时间(表4和表5)由维卡特(Vicat)方法确定，维卡特方法是通过维卡特针测定水硬性水泥浆体固化时间的标准试验方法。初始固化时间被计算为从反应开始到针刺入25mm之间经过的时间。最终固化时间是指针头未刺入测试材料时所经过的时间。测量值一式三份，以平均值±标准偏差表示。(n＝5)
表4根据实施例2制造的钙化组织替代物的固化时间(使用珍珠母颗粒(粒径<200μm)，透钙磷石颗粒(粒径<200μm)和磷酸四钙颗粒(粒径<70μm))。
| 钙化组织替代物 | 初始固化时间(T<sub>i</sub>，min) | 最终固化时间(T<sub>f</sub>，min) |
| A，30％珍珠母 | 38.5±1.2 | 60.5±0.5 |
| B，35％珍珠母 | 55.0±0.5 | 74.0±0.5 |
| C，40％珍珠母 | 59.5±0.8 | 77.0±0.8 |
| D，45％珍珠母 | 78.3±1.5 | 95.5±1.5 |
| E，50％珍珠母 | 89.8±1.2 | 114.5±2.3 |
表5根据实施例2制造的钙化组织替代物的固化时间(使用珍珠母颗粒(粒度<200μm)，重新磨碎的透钙磷石颗粒(粒度<30μm)和磷酸四钙颗粒(粒度2-20μm))。
| 钙化组织替代物 | 初始固化时间(T<sub>i</sub>，min) | 最终固化时间(T<sub>f</sub>，min) |
| A，30％珍珠母 | 29.5±1.0 | 46.0±0.5 |
| B，35％珍珠母 | 41.5±0.8 | 62.0±0.5 |
| C，40％珍珠母 | 49.5±1.8 | 70.0±1.5 |
| D，45％珍珠母 | 64.3±1.5 | 82.5±0.5 |
| E，50％珍珠母 | 82.4±2.2 | 107.5±1.0 |
表4和表5显示，使用较细颗粒作为原料制造的钙化组织替代物的固化时间比使用较粗颗粒更快。因此，粒径对于钙化组织替代物的固化时间至关重要。
3.体外测试
为了研究钙化组织替代物的细胞相容性，在钙化组织替代物上培养了HeLa、MLO-Y4和MC3T3细胞系(图5至8)。通过激光共聚焦扫描显微镜观察细胞粘附。以羟基磷灰石为对照，通过比色MTS法测试细胞增殖。
v.激光扫描共聚焦显微镜-细胞粘附和细胞相容性
a.HeLa细胞系(24小时)
图5所示的HeLa细胞培养物显示了珍珠母-正磷酸颗粒，即钙化组织替代物的良好细胞粘附性和细胞相容性。
b.MLO-Y4细胞株(72小时)
MLO-Y4是一种骨细胞样细胞系。MLO-Y4细胞在根据实施例2制备的钙化组织替代物A(使用以6:9:5比例的珍珠母颗粒、透钙磷石颗粒和磷酸四钙)上培养72小时。用荧光鬼笔环肽标记细胞膜中的F-肌动蛋白(红色)。激光共聚焦扫描显微镜显示细胞对钙化组织替代物(青绿色)的粘附和进入钙化组织替代物的3D结构。图6和图7显示了对钙化组织替代物的粘附(图6)、树突生长(图6B)和树突连接的形成(图7)。
c.MC3T3细胞系(最长72小时)
MC3T3是成骨细胞前体细胞系，用于培养最长72小时的细胞增殖分析。细胞增殖分析的结果如图8所示，其中阴性对照是没有细胞的试剂的吸光度，而阳性对照是在普通骨替代物，羟磷灰石(西格玛奥德里奇)上培养的MC3T3细胞。如图8所示，与羟基磷灰石相比，当将细胞培养在珍珠母-正磷酸钙颗粒上，即钙化组织替代材料上时，细胞增殖更快。细胞成骨分化的结果如图9所示，其显示珍珠母-正磷酸钙复合材料上的ALP活性显著高于羟基磷灰石上的ALP活性。该结果表明，与羟基磷灰石相比，珍珠母-正磷酸钙材料为成骨细胞提供了更强的骨诱导能力。
4.动物研究
为了研究钙化组织替代物的生物降解效率，将圆柱形的钙化组织替代物植入兔子背部浅筋膜下。并且，为了研究钙化组织替代物的生物相容性和骨诱导性，将钙化组织替代物植入兔股骨远端干骺端区域上的人工骨缺损部位。在动物研究中，使用根据实施例2制备的钙化组织替代物C，并且羟基磷灰石用作对照。
在动物研究中，使用体重为2.8±0.3kg的骨骼成熟的新西兰大白兔。开始实验前，让动物适应环境1周。将它们分别饲养在光滑的不锈钢笼中，每笼一只动物，给予食物和水，并按照国家卫生和医学研究委员会(NHMRC)的动物护理准则进行处理。每天进行一次发病率，死亡率和一般健康观察(笼侧)。
vi.生物降解效率
通过耳静脉注射戊巴比妥(0.03mg/kg体重)麻醉新西兰大白兔。通过背侧中线入路将圆柱形材料(直径10mm，高5mm，四种珍珠母-正磷酸钙材料和四种羟基磷灰石材料)植入动物的双侧椎旁浅筋膜下(左侧为珍珠母-正磷酸钙材料，右侧为羟基磷灰石材料)。在四个不同的时间点(3周、6周、9周或12周)取出每种材料中的一种，称重，然后计算每种材料的失重百分比。测试进行三次，并计算每个时间过程的失重百分比的平均值±SD。图10A是显示生物降解速率的折线图，图10B包括显示随时间变化的降解材料的形态的照片。图10A的折线图表明，珍珠母-正磷酸钙材料的生物降解速率明显快于羟基磷灰石的生物降解速度。然而，如图10B所示，对于珍珠母-正磷酸钙材料，尽管观察到该材料的腐蚀表面，但仍保持圆柱形状。这表明钙化组织替代物的生物降解比最常用的骨替代生物材料，羟磷灰石更快。生物降解速率是缓慢而适中的，没有物理支撑物的崩塌。
