CN1953749A

CN1953749A - 1－(取代苯基)－5－甲基－2－(1h)吡啶酮(ⅰ)化合物用于制备抗器官或组织纤维化药物的应用

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Publication number: CN1953749A
Application number: CNA2006800002161A
Authority: CN
Inventors: 陶立坚; 胡高云
Original assignee: Shenzhen East Sunshine Industrial Development Co ltd
Current assignee: Haikou Pharmaceutical Factory Co., Ltd.
Priority date: 2005-04-13
Filing date: 2006-04-11
Publication date: 2007-04-25
Anticipated expiration: 2026-04-11
Also published as: CA2603763A1; KR20080018857A; JP2008535871A; AU2006233433A1; US20090005424A9; EP1878428A1; TW200808315A; WO2006108354A1; RU2007141892A; CN1953749B; CN1846699A; US20070203203A1; EP1878428A4; US20090258911A1; US20080319027A1

Abstract

本发明涉及1－(取代苯基)－5－甲基－2－(1H)吡啶酮化合物在制备抗器官或组织纤维化药物中的用途。结果表明，1－(取代苯基)－5－甲基－2－(1H)吡啶酮对各种ECM产生细胞具有抑制作用，且其作用强于吡非尼酮。因此，该类化合物可作为制备抗器官或组织纤维化药物的活性成分。

Description

1- (取代苯基） -5-甲基 -2- ( 1H)卩 ¾3定酮 (I)化合物

用于制备抗器官或组织纤维化药物的应用技术领域

本发明涉及 1- (取代苯基） -5-甲基 -2- ( 1H)哋 ¾S 合 «H]用逸具彬也

官或组织^ ¾¼ 物中的用途。背景技术

纤维化（fibrosis)可发生于多种器官或组织，引起器官或组织内实质细胞减少，纤维结缔组织增多，最终可导致器官或组织结构破坏和功能减退，甚至器官衰竭。目前对器官或组织纤维化的发生机制、诊断方法和防治措施已进行了广泛的研究，现有技术中，在某些方面已取得了长足的进步，但仍有一些关键问题没有解决。

现已知，器官或组织纤维化是由于多种原因（如炎症、免疫、毒物、缺血及血流动力学改变等）引起实质细胞损伤，然后导致实质细胞的炎症变性、坏死、并激活相应的巨噬细胞释放多种细胞因子和生长因子，这些因子激活静息状态的细胞外基质 (extracellular martrix, ECM)产生细胞，使之转化为肌成纤维细胞；肌成纤维细胞增殖，并分泌细胞因子，通过旁分泌方式再作用于巨噬细胞。肌成纤维细胞可合成大量胶原等 ECM成分，同时 ECM降解减少，从而造成器官或组织纤维化。因此，器官或组织纤维化的发生和发展是细胞、细胞因子和 ECM等相互作用、多因素参加的结果。鉴于 ECM产生细胞在器官或组织纤维化形成中的重要作用，目前治疗器官或组织纤维化的重要靶标之一是抑制 ECM产生细胞的增殖、活化和诱导其凋亡。

由于各器官或组织功能、形态的不同，以及各器官或组织主要组成细胞的不同，使得不同器官或组织的纤维化在其发病机理中既有共性、也有个性；因此，在不同器官或组织纤维化的发病机制和治疗靶点上也存在一定的差异。以 ECM主要产生细胞为例，肝脏中是肝星状细胞，肾小球中为肾小球系膜细胞，肾间质中为肾间质成纤维细胞，肺脏中为肺成纤维细胞，心脏中为心肌成纤维细胞，腹膜中为腹膜间皮细胞。

吡啶酮类化合物在现有技术中已有公开。

美国专利 US3839346A公开了下式结构的吡啶酮类化合物。

其中，取代基 R数目为 0或 1， R取代基的种类代表硝基、氯原子、垸基、甲氧基。并公开了此类吡啶酮具有抗炎、解热、降低血清尿酸水平、止痛等作用。确认本美国专利 US4052509A也公开了式（0) 结构的化合物，其中具体公开了苯环上的取代基为硝基、甲氧基、对甲基、三氟甲基、氯原子，还具体公开了苯环上没有取代基的化合物，即 1-苯基 -5-甲基 -2- cm) mMo mi^m mmm i^并且毒性低。

中国专利 ZL02114190.8提供了一类吡啶酮化合物，具有如下的结构。

当 n=l时，所述的取代基 R表示 F、 Br, I。

当 n=2时，所述的取代基 R表示 F、 Cl、 Br、 I, 饱和直链烃基、氧代饱和直链烃基、卤代饱和直链烃基。

所述的取代基团 R在苯环上的位置具有邻位、间位、对位等方式。

现有技术中（EP1138329A) , 已知的一种有效的抗纤维化的化合物是吡非尼酮 (pirfenidone, PFD， 5-甲基 1-苯基 2 ( 1氢）吡啶酮）。实验表明，在肾纤维化、肺纤维化动物实验和特异性肺纤维化病人的临床治疗中，吡非尼酮均具有阻止甚至逆转 ECM 聚禾只的作用 ( Shimizu T, Fukagawa M, Kuroda T, et al. Pirfenidone prevents collagen accumulation in the remnant kidney in rats with partial nephrectomy. Kidney Int, 1997,52 (Suppl 63 )： S239-243 ; Raghu G, Johnson WC, Lockhart D, et al. Treatment of idiopathic pulmonary fibrosis with a new antifibrotic agent, pirfenidone. Am J Respir Crit Care Med, 1999,159： 1061-1069), 能够防止甚至逆转纤维化发生和瘢痕形成，这已经在大量的体外和动物实验中得到证实。吡非尼酮抗纤维化作用的机制尚处于研究之中，但大量的研究已经证明吡非尼酮是一种有效的细胞因子抑制剂，能够通过参与调节某些因子，抑制成纤维细胞的生物学活性，导致细胞增殖受抑，基质胶原合成减少。

