发明内容
现已开发了一种用于制备形成水性-核储器纳米胶囊的纳米-组件的方法,由油包水型纳米-乳液模板产生,特别是低能量方法,且得到新型多官能物体,该物体也由为纳米胶囊壳的油储器组成。
这些水性核纳米胶囊特别可用于包封和递送亲水性或亲油性物类,特别是易碎药物。此外,这些水性核纳米胶囊还具有这样的优点,能高收率地同时包封水性核中的亲水性物类和脂质壳中的亲油性物类。
因此,根据第一个目标,本发明涉及一种用于制备组合物的方法,该组合物含有在水相中直径在20-500nm范围内的颗粒(P),所述颗粒含有:
-油相;
-在所述油相中,含有
-水性液滴,或
-纳米胶囊(NC),所述纳米胶囊包括:
-水性核,和
-聚合物壳或由两亲型物质组成的壳;
和
-表面活性剂;
所述方法包括以下步骤:
i)制备油包水型(w/o)乳液(E1),其中,液滴的流体动力学平均直径为10-400nm,其中,连续相含有两种油,挥发性油(O1)和非挥发性油(O2),所述挥发性油(O1)比水更易挥发,所述非挥发性油(O2)比水的挥发性差;
ii)任选地,加入单体或者加入两亲型物质,以形成水性核-壳纳米胶囊(NC);所述单体可溶于乳液(E1)的连续相且当与水接触时聚合的;和
iii)加入水相并除去所述挥发性油(O1),从而形成期望的组合物。
本文使用的术语“平均直径”是指测量的所有可测量颗粒的大小测量值的总和除以测量颗粒的总数。
根据本发明的乳液E1(在本文中是指“纳米乳液”)的液滴的“流体动力学平均直径”根据基于动力学光散射的方法,通过在乳液上进行的颗粒大小测量来确定。
颗粒(P)的直径通过在透射式电子显微镜(TEM)和/或在低温-TEM上进行的颗粒大小测量来确定。
步骤i)
油包水型(w/o)乳液(E1)包括水作为不连续相、两种油(O1)和(O2)的混合物作为连续相、和表面活性剂。其可根据本领域已知的任何常规技术来制备,包括特别是所谓的高能量方法(该方法涉及高剪切装置,例如高压均化器或超声破碎器(sonifiers))和低能量方法(例如自发乳化(或溶剂扩散)和相转化温度(PIT)方法)。
其中,优选低能量方法,更特别是PIT方法,特别是用于药物包封,该方法在待包封的易碎分子的加工过程中可防止降解。
PIT方法为Shinoda和Saito介绍了三十年的不含有机溶剂的方法(Shinoda,K.等人,1968;Shinoda,K.等人,1969),该方法基本上报道用于水包油型乳液的制备。该方法包括通过热敏非离子表面活性剂稳定水/油乳液,其在两个不混溶的相中的溶解度随温度而变。采用这种方式,整个粗滴乳液进行过渡相转化,当固定组成时,对样品逐渐进行温度变化。接着,油包水型(w/o)乳液将变成水包油型(o/w)乳液,随之样品温度上升,反之,则样品温度下降。在相转化温度(PIT)时,表面活性剂对水和油的亲和力达到平衡,导致建立双连续微乳液,纳米级结构化。由此,适用于制备油/水乳液的‘PIT方法’与形成动力学稳定的纳米乳液液滴的不可逆的方法相似,包括通过在PIT下进行,突然破碎双连续的纳米网络,快速冷却和/或突然水稀释。
本发明人近来开发了一种基于PIT方法的方法,该方法经改变并适用于在油连续相中产生纳米乳液。将该方法主要分成(i1)在PIT附近的温度循环的阶段,和(i2)突然稀释用于破碎过渡微乳液结构从而立即产生纳米-乳液的阶段。因此,当该步骤通常通过用水稀释来进行以产生o/w纳米乳液时,过渡微乳液突然被油稀释,导致形成w/o纳米乳液。
因此,根据一个优选的实施方式,(w/o)乳液(E1)是根据PIT方法制备的,并含有表面活性剂(S1),当温度超过相转化温度(PIT)时,该表面活性剂在非挥发性油(O2)中比在水中更易溶;当温度低于PIT时,该表面活性剂在水中比在非挥发性油(O2)中更易溶。
更具体地,油包水型(w/o)乳液(E1)是根据包括下述步骤的方法来制备的:
i1)通过在PIT附近进行温度循环,由三元混合物形成纳米结构化的双连续体系,所述三元混合物含有:
-所述非挥发性油(O2);
-水;和
-所述表面活性剂(S1);
i2)通过加入挥发性油(O1),从而形成w/o乳液,其中,液滴的流体动力学平均直径在10-400nm范围内;和
i3)任选地,加入进一步量的表面活性剂(S2)。
本文使用的术语“挥发性油”是指比水更易挥发的油,也就是其沸点低于水的沸点,特别是沸点低于50℃,优选在25℃至50℃范围内的油。适用于根据步骤i)制备纳米乳液的挥发性油的实例特别是异戊烷(Bp=28℃)或戊烷(Bp=36℃)。
本文使用的术语“非挥发性油”是指比水挥发性差的油,也就是沸点超过水的沸点,优选沸点超过150℃的油。
优选,非挥发性油(O2)是药学上可接受的。
本文使用的“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内、适用于与人类和动物的组织接触,而无过度毒性、刺激、过敏反应、或其它问题复杂性,同时具有合理的收益/风险比的那些油。
