CN1953803B

CN1953803B - 标准生物可降解微球体的制备方法

Info

Publication number: CN1953803B
Application number: CN2005800066084A
Authority: CN
Inventors: A·鲁瓦埃; D·巴齐勒; J·比贝
Original assignee: Ethypharm SAS
Current assignee: Ethypharm SAS
Priority date: 2004-03-03
Filing date: 2005-03-03
Publication date: 2013-02-06
Anticipated expiration: 2025-03-03
Also published as: CA2557755C; BRPI0507521B1; JP2007526287A; EP1720649A1; BRPI0507521B8; FR2867075A1; FR2867075B1; IL177593A0; EP1720649B1; US20080233201A1; WO2005087362A1; CA2557755A1; AU2005221361A1; KR20060129437A; AU2005221361B2; MXPA06009827A; CN1953803A; BRPI0507521A; IL177593A; KR101184401B1

Abstract

本发明涉及一种制备单分散生物可降解微球体的方法，包括：a)制备包含至少一种聚合物相以及至少一种水相的乳剂，分散的聚合物相和水相的粘度比例在0.12到10的范围内；b)使这样获得的乳剂经受受控层流剪切力；c)从聚合物相中除去溶剂；以及d)分离如此获得的微球体。还公开了制备的微球体的应用。

Description

标准生物可降解微球体的制备方法

发明领域

本发明涉及药物工业。更确切地说，本发明涉及单分散生物可降解微球体，特别是用于药物活性成分给药的单分散生物可降解微球体的制备。

发明背景

众所周知，为了易于药物活性成分的给药或者防止其在在活的有机体内的衰减，(我们)将药物活性成分密封到微球体中。

微囊化包括把固体或者液体物质包覆成为尺寸从0.1到1000μm变化的粒子的方式。

在本文中，在更长时期内递送活性成分的生物可降解微球体的应用是特别值得展望的。

用于制备生物可降解微球体的各种技术是已知的。

因此，美国专利US5,643,607公开了用于延长亲水性活性成分，特别是肽的给药的微囊体。微囊体由分散的水相包含活性成分以及连续相包含聚合物的乳剂的微囊包封制备而成。

然而，人们发现这些微球体中含有的活性成分的释放动力学是不均匀的。这种结果是由于微球体具有宽的粒径分布的事实。活性成分从微球体中的释放是基于扩散作用，因此对于经过更长时期的扩充、尺寸增加的微球体，释放速度通常会降低。

一种制备单分散微球体的方法包括使一种聚合物溶液通过一种处于振动的喷嘴，每次振动致使离开喷嘴的流体破裂以形成液滴(Berkland等人，J.Controlled Release 73(2001)，59-74)。这种方法是复杂和长时间的，并且具有低产率。另外，它看起来难于转换为工业规模。此外，它不能总是获得微囊中的活性成分的均匀分布，因为它是基于瞬间沉淀现象发生的。

因此，本发明的目的是提供一种制备可控制尺寸的单分散生物可降解微球体的方法，该微球体尤其用来输送水溶性和脂溶性活性成分。

从专利FR2747321可知一种通过在库爱特类型的装置中受控层流剪切用于制备单分散乳剂的方法。然而，这种方法仅仅针对于提供脂类乳剂和非复杂的系统，其中有机相包含一种聚合物和有机溶剂。

发明内容

本发明主要基于当分散相和连续相的粘度比率(在正乳剂情况下为η_org/η_aq或者在逆乳剂的情况下为η_aq/η_org)为0.1-10时，可以获得包含至少一种聚合有机相的乳剂的发现。

因此，本发明更准确地说涉及制备单分散生物可降解微球体的方法，该方法包括步骤：

a)制备包含至少一种聚合物相和至少一种水相的乳剂，分散相和连续相之间的粘度的比率必须在0.1-10之间；

b)使获得的乳剂经受受控层流剪切；

c)从聚合物相中除去溶剂；以及

d)分离这样得到的微球体。

在本发明中，术语“微球体”表示直径为0.1μm-1000μm，尤其为0.7μm-30μm的球形体。

依据本发明的微球体是由基于聚合物的基质组成。这样它们特别有助于热敏活性成分的给药，例如蛋白质或多肽。当脂类相通过加热转变为液体时，聚合物微球体的形成基于聚合物在有机溶剂中的分散。当除去溶剂后，微球体的聚合物成分形成其中活性成分可以被微胶囊化的均一的基质。聚合物微球体可以这样制备而不用升高温度。

依赖于活性成分的溶解性，后者可以在聚合物相中直接胶囊化，也就是在包含于微球体聚合物基质里的水相微液滴的里面。通常，当活性成分为脂溶性的时候，其可以在聚合物基质中胶囊化。相反的，当活性成分为水溶性时，其可以在内部水相中胶囊化。一些活性成分在水中或者非极性溶剂中均有具有低的溶解性。如果是那样的话，活性成分可以在聚合物溶液中以固体状态分散。

当使用已知的盖仑制剂时，既不是脂溶性的也不是水溶性的活性成分的给药特别棘手。本发明的微球体因此看起来对这些活性成分的给药特别有价值。

在该申请中，“生物可降解”意味着一种材料，其能在生物介质中降解并且它的降解产物能被肾过滤除去或者产生代谢变化。生物可降解聚合物被定义为在活的有机体内以酶或非酶的方式可降解产生无毒的降解产物的合成或天然聚合物。