美国专利 US5， 716， 632中宣称包括下列化合物在内的一些化合物也具有吡非尼酮一样的抗纤维化作用，但是除现有技术中的 5-甲基 -1-苯基 -2- ( 1H) 吡啶酮（吡非尼酮）外，没有提供实验数据证明该论断。这些化合物是：

5-甲基- 1- (3-硝基苯基） -2- ( 1H) 吡啶酮，

5-甲基 -1 -（4' -甲氧基苯基） -2 ( 1H)吡啶酮，

5 -甲基 -1-对甲苯基 -2- ( 1H)吡啶酮，

5-甲基- 1- (3' -三氟甲基苯基） -2- ( 1H)吡啶酮，

5_乙基- 1-苯基 -2- ( 1H) 吡啶酮，

5 -甲基 - 1- (3-硝基苯基） -2- ( 1H)吡啶酮。

本申请发明人曾在《中南大学学报》（医学版）（2004， 29 (2))上公开了化合物 1- (3 -氟苯基） -5-甲基 -2- ( 1H)吡啶酮对肾成纤维细胞的细胞实验，结果显示其具有抑制肾成纤维细胞生长的作用。发明内容

本发明是在上述现有技术基础上，进一步公开吡啶酮类化合物在制备抗器官或组织纤维化药物中的应用。

本发明提供如式（I)所示化合物用于制备抗器官或组织纤维化药物的应用；

当 n=l时，所述的取代基 R表示 F、 Cl、 Br、 I、硝基、烷基、氧代垸基、卤代垸基；

当 n=2时，所述的取代基 R表示 F、 Cl、 Br、 I，垸基、氧代垸基、卤代烷基。上述化合物可以用于制备一种广谱的抗器官或组织纤维化的药物。

本发明中，所谓"抗器官或组织纤维化 "是指防止器官或组织中纤维化的产生，阻止器官或组织中纤维化的发展，或 /和逆转器官或组织中已经形成的纤维化。

其中，优选 n=l时， R=F、 Br、 I;

当 n=2时， R=F、 Cl、 Br、 I，饱和直链烃基，氧代饱和直链烃基、卤代饱和直链烃基； R取代基在苯环上的位置具有邻位、间位或对位。

最优选氟原子的位置为间位（即 3-氟取代）。

本发明所涉及的垸基是指直链或支链的具有 1-6个碳原子数的垸基，优选 1-4个碳原子。

根据本发明，可优选的化合物还包括下列化合物：

式 (I)的 1-取代苯基 -5-甲基 -2 (1H) 吡啶酮中， n= l， R = B_r，如：

1- ( 2-溴苯基） -5-甲基 -2- (1H)吡啶酮；

1- (3-溴苯基） -5-甲基 -2- (1H)卩比啶酮；

1- (4-溴苯基） -5-甲基 -2- (1H)吡啶酮；或

式 (I)的 1-取代苯基 -5-甲基 -2 (1H) 吡啶酮中， n= l， R=F，如：

1- (2-氟苯基） -5-甲基 -2- (1H)吡啶酮；

1- (3-氟苯基） -5-甲基 -2- (1H)吡啶酮；

1- (4-氟苯基） -5-甲基 -2- (1H)吡啶酮；或

式 (I)的 1-取代苯基 -5-甲基 -2 (1H)吡啶酮中， n= l， R=I，如：

1- (2-碘苯基） -5-甲基 -2- (1H)吡啶酮；

1- (3-碘苯基） -5-甲基 -2- (1H)卩比啶酮；

1- (4-碘苯基） -5-甲基 -2- (1H)吡啶酮；或

式 (I)的 1-取代苯基 -5-甲基 -2 (1H) 吡啶酮中， n=2， R=F、 Br或 Cl，如：

1- (2,3-二溴苯基） -5-甲基 -2- (1H)吡啶酮； 1- (2，4-二溴苯基） -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1- (2，5-二溴苯基） -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1- (2,6-二溴苯基) -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1- (3，4-二溴苯基） -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1- (3,5-二溴苯基） -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1- (2,3-二氯苯基） -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1- (2,4-二氯苯基） -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1- (2,5-二氯苯基) -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1- (2,6-二氯苯基） -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1- (3,5-二氯苯基） -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1- (2,3-二氟苯基） -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1- (2,4-二氟苯基） -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1- (2,5-二氟苯基） -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1- (2,6-二氟苯基） -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1- (3,5-二氟苯基) -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；或

式 (I)的 1-取代苯基 -5-甲基 -2 (1H) 吡啶酮中， n=l或 2， R=三氟甲基，如：

1- (2-三氟甲基苯基） -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1- (4-三氟甲基苯基） -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1- (2,3-三氟甲基苯基） -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1- (2,4-三氟甲基苯基） -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1- (2,5-三氟甲基苯基) -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1- (2,6-三氟甲基苯基) -5-甲基_2- (1H) 吡啶酮；

1- (3,4-三氟甲基苯基) -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1- (2,5-三氟甲基苯基) -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；或

