CN1945310A - 筛选中药抗血小板聚集作用活性成分的细胞膜固相色谱法模型的建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种筛选中药抗血小板聚集作用活性成分的细胞膜固相色谱法模型的建立方法，该方法包括如下步骤：待筛选中药姜油树脂供试液指纹图谱的建立；鸡血小板悬液的分离；血小板细胞膜固相化待筛选中药姜油树脂供试液中的效应成分；未结合成分的洗脱；血小板固相化姜油树脂中活性成分的解离；血小板固相化活性成分解离液的HPLC色谱分析。本发明用鸡血小板固相色谱技术作为抗血栓药物初筛的细胞模型，来源丰富、成本低，可以对具有抗血小板聚集作用的中药进行活性成分筛选，具有良好的应用前景。

Description

筛选中药抗血小板聚集作用活性成分的细胞膜固相色谱法模型的建立方法

                        技术领域

本发明属于中药活性成分筛选及作用机理研究领域，特别涉及一种筛选中药抗血小板聚集作用(抗血栓作用)活性成分的细胞膜固相色谱法模型的建立方法。

                        背景技术

传统的中药活性成分的研究模式，即对中药进行提取、分离纯化单一成分和药效验证模式，存在工作量巨大，研究周期长，且不能全面反应中药多成分、多靶点和整合作用的特点，使得中药药效物质基础研究一直进展缓慢。

细胞膜固相色谱技术(Cell Membrane Immobilized Chromatography，CMIC)，是一种新型生物亲和色谱技术，克服了以往先从中药中分离有效部位或单体，再分析其药效，从而使成分分离与效应筛选脱节的弊端，是一种化学成分—效应—作用机理联动的药物研究方法。

CMIC是在细胞膜色谱法(Cell Membrane Chromatography，CMC)的基础上发展起来的，两者均属于新型的生物亲和色谱技术。CMC是将人或动物的活性组织细胞膜固定在特定载体表面，制备成细胞膜固定相，通过紫外在线检测被分析成分在细胞膜固定相上的保留特性，所得色谱参数与药物和膜及膜受体特异性结合密切相关，已成功用于多种中药的活性成分筛选，如用不同组织制备的CMC模型筛选了淫羊藿、红毛七、太白花、川芎等中药中的活性成分，为创新中药物质基础研究奠定了基础。

但有研究者认为，用CMC研究中药的活性成分，细胞膜包被硅胶的包被率和柱内硅胶的均匀度较难控制，特别是HPLC生物色谱柱内难以顾及到细胞膜所需要的温度、压力、离子强度及溶液pH等要求，且不能完全排除非特异性结合的问题。为了解决上述现有技术的不足之处，樊宏伟建立了血小板细胞膜固相色谱法(Platelet Membrane Immobilized Chromatography，PMIC)，利用血小板细胞膜固相化丹参注射液中的成分，得到了原儿茶醛，绿原酸类等一群化合物，该群化合物可以抗血小板聚集，认为PMIC基本可以反映化合物与细胞膜生物靶点(受体、通道、酶等)的相互作用，该体系中的保留成分和其药理作用有显著的相关性，可以进行具有抗血栓作用中药的活性成分的筛选。但利用PMIC建立筛选具有抗血栓作用的药物活性成分实验模型，整个实验过程需要大量血小板进行实验，血小板的活性对实验结果尤为关键，目前多采用猪、狗等动物的血小板进行实验，成本高，一次大量采集血小板活性难以保持。而鸡血中的血小板浓度高于哺乳类动物，功能与哺乳类动物相似且活性更强，体外易发生聚集，是理想的高活性血小板来源，但采用鸡血小板建立血小板固相色谱法模型目前未见报道。

                          发明内容

为了解决上述现有技术存在的不足之处，本发明的目的在于提供一种低成本的筛选中药抗血小板聚集作用(抗血栓作用)活性成分的细胞膜固相色谱法模型的建立方法。本发明利用鸡血小板作为建立PMIC的细胞模型，来源丰富、价格低廉，且取材方便。