优选,非挥发性油(O2)为所谓的‘轻质矿物油’,其为标准化命名,是指得自石油的饱和烃的混合物,且有利地是药学上可接受的。
优选,O1/O2的体积比超过1,特别是超过3,更特别是超过5。
优选,表面活性剂(S1)的相转化温度(PIT)低于50℃。
优选,表面活性剂(S1)为非离子型。优选,它含有聚氧乙烯部分,特别是聚氧乙烯C6-C18脂肪酸酯,例如POE-300-硬脂酸酯。
考虑由轻质矿物油(O2)、水和POE-300-硬脂酸酯(S1)组成的三元混合物,100×水/(水+油)重量比优选在30-90的范围内,和/或相对于三元混合物的总重量,(S1)表面活性剂的量在5-15重量%范围内,优选在8-13重量%范围内。
步骤i1)
在适用于制备w/o纳米乳液(E1)的PIT方法的步骤i1)中,将三元混合物{水/非挥发性油(O2)/表面活性剂(S1)}结构化为纳米结构化的双连续体系,该体系是在热力学和动力学上非常稳定的中间阶段。
本文使用的术语“纳米结构化的双连续体系”是指油相和水相共存于连通的连续畴,该连续畴含有位于界面的表面活性剂分子。这些纳米结构化的双连续体系也称为“Winsor IV双连续微乳液”。
温度循环基本上包括将温度升高超过PIT,特别是超过高达30℃,和将温度降至PIT。出于该考虑,PIT优选不超过70℃。该温度循环能形成和导致双连续体系的稳定。此外,本发明人发现,在减小液滴直径和降低多分散性指数(PDI)以及减少循环次数方面,制得的纳米乳液(E1)的品质得到提高。
温度循环的加热和冷却速率不是关键的,且可以在宽范围内变化。加热和冷却速率实际上仅对形成纳米乳液E1所需的循环次数有影响。作为一个实例,当加热和冷却速率为dT/dt=±1.5℃/min时,6次循环,甚至3次循环可足以获得具有低多分散性指数的纳米乳液E1。
使用所选次数的循环可实现温度循环,获得的双连续体系在接近PIT的温度下是稳定的,优选仍在适度搅拌下。
应注意到,当该方法适用于制备具有包括由两亲型物质组成的壳的纳米胶囊的组合物时,作为一种选择,两亲型物质可在步骤i1)开始时加入,而不是在步骤ii)中加入。
步骤i2)
随后,在步骤i2)中,将在该给定温度下显示半透明和带蓝色外观的双连续体系突然用挥发性油O1稀释,立即并不可逆地产生w/o纳米乳液E1。该连续相现在实际上是挥发性油O1与非挥发性油O2的混合物。
应注意到,在稀释步骤期间搅拌双连续体系以及搅拌速率不影响纳米-液滴的形成机理,但是可改进和确保中间物的均化,从而制得具有特别低的多分散性指数的纳米乳液。
根据该方法,所述挥发性油O1优选为粘度比水低的物质,例如戊烷或异戊烷。
通常,加入至少等于双连续体系体积两倍体积的O1,以产生w/o纳米乳液(E1)。
由于挥发性油O1的粘度比水低,该挥发性油O1将更加快速地互相渗透连通的双连续畴,因此,产生油包水型乳液(E1)。
步骤i3)
根据本发明的PIT方法,该方法还可以包括在步骤i3)中加入进一步量的表面活性剂(S2)。实际上,已观察到,在纳米乳液连续油相中加入其它表面活性剂不可逆地稳定悬浮液,也就是,防止液滴的聚集过程。
为了确保良好的稳定液滴,优选,所述进一步量的表面活性剂(S2)为所述表面活性剂总重量的30-40重量%。
假定表面活性剂分子(S2)包裹和涂布水性液滴,从而导致液滴之间空间稳定。
附加的表面活性剂(S2)可与在步骤i1)中使用的(S1)相同或不同。
优选,所述表面活性剂(S2)在油相中比在水相中更易溶。所述表面活性剂(S2)可以特别是聚氧乙烯脂肪酸,例如POE 300硬脂酸酯。
步骤ii)
在步骤iii)之前,在步骤i)结束时形成的乳液(E1)的水性液滴可任选地被“壳”增强。
在本发明的上下文中,“壳”是指围绕水性液滴且可增强水性液滴稳定性的层。
因此,在该方法的任选的步骤ii)中,乳液(E1)的液滴的界面被聚合物的二维网络或两亲型物质增强。
在一个优选的方面,乳液(E1)的液滴被聚合物增强。
根据一个优选的实施方式,单体对水相具有反应性,因此引发界面聚合,该单体可溶于油相,即,在油相中比在水相中更易溶,和/或对表面活性剂(S1)和/或(S2)或存在于乳液E1中的任何其它化合物不具有反应性。
优选,所述单体包括两个二异氰酸酯(-N=C=O)基团。作为单体的实例,可提及甲苯-2,4-二异氰酸酯(TDI)(tolylene-2,4-diisocyanate)、异佛尔酮二异氰酸酯或4,4-甲基-双(异氰酸苯酯)(4,4-methyl-bis(phenylisocyanate))。最优选的单体为甲苯-2,4-二异氰酸酯(TDI)。
不希望局限于理论,假定单体分子的异氰酸酯官能团在与水液滴接触时使得形成胺基,其后来比水更具有反应性,并优选与另一种异氰酸酯单体反应,从而形成聚脲。因此,由于该化学反应为逐步聚合,且为了生长,由于聚脲链需要与水和油(单体储器)均连续接触,导致聚合物壳的厚度有利地在分子范围内,并形成格栅样界面网络。