这种降解通常会经历几星期到几个月的时间(例如：PGA-TMC在7个月内被吸收，而L-PLA具有大约2年的降解时间)。

聚合物的降解时间依赖于它的类型，因此依赖于单体单元的化学性质，但是同样也依赖于它的聚合程度和它的结晶度。另外，除了这些因素外，它会特别依赖于易于接触到酶或其它降解物质的材料的表面积。从而，这些材料分割的越细小，它的降解就会越迅速。

微球体这样被降解，有机体中累积的聚合物的数量不超过相当于每次给药聚合物的剂量的20倍的数量。优选地，有机体中累积的聚合物的数量不超过相当于每次给药聚合物的剂量的10倍的数量。

本发明微球体的两个连续给药的间隔通常是至少一天，优选从1天到30天，并且更优选从5天到14天。

因此，防止了微球体在体内的累积。

根据本发明的微球体包含一种聚合物基质，其中分散了一种或者更多的活性成分或者本身包含一种或多种活性成分的水溶液液滴。

活性成分可以为相互独立的，水溶性的或者水溶性差的，脂溶性的或者脂溶性差的或者既脂溶性差又水溶性差的。

在分散相包含内在亲水相的组合物的情况下，举例来说，独自负载亲水性活性成分或者与水溶性差的活性成分结合是可能的。

活性成分可以特别是制药学的、兽医的、植物保护的、美容的或者农作物营养的活性成分。更进一步的，它可以为去污剂、营养素、抗原或者疫苗。优选它为一种药用活性成分。

优选的，药用活性成分选自抗生素、降血脂制剂、抗高血压药物、抗病毒制剂、β-受体阻滞药、支气管扩张剂、细胞抑制剂、精神调节制剂、激素、血管扩张剂、抗过敏剂、止痛剂、退热剂、止痉挛的药、消炎药、抗血管形成药、抗菌药、抗溃疡剂、杀真菌剂、抗寄生虫剂、抗糖尿病剂、抗癫痫药、抗帕金森症剂、抗偏头痛剂、抗阿而茨海默氏痴呆剂、抗粉刺剂、抗青光眼制剂、抗哮喘剂、神经安定药、抗抑郁剂、抗焦虑剂、催眠药、调节胸腺药(normothymics)、镇定剂、精神兴奋剂、抗骨质疏松制剂、抗关节炎药、抗凝血剂、治牛皮癣制剂、高血糖剂、开胃药、食欲减退剂、抗衰弱药、抗便秘制剂、抗腹泻剂、抗外伤药、利尿剂、肌松剂、遗尿症药物、勃起障碍药物、维生素、肽、蛋白质、抗癌制剂、核酸、核糖核酸、寡核苷酸、核酶、脱氧核糖核酸。

另外，活性成分和调节通过口服吸收的制剂或者诸如p-糖蛋白抑止剂或者蛋白酶抑止剂的酶抑止剂相结合可以提高优势。

术语“单分散”用来表示微球体的总体，它们中每个微球体的直径非常接近于总体的平均直径。当多分散性少于或者等于40％时，优选从5％到30％，例如15％-25％的量级时，总体被称为“单分散”。多分散性则被定义为与直径分布中间值的标准偏移率，用液滴或者小球的体积表示。

本发明的单分散微球体通过使包含作为分散相的、含有一种或多种活性成分的聚合物相液滴(其可以或不可以包含内在水液滴)的乳剂经受受控剪切获得。此外，可参数化的和可控制的剪切能够控制微球体尺寸，从而控制活性成分的释放和其从有机体中的除去。

优选的，这一步骤在库爱特型设备下实现。这样获得尺寸分布狭窄和均匀的微球体。

根据本发明的用于制备微球体的方法具有方法简单以及采用仅仅少量溶剂的优点。它能容易的转为工业规模。

另外，这种方法具有微球体中活性成分微囊化的高产率。所谓的微囊化产率指微囊化活性成分和所用活性成分之间的比率。这可以通过在方法中采用最适宜活性成分在有机相中溶散的水相和有机相之间的分配系数以及乳剂中含有高浓度有机相而被最优化。为了更准确，该方法包括在第一步骤中制备包含至少一种有机相和至少一种水相的乳剂。

假如存在一种有机相和一种水相，可以制备一种正向单一的乳剂。

术语“正向乳剂”是指有机相被分散在水相中的乳剂。相反的，在“反向”乳剂中，水相分散在有机相中。

在微囊化脂溶性活性成分(在有机相中溶解)时正向乳剂尤其有用。

然而也可以由复乳剂制备微球体。这些乳剂包括两种水相：一种所谓“内”水相，它分散在其本身分散在所谓“外”水相中的有机相中。所以内水相能够溶散亲水活性成分和特别脆弱的活性成分，例如像蛋白质或多肽。

这样，依赖于它是否被期望于微囊化亲脂性或者亲水性活性成分，可以使用正向单一乳剂或者复乳剂W/Org/W。复乳剂同样是获得微囊化了几种活性成分的微球体的一种方法，例如，亲水性活性成分(在内水相分散)和疏水性活性成分(在含有聚合物的有机溶液中溶解)的结合。