式 (I)的 1-取代苯基 -5-甲基 -2 (1H) 吡啶酮中， n=l或 2， R =甲基，如-

1- (2-甲基苯基） -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1- (3-甲基苯基) -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1- (2,3-二甲基苯基） -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1- (2,4-二甲基苯基） -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1- (2,5-二甲基苯基） -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1- (2,6-二甲基苯基） -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1- (3,4-二甲基苯基) -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1- (2,5-二甲基苯基) -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；或

式 (I)的 1-取代苯基 -5-甲基 -2 (1H) 吡啶酮中， n=l或 2， R =甲氧基，如：

1- (2-甲氧基苯基） -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1- (3-甲氧基苯基） -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1- (2，3-二甲氧基苯基） -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1- (2,4-二甲氧基苯基） -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1- (2,5-二甲氧基苯基） -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1- (2，6-二甲氧基苯基） -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1- (3,4-二甲氧基苯基） -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1- (3,5-二甲氧基苯基） -5_甲基 -2- (1H) 吡啶酮。

根据本发明提供的实施例，优选用于制备抗肾间质纤维化、抗肾小球硬化、抗肝纤维化、抗肺纤维化、抗腹膜纤维化、抗心肌纤维化、抗皮肤纤维化、抗手术后粘连、抗良性前列腺肥大症、抗骨骼肌纤维化、抗硬皮病、抗阿尔茨海默病或抗血管纤维化疾病的药物。

根据本发明的实施例，通式（I)的化合物优选用于制备治疗由于血吸虫病引起的肝纤维化的药物。

根据本发明的实施例，通式（I) 的化合物优选用于制备治疗由于糖尿病引起的肾小球硬化的药物。

根据本发明的实施例，通式（I) 的化合物优选用于制备治疗由于输尿管梗阻或糖尿病引起的肾间质纤维化的药物。

本发明公开的式（I) 化合物给药方式为所说的化合物口服、注射或外用给药；或与药用辅料及其它药物做成适当的形式给药。

本发明对各种导致器官或组织纤维化的 ECM产生细胞进行细胞实验，同时还对各类纤维化疾病的动物模型进行了实验。结果表明， 1- (取代苯基） -5-甲基 -2- ( 1H) 吡卩雄格种 ECMJ^^BW 搞f乍用，域作用徘尼酮。 Hitb,蘭 ^ W作为帝観器官或组织 ^i^tt W r活 ¾)^。具体实施例

本发明中以 1- (3-氟苯基） -5-甲基- 2- ( 1H) PtUM¾WJ l- (取代基苯基） - 5 - 甲基- 2- ( 1H) ι- (3-氟苯基） -5-甲基- 2- ( IH)

Ptte»T按中国专利 ZL02114190.8中公开的方法制备。实施例 1

1- (3-氟苯基） -5-甲基 -2- ( 1H) m (錦圆， AKF-PD)与 t徘尼酮 (pirfenidone, pro)抑制小鼠肾小球系膜细胞增殖的作用比较，用噻唑蓝（Μττ)方法检测。细胞用含 10%小牛血清的 DMEM培养基常规培养，将细胞制成 IxlOVml的细胞悬液，每孔 lOOul接种于％孔板中。待细胞贴壁后换无血清 DMEM培养基， 24小时后弃去无血清培养基，换含不同浓度氟非尼酮和吡非尼酮的含 10%小牛血清的培养基，每个浓度设 5 个复孔。分别于加药后 8、 20、 44小时后，每孔加 MTTlOul, 4小时后将 MTT吸出，每孔加 MTT溶解液 100ul， 15min后待 MTT完全溶解，酶标仪 570nm测 OD值。结果见表 1。表 1 饀呢 S^P排尼醇孙鼠肾小球系膜细胞的影响

组别各时间点光密度值

12h 24h 48h 对照组 0. 363 ±0. 002 0. 591 ±0. 002 0. 851 ±0. 009 氟非尼酮 10(^g/ml 0. 368 ±0, 003 0. 594±0. 003 0. 812±0. 002* 氟非尼酮 50(^g /ml 0. 363 ±0. 002 0. 579±0. 001* 0. 675 ±0. 006** 氟非尼酮 100(^g /ml 0. 361 ±0. 002 0. 557±0. 002** 0. 583 ±0. 005*** 氟非尼酮 2500μ_ε /ιη1 0. 355±0. 002 0. 541 + 0. 002*** 0. 552 + 0. 004*** 吡非尼酮 10(^g /ml 0. 362 ±0. 003 0. 591 ±0. 002 0. 830±0. 003*⁺ 吡非尼酮 50(^g /ml 0. 360±0. 003 0. 590±0. OOl^ 0. 707 ±0. 002**" 吡非尼酮 lOOO g /ml 0. 362±0. 002 0. 565 ±0. 001***⁺⁺ 0. 599 + 0. 004***+ 吡非尼酮 250(^g /ml 0. 362 ±0. 002+ 0. 548 + 0. 002***+ 0. 559 + 0. 002***

*p<0.05 vs对照组 **p<0.01 vs对照组 ***p<0.001 vs对照组

⁺p<0.05 vs氟非尼酮 ⁺⁺p<0.01 vs 氟非尼酮 ^p^.001 vs 氟非尼酮

在 24小时，氟非尼酮 500 g/ml能抑制小鼠肾小球系膜细胞的增殖，而吡非尼酮 500 μ g/ml 不能抑制小鼠肾小球系膜细胞的增殖； 1000 μ g/ml、 2500 μ g/ml 的氟非尼酮和吡非尼酮均能抑制小鼠肾小球系膜细胞的增殖，但氟非尼酮 1000 w g/ml、 2500 μ g/ml的作用强于同等剂量的 pirfenidone。在 48小时， 100 u g/ml、 500 g/mK 1000 g/ml、 2500 μ g/ml氟非尼酮和吡非尼酮均能抑制小鼠肾小球系膜细胞的增殖，但氟非尼酮在 100 μ g/ml、 500 μ g/m 1000 μ g/ml的作用强于同等剂量的 pirfenidone。

