CN1958071A - 抗猪繁殖与呼吸综合征、猪2型圆环病毒二联高免免疫球蛋白 - Google Patents

Abstract

抗猪繁殖与呼吸综合征、猪2型圆环病毒二联高免免疫球蛋白，其免疫原用取细胞培养物经浓缩后加完全弗氏完全佐剂制备而成，浓缩后将这两种病毒抗原以体积比(1～3)∶(1～3)的比例混合后按照体积比1∶1加入弗氏完全佐剂作为免疫原免疫动物，同时使用吉林鲸象动物药业有限公司生产的苷肽注射液作为免疫增强剂，以提高抗体效价，其制备方法按照中华人民共和国兽用生物制品规程(2000年版)规定的方法对制备的高免免疫球蛋白进行加工；本发明的产品主要是针对目前对我国养猪业威胁最为严重的两种疾病；具有组方科学，特异性高，针对性强，疗效确实、安全性好、不会产生药物残留、保存和使用方便的积极效果。

Description

抗猪繁殖与呼吸综合征、猪2型圆环病毒二联高免免疫球蛋白

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗猪繁殖与呼吸综合征、猪2型圆环病毒的二联高免免疫球蛋白，国际专利分类号为：A61K39/395。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征和猪2型圆环病毒病是近年来在我国猪群发生的严重危害养猪业的新的传染病。这两种疾病来自于进口猪，在我国属于新近引进的疾病。由于目前我国属于新疫区，故这两种疾病在我国的流行以及危害程度也比较严重。往往造成母猪流产和仔猪成窝的死亡。对养猪业造成了巨大的损失。

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)又叫蓝耳病，是由披膜病毒科(Togaviridse)动脉炎病毒属(Arterivirus)的猪繁殖呼吸道综合征病毒(Porcinereproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)所引起以怀孕母猪流产、死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍及仔猪严重呼吸道症状和高死亡率为特征的一种传染病。在发现该病的初期，由于当时不明白其病因，因此将其称为“神秘猪病”(MSD)。直到1991年春季，荷兰科学家找到了导致“神秘猪病”的病毒，证实猪繁殖与呼吸综合征是由由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的疾病。上世纪90年代初，PRRS已成为一种全球性的流行病，至今还对养猪业造成着巨大的经济损失。

在临床上猪繁殖与呼吸综合征以怀孕母猪流产、死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍及仔猪呼吸道症状和高死亡率为特征疾病。经产和初产母猪出现精神沉郁、冷漠、厌食、发热、呼吸困难等症状，有时还出现呕吐。重要的是出现这些症状后，大量怀孕母猪流产或早产，主要见于妊娠后期的母猪流产严重，表现为突然出现厌食，部分猪可能会出现呼吸道症状，如喷嚏、咳嗽等类似猪流感的症状，部分母猪体温稍高，但通常不出现高热稽留。有的母猪拉干粪。严重的病例出现沉郁、呼吸困难等。耳间、耳边呈现蓝紫色。有的四肢末端、腹侧有水肿，有的皮肤有红斑，大面积梗死和大的疹块，阴部肿胀。产出死胎、弱仔胎、木乃伊胎、组织自溶胎儿和假似健康胎儿。这些弱小仔猪出生后外表正常，不久便出现呼吸困难，在呼吸困难中可见到呃逆样表现，常会在24小时内死亡。有的出现腹泻，导致死亡或生长停止。有的产后母猪因发热、厌食、少奶或无奶而导致仔猪大批死亡。仔诸死亡率可达80％～100％。有的母猪断奶后发情时间延长。

圆环猪病毒感染是由猪2型圆环病毒所引起的疾病。猪圆环病毒(Porcine Circovirus PCV)是圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属成员，正二十面体对称，无囊膜，直径17-22nm，为单股环状DNA病毒，DNA长度约为1768bp，是迄今发现的最小的动物病毒。PCV存在两种基因型，即PCV-1和PCV-2。PCV-1无致病性，普遍存在于猪源细胞系及正常猪体内各组织中。