乳剂的有机相包含至少一种溶解在有机溶剂中的生物可降解聚合物。

乳剂有机相有利地含有5％-30％的至少一种生物可降解聚合物，优选以有机相总质量计为10％-20％。

聚合物选自对于人类和动物无毒的生物可降解聚合物。同样有利的是它对于活性成分为惰性的并且不溶于水。

采用的生物可降解聚合物优选为批准用于所考虑的给药途径(例如，胃肠外)的聚合物。优选的，降解产物可以被有机体容易地除去的聚合物将会用作生物可降解聚合物。

在这些聚合物中，尤其要提及的是衍自乳酸的衍生物，特别是衍生自α-羟酸的家族，例如PLGA(聚乳酸羟基乙酸)。这些聚合物获准用于人体胃肠外使用。它们同样具有在有机体中释放活性成分方面适用的降解动力学。聚合物的结晶度将对其亲水性能以及在有机体内的降解速度有直接的影响。

这些聚合物在有机体内通过非特异的化学水解机制或者酶降解而降解。从中得到的单体产生代谢变化并且产生主要以二氧化碳和水的形式通过呼吸途径被除去的降解产物。

这样，为了实现本发明可以使用选自聚(α-羟酸)、聚(α-羟酸)、聚(ε-己内酯)-PCL、聚二噁酮-PDO的脂肪族聚酯、聚原酸酯、聚酐、聚氰基丙烯酸酯、聚氨酯、多肽或者聚(氨基酸)、改性多糖、纤维素、聚碳酸酯、聚二甲基硅氧烷和聚乙酸乙烯酯的聚合物和它们的衍生物以及共聚物。

聚(α-羟酸)种类的聚合物为聚酯，它的重复单元衍生自α-羟酸，例如聚乙交酯(PGA)、聚丙交酯(PLA)、聚(丙交酯共聚乙交酯)(PLAGA或者PLGA)、乙交酯共聚亚丙基碳酸酯共聚物，或者聚葡糖酸酯、(PGA-TMC)。它们在商业上是可获得的(例如，商品名Resomer

和Medisorb

)。

其他聚合物出可以被考虑，例如由乙交酯和亚丙基碳酸酯和P-二噁酮聚合得到的三聚物，或者嵌段共聚物，例如聚乙二醇-聚(α-羟酸)(PLA-PEG、PLGA-PET)或者甲氧基聚乙二醇-聚(α-羟酸)。

与关于α-羟酸一样，聚合物的结晶程度会对其亲水性以及在有机体中的降解速度具有直接影响。

ε-己内酯是一种羟基-6-己酸的酯。聚(ε-己内酯)和其与乳酸获得的共聚物为用于控制释放药剂形式组合物的半-结晶聚合物。这些聚合物以与PLAs和PLGAs(非酶化降解)相似的方式在有机体中降解。这种聚合物以名称Lactel

销售。

聚二噁酮-PDO是由p-二噁酮开环得到的聚醚酯。

一些活性成分是不稳定的，尤其那些迅速水解的。因此使用保留水的聚合物显示是不恰当的。如果是那样的话，更疏水的和通过表面侵蚀降解的聚合物，例如聚原酸酯和聚酐是优选的。

聚原酸酯是由2，2-二乙氧基四氢呋喃和二醇的缩合得到的化合物。作为降解产物，这些聚合物具有催化降解过程的酸化合物。因此降解加快了时间进程。举例来说，它们以名字Chronomer

和Alzamer

销售。

聚酐是衍生自癸二酸p(SA)和二-p(羧基苯氧基)丙烷p(CPP)的化合物。癸二酸也可以和脂肪酸二聚物(油酸p(FAD-SA)结合。它们的降解时间可以在几天到几年中变化，这依赖于所用单体的疏水程度。它们由于表面侵蚀降解并且具有优良的生物相容性。

优选的聚氰基丙烯酸酯为具有长烷基链的聚氰基丙烯酸酯，其降解缓慢并引起组织的小的炎症反应。这些聚合物以名字Desmolac

(BAYER)可商购获得。

多肽或者聚氨基酸中有机体中自然存在的分子缩合产生的聚酰胺。为了获得在时间进程中逐渐水解的材料，从单纯的氨基酸(亲水的)以及氨基酸的疏水衍生物得到的聚合物，例如甲基或者苯甲基天冬氨酸酯是优选的。

降解的假想机制为首先酯官能团(二硫桥)水解，提供水溶性大分子，然后是朝着肝和肾的扩散过程，在肝和肾中肽键在酶进攻下打开。作为这种类型聚合物的例子可以提及Ultramid A4 Naturel(BASF)。

在纤维素衍生物中可以特别提及的是甲基纤维素或乙基纤维素，例如它们以名字Blanose

、Ethocel(Dow Cemica)，Pharmacoat

603或者606(ShinEtsuChemical)，以及Aqualon EC(Aqualon公司)销售。

可以提及聚亚丙基碳酸酯(Poly(TMC))和聚丙烯碳酸酯，可以名称Araconate 5000商购获得，作为聚碳酸酯。

在聚乙酸乙烯酯中，乙烯和乙酸乙烯酯的共聚物(EVA)，例如名称为Coathylene(plast-Labor SA)，是尤其优选的。

有机相中存在的聚合物优选具有50-500千道尔顿，尤其是100-200千道尔顿的平均分子质量。

在一种完全优选情况下，微球体由PLGAs家族制备。这些聚合物家族中，发现以名称“High IV”出售，具有110-160千道尔顿的分子量的PLGA 75/25(乳酸/羟基乙酸)或者85/15尤其合适。