结论：氟非尼酮能抑制小鼠肾小球系膜细胞的增殖，且其作用强于 pirfenid_0ne。实施例 2

1- (3-氟苯基） -5-甲基 -2- cm) mm mmwi 与!: I≡尼顧脚制大鼠心肌成纤维细胞增殖的作用比较，用噻唑蓝（MTT)方法检测。细胞用含 10%小牛血清的 DMEM培养基常规培养，将细胞制成 lxl0⁵/ml的细胞悬液，每孔 lOOul接种于 96孔板中。待细胞贴壁后换无血清 DMEM培养基， 24小时后弃去无血清培养基，换含不同浓度氟非尼酮和吡非尼酮的含 10%小牛血清的培养基，每个浓度设 5个复孔。分别于加药后 8、 20、 44小时后，每孔加 MTTlOul, 4小时后将 MTT吸出，每孔加 MTT溶解液 100ul， 15min 后待 MTT完全溶解，酶标仪 570nm测 OD值。结果见表 2。

表 2 鏰呢諮 Pt悱尼酮¾^鼠心肌成纤维细胞的影响

组别各时间点光密度值

12h 24h 48h

对照组 0.330±0. 002 0.445 ±0. 016 0.684±0. 008

氟非尼酮 100 ug/ml 0.328±0. 010 0.426 ±0. 006* 0.620±0. 018*** 氟非尼酮 500 ug/ml 0.326 ±0. 003 0.408±0. 009** 0.580±0. 014*** 氟非尼酮 1000 ug/ml 0.332±0. 006 0.392±0. 008** 0.538±0. 009*** 氟非尼酮 2500 ug/ml 0.325 + 0. 008 0.377±0. 013*** 0.514±0. 005*** 吡非尼酮 100 ug/ml 0.330±0. 014 0.429±0. 009* 0.654±0. 007*+ 吡非尼酮 500 ug/ml 0.329±0. 013 0.411 ±0. 006* 0.612±0. 014***w 吡非尼酮 1000ug/ml 0.331 ±0.009 0.403 ±0.010**+ 0.597±0.013*** 吡非尼酮 2500 ug/ml 0.329±0.008 0.392±0.009**⁺ 0.566±0.027**

*p<0.05 vs对照组 **p<0.01 vs对照组 ***p<0.001 vs对照组

+p<0.05 vs氟非尼酮 "^ρΟ.ΟΙ vs氟非尼酮 "^ρΟ.ΟΟΙ vs氟非尼酮在 24小时， 100 μ g/ml 500 μ g/ml 1000 μ g/ml 2500 μ g/ml氟非尼酮和吡非尼酮均能抑制大鼠心肌成纤维细胞的增殖，但氟非尼酮 1000 g/ml 2500μ g/ml的作用强于同等剂量的吡非尼酮；在 48小时， ΙΟΟμ g/ml 500μ g/ml 1000μ g/ml 2500 μ g/ml 氟非尼酮和吡非尼酮均能抑制大鼠心肌成纤维细胞的增殖，但氟非尼酮 100wg/ml 500μ g/ml 1000 μ g/ml的作用强于同等剂量的吡非尼酮。

结论：氟非尼酮能抑制大鼠心肌成纤维细胞的增殖，且其作用强于吡非尼酮。实施例 3

1- (3-氟苯基） -5-甲基 -2- (1H) f¾ (t^尼酮）与^ μ尼酣 Φ制人肝星状细胞增殖的作用比较，用噻唑蓝（ΜΤΤ)方法检测。细胞用含 10%小牛血清的 DMEM培养基常规培养，将细胞制成 lxl0⁵/ml的细胞悬液，每孔 lOOul接种于 96孔板中。待细胞贴壁后换无血清 DMEM培养基， 24小时后弃去无血清培养基，换含不同浓度氟非尼酮和吡非尼酮的含 10%小牛血清的培养基，每个浓度设 5个复孔。分别于加药后 8 20 44 小时后，每孔加 MTTlOul, 4小时后将 MTT吸出，每孔加 MTT溶解液 lOOul, 15min 后待 MTT完全溶解，酶标仪 570nm测 OD值。结果见表 3

表 3 m m mm对人肝星状细胞的影响

组别各时间点光密度值

*p<0.05 vs对照组 **p<0.01 vs对照组 ***p<0.001 vs对照组

⁺p<0.05 vs 氟非尼酮 ^ρΟ.ΟΙ vs 氟非尼酮 "^ρΟ.ΟΟΙ vs氟非尼酮

500 g/mK 1000 g/mK 2500 g/ml 的氟非尼酮和吡非尼酮均能抑制人肝星状细胞的增殖；但 24小时氟非尼酮 1000 g/ml、 2500 g/ml的作用强于同等剂量的吡非尼酮， 48小时氟非尼酮 500 μ g/ml、 1000 μ g/ml、 2500 μ g/ml的作用强于同等剂量的 pirfenidone。