PCV-2可引发猪发生多种疾病。病猪和隐性感染的带毒猪是主要的传染源。由猪2型圆环病毒所引起的主要疾病是：(1)仔猪断奶后多系统衰竭综合症(Post-weaning multisystemicwasting sysdrome，PMWS)：病猪精神、食欲不振，消化不良，腹泻，被毛粗乱，生长迟缓或停滞，进行性消瘦，肌肉无力。气喘，咳嗽，呼吸困难。皮肤苍白，贫血。体表淋巴结，尤其是腹股沟淋巴结肿大。偶见的临床症状有发热，胃溃疡，嗜睡，神经紊乱，猝死等。在临床上大约有20％左右的病猪呈现贫血与黄疸症状。PMWS的发病率一般为5％～30％，死亡率可达70％～80％。(2)猪皮炎与肾病综合症(PDNS)：病猪厌食，消瘦和生长停滞，皮肤苍白，少数病猪皮肤发黄。部分病猪体温升高，后期喘气症状明显，咳嗽不一定很严重。有些病猪发生腹泻，关节肿胀或跛行。多数发病仔猪的腹股沟淋巴结明显肿大。(3)母猪繁殖障碍：发病猪体温升高，可达41℃～42℃。食欲减退，出现流产，产死胎、木乃伊胎、弱胎，断奶前仔猪死亡率上升，病后母猪受胎率降低或不孕。(4)猪间质性肺炎：其临床表现主要为猪呼吸道病综合症(PRDC)，多见于保育期和育肥期的猪。病猪咳嗽，流鼻涕，呼吸加快，精神沉郁，食欲不振，生长缓慢。在PCV-2与蓝耳病(PRRS)混合感染时，可使临床症状加剧并大大增加死亡率。(5)仔猪先天性震颤：发病仔猪站立时震颤，由轻变重，卧下或睡觉时震颤消失，受外界刺激时可以引发或加重震颤，严重时可影响吃奶，以致死亡。

目前我国用于预防PRRS病毒疫苗有弱毒疫苗和灭活疫苗。毫无疑问，这两种疫苗在控制PRRS的发生和流行中都起到了积极的作用。弱毒疫苗的优点是免疫保护效果确实，免疫期长。肌肉接种弱毒疫苗后，会在猪体内复制产生病毒血症，病毒血症的持续期大约为2～4周时间。种公猪接种后会从精液排出疫苗病毒，妊娠母猪接种后，可产出获得免疫的健康仔猪。其缺点是在使用过程中，有些弱毒疫苗的毒株可能会与野毒株杂交，使其毒力返强，存在安全隐患。灭活疫苗的优点是比较安全，但其免疫保护其较短，需要多次注射加强免疫。但也可产生一定的免疫保护并能减少PRRS感染带来的损失。对PRRS而言，在自然条件下，受到PRRS病毒感染的猪不会很快的产生保护性免疫应答而从动物体内清除病毒，正常猪的免疫系统可能要花上几个月的时间才能从机体内清除PRRS病毒。而且，疫苗所诱导出的免疫应答要比猪对野毒的免疫应答弱。

对于2型圆环病毒感染目前我国还没有可供使用的商品化疫苗。

在我国目前的情况下，对于这两种疾病，由于没有特效的治疗药物以及饲养条件及其它方面条件的制约，加之又是新发生的疾病，饲养者几乎没有对这两种疾病进行免疫的概念，经常不使用PRRS疫苗进行免疫。加之这两种疾病又经常会出现混合感染并引起感染猪机体发生免疫障碍，从而引起其他疾病的的继发感染(如猪链球菌病的继发感染)，使猪群的死亡率急剧增加，尤其是对于饲养商品猪的养殖场、户，经常造成全军覆没的后果。在动物发病后，只能使用抗生素类药物或免疫调节制剂，控制并发的细菌性感染和提高动物机体的非特异性免疫功能，不能从根本上解决问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种采用两种免疫原制备的具有特异性高，针对性强，疗效确实的抗猪繁殖与呼吸综合征、猪2型圆环病毒二联高免免疫球蛋白。

本发明的免疫原用取细胞培养物经浓缩后加完全弗氏佐剂制备而成，用Marc-145细胞培养猪繁殖与呼吸综合征病毒，病毒校价达到10^6～8。用PK-15细胞培养猪2型圆环病毒，病毒校价达到10^5～6，将这两种免疫原以(1～3)∶(1～3)的比例混合后按照体积比加入1∶1弗氏佐剂作为免疫原免疫动物。同时使用吉林鲸象动物药业有限公司研制成的苷肽注射液(发明名称为：一种提高动物免疫功能的苷肽注射液，中国专利申请号为：2005 1 0016626.2)作为免疫增强剂，5毫升/支，以提高抗体效价。

本发明的免疫动物使用经过严格检疫的猪、马(骡、驴)作为免疫动物。

本发明的免疫程序

免疫途径采用皮内、皮下或穴位、肌肉多点注射。基础免疫剂量为每头猪3ml，马(骡、驴)5ml。免疫方式猪为皮下或肌肉多点注射，马(骡、驴)用皮内、皮下或穴位多点注射。间隔28天进行第一次加强免疫，免疫剂量为猪8ml，马(骡、驴)12ml。以后每间隔14天抗体效价达不到此标准，继续加强免疫一次，然后对马(骡、驴)颈静脉采血或对免疫猪颈动脉或心脏直接放血。