依赖于乳酸单元的比例，这些聚合物具有不同的疏水性能。因此，乳酸浓度增大越多，PLGA将会越疏水。

在另外一方面，乳酸比例越高，聚合物降解动力学越长。聚合物的这种特性影响胶囊化的活性成分的释放动力学。这种从一种PLGA到另外一种不同的特性使得可以使用这些共聚物的一种或另一种或者甚至其混合物，这依赖于期望的释放特性。

进一步，PLGA共聚物溶于几种有机溶剂，例如氯仿、二氯甲烷或者乙酸乙烯酯，然而它们几乎不溶于水。

最后，这种类型的聚合物通过水解降解并且反应产物被代谢形成CO₂和H₂O，其可以在呼吸过程中除去。

制备微球体使用的有机溶剂优选获准用于人体胃肠外使用。同时还进行选择以使这些聚合物具有良好的溶散性，尤其在环境温度下。

另外，为了进行以后通过在大体积水中扩散萃取溶剂而除去溶剂的方法，有机溶剂优选在水中展现一些溶解性。通过蒸发除去溶剂同样是可能的。这种溶剂包括，例如乙酸乙烯酯和二氯甲烷。

乙酸乙烯酯是一种挥发性无色溶剂，其在水中适度溶解(8.7克/100g水，20摄氏度)并且当温度升高时它的水溶性减小。它同样被有机体良好地耐受，并且对环境不产生任何特殊的问题。

有利地，为了限制水从水相向有机相逸出，乳剂有机相用水饱和，并且相反，水相用有机溶剂饱和，反之亦然。

有机相可以同样有利的包含亲脂性的或者弱脂溶性以及弱水溶性的活性成分。

正乳剂的水相以及所谓复乳剂的“外”水相优选除水之外还含有其他制剂。优选的，这些制剂是获准于胃肠外使用的。这样，为了提高乳剂稳定性，优选可以加入稳定剂，通常为表面活性剂。

可有利地使用非离子表面活性剂例如PVA(聚乙二醇)，或者非离子表面活性剂例如聚山梨醇单油酸酯(Tween 80或者Montanox 80)。优选使用的PVA具有30-200千道尔顿的分子量。

举例来说，这些非离子表面活性剂被水解到88％。由于它提高了所谓“外”水相的粘性，因此也是特别有利的。

在复乳剂的情况下，为了平衡与内水相的渗透压，外水相有利地还包含至少一种渗透压制剂。这样防止活性成份向外介质逸出。

举例来说，通常使用的渗透压制剂为葡萄糖或者任意其他的糖，例如甘露糖以及海藻糖，但是盐类，例如氯化钠，同样也是适用的。

渗透压制剂原则上以足以达到存在于内水相中的离子浓度的量存在于外水相中。通常，渗透压制剂的浓度相对于水相重量为0.1-20重量％。这种盐在内水相使用的优选浓度为0.6％(m/m)，该浓度为最适合可注射制剂的浓度。优选的，葡萄糖以11.5％(m/m)的浓度用于外水相，该浓度为必需等于存在于内水相中离子浓度的含量。

最后，乳剂水相有利的含有至少一种粘度剂，该粘度剂使得水相的粘度可调节，从而对于下述第二步骤的实施是可接受的。这些制剂通过限制悬浮液中的液滴的合并也有助于稳定复乳剂。

相对于乳剂总重量，水相通常含有10-80％，优选30-70％，更优选40-60％的粘度剂。

通常，粘度剂可以选自亲水性聚合物，例如乙二醇醚类和酯类、泊洛沙姆，例如Lutrol

、聚(氨基糖)，例如壳素和壳聚糖、多糖，例如右旋糖苷、以及纤维素衍生物，例如Carbopols

。

优选的，粘度剂为一种泊洛沙姆：聚乙烯聚丙烯的嵌段共聚物。疏水中心核由聚丙烯构成并且被聚乙烯的亲水性序列包围。优选使用泊洛沙姆188(Lutrol

F68，BASF)，其浓度为50-60％时在水中形成凝胶。

使用制剂的含量依赖于要达到的粘度。然而为了防止凝胶的形成，优选泊洛沙姆的浓度小于50质量％。

稳定剂和粘度剂的组合具有特别重要的作用，因为已经证明层流剪切步骤的实现很大程度依赖于分散相和连续相之间的粘度比率。这些制剂的组合使得易于获得相之间最适宜的粘度比率以及相对于液滴的合并获得乳剂的稳定性。

乳剂的水相可以包含任何药物制剂中常用的其他制剂或者添加剂，例如防腐剂和缓冲剂。

尤其是，内水相还可以包含至少一种其他活性成分，特别是一种水溶性活性成分。

因此，亲水活性成分和亲脂活性成份可以通过在内水相中溶解前者而在聚合物有机相中溶解后者相结合。

最后，为了防止溶剂从有机相到水相的扩散，乳剂的水相优选用有机溶剂饱和。

如上所述，微球体可以从复乳剂开始制备，该乳剂中第二水相(称为“内相”)被分散在聚合有机相中。

复乳剂的内水相可包含在关于外水相中已上述提及的制剂。

而且复乳剂的内水相还可以同样含有至少一种蛋白质作为表面活性剂，和/或粘度剂和/或作为活性成分。

从而，为了提高乳剂的粘度和/或稳定性，它可以含有高分子量蛋白质，例如HSA(人血清白蛋白)。因为发现这种大分子的两性特征可以有助于稳定乳剂。优选的，内水相包含HSA或者至少一种蛋白质，其浓度相对于内水相重量为0.01％-10重量％，优选0.1-2重量％。