本发明采用鸡血小板建立血小板固相色谱法模型，对干姜超临界CO2萃取部位——姜油树脂进行活性成分筛选及结构鉴定，通过对筛选出的成分进行药理学验证，确定了该方法的可行性，可用于其他抗血小板聚集作用(抗血栓作用)药物的活性成分筛选。

本发明建立的筛选中药抗血小板聚集作用(抗血栓作用)活性成分的细胞膜固相色谱法模型——鸡血小板细胞膜固相色谱法(Chicken ThrombocytesMembrane Immobilized Chromatography，CTMIC)，可以对具有抗血小板聚集作用(抗血栓作用)的中药进行活性成分筛选。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种筛选中药抗血小板聚集作用活性成分的细胞膜固相色谱法模型的建立方法，包括如下步骤：

(1)待筛选中药姜油树脂供试液指纹图谱的建立：精密称取5mg姜油树脂，以2％吐温-80溶解，得姜油树脂供试液，经水相滤膜滤过，滤液供HPLC分析，确定姜油树脂供试液中的共有指纹峰。

(2)鸡血小板悬液的分离：将鸡全血收集在含枸椽酸三钠的抗凝剂的塑料离心管中(血液与抗凝剂的体积比为9∶1)，再将抗凝血分装至塑料离心管中，在22℃以680转/分离心10min，吸取上层富血小板血浆(PRP)，再将PRP以2800转/分离心10min，使血小板沉淀，将血小板用pH7.4PBS洗涤后，调成10¹⁰个/ml血小板悬液。

(3)血小板细胞膜固相化待筛选中药姜油树脂供试液中的效应成分：取血小板悬液5ml加入1ml步骤(1)中配制的姜油树脂供试液，混匀后置于37℃水浴中振荡结合，使姜油树脂中活性成分充分与血小板膜受体结合。

(4非特异性结合成分)(即未结合成分)的洗脱：以2倍量22℃的pH7.4的PBS洗涤步骤(3)中的固相化效应成分后的血小板悬液，使成均匀悬液，2800转/分离心10min，弃上清液，取下层血小板洗涤，使非特异性结合成分洗脱。

(5)血小板固相化姜油树脂中活性成分的解离：向经步骤(4)洗涤后的结合有药物效应成分的血小板悬液中加入3ml pH4的PBS溶液，使成均匀悬液，置于37℃水浴中振荡30min后，2800转/分离心10min，上清液为活性成分解离液。

(6)血小板固相化活性成分解离液的HPLC色谱分析：将活性成分解离液通过固相萃取(SPE)柱，保留液过有机滤膜，氮气挥发浓缩至200μl，HPLC分析，通过比较活性成分解离液和姜油树脂指纹图谱中各吸收峰的比例，确定与血小板特异结合的特征峰，得到活性成分的特征峰。

所述与血小板特异结合的特征峰为2号峰、3号峰、4号峰、5号峰、6号峰五个特征峰，所述五个特征峰是与血小板膜靶点结合的效应成分群。

确定待筛选中药指纹图谱中各特征峰物质化学结构，所述2号峰物质为6-姜酚、3号峰物质为8-姜酚、4号峰物质为6-姜脑、6号峰物质为10-姜酚。

为了更好地实现本发明，所述步骤(1)、步骤(6)中HPLC分析条件如下：色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18150×4.6mm，5μm；色谱条件：采用梯度洗脱，流动相：A为水，B为乙腈；A+B＝100％，0～8min，55％A变为50％A；8～15min，50％A变为45％A；15～40min，45％A变为10％A；40～45min，90％B渐变至45％B(上述均为体积百分比)；流速1ml/min；柱温：25℃；DAD检测波长280nm。