结论：氟非尼酮能抑制人肝星状细胞的增殖，且其作用强于吡非尼酮。实施例 4

1- (3-氟苯基） -5-甲基 -2- ( 1H)啲 (鎖呢酮）与 t徘尼酮肿制大鼠肺成纤维细胞增殖作用的比较，用噻唑蓝（MTT)方法检测。细胞用含 10%小牛血清的 DMEM培养基常规培养，将细胞制成 lxl0⁵/ml的细胞悬液，每孔 lOOul接种于 96孔板中。待细胞贴壁后换无血清 DMEM培养基， 24小时后弃去无血清培养基，换含不同浓度氟非尼酮和吡非尼酮的含 10%小牛血清的培养基，每个浓度设 5个复孔。分别于加药后 8、 20、 44小时后，每孔加 MTTlOul, 4小时后将 MTT吸出，每孔加 MTT溶解液 100ul， 15min 后待 MTT完全溶解，酶标仪 570nm测 OD值。结果见表 4。表 4 鎖^尼酮与 Ptl?jf≡尼酮对大鼠肺成纤维细胞的影响

各时间点光密度值

*p<0.05 vs对照组 **p<0.01 vs对照组 ***p<0.001 vs对照组

+p<0.05 vs氟非尼酮 ^ρΟ.ΟΙ vs氟非尼酮 ^ ρΟ.ΟΟΙ vs氟非尼酮

在 24小时，氟非尼酮 1000 u g/ml能抑制大鼠肺成纤维细胞的增殖，氟非尼酮 2500 g/ml和吡非尼酮 2500 g/ml均能抑制大鼠肺成纤维细胞的增殖，但氟非尼酮 2500 μ g/ml的作用强于同等剂量的吡非尼酮。在 48小时， 500 μ g/ml、 ΙΟΟΟ μ g/ml、 2500 y g/ml 的氟非尼酮和吡非尼酮均能抑制大鼠肺成纤维细胞的增殖，但氟非尼酮 500 μ g/ml、 1000 μ g/ml的作用强于同等剂量的吡非尼酮。结论：氟非尼酮能够抑制肺成纤维细胞的增殖，且其作用强于吡非尼酮。实施例 5

1- (3-氟苯基） -5-甲基 -2- c m) 卩 (mmm 与 i≡尼酮抑制人皮肤疤痕成纤维细胞增殖作用的比较，用噻唑蓝（MTT)方法检测。细胞用含 10%小牛血清的 DMEM 培养基常规培养，将细胞制成 lxl0⁵/ml的细胞悬液，每孔 lOOul接种于 96孔板中。待细胞贴壁后换无血清 DMEM培养基， 24小时后弃去无血清培养基，换含不同浓度氟非尼酮和吡非尼酮的含 10%小牛血清的培养基，每个浓度设 5个复孔。分别于加药后 8、 20、 44小时后，每孔加 MTTlOul, 4小时后将 MTT吸出，每孔加 MTT溶解液 100ul， 15min后待 MTT完全溶解，酶标仪 570nm测 OD值。结果见表 5。

表 5 mm mmm对人皮肤疤痕成纤维细胞的影响

各时间点光密度值

*p<0.05 vs对照组 **p<0.01 vs对照组 ***p<0.001 vs对照组

+p<0.05 vs 氟非尼酮 ^ρΟ.ΟΙ vs氟非尼酮 ρθ.001 vs 氟非尼酮

在 24小时， 100 μ g/ml、 500 u g/ml、 1000 μ g/ml、 2500 μ g/ml的氟非尼酮和吡非尼酮均能抑制人皮肤疤痕成纤维细胞的增殖，但氟非尼酮 500 g/ml、 1000 g/mK 2500 μ g/ml的作用强于同等剂量的吡非尼酮。在 48小时，氟非尼酮 500 g/ml、 1000 μ g/ml的作用强于同等剂量的吡非尼酮。

结论：氟非尼酮能抑制人皮肤疤痕成纤维细胞的增殖，且其作用强于吡非尼酮。实施例 6

1- (3-氟苯基） -5-甲基 -2- c m) mm m m 与 ¾i≡尼酮肿制人腹膜间皮细胞增殖作用的比较，用噻唑蓝（MTT)方法检测。细胞用含 10%小牛血清的 DMEM培养基常规培养，将细胞制成 lxl0⁵/ml的细胞悬液，每孔 lOOul接种于 96孔板中。待细胞贴壁后换无血清 DMEM培养基， 24小时后弃去无血清培养基，换含不同浓度氟非尼酮和吡非尼酮的含 10%小牛血清的培养基，每个浓度设 5个复孔。分别于加药后 8、 20、 44小时后，每孔加 MTTlOul, 4小时后将 MTT吸出，每孔加 MTT溶解液 100ul， 15min 后待 MTT完全溶解，酶标仪 570nm测 OD值。结果见表 6。

表 6 ^尼！悱尼酮对人腹膜间皮细胞的影响

各时间点光密度值

*p<0.05 vs对照组 **p<0.01 vs对照组 ***p<0.001 vs对照组

⁺p<0.05 vs 氟非尼酮 ""pO.Ol vs 氟非尼酮 "^ pO.001 vs氟非尼酮

在 24小时， 500 g/ml、 1000 u g/mK 2500 u g/ml的氟非尼酮和吡非尼酮均能抑制人腹膜间皮细胞的增殖，氟非尼酮 1000 u g/ml、 2500 u g/ml的作用强于同等剂量的吡非尼酮；在 48小时，氟非尼酮 1000 g/ml抑制人腹膜间皮细胞增殖的作用强于同等剂量的吡非尼酮。