有利地,已观察到,聚合物“格栅”密度可根据单体浓度而改变。单体含量越高,则越接近形成聚合物“格栅”。因此,为包封亲水性大分子比为包封较小的亲水性分子需要的单体浓度更低。
优选,在乳液(E1)的油相中,单体的浓度超过0.05mg.L-1,特别是超过0.5mg.L-1,且特别是在0.6-0.8mg.L-1的范围内。
在另一具体的实施方式中,乳液(E1)的液滴被两亲型物质增强。
所述两亲型物质特别包括表面活性剂、合成的或生物聚合物。
本文使用的术语“生物聚合物”应理解为是指在自然界中发现的分子,它包括多于30个单体单元,通常包括高达上百个单个的单体单元。单体单元可特别为糖、氨基酸和核苷酸。
在本发明的上下文中,术语“生物聚合物”还包括含有30个或更少单体单元的“生物低聚物”。
作为生物聚合物的实例,可提及肽、蛋白质(球形或纤维质)例如骨胶原(氨基酸单体)、多糖例如纤维素、藻酸盐或甲壳质(糖单体)、核酸例如RNA和DNA(核苷酸单体)。
本文使用的术语“合成的聚合物”是指通常包括高达上千个可相同或不同的单个单体单元的大分子。因此,术语“合成的聚合物”包括均聚物或共聚物。在本发明的上下文中,合成的聚合物可包括表面活性剂。
优选,所述两亲型物质为表面活性剂S4,特别是非离子表面活性剂。
优选,所述表面活性剂的亲水亲油平衡(HLB)超过或等于10。
优选,所述表面活性剂S4为聚山梨酸酯,最优选聚山梨酸酯80。
步骤iii)
在该阶段,在任选的步骤ii)中制得的体系包括分散在挥发性油O1与非挥发性油O2的混合物中的聚合物壳水性核纳米胶囊(NC)。可选择的是,在步骤ii)中制得的体系包括具有由两亲型物质组成的壳的水性核纳米胶囊(NC)。
根据另一种实施方式,在该阶段,该体系包括分散在挥发性油O1与非挥发性油O2的混合物中的乳液(E1)的水性液滴。
在步骤iii)中,颗粒(P)的组合物是通过如下方法制得的:加入一定体积(优选占由步骤ii)或i)制得的分散体体积的4-5倍)的水,和通过在超过O1沸点的温度下并优选超过(E1)沸点20℃下加热,除去(优选同时)挥发性油O1,特别是通过蒸发。
不希望局限于任何理论,可解释脂质壳水性核颗粒(P)形成的假说为除去(特别是蒸发)挥发性油所提供的能量能良好均化体系,更特别是当挥发性油的量变得非常低时。在纳米胶囊(NC)上铺展的非挥发性油O2最初存在于油相中,从而制得小的水性核脂质壳颗粒(P)。因此,颗粒(P)的大小可有利地适应非挥发性油(O2)的残余量。
此外,已观察到,只要挥发性油O1蒸发,即油相的体积减少,可溶于油相的表面活性剂(S1)在油相中逐渐结晶,特别是在O2中结晶。最后,固体表面活性剂(S1)被封入围绕液滴的油相中,因此,形成包裹任选被聚合物壳或两亲型物质(NC)保护的水性核的包括无定形固体表面活性剂和油(O2)的基质脂质壳。
步骤iv)
根据一个优选的方面,所述方法进一步包括在水相中加入亲水性表面活性剂(S3)的步骤iv)。该附加的步骤实际上有利地使制得的颗粒(P)稳定,并防止它们聚集。
本文使用的“亲水性表面活性剂”是指“亲水亲油平衡”(HLB)超过12,且更特别是超过14的表面活性剂。
作为合适的亲水性表面活性剂(S
3)的一个实例,可提到POE 660羟基硬脂酸酯(Solutol HS15
),它的HLB在14-16之间。
作为选自,所述方法还可以包括附加的步骤,该步骤包括用水进一步稀释在步骤iii)中制得的组合物。
亲水性和/或亲油性物质的包封
可将可通过本发明方法制得的颗粒(P)掺入亲水性物质或亲油性物质或亲水性物质和亲油性物质中。
亲水性和亲油性物质可特别选自药物、诊断产品、化妆品、兽医产品、植物检疫产品、或经加工的食品。
可将所述亲水性物质掺入该方法的步骤i)中,更具体地,掺入预期用于形成纳米结构化的双连续体系的水相中。
优选,在根据步骤i1)形成双连续体系之后,在根据步骤i2)加入挥发性油O1之前,加入含有亲水性物质的水溶液。因此,对三元混合物{非挥发性油(O2)/水/表面活性剂(S1)}进行温度处理以形成双连续体系不会有利地影响待包封的亲水性物质。
优选加入的水溶液的体积非常低,相对于双连续体系的体积,加入的水溶液的体积可特别为1-5%体积。因此,该浓溶液将非常快速地结合双连续体系的水性部分,并在根据步骤i2)用挥发性油O1稀释后,将同样产生纳米乳液E1。
关于亲油性物质,优选在界面聚合步骤ii)之后并在步骤iii)之前加入亲油性物质。从而,在挥发性油完全蒸发后,亲油性物质同样共存于颗粒(P)的油相上。
根据其它目的,本发明涉及一种组合物,该组合物在水相中含有直径在20-500nm范围内的颗粒(P),所述颗粒含有:
-油相;
-在所述油相中,含有
-水性液滴,或
-纳米胶囊(NC),所述纳米胶囊包括:
-水性核,和
-聚合物壳或由两亲型物质组成的壳;
和
-表面活性剂。