步骤 (4) 根据保留液中所含成分的变化，确定在排除非特异性结合成分干扰的情况下，下层血小板优选洗涤次数为3次。

本发明与现有技术相比，其优点和有益效果在于：

1)本发明建立的鸡血小板细胞膜固相色谱法，具有细胞膜固相色谱技术的优势，即解决了传统细胞膜色谱技术中存在的“非特异性结合”和“细胞膜固定相所处的生物活性状态和色谱分析系统无法共存于同一体系内”等问题，而且取用鸡血小板固相色谱技术作为抗血栓药物初筛的细胞模型，来源丰富、成本低，可以对具有抗血小板聚集作用(抗血栓作用)的中药进行活性成分筛选，具有良好的运用前景。

2)从姜油树脂中筛选出的效应物质8-姜酚，有报道8-姜酚体外的抗血小板聚集活性(IC₅₀＝6±1μM)更优于阿司匹林(IC50＝20±11μM)，提示8-姜酚有望开发为新一代的抗血栓药物。

3)通过本发明模型从姜油树脂中筛选出的效应物质——姜酚类物质对中暑内毒素血症模型小鼠的影响，其药理作用机制是通过缓解中暑对肝脏的损伤，提高中暑内毒素血症模型小鼠腹腔巨噬细胞能量代谢水平，增强其吞噬能力，增加血浆SOD活性、减少MDA生成，对中暑内毒素血症模型小鼠有保护作用，可能是姜防治中暑的有效成分。

4)本发明建立的CMIC不仅具有细胞膜固相色谱技术的优势，如直接取用生物靶点富集的细胞膜蛋白选择性地结合(固相化)中药提取液中的活性成分，通过洗脱非特异性结合成分后，再行分离鉴定效应物质，将生物学部分与化学分析部分分开进行，能发挥特异性结合和色谱分析的各自长处，且省去了分子生物色谱中载体与受体、通道和酶等蛋白质连接的过程，节约经费和时间，尤其是有利于保持生物靶点的活性，而且利用鸡血小板建立筛选模型，较以往建立的PMIC成本低。

                        附图说明

图1为姜油树脂指纹图谱。

图2为本发明分离获得的鸡血小板瑞氏染色图。

图3为姜油树脂血小板固相膜解离液和空白对照组膜解离液，最后一次洗脱液的HPLC对照图谱。

图4为鸡血小板固相化姜油树脂供试液最后一次洗脱液的HPLC图谱。

图5为姜油树脂鸡血小板固相膜解离液与姜油树脂供试液的HPLC对照图谱。

图6为血小板膜解离液图谱(重现性)。

图7为各组小鼠血小板涂片比较图。

图8为小鼠腹腔巨噬细胞瑞氏染色图。

图9为各组肝细胞超微结构变化图。

图10为本发明鸡细胞膜固相色谱法模型实验路线图。

                       具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的介绍，但本发明的实施方式不限于此。

实施例一：筛选中药活性成分的细胞膜固相色谱法模型的建立方法

如图10所示，本发明鸡细胞膜固相色谱法模型实验路线如下：

(一)姜油树脂供试液与鸡血小板细胞膜固相化的研究与分析

(1)待筛选中药姜油树脂供试液指纹图谱的建立：精密称取5mg姜油树脂，以2％吐温-80溶解，漩涡混合器助溶得姜油树脂供试液，经0.45μm水相滤膜滤过，滤液供HPLC分析。分析条件如下：色谱柱：Agilent Zorbax EclipseXDB-C18 150×4.6mm，5μm。色谱条件：采用梯度洗脱，流动相：A为水，B为乙腈；A+B＝100％，0～8min，55％A变为50％A；8～15min，50％A变为45％A；15～40min，45％A变为10％A；40～45min，90％B渐变至45％B(上述均为体积百分比)。流速1ml/min；柱温：25℃。DAD检测波长280nm。根据参考文献的色谱条件制备的指纹图谱，精密度和稳定性均良好，图谱中各峰峰形对称，分离度好，确定姜油树脂供试液中1～8个共有指纹峰，如图1所示。