vii.生物相容性和骨诱导性
通过耳静脉注射戊巴比妥(0.03mg/kg体重)麻醉新西兰大白兔。将动物仰卧在手术台上，并以无菌方式剃刮、准备和覆盖实验膝盖(右)。经髌骨内侧纵切口进入右侧股骨干骺端，髌骨外侧移位露出股骨皮质骨。用不锈钢钻造成一个直径为5毫米，深度5毫米，距股骨骨骺线2.5毫米的圆形缺损。然后，根据表5将不同的钙化的组织替代物(珍珠母-正磷酸钙)或对照材料(羟基磷灰石)植入不同的骨缺损部位。切口层层闭合。每只兔子只进行了一次股骨手术，33只兔子共造成33个缺损(图11)。术后，通过手术对照组的Micro-CT和X射线确认动物模型(图12)。之后，将兔子放回笼子，自由走动。术后的头三天，通过肌肉注射头孢唑林(200mg/kg)对每只兔子进行抗感染治疗。
4周和8周后，处死所有兔子，取回右股骨，去除软组织(图13)。然后，在进行Micro-CT扫描和分析之前，样品在乙醇/水体积分数的乙醇梯度中脱水。
表5生物相容性和骨诱导性动物研究。
| 组 | 骨替代材料 | 处死时间点 | 样品 |
| NO4 | 珍珠母-正磷酸钙 | 4周 | n＝5 |
| NO8 | 珍珠母-正磷酸钙 | 8周 | n＝5 |
| HA4 | 羟基磷灰石 | 4周 | n＝5 |
| HA8 | 羟基磷灰石 | 8周 | n＝5 |
| BC4 | 无植入物(空白对照) | 4周 | n＝5 |
| BC8 | 无植入物(空白对照) | 8周 | n＝5 |
| 手术对照 | 没有植入物 | 手术后 | n＝3 |
使用Micro-CT对取出的股骨进行高分辨率扫描和重建，以观察骨/植入物界面(图14A，B，C，D，E，F)。用μCT(Skyscan1172，布鲁克，德国)在70keV和145μA下对标本进行三维扫描，各向同性分辨率为10.5μm。扫描整个股骨。对于每次扫描，均在股骨远端进行扫描，并向近端继续扫描0.5毫米。选定区域的总体积是恒定的(4mm3)。应用于3D图像的灰色阈值用于将新形成的骨骼组织(阈值60)与残留材料(阈值110)分开。通过从阈值110减去阈值60可计算出缺损部位新形成的骨组织的体积。新骨组织的体积分数表示为所选体积的百分比。通过计算在不同注入时间下材料的体积分数的差异来确定降解速率。每个样品进行三次重复。此后，计算骨体积/总体积(BV/TV)、骨表面/骨体积(BS/BV)、皮质厚度(Ct.Th)、分形维数(Fractal dimension，FD和孔隙率百分比(PoV)/TV％)的值(图15、16、17)。
通过肉眼观察(图13)取出的样品和Micro-CT的图像(图14A和14D)，没有发炎、感染或排斥的迹象，例如从骨缺损部位非炎性渗出、骨溶解、骨质破坏等。从动物的总体健康观察来看，兔子在手术后总体上是健康的，没有发现明显的感染和过敏体征。因此，研究表明珍珠母-正磷酸钙材料是一种安全且生物相容的植入物。
从Micro-CT的图像来看，在4周和8周后，周围骨组织与珍珠母-正磷酸钙材料紧密连接，这表明该材料具有良好的骨整合性(图14A和14D)。与空白对照组(图14C和14F)相比，植入的珍珠母-正磷酸钙和羟基磷灰石均可促进骨缺损的恢复。然而，在8周，植入珍珠母-正磷酸钙的组的骨缺损侧皮质骨的连续性要好于植入羟基磷灰石的组(图14D和14E)，这表明其骨愈合性能更好。更重要的是，珍珠母-正磷酸钙植入组的皮质骨厚度明显比羟基磷灰石植入组的皮质骨厚，这表明骨膜反应更强。准确地说，这表明钙化组织替代物能够刺激有效的成骨细胞活性。
如Micro-CT数据分析的结果所示(图15、16、17)，珍珠母-正磷酸钙植入组的BV/TV和BS/BV在统计学上高于羟基磷灰石植入组。此外，在4周内，珍珠母-正磷酸钙植入组的骨缺损部位的孔隙率低于羟基磷灰石植入组。结果表明，植入珍珠母-正磷酸钙的组中形成的新骨体积更大，这可以解释为珍珠母-正磷酸钙材料的骨诱导性。
总之，作为临床前试验的重要组成部分，动物研究证实，与传统的磷酸钙材料(例如羟磷灰石)相比，珍珠母钙正磷酸盐材料因其生物降解速率较快，生物相容性和骨诱导性良好，而是较好的骨替代物。
Claims (31)
1.一种制造钙化组织替代物的方法，所述方法包括：
-将磨碎的珍珠母、磷酸一钙和水反应生成透钙磷石；
-研磨所述的透钙磷石；