当内水相包含蛋白质时，为了形成适用于目的蛋白质的介质，特别是关于pH值，通常优选加入其它添加剂。pH值接近蛋白质pI的缓冲剂的存在有利于使蛋白质的自然构造得以保持。

复乳剂的内水相从而也可以包含形成稳定溶液pH值的缓冲液所需的化合物。适用于不同蛋白质的pH值和相应的缓冲液是本领域技术人员已知的，因此这里不再详细说明。

内水相还可以含有稳定剂，例如SANCHEZ，A等人(生物可降解微米-和纳米粒子作为α-干扰素的长期运输工具.Eur.J.Pharm.Sci.)，(2003)18，221-229)所述的泊洛沙姆188。

内水相有利的还包含一种辅助表面活性剂。与蛋白质结合的后者浓缩在内水相和有机相的分界面，并且有助于减少这两种介质之间的表面张力。

使用的辅助表面活性剂优选BASF的Solutol HS 15。这种产品是12-羟基硬脂酸的单和双聚乙二醇660酯的混和物。它溶于水、乙醇和2-丙醇。

内水相包含相对于内水相的重量浓度为0.01-10wt％，优选为0.05-1wt％，更优选为0.1-0.2wt％的表面活性剂。

微球体的内水相也可以有利的含有活性成分。

已发现这对于诸如蛋白质或者多肽等脆弱的亲水性活性成分的给药是尤其合适的，因为常常发现当存在化学环境变化时，例如在有机溶剂中分散或者假如温度或pH值变化，这些化合物的生物活性会劣化。

在微球体的制备中，因为活性成分将会在最合适的pH值下溶解于复乳剂的内水相中，所以其在活性上不会经受任何的劣化。物理化学环境中的变化和因此而起的分子结构的改变就这样减少了，这使得活性成分的活性得以保持。

用于制备微球体的方法包含第二步骤，包括使获得的乳剂经受层流剪切。层流剪切优选在库爱特装置中实施。基于现有相之间最适宜的粘度比而获得的乳剂的粘弹性，转子的旋转速率和乳剂注入空隙的速率将决定所得微球体的尺寸和尺寸的均匀度。

用于制备微球体的方法包含第三步骤，其由从分散的聚合物溶液中萃取有机溶剂组成。

这一步骤可以通过本领域技术人员已知的任何一种方法实施，例如在加热或者真空条件下蒸发。

根据一个优选的实施方案，通过在水中萃取有机溶剂实施。更优选地，加入大量的用于有机溶剂扩散的水以制备单分散乳剂。这个实施方案尤其具有防止胶囊化的活性成分在温度或者压力下变化的优势。

当溶剂通过扩散到水中而在有机相消失的时候，聚合物产生沉淀并根据初始乳剂的种类形成具有保留水溶液液滴的聚合物基质的微球体(复乳剂)或者形成固态微球体(单乳剂)。

为了保持乳剂和悬浮液的均一性，沉淀优选伴随轻柔的搅拌发生。

最后，在最后的步骤中，微球体可以通过常规方法，例如通过过滤溶液收集。

假如需要，微球体可以在低温防护剂的存在下被冻干。低温防护制剂中可以特别提到的是多元醇和电解质。特别的，诸如甘油、甘露糖、葡萄糖、果糖、木糖、海藻糖、甘露醇、山梨糖醇、二甲苯酸和其他多元醇以及聚乙二醇是合适的。可以提及的电解质是氯化钠。

从而，制备的微球体可以作为一种或者多种活性成分，特别是对于亲水性和亲脂性活性成分的载体，使得它们随时间均匀的和按预定地释放。

在以下记载和显示的实施方案和附图中对本发明进行更详细的描述：

图1：库爱特装置的简图；

图2：根据实施方案2制备的微球体的光学显微镜照片：(a)在萃取前(物镜x100)；(b)经过干燥和再次分散后(物镜x40)；(c)再次分散后它们的粒径分布；

图3：根据实施方案3制备的聚合物微球体的光学显微镜照片：(a)在萃取前(物镜x40)；(b)萃取后(物镜x40)；(c)再次分散后它们的粒径分布；

图4：根据实施方案5制备的反相乳剂的光学显微镜照片：(a)在剪切前(物镜x10)；(b)使用库爱特装置在600rpm剪切后(物镜x10)；

图5：获得的微球体的粒径分布：(a)为根据实施方案7通过标准随机剪切(叶片式搅拌器)；(b)为根据实施方案6通过层流剪切(库爱特装置)。

实施方案

实施方案1

从单乳剂制备微球体的常规工艺：

这种方法可以用于制备生物可降解聚合物微球体，该微球体对于亲脂性活性成分的输送尤其有用。

待胶囊化的活性成份在由溶于乙酸乙烯酯中的PLGA组成的有机相中分散或者溶解。

然后，该有机相在含有水和亲水性表面活性剂和粘度剂的水相中乳化，亲水性表面活性剂例如PVA，含量为0.1-10％，优选1-4％，粘度剂例如聚乙二醇或者泊洛沙姆，含量为10-50％。