结论：氟非尼酮能够抑制人腹膜间皮细胞的增殖，且其作用强于吡非尼酮。注：上述实验所用细胞除心肌成纤维细胞、皮肤疤痕成纤维细胞和腹膜间皮细胞是用已知的方法进行原代培养获得外，其他细 '胞均有商品化产品可供购买。以下实施例为 1- (3-氟苯基） -5-甲基 -2- ( 1H) 吡啶酮（I) 化合物（氟非尼酮）对各种纤维化动物模型所进行的实验。其中，该化合物与 5%的羧甲基纤维素钠溶液配制成悬浊液给药。实施例 7

氟非尼酮抗肾小球硬化和肾间质纤维化的动物实验研究

1. 实验方法：

选择用链脲佐菌素制造的 wistar大鼠糖尿病肾病模型，观察氟非尼酮抗肾小球硬化和肾间质纤维化的效果。 Wistar大鼠（8周龄、雄性、体重 180g~220g)，随机分正常组、糖尿病肾病模型组、糖尿病肾病缬沙坦组、糖尿病肾病氟非尼酮组

糖尿病大鼠模型制备釆用链脲佐菌素 (STZ) 55mg/kg一次性腹腔注射法。

24小时后，空腹血糖维持在 13. 9mmol/L,或随机血糖 16. 7醒 ol/L以上,尿糖阳性，则糖尿病模型建立。 4 周后糖尿病大鼠肾病（尿蛋白〉 30mg/d) 则糖尿病大鼠肾病模型成立。氟非尼酮千预组（氟非尼酮 500mg/kg. d，灌胃）、缬沙坦药物干预组（缬沙坦 30mg/Kg. d)、糖尿病模型组予等量生理盐水灌胃。药物连续干预 12周后，将大鼠全部处死取肾脏。

肾小球和肾小管间质损伤评分标准：参照： Radford MG Jr, Donadio JV Jr， Bergstralh EJ, et al. Predicting renal outcome in IgA nephropathy . J Am Soc Nephrol 1997, 8 (2) : 199-207. 和赵雅妮，李惊子，王海燕等，血管紧张素 II受体拮抗剂与血管紧张素转换酶抑制剂抗大鼠肾脏纤维化的作用及机制探讨，中华老年多器官疾病杂志， 2002； 1 ( 1 ): 36-40. 2. 实验结果：

肾组织显微镜检查结果: 表 7 各组肾小球和肾小管间质损伤指数比较

组别例数肾小球损伤指数肾小管间质损伤指数氟非尼酮组 5 1.29+-0.18 2.20+-0.14

缬沙坦组 8 1.36+-0.24 3.12+-0.64

糖尿病肾病模型组 9 1.63+-0.33 3.33+-0.54

正常组 5 0.21+-0.04 0.48+-0.14 3. 结论：

氟非尼酮组大鼠肾脏的肾小球及肾小管间质病变较糖尿病肾病模型组的大鼠肾脏病变明显减轻。说明，氟非尼酮能有效治疗糖尿病肾病的肾小球硬化和肾间质纤维化。实施例 8

氟非尼酮抗肺纤维化的动物实验研究

1. 实验方法：

选择用博莱霉素制造的 SD大鼠肺纤维化模型，观察氟非尼酮抗肺纤维化的效果。

Sprague- Dawley (6- 8周龄,雄性大鼠，体重 180g~220g )，常规条件下喂养。将大鼠随机分为 3组：氟非尼酮干预组，模型组，假手术组。

对氟非尼酮组、模型组大鼠用博莱霉素按 6 mg/kg /4ml生理盐水气管内缓慢注入，对假手术组大鼠用等量生理盐水气管内缓慢注入。

氟非尼酮组 (氟非尼酮 500mg/kg)，在手术前 2天至术后 27天每日灌胃 1次；模型组、假手术组用等量生理盐水在手术前 2天至术后 27天每日灌胃 1次。术后 27天处死大鼠取肺组织。肺组织显微镜检查（HE染色)：

肺纤维化评分标准：参考： Szapiel SV, El son NA, Fulmer JD, Hunninghake GW， Crystal RG. Bleomycin- induced interstitial pulmonary disease in the nude, athymic mouse. Am Rev Respir Dis. 1979 Oct ; 120 (4) :893-9.

2. 实验结果：

肺组织显微镜检查结果：

表 8 各组肺纤维化程度比较

3. 结论: 氟非尼酮组大鼠的肺纤维化病变较模型组明显减轻，说明，氟非尼酮能有效治疗肺纤维化疾病。实施例 9

氟非尼酮抗肝纤维化的动物实验研究 1. 实验方法：

选择用血吸虫尾蚴感染制造的昆明小鼠血吸虫病肝纤维化模型，观察氟非尼酮抗肝纤维化的效果。

昆明小鼠（4-6周龄、雄性、体重 18-22g)，随机分正常组、感染组、吡喹酮组、 Y -干扰素组、氟非尼酮组。用 10条血吸虫尾蚴感染小鼠腹部除毛部位。各组在感染尾蚴 8周后，用吡喹酮（共 650mg/kg,分 4天，）杀虫。杀虫后，氟非尼酮组小鼠每天给予氟非尼酮（500 mg/kg) 灌胃； Y -干扰素组小鼠每天给予干扰素 5万单位肌注；吡喹酮组及单纯感染组小鼠给予等量生理盐水每日灌胃 1次；连续用药 8周后，停药一周，再处死小鼠取肝左叶做病理检査。

肝组织切片 HE染色检査，由于血吸虫尾蚴感染 16周后，肝脏血吸虫虫卵结节面积反映血吸虫肝纤维化的程度，用 HPIAS- 1000髙清晰度彩色病理图文分析系统检查血吸虫虫卵结节面积，分析每张切片典型的多卵和少卵结节各五个，计算虫卵结节面积。 2. 实验结果：