抗体效价检测

分别使用检测这两种疾病的ELISA方法检测血清抗体效价。检测抗原用细胞培养物经浓缩的并经过相应处理的病毒，第二抗体采用相对应的兔抗猪(鼠抗猪)或兔抗马(鼠抗马)，同时设立阴、阳性血清对照。血清抗体效价合格者方能进行采血或作为合格产品出厂。

采血和血清提取

首先用1％～5％无菌氯化钠溶液将采血的容器内壁完全打湿。每个容器应标明动物号码、最后一次加强免疫日期和采血日期。无菌采血后将采集的血液在20℃在～25℃放置，待其全部凝固并有血清析出时，加入灭菌的压砣，48～72小时后，以无菌方式提取血清。同时按血清总量的0.5％加入氯仿、0.0035％加入硫柳汞，加塞密封，充分摇匀，放置于2℃～15℃冷暗处，沉淀澄清。同时每瓶血清应贴有动物号、血清量和分离日期。

血浆提取

将血液收集于盛有5％灭菌枸橼酸钠溶液的灭菌玻璃瓶中，血液和枸橼酸钠溶液的比例为9∶1；经48～72小时沉淀，抽取上清，并按总量的0.5％加入氯仿、0.0035％加入硫柳汞，加塞密封，充分摇匀。每瓶血浆应作详细记录。

血清(血浆)精制

将要精制的血清(血浆)混合至同一灭菌容器中，按血清(血浆)总量的2倍量加入蒸馏水，充分搅拌均匀；用2mol/L盐酸调节pH至3.0，加入盐酸调节pH时，要缓慢加入，边加边搅拌边测量，防止局部pH过酸对免疫球蛋白的活性产生影响。放置60分钟，再用2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至3.2～3.4。然后按照每1ml 6～9单位的量加入胃蛋白酶，并按总量的0.2％加入甲苯，在29℃～31℃条件下消化2～24小时，消化期间要经常搅拌。

将消化完的溶液按照总量的15％加入硫酸铵，充分溶解后，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至4.5～4.7，60℃水浴60分钟。待溶液冷却至43℃以下时，用帆布过滤，收集滤液，去掉沉淀。对收集到的滤液进行计量，并放于同一个灭菌的容器中，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.1～7.3，按照总量的20％加入硫酸铵，充分搅拌均匀后，用灭菌的帆布过滤，收集沉淀物。然后对沉淀进行称量，放入到一个无菌容器中，并向沉淀物中加入5～6倍的蒸馏水，溶解沉淀物，待沉淀物充分溶解后，按照总量加入10％的明矾溶液，使明矾总含量达到1％。再用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.7～7.8，静置2～4小时使其沉淀，然后用无菌帆布过滤，收集滤液。

将收集到的滤液放置于同一个无菌容器中，按总量的38％加入硫酸铵，充分搅拌后用无菌帆布过滤，弃上清收集沉淀，将沉淀压干后用透析袋分袋包装，每袋约200～250g，加入少许氯仿，扎紧透析袋后放置于流水槽内透析48～72小时。然后收集袋内的血清，按总量的0.5％加入氯仿、0.85％加入氯化钠，0.0035％加入硫柳汞。充分溶解后在无菌条件下用0.22um膜过滤，放置于5℃～15℃静置沉淀。然后取少量血清进行抗体效价检测，并对其保护效力进行测定。

按照中华人民共和国农业部2000年出版的《中华人民共和国兽用生物制品规程》对生产的血清进行无菌检验。

高免免疫球蛋白对仔猪的保护效力测定

将10kg左右的仔猪20头分为4组，每组5头，第一组肌肉注射病毒效价为10⁸的猪繁殖与呼吸综合征病毒进行攻毒，同时注射经ELISA检测抗体效价≥2048的高免免疫球蛋白10ml，2天或3天后再注射一次，剂量仍为10ml，连续观察3周。试验结束后，将试验猪扑杀做病理解剖和病理组织学检查。在此期间，出现典型临床症状者以及病理解剖和病理组织学检查，出现猪繁殖与呼吸综合征典型病理变化者判为感染，不出现临床症状及病理学变化者判为保护。第二组为对照组，处理方法与第一组相同，只是用生理盐水代替高免免疫球蛋白。第三组肌肉注射10⁶毒价的猪2型圆环病毒，同时注射经ELISA检测抗体效价≥2048的高免免疫球蛋白10ml，2天或3天后再注射一次，剂量仍为10ml，连续观察3周。在试验期内，出现典型临床症状者或出现典型病理变化者判定为感染，不出现临床症状及病理学变化者判为保护。第四组为对照组，处理方法与第三组相同，用生理盐水代替高免免疫球蛋白。