所述组合物可根据本发明的方法制得。
根据本发明的一方面,颗粒(P)在油相中含有水性液滴,任选包括亲水性物质。该实施方式特别适用于包封各种亲水性物质,特别是具有高分子量的物质。
这种亲水性物质的实例包括特别是蛋白质、质粒、抗体、多糖。
在其它方面,颗粒(P)在油相中含有纳米胶囊(NC),该纳米胶囊包括水性核和壳。
根据一方面,所述纳米胶囊(NC)包括由两亲型物质组成的壳。
在一个优选的方面,所述纳米胶囊(NC)包括聚合物壳。
优选,所述聚合物壳由聚脲组成。
优选,颗粒(P)的纳米胶囊(NC)的直径在10-400nm范围内,特别是约50nm,通过在透射式电子显微镜(TEM)和/或在低温-TEM上进行的颗粒大小测量来确定。
优选,所述水性核含有亲水性物质。
优选,油相含有亲油性物质。
有利地,本发明组合物表征为多分散性指数低于0.5,特别是为约0.1。
根据其它目的,本发明涉及一种可根据包括以下步骤的方法制得的油包水型(w/o)乳液(E1):
i1)通过在PIT附近进行温度循环,由一种混合物形成纳米结构化的双连续体系,所述混合物含有:
-非挥发性油(O2);
-水;和
-表面活性剂(S1);以及
i2)加入挥发性油(O1),从而形成w/o乳液(E1),其中,液滴的流体动力学平均直径在10-400nm范围内;和
i3)任选地,加入进一步量的表面活性剂(S2),
其中,非挥发性油(O2)为石蜡油,而挥发性油(O1)为戊烷或异戊烷。
在又一目的中,本发明涉及一种油包水型(w/o)乳液(E1),所述乳液含有:
-作为连续相,异戊烷或戊烷作为挥发性油,而石蜡油作为非挥发性油;
-作为不连续相,水;和
-表面活性剂(S1)。
优选,表面活性剂(S1)含有聚氧乙烯部分。
由于具有良好的稳定性,这些乳液(E1)特别有利,因此,能根据本发明制备颗粒(P)的稳定的组合物。
根据其它目的,本发明涉及本发明的颗粒(P)的组合物在用于包封亲水性和/或亲油性物质中的用途。
实施例
1.材料和方法
1.1.材料
工业级聚乙氧基化表面活性剂C18E6由Stearinerie-Dubois(Boulogne,法国)友好提供。其通常为泊松样环氧乙烷(EO)分布约为6的商品。该偏亲油性的两亲物(即,EO值低)可稳定由‘轻质矿物油’和水加上电解质(NaCl)组成的乳液。轻质矿物油购自Cooper(Melun,法国),其为涉及由石油制得的饱和烃的混合物的标准化命名。超纯水通过MilliQ
过滤体系(Millipore,Saint-Quentin-en-Yvelines,法国)和得自Prolabo(Fontenay-sous-Bois,法国)的氯化钠制得。最后,非常具有流动性和挥发性的非极性相也用作第二种油,且也是该方法的关键:异戊烷(2-甲基丁烷)得自Riedel-de-Han(德国),其25℃的绝对粘度η=0.35mPa·s,且沸点B
p=28℃。
亚甲基蓝(MB)、牛血清白蛋白-荧光素异硫氰酸酯标记的(BSA-FITC)、苏丹红(RS)购自Sigma。
1.2.颗粒(P)的组合物的制备
基于以下成分(表1),根据以下通用方法来制备颗粒(P)的组合物。
表1
微乳液制备
|
量 |
NaCl |
0.8g |
MilliQ水 |
26.88g |
石蜡油 |
40.32g |
POE 300硬脂酸酯 |
7.46g |
纳米乳液制备(E
1
)
|
|
POE 300硬脂酸酯 |
0.4g |
异戊烷 |
30ml |
界面缩聚
|
|
甲苯-2,4-二异氰酸酯 |
0.7mg/L在异戊烷中 |
蒸发
|
|
MilliQ水 |
20ml |
1.2.1.油包水型纳米-乳液(E1)制备
由‘轻质矿物油’和MilliQ水(100×水/(水+油)重量比:WOR=40)加上NaCl(在水中的浓度:0.51M)组成的粗滴乳液通过含有短PEO链(PEO-300硬脂酸酯,10wt.%)的非离子聚乙氧基化(PEO)表面活性剂稳定。PEO-300硬脂酸酯大量地溶于这种“轻质矿物油”中,且不溶于水(Yu,C.D.,1994)。
该体系最后能随温度进行乳液相转化(Salager,J.L.等人,2004;Anton,N.等人,2007)。该现象,制剂和组合物参数的影响,以及该三元体系的特征在以前的研究中已进行了深入的研究(Anton,N.等人,2007)。因此,当体系精确保持在乳液相转化温度(PIT)时,自发形成具有带蓝色和半透明外观的双连续微乳液(Winsor IV-like),以纳米级结构化(Kahlweit,M.等人,1985;Forster,T.等人,1995;Morales,D.等人,2003;Izquierdo,P.等人,2004)。接着,在PIT附近(35<T<60℃)进行温度循环处理,以‘结构化’过渡微乳液,逐渐增加纳米级网络的细度以及温度循环次数。