(2)鸡血小板悬液的分离：将20ml鸡全血收集在含枸椽酸三钠的抗凝剂的50ml塑料离心管中(血液与抗凝剂的体积比为9∶1)，再用塑料吸管将抗凝血分装至15ml塑料离心管中，每管6.5ml，在22℃水平冷冻离心机中以680转/分离心10min，吸取上层富血小板血浆(PRP)，再将PRP以2800转/分离心10min，使血小板沉淀，将血小板用pH7.4PBS洗涤2次后，调成5ml血小板10¹⁰个/ml悬液，如图2所示。图2(a)为瑞氏染色的鸡全血图，由图可见鸡红细胞为边缘清晰的椭圆形有核的血细胞，核深染，胞质浅染(如黑色箭头所示)。白色箭头所指为聚集成团的鸡血小板。图2(b)为瑞氏染色鸡血小板图，图2(c)为图2(b)中白色箭头所指的鸡血小板放大图，可见鸡小板细胞核为椭圆形，深染，周边有透明泡沫样膜。

(3)实验分组：试验分为姜油树脂组和空白对照组。姜油树脂组为取血小板悬液5ml加入1ml步骤(1)中配制的姜油树脂供试液，空白对照组即在血小板悬液中加入同体积的终浓度为0.3％吐温-80溶剂。由图3姜油树脂鸡血小板固相膜解离液(b)与空白对照组解离液(a)，最后一次洗脱液(c)的HPLC对照图谱可见，各组在1.2min左右均出现一杂质峰(如图3中箭头所示)，考虑为溶剂中对紫外有吸收的杂质峰。由于其出峰时间均前于姜油树脂中各主峰物质的出现，因此认为溶剂对本实验结果基本无干扰。

(4)血小板固相化姜油树脂供试液中的效应成分：取血小板悬液5ml三份，分别加入1ml步骤(1)中配制的姜油树脂供试液，混匀后置于37℃水浴中振荡结合30min，使姜油树脂中活性成分充分与血小板膜受体结合。空白对照组，则血小板悬液中加入同体积的终浓度为0.3％吐温-80溶液，余操作均相同。

(5)未结合成分(即非特异性结合成分)的洗脱：以2倍量22℃的pH7.4的PBS洗涤每份样品，每次洗涤过程中，先将管壁的姜油树脂供试液轻轻淋洗净，然后用塑料吸管轻轻地反复吹打，使成均匀悬液，2800转/分离心10min，弃上清液，取下层血小板重复洗涤，根据保留液中所含成分的变化，确定在排除非特异性结合成分干扰的情况下的最佳洗涤次数为3次。如图4为鸡血小板固相化姜油树脂供试液最后一次洗脱液的HPLC图谱，可见姜油树脂中活性成分与血小板结合后，经利用与体液pH值相当(pH＝7.4)的PBS洗涤3次，已将供试液中吸附力较弱的7号峰和8号峰成分洗脱。

(6)血小板固相化姜油树脂中活性成分的解离：向结合有药物效应成分的血小板中加入3ml pH＝4的PBS溶液，使血小板膜上效应靶点失活。用塑料吸管反复吹打使成均匀悬液，置于37℃水浴中振荡30min后，2800转/分离心10min，上清液为活性成分解离液。