仔猪保护效力测定结果

第一组在临床上全部保护，其中有一头猪出现耳朵发紫的现象，但对食欲及其他活动没有任何影响。第二组有5/4临床明显发病3头死亡，剖检具有典型的“蓝耳病”变化。一头在临床上没有看到症状，剖检后出现轻微的间质性肺炎的病理变化，判定为发病。第三组，临床上全部保护，剖检也没有见到病理变化。第四组2/5的猪出现腹股沟淋巴结肿大、精神、食欲不振，进行性消瘦。3/5在临床上看不到任何临床症状。剖检后有2头猪具有轻微的间质性肺炎病变，肺脏轻度肿胀，间质稍增宽，上面散在有少量的大小不等的褐色实变区，脾脏轻度肿胀的剖检变化。一头猪没有见到病理变化。判为4/5发病。

母猪的保护效力测定

将3头妊娠母猪作为试验组进行试验。在母猪的产前30天注射病毒效价为10⁸的猪繁殖与呼吸综合征病毒和10⁶病毒效价的猪2型圆环病毒混合液。同时注射经ELISA检测抗体效价≥2048的高免免疫球蛋白120ml，在产前10左右的时间再注射一次。然后进行实验观察，主要对于母猪是否发生流产、产弱仔、死胎、木乃伊胎进行统计，同时对于健康胎儿进行观察，在健康胎儿28日龄断奶后继续观察3周，看其是否发病。将2头妊娠母猪作为对照，攻毒同实验组，用生理盐水替代高棉免疫球蛋白。

母猪的保护效力测定结果

3头试验母猪没有出现流产、产弱仔和死胎的情况。共产仔猪29头(12、9、8)到断奶后3周时，在临床上没有出现发病的猪。对照组2头母猪中，有一头猪在产前8天左右的事件发生流产，另一头虽然没有发生流产，但在所产的8头仔猪中有3头弱仔，并在产后24小时内死亡，其余5头仔猪在哺乳期间吃奶、活动、发育正常，但在断奶后生长发育较正常猪缓慢。

产品分装

将半成品经适当稀释后，作为成品分装时，抗体效价应比规定标准高出20％，即使用时的抗体效价为≥2048时，分装成品的抗体效价为≥2640。使用剂量为1ml/kg体重。保存期为24个月。

本发明具有以下优点和积极效果：

①安全性好  在免疫球蛋白的加工工艺中使用胃蛋白酶对免疫球蛋白进行消化，将抗体的FC片断切掉，使免疫球蛋白的分子量缩小将近一倍，同时用硫酸胺沉淀法将血清中的白蛋白除去，这样就不会引起过敏反应。同时在加工工艺中用控制温度，调节pH来杀灭其他致病病毒。

②临床应用效果好  高免免疫球蛋白治疗这两种病毒性疾病具有特异性强，疗效确实，疗程短、见效快的特点。由于高免血清是用这两种病毒免疫动物而制备的，故对这两种病毒引起的疾病，尤其是可治疗母猪繁殖障碍和仔猪的断奶后多系统衰竭综合症这两种对养猪生产影响极为重大的疾病。

③保存和使用方便  本品为淡黄色透明液体，4℃保存二年内检测抗体效价仍在≥2048以上，非常稳定。在使用上也比较方便，一针即可预防和治疗两种疾病。

④免疫球蛋白半衰期短，在动物体内没有蓄积作用，故用其对这三种疾病进行预防、治疗后不会出现药物残留现象。

具体实施方式

实施例1：

1、选择免疫动物：本发明的免疫动物使用经过严格检疫的猪、马(骡、驴)作为免疫动物。

2、本发明的免疫原用取细胞培养物经浓缩后加完全拂氏佐剂制备而成，用Marc-145细胞培养猪繁殖与呼吸综合征病毒，病毒校价达到10^6～8。用PK-15细胞培养猪2型圆环病毒，病毒校价达到10^5～6，将这两种免疫原以1∶2的比例混合后按照体积比1∶1加入弗氏佐剂作为免疫原免疫动物；同时使用吉林鲸象动物药业有限公司研制成的苷肽注射液作为免疫增强剂，5毫升/支，以提高抗体效价。