作为最后一步,在PIT下将该纳米双连续体系突然用另一种油(异戊烷)稀释,这种油与水相比非常具有流动性。立即产生油包水型纳米乳液,通常液滴流体动力学直径为约40nm,且具有约0.05的非常令人满意的多分散性指数(使用Nano ZS Malvern Instruments进行测量)。这种w/o纳米乳液的去稳定机理显示遵循胶态聚集过程,通常是其中液滴间相互作用曲线通常呈现深度初级最低值的反向乳液。
此外,已观察到,在已建立纳米-乳液后,在纳米乳液连续油相(POE-300硬脂酸酯)中加入其它表面活性剂,不可逆地导致稳定悬浮液,也就是,防止聚集过程。实际上,为了确保液滴良好稳定,加入相应于表面活性剂总量的约35wt%的表面活性剂。假定非离子表面活性剂分子包裹和涂布水性液滴,从而导致液滴之间空间稳定。
1.2.2.界面缩聚
界面缩聚阶段为在w/o纳米乳液模板上产生二维聚脲膜的逐步法。选择单体的标准为:(i)随意溶解于连续的油混合物(异戊烷加上矿物油)中,和(ii)与分散的水相具有良好的反应性。参见图1,在该实施方式中选择甲苯-2-4-二异氰酸酯(TDI)。采用这种方式,单体分子的异氰酸酯官能团在与水液滴接触时形成胺基,随后比水更具有反应性,并优选与另一种TDI分子反应。
因此,由于该化学反应为逐步聚合,且为了生长,由于聚脲链需要与水和油(单体储器)均连续接触,导致聚合物壳的厚度在分子范围内,并形成界面网络,可将该界面网络想象为格栅(这种观念由关于包封收率的以下结果得到支持)。假定单体和待包封的分子的可能的NH2基团之间的反应不妨碍聚合物膜的形成。以下研究缩聚时间tp对包封收率的影响,且对于最优化制剂,tp最后固定为2小时。
1.2.3.纳米胶囊(NC)的制造
在该阶段,实验体系由水性纳米-液滴组成,被假定具有格栅样结构的聚脲二维膜围绕,并分散在异戊烷(来自PIT稀释)和矿物油(来自初始乳液)的本体油混合物中。此外,还认为在油中可能存在一些仍未反应的单体分子。
因此,(i)通过加入作为外部相的附加的水相,和同时(ii)在蒸发器中,于明显超过异戊烷沸点(Bp=28℃)的温度(例如50℃)下,通过其自身蒸发1小时,通过除去异戊烷相,简单地实现获得水性核纳米胶囊(参见图1)。
从而,该蒸发阶段提供的能量不仅能快速除去挥发性油,而且确保样品适当均化,这样可防止液滴立即聚集,同时使球形油的体积下降。水性液滴可能同样铺展于非极性相上,导致在水中产生截然不同的胶态物体。采用这种方式,由于在非极性相中存在非挥发性矿物油,当异戊烷蒸发完成时,最后在新形成的胶态颗粒上共享。此外,由于使用的PEO非离子表面活性剂完全不溶于水,随着油的蒸发,也就是,油体积的下降,两亲物在油中逐渐结晶。最后,将固体表面活性剂封入所得到的围绕液滴的矿物油中,因此,产生包裹被聚合物膜保护的水性核的由无定形固体表面活性剂和矿物油制成的基质脂质壳(图1所示的结构)。该胶囊结构被以下电子显微镜实验以及其能同时包封亲水性和亲油性分子的高能力充分支持。最后,关于可能保留在油中的游离的单体,看起来最后当与形成的聚合物膜接触(通过末端NH2基)时或与外部水相接触时被中和(由于也封入矿物油中)。
1.2.4.纳米胶囊(NC)的特征
显微镜观察
透射式电子显微镜(TEM)。将一滴每种水性分散体样品首先放置在涂碳TEM铜格栅(Quantifoil,德国)上,并让其风干。随后样品用乙酸双氧铀(Merck,德国)负染色。为此,将涂有样品的TEM格栅依次放置在一滴乙酸双氧铀水溶液(2wt.%)和一滴蒸馏水上。随后,在将它们置于电子显微镜中之前,将格栅风干。使用于80kV下运行的JEOL JEM-1230TEM观察样品。
低温-TEM。使用低温浸渍低温-固色装置(Gatan,USA)制备用于低温-TEM观察的样品,其中将一滴水性悬浮液沉积在辉光放电的孔型涂碳格栅(Ted Pella Inc.,USA)上。随后制备TEM格栅:将含有样品的液滴吸至厚度约为50-500nm的薄液体层,该层保持横穿支撑碳膜中的孔。通过将格栅快速地投入到用液氮冷却的液体乙烷中,使液体膜玻璃化。将玻璃化的样品安装在使用低温转移体系(Gatan,USA)插入显微镜中并用液氮冷却的Gatan 910样品夹具(Gatan,USA)中。随后由保存在透明的冰中并横过支撑碳基材中的孔悬浮的样品得到TEM图像。于-178℃下,使用在80kV下运行并配备LaB6灯丝的JEM 1230‘低温’显微镜(Jeol,日本),在低剂量条件下(低于10e·A2)下观察样品。在Gatan 1.35K×1,04K×12bit ES500W Erlangshen CCD照相机中记录所有显微照片。
表面势能测量
作为纳米胶囊表面势能的图像,使用Nano ZS(Malvern Instruments)评估ζ势能。我们使用结合电泳淌度和ζ势能的斯莫卢霍夫斯基(Smoluchowski)模式。Helium-Neon laser,4mW,在633nm下操作,散射角固定为173°,温度恒定为25℃。但是,通过软颗粒分析模式(H.Ohshima,等人,2006)对表面性能的深入研究表明,包封的材料对这些物体的表面势能没有影响。已表明,包封材料不构成壳结构的一部分。