表 10肝组织血吸虫虫卵结节面积（Mm²) 比较

肝组织血吸虫虫卵结节面积（Mm²) 比较的 P值

3. 结论：

氟非尼酮组血吸虫虫卵结节面积较单纯感染组和单纯吡喹酮治疗组小。说明，氟非尼酮能有效治疗血吸虫病肝纤维化。实施例 10

氟非尼酮抗肾间质纤维化的动物实验研究

1 . 实验方法：

选择用单侧输尿管结扎肾间质纤维化 SD大鼠模型，观察氟非尼酮抗肾间质纤维化的效果。

SD大鼠（8周龄、雄性、体重 180g~220g)，随机分为 4组：假手术组，模型组，依那普利组（依那普利， 10mg/kg.d，），氟非尼酮组（氟非尼酮， 500mg/kg.d)。

除假手术组大鼠外，其他三组大鼠均在无菌条件下行左侧输尿管结扎术。术前器械消毒，假手术组大鼠除不结扎、不剪断输尿管外，所有处理同前。依那普利组和氟非尼酮组，于手术前 1天灌胃给药至手术后 14天，模型组和假手术组以等量生理盐水灌胃至手术后 14天。手术后 14天处死大鼠，留取左侧梗阻肾标本，行 HE染色检查。

肾组织肾小管间质损伤评分标准：参照： Radford MG Jr, Donadio JV Jr, Bergstralh EJ, et al. Predicting renal outcome in IgA nephropathy . J Am Soc Nephrol 1997, 8(2): 199-207. 2. 实验结果：各组大鼠左侧肾脏肾小管间质损伤指数结果

表 12 各组大鼠左侧肾脏镜下肾间质损伤指数的比较

组别假手术组模型组依那普利组無非尼翻 3组

(n=9) (n=8) 肾间质损伤指数 1. 33±0. 58 10. 24±0. 99 9. 21 ±0. 64 6, 43± 1. 28

3. 结论:

氟非尼酮组的肾间质损伤指数较模型组、依那普利组低，说明，氟非尼酮能有效

II

治疗肾间质纤维化。 o

实施例 11

1- (3-氟苯基） -5-甲基- 2 ( 1H) 吡啶酮口服给药急性毒性试验。

1、试验动物

昆明种小鼠（KM) 50只，雌雄各半11，D C体重 18g〜22g。由中南大学湘雅医学院实验动物学部提供。 '

2、试验方法

取健康 KM小鼠 50只，随机分成 5组，每组 10只，雌雄各半，给药前禁食 12h，不禁水。按 20ml/kg体重灌胃给药，剂量组距比为 1:0.65，给药剂量为 1071mg/kg〜 6000mg/kg，给药后常规伺养，观察一次给药后 14天内小鼠急性毒性反应及死亡情况，并对死亡动物进行解剖，肉眼观察各脏器变化。

3、结论

LD_5G及 95%可信限计算。

用 Bliss 方法计算， LD_5Q 为 2979.89mg/kg， 95%可信限为 2402.70mg/kg〜 3695.73mg/kg, 结果见表 13。表 13 小鼠口服 1- (3-氟苯基） ■ -5-甲基 -2 ( 1H) 吡啶酮急性毒性试验结果剂量对数剂量动物数死亡数死亡率 LDso及 95%可信限

(mg/kg) (X) (只） (只） (%) (mg/kg)

6000. 0 3. 7782 10 9 90

3900. 0 3. 5911 10 7 70

2535. 0 3. 4040 10 4 40 2979. 89

1647. 8 3. 2169 10 1 10 (2402. 70〜3695. 73)

1071. 0 3. 0298 10 0 0 小鼠一次灌胃 1- (3-氟苯基） -5-甲基 -2 ( 1H)吡啶酮， LD₅₀为 2979.89mg/kg， 95% 可信限为 2402.70mg/kg〜3695.73mg/kg。与文献报道的吡非尼酮的急性毒性结果 1112 mg/kg (《药学服务与研究》 2005.3： 5 ( 1 )： 4823 )、 997.7 mg/kg ( US5310562)相比，本发明中所用的氟非尼酮毒性较小。

Claims

权利要求

1. 1- (取代苯基） -5-甲基 -2- (1H) 卩¾定酮（I)化合物用于制备抗器官或组织纤维化的药物的应用；

当 n=l时，所述的取代基 R表示 F、 Cl、 Br、 I、硝基、垸基、氧代烷基、卤代垸当 n=2时，所述的取代基 R表示 F、 Cl、 Br、 I，烷基、氧代垸基、卤代烷基。

2、根据权利要求 1所述的化合物在制备抗器官或组织纤维化药物的应用，其特征在于其中当 n=l时， R=F、 Br、 I；当 n=2时， R=F、 Cl、 Br、 I, 饱和直链烃基，氧代饱和直链烃基、卤代饱和直链烃基； R取代基在苯环上的位置具有邻位、间位或对位。
3、根据权利要求 2所述的化合物在制备抗器官或组织纤维化药物的应用，其特征在于: 式 (I)的 1 -取代苯基 -5-甲基 -2 (1H) 吡啶酮中， n= l， R = Br，如：

1 - ( 2-溴苯基） -5-甲基 -2- (1H) Π比啶酮；

1 - ( 3-溴苯基） -5-甲基 -2- (1H) 卩比啶酮；

1 - ( 4-溴苯基） -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；或

式 (I)的 1-取代苯基 -5-甲基 -2 (1H) 吡啶酮中， n= l， R=F，如：

1 - ( 2-氟苯基） -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1 - ( 3-氟苯基） -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1 - ( 4-氟苯基） -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；或