为了最优化剪切效率，可调节两相的粘度比率。优选有机相和水相的粘度比率为0.1-10，更精确为3-8。

然后使如此获得的所谓的“粗糙”乳剂经受层流剪切。这一步骤优选在库爱特装置中实施，如图1所示。可控的剪切使得分散相的液滴呈现单分散性；然而，还同样可使得它们的尺寸受控制。

优选地，可控剪切通过使乳剂与移动固体表面接触实施，表征乳剂流动的速率梯度在与移动固体表面垂直方向上是一个常数。举例来说，在由两个相对于彼此旋转的同心圆柱体组成的单元，例如库爱特单元中，这样的剪切会受影响。

库爱特装置(1)如图1所示。它包含转子(2)，定子(3)以及活塞(4)。乳剂通过注射器(5)被引入到转子和定子之间限定的空间，其称为空隙。在转子和定子之间剪切了的乳剂然后回收通入密封烧瓶的容器(6)中。剪切速率，空隙的宽度和注射速率是可调节参数，其可以根据微球体所需尺寸变化。

这种方法的详细描述，特别参见申请WO97/38787，FR2767064以及WO0185319。

一旦乳剂呈现这样的单分散，为了沉淀微球体，可以对溶剂进行萃取。通过依照乙酸乙烯酯在水中的溶解度和获得乳剂的总量计算而加入一定量的水来实现萃取。优选使用溶解乙酸乙烯酯所需最小量的至少两倍的水。

由于乙酸乙烯酯在低温下更溶于水，为了除去残余溶剂，实施第二步骤的冷萃取。这样，在30分钟的搅拌后，加入冷却到5℃的第二体积的软化水，然后整体在搅拌下再维持30分钟。这样实施的溶剂萃取几乎是完全的。

在30分钟结束时，微球体在孔隙率为0.45μm的尼龙滤网上通过压力过滤从萃取介质中分离。回收的饼用1升软化水漂洗3次。然后使微球体在环境温度下被放置干燥一夜或者在加入低温防护剂后冷冻并冻干。

一旦变干，通过搅拌和通过超声波浴使微球体重新分散在1％的表面活性剂Montanox

20或者80(BASF)(Montanox

80：聚山梨醇酯单油酸酯和Montanox

20：聚山梨醇酯单月桂酸酯)的溶液中。再次分散的微球体通过在显微镜下观察表征，它们的尺寸分布可以通过激光粒度测定仪测定。

实施方案2

从单乳剂制备2.5μm的微球体：

在烧瓶中，连续水相通过在70℃在磁力搅拌下在处于乙酸乙烯酯饱和的14.14g的软化水(3％)中溶解0.9g的PVA制备。经过冷却，在其中加入15g的PEG 400。因此该水相包含3％的PVA，50％的PEG 400并且处于乙酸乙烯酯饱和状态。

在磁力搅拌下通过在17.39g的水饱和乙酸乙烯酯溶液(3％)中溶解2.6g的PLGA 75/25而在密封瓶中制备有机相。该有机相因此含有溶解在水饱和乙酸乙烯酯中的13％的PLGA。

然后所有这些有机相在20g上述水相中使用刮勺通过手动搅拌乳化。乳剂包含50％质量的分散有机相。

这样得到的预混合料置于库爱特装置中，并且在100μm的空隙中以活塞上行速率为0.7，在400rpm的转速下对其进行剪切，活塞的速率相当于大约7ml/min的流动速率。转子的直径为2cm。图2(a)表示如此制备的乳剂的均匀的尺寸分布。

一旦乳剂呈现这样的单分散，就进行溶剂萃取然后过滤微球体并干燥，如实施方案1所述。图2(b)表示如实施方案1所述再分散后获得的微球体的规则外观。

微球体的尺寸分布通过激光粒度测定仪测定(参见图2(c)；其集中于2.5μm。

实施方案3

从单乳剂制备6.5μm的微球体：

在烧瓶中，连续水相通过在70℃、磁力搅拌下在处于乙酸乙烯酯饱和的35.25g的软化水(3％)中溶解1.2g的PVA制备。经过冷却，在其中加入4.02g的PEG 2000。因此该水相包含3％的PVA，10％的PEG 2000并且处于乙酸乙烯酯饱和状态。

在磁力搅拌下通过在17.89g的水饱和的乙酸乙烯酯溶液(3％)中溶解2.67g的PLGA 75/25而在密封烧瓶中制备有机相。该有机相因此含有溶解在水饱和乙酸乙烯酯中的13％的PLGA。

这样得到的预混合料置于库爱特装置中，并且在100μm的空隙中以活塞上行速率为0.7，在300rpm的转速下对其进行剪切，活塞的速率相当于大约7ml/min的流动速率。转子的直径为2cm。图3(a)表示如此制备的乳剂的均匀的尺寸分布。

一旦乳剂呈现这样的单分散，就进行溶剂萃取然后过滤微球体并干燥，如实施方案1所述。图3(b)表示如实施方案1所述的溶剂萃取后获得的微球体的规则外观。

微球体的尺寸分布通过激光粒度测定仪测定(参见图3(c))；其集中于6.5μm。

实施方案4

由复乳剂制备微球体的常规工艺：

这种方法用于聚合物微球体的制备，该微球体对于输送亲水性活性成分或者亲水性活性成分和亲脂性活性成分的结合体是尤其有用的.