1.2.5掺入亲水性和亲油模式分子
关于图1中的整个制备过程,亲水性和亲油性物类的掺入看起来采用不同的方式进行。
(i)最终,亲水性材料必须分配到w/o纳米乳液水液滴中,且这种分配从亲水性材料开始时包括在粗滴乳液制剂的水相中就开始进行了。另一种较有效的方式包括在温度循环之后,且在异戊烷稀释之前,在保持在PIT的微乳液中注射非常小体积(不多于2%(v./v.))的非常浓的水溶液。注射在(仍)搅动的微乳液中的液滴非常快速地结合双连续网络的水性部分。由于油稀释,立即形成纳米乳液,使得注射的亲水性分子在油中非常均匀地分散。通过该原始方式掺入亲水性物类,最后防止在加工过程中可能由于温度循环处理而使分子降解。选择具有非常不同分子量的亲水模式分子:第一种为不稳定的染料亚甲基蓝(MB),第二种为牛血清白蛋白荧光异硫氰酸酯标记(BSA-FITC)的蛋白质,最后一种为荧光化合物氯水合多柔比星(DoxorubicinChlorhydrate)(DOX),其为一种抗癌药物。
(ii)另一方面,在所选的聚合时间(最大程度防止与单体可能的相互作用)之后,且在异戊烷蒸发阶段之前,将亲油性物类引入纳米乳液的油相中。从而,在异戊烷蒸发完全之后,加入的亲油性材料同样共存于封入残余的矿物油中的液滴上,也就是,被无定形油/非离子表面活性剂基质捕获。最后出现的是残余的矿物油位置的标记,且确定显著包封收率应支持提出的多官能水/油结构。亲油模式分子也是染料苏丹红III(red Soudan III)(RS)。此处重要的是注意到,含有亲水性和亲油性试剂的纳米胶囊制剂的这些方法仍可看作仅涉及低能量(也称为‘低能量’方法)。从而,包封的分子不经受‘高能量’乳化过程和装置(例如高压均化器或sonifier),且甚至不进行温度循环。防止待包封的易碎分子在加工过程中可能降解。
采用间接方法进行所有量化,通过离心法(30分钟,14500rpm),在将外部水与纳米胶囊分离后,将其冷冻-干燥(RP2V,SGD,Le CoudraySaint-Germer,法国),以确保将可能残留的纳米胶囊破坏(并且还防止在量化过程中的额外的光吸收)。接着,将冷冻-干燥的样品溶解于二氯甲烷(DCM)中,并使用Spectrophotometer UV-visible Uvikon 922分光光度计(Bio-TekKoutron instruments,Saint-Quentin-en-Yvelines,法国),将存在于外部水中的除DOX以外的不同的掺入的分子简单量化。使用分光荧光计(FluoroskanAscent FL,类型374,Thermo Electron Corporation,Finland)量化DOX。激发光和发射光分别在485nm和550nm下通过通带滤色片。
1.2.6.多柔比星从颗粒(P)中的释放收率
为了建立药物释放动力学(参见图8),将封闭在渗析15kDa膜(Spectra/Por
membrances,Fisher Bioblock Scientific,Illkirch,法国)中的2mL新制备的含有负载DOX的颗粒(P)的悬浮液加入到得自Sigma的40mL磷酸盐缓冲盐水(PBS,pH 7.4)中。于37℃下(在蒸发器中,Julabo SW22,JULABOLabortechnik GmbH,Seelbach,德国),将烧瓶在暗处轻微机械搅拌(125rpm)。接着,在指定的时间点收集500μL释放介质,如前所述,通过分光荧光法确定DOX浓度。将该收集的体积系统地用相同体积的新的PBS代替,以确保“沉降”实验条件。
2.结果
2.1纳米胶囊特性
图2表示这些水性-核纳米胶囊的负染色TEM图,低温透射电镜图如图3所示。由这两个补充实验技术呈现补充信息,并最终,与图1提出的结构非常一致。首先关注液滴的大小,它的大小在50nm左右,最后与(减去油、加上表面活性剂壳厚度)测量的w/o纳米乳液大小一致。此外,仅考虑形成纳米胶囊的材料,可接近理论油/表面活性剂壳的厚度,已知它们各自的比例,且假定纳米胶囊具有假定的结构:产生约7.5nm的厚度。该计算结果看起来也能得到如图2所示的核/壳比例的支持。
此外,这些电子显微镜照片显示胶囊较良好的单分散性,并证明分散体和该配制方法的较良好的品质。当然,由于胶态物体在测量和形成真空阶段的过程中可能已爆破,而在图2中显示出含有这些胶态物体的水性核的胶囊结构。随后空腔被(亲水性)染色剂填充,在纳米胶囊内产生有对比斑点。
相反,图3(a)、(b)、(c)中的低温透射电镜图存在完整的纳米胶囊,且由于颗粒的中心与边缘之间对比度的差异,也同样显示胶囊结构。实际上,在不存在染色剂时,对比有机物类与水之间的差异,足以显示这样的细节。最后,关于在图3中所公开的电子强度的详细描述,某些壳的质地显示有机材料(和聚合物排列)在纳米胶囊壳中的无规分布。这点仍与图1所示的提出的机理和格栅样结构相关。