(7)血小板活性成分解离液的HPLC色谱分析：将3管活性成分解离液通过经甲醇、超纯水活化的固相萃取(SPE)柱，SPE柱用0.5mI超纯水冲洗后，以1ml甲醇保留，保留液过0.45μm有机滤膜，氮气挥发浓缩至200μl，进样供HPLC分析。分析条件与指纹图谱(步骤1中)的色谱分析条件相同。通过比较解离液和姜油树脂指纹图谱中各吸收峰的比例，确定与血小板特异结合的特征峰，得到指纹图谱中2号峰、3号峰、4号峰、5号峰、6号峰五个特征峰，是与血小板膜靶点结合的效应成分群，其中3号峰、4号峰物质与血小板细胞膜结合力较强，3号峰物质是五个特征峰物质中抗血小板作用最强的成分。如图5所示姜油树脂鸡血小板固相膜解离液与姜油树脂供试液的HPLC对照图谱，3号峰、4号峰的成分在供试液中含量不高，而在血小板固相膜解离液中含量明显增加(如图5中箭头所示)，说明这两种成分在血小板膜上的特异性结合能力较强，是对鸡血小板作用较强的物质。再比较姜油树脂血小板固相膜解离液、最后一次洗脱液的色谱图中各保留峰的相对保留时间、在总峰面积中的所占比例的数据，如表1所示：

    表1血小板固相膜解离液、最后一次洗脱液的色谱图中

    各保留峰的相对保留时间、在总峰面积中的所占比例

特征峰	保留时间[min]		占总峰面积的百分比[％]
					最后一次洗脱液	固相解离液	最后一次洗脱液	固相解离液
	2号峰3号峰4号峰5号峰6号峰	6.48313.96916.50120.43823.650	6.40513.91216.45520.40023.630	50.53814.6118.1224.2657.078					13.15016.3807.6326.5829.854

由解离液和最后一次洗脱液中各物质峰面积比例基本保持一致，其中3号峰物质在血小板固相膜解离液所占百分数较最后一次洗脱液中增加，且在解离液总峰面积中所占百分数3号峰最高(16.38％)，说明通过使血小板膜靶点失活后从血小板膜靶点释放的3号峰物质最多，说明这种成分在血小板膜上的特异性结合能力最强，是这五个特征峰物质中对鸡血小板作用最强的物质。

(8)重复性实验：所有步骤均与以上操作相同。在不同时间用鸡血小板细胞膜固相色谱技术模型筛选姜油树脂中的效应成分(重复性实验)，结果发现，被血小板膜受体固相化的效应成分没有变化，且各成分的峰面积比例基本一致(如图6所示)，即血小板特异结合的成分相同，3号峰物质均表现出很强的结合能力，说明用这种鸡血小板细胞膜固相色谱法筛选姜油树脂供试液中抗血小板聚集作用(抗血栓作用)活性成分，方法稳定可靠，重复性好。

(二)姜油树脂指纹图谱中特征峰效应物质化学结构的确定：由于姜酚类物质沸点高、难以挥发，且具有对热不稳定等性质，不宜采用气—质联用方法进行定性并测定其分子量，因此本发明采用具有样品用样量少、分离效果好、电喷雾离子化等效果的液—质联用技术进行定性鉴定各效应物质并测定其分子量。结合已报道的姜油树脂指纹图谱信息(据相对保留值)和液质联用技术，鉴定其中四个特征峰成分为姜酚类物质，分别为6-姜酚、8-姜酚、6-姜脑和10-姜酚，其中3号特征峰物质为8-姜酚。各特征峰效应物质化学结构分别如下所示：

2号特征峰：6-姜酚(6-gingerol)C₁₇H₂₆O₄MW＝294；

3号特征峰：8-姜酚(8-gingerol)C₁₉H₃₀O₄MW＝322；

4号特征峰：6-姜脑(6-shogaol)C₁₇H₂₆O₃MW＝276；

6号特征峰：10-姜酚(10-gingerol)C₂₁H₃₄O₄MW＝350.