首先通过在含有聚合物(例如PLGA 75/25)溶液的有机相中分散所谓的“内”水相来制备一种反相乳剂(W/O)。

为了最优化剪切效率，调节反相乳剂两相之间的粘度比率。优选的内水相和有机相之间的粘度比率为0.1-10，更准确为0.1-0.3。

内水相含有蛋白质，特别是HSA，含量为0.01-10％，优选0.1-2％；辅助表面活性剂，特别是Solutol

HS15，含量为0.01-10％，优选0.05-1％以及盐，特别是氯化钠，含量为0.1-20％，优选0.6％。

在磁力搅拌下通过在水饱和乙酸乙烯酯溶液(3％)中溶解5-30％的，优选20％的PLGA 75/25在密封瓶中制备有机相。

通常，待胶囊化的亲水性活性成分包含在内水相中，而亲脂性活性成分包含在有机相中。

为了获得可控尺寸和分布的分散相，“粗糙”的反相乳剂经受如实施方案1所述的剪切。可控的剪切步骤可以使用库爱特装置或者在Ultra-Turrax类型的湍流装置中实施。

在瓶中，把0.01-10％、优选1-4％的PVA水溶液在磁力搅拌下加热到70℃。冷却后，把0.1-40％、优选1-10％的Lutrol

F68和与内水相中同样浓度的0.6％的氯化钠加入溶液(外水相)。

随后，该所谓“外”水相处于有机溶剂饱和状态，有机溶剂优选乙酸乙烯酯，对于这种特殊的有机溶剂，乙酸乙烯酯呈现了相对于水相重量大约3wt％的浓度。

反相乳剂然后与上述外水相混合。这一步骤可以使用刮勺手动实施。

在复乳剂的情况下，为了最优化剪切效率，可以调节两相的粘度比率。优选的，有机相和外水相的粘度比率为0.1-10，更准确为3-8。

由于分散相是由大的和尺寸可变的液滴组成，因此如此获得的乳剂依然被称为“预混合料”或者“粗糙”乳剂。

为了获得可控尺寸和分布的分散相，“粗糙”乳剂经受如实施方案1所述的剪切。可控的剪切步骤可以使用库爱特装置实施。

一旦乳剂呈现这样的单分散，为了沉淀微球体，对溶剂进行萃取。通过依照乙酸乙烯酯在水中的溶解度和获得乳剂的总量计算而加入一定量的水来实施萃取。优选使用溶解乙酸乙烯酯的所需最小量的至少两倍的水。

由于乙酸乙烯酯在低温下更溶于水，为了除去残余溶剂，实施第二步骤的冷萃取。这样，在30分钟的搅拌后，添加冷却到5℃的第二体积的软化水，然后整体在搅拌下再维持30分钟。这样实施的溶剂萃取几乎是完全的。

包含活性成分的单分散微球体如实施方案1所述进行过滤和冻干。

一旦变干，通过搅拌和经过超声波浴使微球体重新分散在1％的表面活性剂Montanox

20或者80(BASF)(Montanox

80：聚山梨醇酯单油酸酯和Montanox

20：聚山梨醇酯单月桂酸酯)的溶液中。再次分散的微球体用显微镜观察表征，它们的尺寸分布可以通过激光粒度测定仪测定。

实施方案5

制备1μm的反相乳剂：

在瓶中，内水相在磁力搅拌下制备。它由0.04g HSA，0.0036g Solutol

HS15和0.022g的溶解在4g的pH＝5处于乙酸乙烯酯饱和状态(3％)的柠檬酸盐缓冲剂中的NaCl组成。这种内水相因此包含1％HSA，0.1％SolutolHS15并处于乙酸乙烯酯饱和状态。

在磁力搅拌下通过在处于水饱和状态的12.82g的乙酸乙烯酯(3％)中溶解3.2g的PLGA 75/25而在密封瓶中制备有机相。该有机相因此含有20％的溶解在水饱和态乙酸乙烯酯中的PLGA。

为了获得粗糙的反相溶液，使用刮勺将内水相手动分散在乙酸乙烯酯中。

乳剂含有相对于其总重量的20wt％的内水相。在进行剪切之前，通过相分离和聚结的缺少来验证所得粗糙乳剂的稳定性。

这样得到的预混合料置于库爱特装置中，然后在100μm的空隙中以活塞上行速率为0.7在400rpm的速率下进行剪切，活塞的速率相当于大约7ml/min的流动速率。转子的直径为2cm。使用库爱特装置进行剪切后反相乳剂是稳定的。