2.2稳定性
由于特定的纳米胶囊结构,组成壳框架的聚合物的存在,关于其亲油性部分,由于使用的表面活性剂具有短PEO-链,且还由于其大部分在油壳中结晶,像空间来源的静电一样的排斥的分布力显示出非常低。新形成的纳米胶囊具有非常良好的单分散性且多分散性指数(得自Nano ZS Malvern,在合适的稀释条件下)相当好,也就是,低于0.1。接着,通过在水中的胶态聚集过程,浓NC悬浮液明显地快速去稳定,储存约1个月后,显示乳状液浓度的NC。实际上,当足够大(>1μm)时,簇(clusters)能经受地心引力。另一方面,通过简单地稀释样品(例如1/100)可使该过程明显降低,且悬浮液显示可稳定数月。
2.3亲水性和/或亲油性分子的高效纳米包封
由于将亲水性试剂包封在纳米胶囊内的组成部分本身分散于水性连续相中的实际困难,首先涉及所选的亲水性物类(亚甲基蓝和BSA-FITC)可包封在该胶体内的程度。采用上述方法,在纳米乳液产生步骤以及分子量化以确定包封收率的过程中进行分子掺入。从而,制剂参数(引入制剂中的单体的量和聚合时间tp)对包封收率的影响公开于图4。
因此,对于固定为tp=2h的最优化的缩聚时间,图4比较了加入到w/o纳米乳液中的单体量对包封收率的影响,使用两种不同的亲水性分子MB和BSA-FITC。因此,趋势看起来非常类似,从在不存在单体时不可能包封(这时假定收率为0)且内部水全部逸向外部,到在最高单体含量下的非常令人满意的收率。BM和BSA-FITC得到的平稳状态结果非常类似,在0.9附近,但是非常感兴趣的点在两种分子之间出现偏移。实际上,与较少染料相比,大的蛋白质保持较低单体量。BSA-FITC在约0.05mg·L-1时达到平稳状态,而MB在偏远的约0.5mg·L-1时达到平稳状态,这点可能说明在单体浓度与聚合物‘格栅’密度之间存在关联性:单体含量越高,越接近于形成聚合物‘格栅’。最终,该结果与以上提出的纳米胶囊结构相关,由于缩聚反应仅产生二维膜,其中聚合物纤维共生(intergrown)形成‘格栅样’网络。从此以后,在异戊烷蒸发过程中,提供的能量将诱导一部分包封的分子逸向外部水,同样,由于聚合物格栅密度提高而使该逸出降低。此外,由MB与BSA-FITC之间观察到的差异看来,包封的分子的分子量在该过程中也是重要的。比起较小的分子,最大的分子更容易被聚合物网络阻挡,直至达到类似的包封收率(在约0.5mg·L-1处)。
图5说明对于单体的三种所选的加入量,缩聚时间tp对MB的包封收率的影响。这样,tp与在将单体加入到纳米乳液中和异戊烷蒸发步骤之间的延迟相一致。在该期间样品仍于500rpm下轻微搅拌。最后证明在该过程中其值固定(tp=2h),这是由于看起来在每种情况下类似地快速(低于1小时)达到某种程度的稳定。此外,由于在异戊烷蒸发步骤中将单体封闭在薄油层中(因此迫使与内部水、聚合物壳、或外部水接触),最后迫使所有TDI分子反应并连接聚脲网络。在这种意义上,对于给定的短的tp以及由此合成的相同量的包封收率的差异源自聚合物在纳米胶囊结构中的不均匀分布。甚至合理地想到该强制的缩聚(对于短的tp)可在胶囊中产生聚合物孔,通过该聚合物孔,内部水可通过油逸出。
现在关于亲水性和亲油性组分的同时包封,进行在相同的纳米胶囊内掺入亚甲基蓝和苏丹红III(red Soudan III)的实验,并在图6中所所报道。关于上述处理,测量包封收率随制剂中加入的单体的量的关系,且最优化缩聚时间选择为2小时。同样,如NC结构预先提出的,MB在内部水中,而RS在油状环绕的壳中。当然,与仅在纳米胶囊中的图4所示的相比,亚甲基蓝曲线具有非常类似的外观。关于苏丹红III,明显地看出,单体量对其包封收率没有影响,由于在界面缩聚之后亲油性分子被加入到油相中,而最终,这是与该过程相关的。因此,RS被封闭在油/无定形表面活性剂壳中,且具有非常高的包封收率,收率达到约0.92。
概括起来,这些物体不仅显示出令人感兴趣的包封亲水性物类的能力(对聚合物内部框架有特定的影响),而且它们还明显地显示出同时包封亲水性(MB)和亲油性(RS)模式分子的能力。由于这些物体包括在其自身结构液体水和油储器中,且同样由于它们具有胶态范围的大小,这些多官能性质看起来较原始。
该研究的其它方面关于DOX包封收率与制剂变量的随动。因此,充分的研究表明,仅两个参数对包封收率有显著的影响:单体量和缩聚时间(tp)。当tp超过约1-1.5h且无论单体浓度如何时,收率快速地达到平稳状态,因此,在该过程中将tp固定为2h。
另一方面,单体量对DOX包封收率的影响显示了如图7所示的典型进展。该性质公开了纳米胶囊结构和均匀壳(不含孔)的形成与单体浓度密切相关,因此,与液滴界面处的聚合物紧密性密切相关。通过限定包封收率与聚合物总量之间的折衷,这些结果可使该方法最优化。