(三)效应物质群的药理活性研究：据文献报道，6-姜酚、8-姜酚、6-姜脑和10-姜酚，这四个化合物在10μM的浓度下均表现一定程度的体外抗血小板聚集作用，其中8-姜酚的体外抗血小板活性最强(96％)，其体外抗血小板聚集活性(IC₅₀＝6±1μM)优于阿司匹林(IC₅₀＝20±11μM)，4号峰6-姜脑活性次之(91％)，这与本发明得出的结论一致。本发明采用小鼠体内抗血小板聚集实验对姜油树脂通过CTMIC筛选得到的特异结合的成分群—姜酚进行活性验证(方法和结果见实施例三)，姜酚通过增加小鼠体内圆树型血小板比例，降低扩大型血小板比例和血小板聚集个数而达到与阿司匹林相似的抗血小板聚集作用，因此体内外实验结果提示姜酚有望开发为新一代的抗血栓药物。

实施例二：姜酚的分离提取

本发明通过化学方法提取姜酚用作药理实验，来验证通过本发明建立的鸡血小板细胞膜固相色谱技术筛选姜油树脂供试液中得到的效应成分——姜酚类物质的抗血小板聚集活性。

市售生姜，由暨南大学理工学院食品科学与工程系黄雪松教授鉴定。将鲜姜洗净泥土，切成姜片，在通风干燥处晒干，然后磨成100目姜粉，用丙酮萃取干姜粉；每批干姜粉萃取三次；将三次萃取液收集在一起。在低于35℃的温度下回收溶剂，得姜酚粗提物。取姜酚粗提物2份，用1份体积的正己烷萃取姜酚，连续萃取3次；合并正己烷提取液后，回收正己烷，得粗姜酚。将上述粗姜酚用硅胶吸附，装于硅胶柱上；用正己烷乙醚连续洗脱，并在低于0℃的环境下放置结晶，得姜酚粗结晶。将姜酚粗结晶用正己烷溶解，反复重结晶，得精制、高纯度簇状姜酚结晶(已经质谱、核磁共振谱、紫外光谱、红外光谱等资料证实其为姜酚，分别为6-姜酚，8-姜酚和10-姜酚)(黄雪松.结晶姜酚的分离与鉴定.食品与发酵工业2005；31(10)：71～72。Huang XS.Crystalgingerol of isolation and identification.Food and Fermentation Industries 2005；31(10)：71～72.)，以0.5％蔗糖酯溶解得供试药。

实施例三：姜酚体内抗血小板聚集实验

将小鼠随机分为三组，分别为溶剂对照组、阿司匹林组和姜酚组。姜酚组以75mg/kg剂量灌胃，阿司匹林组以30mg/kg剂量灌胃，溶剂对照组给等体积0.5％蔗糖酯溶液灌胃。连续灌胃给药5d，1次/d，末次给药1h后眼球取血1ml(3.8％枸橼酸钠溶液按1∶9抗凝)，4℃放置5min诱导聚集，吸取抗凝血300μl滴在已涂有火棉胶溶液的干燥玻片上，约2×2cm²；血片置37℃恒温鼓风干燥箱中温育8min后，用pH＝7.4PBS冲去红细胞、白细胞，室温风干。用饱和高锰酸钾溶液染色8min，取出血片，蒸馏水冲净，自然风干。10×40倍显微镜下观察并照相，数据表明，阿司匹林组、姜酚组圆树型血小板的比例均大于溶剂对照组，而扩大型血小板的比例、血小板的聚集个数均少于溶剂对照组(P＜0.01)；比较姜酚组与阿司匹林组各类型血小板以及聚集个数，结果均无显著性差异(P＞0.05)。血小板涂片可见，表面光滑、外围完整的血小板为圆型；边缘不整，伸展出长短不一、粗细不匀、形态各异的树突状伪足的血小板为树型；圆型和树型合称为圆树型(图7.1)，是正常状态下血小板形态。树型的血小板相互接触，或与其他型的血小板接触，极易发生聚集。这种由两个或以上的血小板边缘相互融合，由树突状伪足相互交连而成的血小板形态，称为扩大型(图7.2)，是血小板的细胞膜形状或结构发生改变而形成的粘着聚集形态。溶剂对照组的血小板图片镜下可见血小板密集，形态不规则，聚集明显，出现大量扩大型血小板，而圆树型相对较少(图7.3)；与溶剂对照组比较，阿司匹林组(图7.4)和姜酚组(图7.5)血小板涂片中血小板明显密度降低，血小板形态规则，圆树型血小板占多数，聚集现象不明显。计算一视野下，各组血小板涂片中圆树型、扩大型血小板所占的百分比，及扩大型血小板的聚集个数，结果见表2所示。