3、免疫途径采用皮内、皮下或穴位、肌肉多点注射。基础免疫剂量为每头猪3ml，马(骡、驴)5ml。免疫方式猪为皮下或肌肉多点注射，马(骡、驴)用皮内、皮下或穴位多点注射。间隔28天进行第一次加强免疫，免疫剂量为猪8ml，马(骡、驴)12ml。以后每间隔14天进行加强免疫一次，经2～4次加强免疫后，检测抗体效价，抗体效价≥2048时视为合格，如抗体效价达不到此标准，继续加强免疫一次，然后对马(骡、驴)颈静脉采血或对免疫猪颈动脉或心脏直接放血。

4、采血和血清提取  无菌采血后将采集的血液在20℃在～25℃放置。血清提取：待其全部凝固并有血清析出时，加入灭菌的压砣，48～72小时后，以无菌方式提取血清。同时按血清总量的0.5％加入氯仿、0.0035％加入硫柳汞，加塞密封，充分摇匀，放置于2℃～15℃冷暗处，沉淀澄清。

5、血浆提取  将血液收集于盛有5％灭菌枸橼酸钠溶液的灭菌玻璃瓶中，血液和枸橼酸钠溶液的比例为9∶1；经48～72小时沉淀，抽取上清。

6、血清(血浆)精制将要精制的血清(血浆)混合至同一灭菌容器中，按总量的2倍量加入蒸馏水，用2mol/L盐酸调节pH至3.0，放置60分钟，再用2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至3.2～3.4。然后按照每1ml 6～9单位的量加入胃蛋白酶，在29℃～31℃条件下消化2～24小时。

将消化完的溶液按照总量的15％加入硫酸铵，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至4.5～4.7，60℃水浴60分钟。待溶液冷却至43℃以下时，过滤，收集滤液，去掉沉淀。计量并放于同一容器中，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.1～7.3，按照总量的20％加入硫酸铵，用灭菌的帆布过滤，收集沉淀物。称量后放入到容器中，加入5～6倍的蒸馏水，溶解沉淀物后，按照总量加入10％的明矾溶液，再用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.7～7.8，静置2～4小时使其沉淀，过滤并收集滤液。

将收集到的滤液放置于同一容器中，按总量的38％加入硫酸铵，搅拌后用无菌帆布过滤，弃上清收集沉淀，将沉淀压干后用透析袋分袋包装，每袋约200～250g，扎紧透析袋后放置于流水槽内透析48～72小时。收集袋内的血清，充分溶解后在无菌条件下用0.22um膜过滤，放置于5℃～15℃静置沉淀。

按照中华人民共和国农业部2000年出版的《中华人民共和国兽用生物制品规程》对生产的血清进行无菌检验。

7、产品分装将半成品经适当稀释后，作为成品分装时，抗体效价应比规定标准高出20％，即使用时的抗体效价为≥2048时，分装成品的抗体效价为≥2640。使用剂量为1ml/kg体重。保存期为24个月。

实施例2：

本发明的免疫原用取细胞培养物经浓缩后加完全拂氏佐剂制备而成，用Marc-145细胞培养猪繁殖与呼吸综合征病毒，病毒校价达到10^6～8。用PK-15细胞培养猪2型圆环病毒，病毒校价达到10^5～6，将这两种免疫原以2∶1的比例混合后按照体积比1∶1加入弗氏佐剂作为免疫原免疫动物；同时使用吉林鲸象动物药业有限公司研制成的苷肽注射液作为免疫增强剂，5毫升/支，以提高抗体效价。

其它步骤与实施例1相同。

Claims (2)

1、抗猪繁殖与呼吸综合征、猪2型圆环病毒二联高免免疫球蛋白，

免疫原采用取细胞培养物经浓缩后加完全弗氏佐剂制备而成，其中用Marc-145细胞培养猪繁殖与呼吸综合征病毒，其病毒校价达到10^6～8和用PK-15细胞培养猪2型圆环病毒，其病毒校价达到10^5～6；

免疫佐剂为弗氏完全佐剂；

免疫增强剂为吉林鲸象动物药业有限公司生产的苷肽注射液。

2、根据权利要求1所述的抗猪繁殖与呼吸综合征、猪2型圆环病毒二联高免免疫球蛋白，其特征是：

所述的免疫原的混合体积比为：Marc-145细胞培养猪繁殖与呼吸综合征病毒，与PK-15细胞培养猪2型圆环病毒之比为：(1～3)∶(1～3)；

所述的弗氏完全佐剂与免疫原的体积混合比例为1∶1；

所述的免疫增强剂苷肽注射液为5毫升/支。