然后,在生理条件下研究水性-核纳米胶囊的释放行为,结果示于图8。这些结果不仅为壳渗透性和DOX释放机理提供信息,而且还为水性-核纳米胶囊的结构性能提供信息。最终,这些结果还证实DOX在胶囊内有效包封,且随着时间完全释放(通过曲线拟合,释放高达约100%)。第一点上应注意到,释放分布图具有指数行为,与指数函数(R=0.992)充分拟合。
2.4.未包封任何活性成分的颗粒(P)的细胞毒性
在NIH/3T3细胞(鼠Mus肌的纤维组织母细胞)上评定根据上述1.2制备的未包封任何活性成分(下文中称为NCB)的颗粒(P)的细胞毒性。将颗粒(P)暴露于各种颗粒浓度下历时4、24、48或72小时。通过MTT测试确定细胞存活率。结果报道于下表和图9中。注意到,在稀释高达1/1000时没有明显的毒性。
平均值 |
对照物 |
DMSO |
NCB 1/10 |
NCB 1/100 |
NCB 1/1000 |
NCB 1/10000 |
4H |
100.00 |
46.75 |
24.98 |
90.40 |
86.12 |
92.79 |
24H |
100.00 |
10.22 |
9.20 |
40.06 |
84.58 |
102.73 |
48H |
100.00 |
4.79 |
5.91 |
35.16 |
72.94 |
83.45 |
72H |
100.00 |
5.00 |
6.00 |
51.00 |
98.00 |
111.00 |
|
|
|
|
|
|
|
偏差 |
对照物 |
DMSO |
1/10NCB |
NCB 1/100 |
NCB 1/1000 |
NCB 1/10000 |
4H |
11.91 |
9.03 |
5.17 |
1.18 |
10.13 |
6.84 |
24H |
4.03 |
2.60 |
3.83 |
5.22 |
17.10 |
23.07 |
48H |
22.70 |
1.35 |
2.60 |
13.79 |
11.25 |
12.55 |
72H |
2.05 |
0.64 |
0.21 |
11.91 |
2.64 |
1.79 |
2.5.含有纳米胶囊(NC)的颗粒(P)的组合物的制备,所述纳米胶囊包括由TweenTM 80作为两亲型物质组成的壳。
基于以下成分,根据上述通用方法(参见1.2.1和1.2.3部分)制备组合物:
微乳液制备 |
量 |
NaCl |
0.08g |
MilliQ水 |
2.6g |
石蜡油 |
4g |
POE 300硬脂酸酯 |
0.74g |
TweenTM 80 |
0.124g |
纳米乳液制备(E1) |
|
POE 300硬脂酸酯 |
0.4g |
异戊烷 |
30mL |
蒸发 |
|
MilliQ水 |
20mL |
在搅拌(500rpm)下,在35-60℃之间进行3次温度循环。在第三次循环冷却相的过程中,于50℃下,通过加入异戊烷和POE 300硬脂酸酯将体系稀释,从而形成稳定的(w/o)纳米乳液。
随后通过在50℃的milliQ水中加入制得的纳米乳液,并蒸发异戊烷历时约1小时,形成纳米胶囊。
通过监测颗粒(P)的大小和ζ势能的变化(使用nanosizer ZS测量,参见1.2.4部分)来研究制得的组合物的稳定性随时间的变化。
结果显示颗粒具有良好的稳定性,相应于大小和ζ势能随时间(一个月)保持恒定值。
2.6.在单体(通过水性液滴包封)存在下或没有单体存在下,亲水性抗癌药物(多柔比星)的包封收率的比较
基于以下成分,根据上述通用方法(参见1.2.1和1.2.3部分)制备组合物:
微乳液制备 |
量 |
NaCl |
0.08g |
MilliQ水 |
2.6g |
石蜡油 |
4g |
POE 300硬脂酸酯 |
0.74g |
纳米乳液制备(E1) |
|
POE 300硬脂酸酯 |
0.4g |
异戊烷 |
30mL |
蒸发 |
|
MilliQ水 |
20mL |
在搅拌(500rpm)下,在35-60℃之间进行3次温度循环,从而形成微乳液。该微乳液随后于39℃下稳定。
随后将50μL多柔比星的水溶液(4.18mg/ml)依次加入到微乳液中,从而在用异戊烷稀释后,形成负载多柔比星的w/o纳米乳液。
随后将一部分该纳米乳液与甲苯2,4-二异氰酸酯进行界面聚合(参见以上1.2.2部分),而另一部分不进行界面聚合。
随后通过在50℃的milliQ水中加入制得的纳米乳液,并蒸发异戊烷历时约1小时,形成纳米胶囊。
这两种纳米乳液的水性纳米胶囊或水性液滴的大小为130nm(使用nanosizer ZS测量)。
包封的多柔比星在聚合物纳米胶囊中的收率为70%,在水性液滴中的收率为30%。
这些结果说明,水性液滴能包封多柔比星,虽然与使用聚合物纳米胶囊得到的包封收率相比,包封收率较低。
参考文献
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