表2  各组小鼠血小板涂片中圆树型、扩大型血小板所占百分数及聚集个数的比较( X±s)

组别	圆树型(％)	扩大型(％)	聚集个数
				溶剂对照组阿司匹林组姜酚组	68.38±5.5384.22±2.23**86.82±1.80**	31.62±5.5315.87±2.23**13.18±1.80**	74.66±12.4036.19±5.59**27.76±5.56**

注：与溶剂对照组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01。结果显示阿司匹林组、姜酚组圆树型血小板的比例均大于溶剂对照组，而扩大型血小板的比例、血小板的聚集个数均少于溶剂对照组(P＜0.01)；比较姜酚组与阿司匹林组各类型血小板以及聚集个数，结果均无显著性差异(P＞0.05)。

实施例四：中暑内毒素血症模型的建立

40只小鼠随机分为生理盐水组、中暑内毒素血症模型组(模型组)、常温对照组、姜酚组和溶剂对照组，每组8只。常温对照组不给药，在室温(25±0.5)℃、相对湿度(43±5)％条件下暴露2h；姜酚组以姜酚灌胃，按75mg/kg体重给药，溶剂对照组给等体积的0.5％蔗糖酯灌胃，生理盐水组动物灌胃等体积生理盐水，模型组不给药。给药30min后将4组动物同时放入人工热气候模拟舱，在干球温度(35±0.5)℃、相对湿度(65±5)％的条件下进行热暴露2h，诱导其产生内源性内毒素血症。

实施例五：腹腔巨噬细胞的收集和鉴定

动物脱髓处死，75％酒精浸泡5秒钟，固定于手术操作台，腹腔注射冰冷含10U/ml肝素RPMI-1640培养液5ml，轻柔1min后收集腹腔灌洗液，洗出液1000r/min离心10min，去上清，沉淀以无血清RPMI-1640培养液重悬两次，台盼蓝染色计数，调整细胞数为1×10⁶个/ml，2％台盼兰检查细胞活性，瑞士染色鉴定细胞纯度＞95％。如图8所示，该视野下瑞氏染色均为腹腔巨噬细胞。

实施例六：MTT(四甲基偶氮唑盐)法测定巨噬细胞能量代谢水平

吸取制备的100μl的细胞悬液加至96孔细胞培养板，置37℃含95％O₂，5％CO₂培养箱继续培养2h，加入MTT(终浓度5g/L)，20μl/孔，再于37℃孵育4h，1000r/min离心5分钟，弃去孔内液体，加入DMSO(150μl/孔)，充分混匀，置微型振荡器上振荡30min，于Bio-Rad680型酶标仪上读取波长570nm处的吸光值，以A₁值表示巨噬细胞能量代谢水平的测定，结果见表3所示。

实施例七：中性红法测定巨噬细胞吞噬功能

吸取制备100μl的细胞悬液加至96孔细胞培养板，置37℃含95％O₂，5％CO₂培养箱继续培养2h后，去除培养液，加入0.072％中性红溶液(100μl/孔)，37℃培养箱继续培养1h，弃上清，预温的37℃生理盐水充分洗涤2次，加入200μl裂解液(无水乙醇：0.1mmol/L乙酸体积比为1∶1)，室温震荡30分钟使其充分溶解，破碎，置Bio-Rad680型酶标仪检测波长为570nm处的吸光度值，以A₂值表示巨噬细胞吞噬功能的强弱，结果见表3所示。

表3  姜酚对各组小鼠腹腔巨噬细胞能量代谢水平和吞噬功能的影响( X±s)