-在磷酸氢二钠溶液中将磨碎的珍珠母与磨碎的透钙磷石反应。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磨碎的珍珠母的粒径为400μm或更小，或200μm或更小。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述磨碎的珍珠母的粒径为50μm或更大。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述磨碎的珍珠母的粒径为50μm至400μm或50μm至100μm。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述磨碎的透钙磷石的粒径为10μm至100μm。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述磨碎的珍珠母和磷酸一钙以4:10的比例反应。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，磷酸氢二钠溶液的pH为8.2至9.5。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，磷酸氢二钠溶液是2.5％至4％的溶液。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于，在室温或约37℃下使磨碎的珍珠母和磷酸一钙反应和/或使磨碎的珍珠母和磨碎的透钙磷石反应。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，还包括在研磨所述透钙磷石之前干燥所述透钙磷石。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，还包括分离粒径为10μm至100μm的磨碎的透钙磷石。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其特征在于，所述磨碎的珍珠母和磨碎的透钙磷石以4：10的比例反应。
13.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其特征在于，在磷酸氢二钠溶液中磨碎的珍珠母与磨碎的透钙磷石的反应体系还包含磷酸四钙。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，在磷酸氢二钠溶液中，所述磨碎的珍珠母、磨碎的透钙磷石和磷酸四钙以6：9：5、7：8：5、8：7：5、9：6：5或10：5：5的比例反应。
15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其特征在于，磷酸氢二钠溶液与其它反应剂以25％、33％、40％或50％的溶液:反应剂比例反应。
16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，所述的方法还包括添加改变所述组合物的固化时间的试剂，任选地水辉石、钠基蒙脱土或α-硫酸钙。
17.一种通过如权利要求1至16中任一项所述的方法制造的钙化组织替代物。
18.如权利要求17所述的替代物，所述的替代物为颗粒并且在所述颗粒表面上包含羟基磷灰石。
19.如权利要求17或18所述的替代物，所述的替代物在100％的湿度和37℃下固化。
20.如权利要求17至19中任一项所述的替代物，所述的替代物具有大于45N的峰值载荷或大于2.3MPa的抗压强度。
21.如权利要求17至20中任一项所述的替代物，所述的替代物是可植入的或可注射的。
22.如权利要求17至21中任一项所述的替代物，所述的替代物具有30-90min的初始固化时间(Ti)。
23.如权利要求17至21中任一项所述的替代物，所述的替代物具有60-120min的最终固化时间(Tf)。
24.磨碎的珍珠母、磷酸一钙和水在制造用于修复钙化组织的钙化组织替代物中的用途。
25.一种修复钙化组织的方法，所述方法包括使所述钙化组织与如权利要求17至23中任一项所述的替代物接触。
26.如权利要求1至16或25中任一项所述的方法，或如权利要求24所述的用途，其特征在于，所述钙化组织是牙齿或骨骼。
27.一种输送装置，所述的装置包括第一腔室和第二腔室，所述第一腔室包括磨碎的珍珠母，所述第二腔室包括磨碎的透钙磷石，其中，通过将磨碎的珍珠母、磷酸一钙和水反应来制备磨碎的透钙磷石，研磨得到的透钙磷石，其中该装置适于将磨碎的珍珠母和磨碎的透钙磷石同时递送到反应附近，从而使磨碎的珍珠母和磨碎的透钙磷石在磷酸氢二钠溶液存在下进行反应。
28.如权利要求27所述的装置，其特征在于，所述第一腔室和/或所述第二腔室还包括磷酸氢二钠溶液。
29.如权利要求27所述的装置，其特征在于，所述装置包括第三腔室，所述第三腔室包含磷酸氢二钠溶液。
30.如权利要求27至29中任一项所述的装置，其特征在于，输送包括将所述磨碎的珍珠母和所述磨碎的透钙磷石混合。
31.如权利要求27至30中任一项所述的装置，所述的装置是注射器。
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