预混合料和在库爱特装置中经过剪切后的乳剂在显微镜下的显示图象如图4(a)和(b)所示。

校准的复乳剂如下述制备。

实施方案6

由复乳剂制备28μm单分散微球体：

首先，如实施方案5所述方法用下述物质制备反相乳剂：

-20％的PLGA乙酸乙烯酯；

-在内水相中的1％的HAS；

-0.1％的Solutol

HS15；

-在内水相中的0.6％的NaCl。

然后将获得的粗糙的反相乳剂用Ultra-Turrax(功率24000)剪切3分钟，或者在400rpm下的库爱特装置中。

20g获得的反相乳剂与等含量的外水相使用刮勺混合，外水相由3g Lutrol

F68，0.9g PVA，以及0.18％NaCl组成。外水相因此含有10％Lutrol

F68，3％PVA，以及0.6％NaCl并且处于乙酸乙烯酯饱和状态。这种复乳剂含有相对于其总重量50wt％的反相乳剂。

这样得到的预混合料置于库爱特装置中，然后在100μm的空隙中以活塞上行速率为0.7在100rpm的速率下进行剪切，活塞的速率相当于大约7ml/min的流动速率。转子的直径为2cm。

将装置出口处收集的复乳剂在250ml的盐水中(0.6％NaCl)在环境温度下搅拌稀释。

10分钟后，在5℃再一次加入250ml的盐水并持续搅拌10分钟。观察到了双球体转变为固态微球体。然后通过在压力下在孔隙率为0.45μm的尼龙滤网上过滤，把微球体从萃取介质中分离。回收的饼用1升的软化水漂洗3次。

为了低压冻干法，将过滤后的微球体分散在海藻糖溶液中。加入的海藻糖的百分数相当于要被冻干的微球体的5％。试样首先在液氮中冷冻，然后在-24℃的冷冻机里贮存。冻干法在固定的0.12mbar的真空度下依照下述坡度实施：

‰首先通过在4个小时内从-44℃升到-10℃，然后在-10℃等温干燥15小时30分钟进行干燥。

‰其次通过在30分钟内从-10℃升到+10℃，然后在30分钟内恢复到环境温度进行干燥。

一旦变干，经过搅拌和通过超声波浴把微球体重新分散在1％的表面活性剂Montanox

20或者80(BASF)(Montanox

80：聚山梨醇酯单油酸酯和Montanox

20：聚山梨醇酯单月桂酸酯)的溶液中。再次分散的微球体通过在显微镜下表征，它们的尺寸分布可以通过激光颗粒测定仪测定。微球体的尺寸分布集中在28μm(图5b)。

实施方案7

通过湍性剪切制备微球体：

采用湍流作用下的剪切(Ultra-Turrax然后叶片式搅拌器)代替库爱特装置产生的层流剪切，依据实施方案6的方法制备一批微球体。

这些微球体的尺寸分布通过激光颗粒测量仪测定(图5a)，并且与依据实施方案6制备的微球体确定的尺寸分布(图5b)相比较。

可以明显发现诸如库爱特装置产生的层流剪切能获得窄的尺寸分布，因此能获得更显著的单分散性。结果是可以更好地控制包含在微球体中的活性成分的释放动力学。

Claims

1.制备单分散生物可降解微球体的方法，包括步骤：

a）制备包含至少一种含有活性成分的聚合物相以及至少一种水相的

乳剂，所述有机相和水相的粘度具有0.1-10 的比；

b）使获得的乳剂经受受控层流剪切，其中通过层流剪切校准的步骤

在库爱特设备（1）中实施，所述库爱特装置包含转子（2），定子（3）以及活

塞（4），乳剂通过注射器（5）被引入到转子和定子之间限定的空间，其称为空

隙，在转子和定子之间剪切了的乳剂然后回收通入密封烧瓶的容器（6）中；

c）从聚合物相中除去溶剂；以及

d）分离如此获得的微球体；

其中微球体主要由生物可降解聚合物组成，所述生物可降解聚合物选自聚乳

酸，以及聚乳酸和聚羟基乙酸的共聚物。

2.根据权利要求1 方法，其中聚合物具有50-500 千道尔顿的分子量。

3.根据权利要求1 或2 任何一项的方法，其中乳剂有机相的有机溶剂

为乙酸乙烯酯。

4.根据权利要求1 或2 的方法，其中活性成分是脂溶性的。

5.根据权利要求1 或2 的方法，其中活性成分是水溶性的。

6.根据权利要求1 或2 的方法，其中活性成分为肽或者蛋白质。

7.根据权利要求1 或2 的方法，其中步骤（a）中制备的乳剂包含与亲

脂性活性成分相结合的亲水性活性成分。

8.根据权利要求1 或2 的方法，其中乳剂有机相相对于乳剂总重量含

量为10-60 重量％。

9.根据权利要求1 或2 的方法，其中乳剂有机相包含1-50％重量的聚

合物。

10.根据权利要求9 的方法，其中乳剂有机相包含5-30％重量的聚合物。

11.根据权利要求1 或2 的方法，其中乳剂有机相包含1-50％的活性成

分。

12.根据权利要求11 的方法，其中乳剂有机相包含5-30％重量的活性成

分。

13.根据权利要求1 或2 的方法，其中乳剂为复乳剂。

14.根据权利要求1 或2 的方法，其中乳剂的外和/或内水相包含至少一

种稳定剂和/或至少一种粘度剂。

15.根据权利要求1 或2 的方法，其中乳剂的外和/或内水相包含至少一

种稳定剂和/或至少一种渗透压剂和/或至少一种表面活性剂和/或至少一种缓

冲剂。

16.根据权利要求1 或2 的方法，其中从聚合物相中除去溶剂的步骤通

过在水中萃取实施。