式 (I)的 1 -取代苯基 -5-甲基 -2 (1H) 吡啶酮中， n= l， R=I, 如：

1 - ( 2-碘苯基） -5-甲基 -2- (1H) 口比啶酮；

1 - ( 3-碘苯基） -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1 - ( 4-碘苯基） -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；或

式 (I)的 1 -取代苯基 -5-甲基 -2 (1H) 吡啶酮中， n= 2 , R=F、 Br或 Cl，如：

1 - (2,3-二溴苯基） -5 -甲基 -2 (1H) 吡啶酮;

1 - (2,4-二溴苯基） -5 -甲基 -2- (1H) 吡啶酮;

1 - (2,5-二溴苯基） -5 -甲基 -2- (1H) 吡啶酮;

1 - (2,6-二溴苯基） -5 -甲基 -2- (1H) 吡啶酮;

1 - (3,4-二溴苯基） -5 -甲基 -2- (1H) 吡啶酮;

1- (3,5-二溴苯基） -5 -甲基 -2- (1H) 吡啶酮;

1 - (2,3-二氯苯基） -5 -甲基 -2- (1H) 吡啶酮;

1 - (2,4-二氯苯基） - 5 -甲基 -2- (1H) 吡啶酮;

1 - (2,5-二氯苯基） -5 -甲基 -2- (1H) 吡啶酮;

1 - (2,6-二氯苯基） -5 -甲基 -2- (1H) 吡啶酮;

1 - (3,5-二氯苯基） -5 -甲基 -2_ (1H) 吡啶酮; 1- (2,3-二氟苯基) -5-甲基 -2- (1H)吡啶酮;

1- (2,4-二氟苯基） -5-甲基 -2- (1H)吡啶酮；

1- (2，5-二氟苯基） -5-甲基 -2- (1H)吡啶酮；

1- (2,6-二氟苯基） -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1- (3,5-二氟苯基） -5-甲基 -2- (1H)吡啶酮；或

式 (I)的 1-取代苯基 -5-甲基 -2 (1H)吡啶酮中， n=l或 2， R=三氟甲基，如：

1- (2-三氟甲基苯基) -5-甲基 -2- (1H)吡啶酮；

1- (4-三氟甲基苯基） -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1- (2,3-三氟甲基苯基） -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1- (2,4-三氟甲基苯基） -5-甲基 -2- (1H)吡啶酮；

1- (2,5-三氟甲基苯基) -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1- (2,6-三氟甲基苯基） -5-甲基 -2- (1H)吡啶酮；

1- (3，4-三氟甲基苯基) -5國甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1- (2,5-三氟甲基苯基） -5-甲基 -2- (1H)吡啶酮；或

式 (I)的 1-取代苯基 -5-甲基 -2 (1H)吡啶酮中， n=l或 2， R =甲基，如：

1- (2-甲基苯基） -5-甲基 -2- (1H)吡啶酮；

1- (3-甲基苯基） -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1- (2,3-二甲基苯基） -5-甲基 -2- (1H)吡啶酮；

1- (2,4-二甲基苯基） -5-甲基 -2- (1H)吡啶酮；

1- (2,5-二甲基苯基） -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1- (2，6-二甲基苯基) -5-甲基 -2- (1H)吡啶酮；

1- (3，4-二甲基苯基) -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1- (2,5-二甲基苯基) -5-甲基國2- (1H)吡啶酮；或

式 (I)的 1-取代苯基 -5-甲基 -2 (1H)吡啶酮中， n=l或 2， 11 =甲氧基，如：

1- (2-甲氧基苯基） -5-甲基 -2- (1H)吡啶酮；

1- (3-甲氧基苯基） -5-甲基 -2- (1H)吡啶酮；

1- (2，3-二甲氧基苯基） -5-甲塞 -2- (1H)吡啶酮；

1- (2,4-二甲氧基苯基） -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1- (2,5-二甲氧基苯基） -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1- (2,6-二甲氧基苯基） -5-甲基 -2- (1H)吡啶酮；

1- (3,4-二甲氧基苯基） -5-甲基 -2- (1H) 吡啶酮；

1- (3,5-二甲氧基苯基） -5-甲基 -2- (1H)吡啶酮。 '
4、根据权利要求 3所述的化合物在制备抗器官或组织纤维化药物的应用，其特征在于优选 R为 3 -氟。
5、根据权利要求 1或 2所述的化合物在制备抗器官或组织纤维化药物中的应用，其特征在于所说的垸基是直链或支链的具有 1-6个碳原子数的烷基，优选 1-4个碳原子。 6、根据权利要求 1至 5之一所述的应用，其特征在于所说的纤维化是肾小球硬化、肾间质纤维化、肝纤维化、肺纤维化、腹膜纤维化、心肌纤维化、皮肤纤维化、手术后粘连、良性前列腺肥大症、骨骼肌纤维化、硬皮病、阿尔茨海默病、血管纤维化疾病。 7、根据权利要求 6所述的应用，其特征在于所说的肾小球硬化是由于糖尿病引起的病变。
8、根据权利要求 6所述的应用，其特征在于所说的肾间质纤维化是由于输尿管梗阻或糖尿病引起的病变。
9、根据权利要求 6所述的应用，其特征在于所说的肝纤维化是由于血吸虫病引起的病变。
10、根据权利要求 1~9之一所述的应用，其特征在于给药方式为所说的化合物口服、注射或外用给药；或与药用辅料及其它药物做成适当的形式给药。