组别	n	A1	A2
				生理盐水组模型组常温对照组姜酚组溶剂蔗糖酯组	88888	0.30±0.030.29±0.050.35±0.02*0.60±0.03*0.30±0.04	0.26±0.030.26±0.030.46±0.04*0.49±0.03*0.27±0.03

注：与模型组比较，^*P＜0.01。常温对照组小鼠腹腔巨噬细胞能量代谢水平和吞噬功能分别高于模型组(P＜0.01)，提示该模型建立成功；姜酚组小鼠腹腔巨噬细胞能量代谢水平和吞噬功能显著高于模型组(P＜0.01)。

实施例八：血浆超氧化物歧化酶(SOD)活性测定

采用黄嘌呤氧化酶法测定，取小鼠血浆30μl，加样量为20μl，按试剂盒说明书测试方法进行，测定555nm吸光度，测得对照管吸光度，按

计算SOD活性。每毫升反应液中SOD抑制率达50％时所对应的SOD量为一个SOD活力单位(U)，结果见表4所示。

实施例九：丙二醛(MDA)含量测定

采用硫代巴比妥酸法(TBA)法测定，按试剂盒说明书测试方法进行，取小鼠血浆100μl，加样量100μl，标准MDA浓度为10nmol/L，测定各管波长532nm的吸光度，测定标准管平均A值，按公式计算：

MDA含量(单位为mmol/ml)，结果见表4所示。

表4  姜酚对各组小鼠血浆SOD活性、MDA含量的影响( X±s)

组别	n	SOD(U/ml)	MDA(mmol/L)
				生理盐水组模型组常温对照组姜酚组溶剂蔗糖酯组	88888	77.88±5.1376.33±5.50112.00±10.43*138.35±20.85*75.47±4.67	7.71±0.467.74±0.375.80±0.53*5.70±0.38*7.34±0.43

注：与模型组比较，^*P＜0.01。常温对照组小鼠血浆SOD活性高于、MDA含量则低于模型组(P＜0.01)，提示该模型建立成功；姜酚组小鼠血浆SOD活性高于、MDA含量则低于模型组(P＜0.01)。

实施例十：电镜标本的制备及观察

动物收集腹腔巨噬细胞后，迅速取出肝脏，置2.5％戊二醛溶液固定，1％锇酸后固定1h，70％～100％梯度酒精、丙酮顺序脱水；环氧树脂Epon812包埋成块，制成50～70nm超薄切片，经醋酸双氧铀、枸橼酸铅双染色，置PHILIPS TECNAI-10型透射电子显微镜下观察、照相。如图9中，图(1)生理盐水组(×8900)线粒体肿胀，线粒体嵴减少，内质网肿胀，呈空泡状，糖原颗粒减少；图(2)中暑内毒素血症模型组(×6200)箭头所指部分肝细胞细胞核变形、不规则；溶酶体增多，糖原颗粒减少，可见大量脂滴，左上图为该模型组线粒体的放大图(×15000)，可见线粒体肿胀，线粒体嵴减少；图(3)常温对照组(×8900)肝细胞清晰，细胞核为圆形或卵圆形，核膜清晰，无畸形改变，线粒体无肿胀，线粒体嵴丰富，糖原颗粒丰富；图(4)姜酚组(×6000)肝细胞形态接近正常组，细胞核变形、不规则，线粒体无肿胀，嵴正常，胞浆内有少量空泡，未见脂滴；图(5)溶剂蔗糖酯组(×15000)线粒体肿胀，线粒体嵴减少，内质网肿胀，呈空泡状，溶酶体增多，糖原颗粒减少。

通过本发明建立的模型从姜油树脂中筛选出的效应物质——姜酚类物质对中暑内毒素血症模型小鼠的影响，其药理作用机制是通过缓解中暑对肝脏的损伤，提高中暑内毒素血症模型小鼠腹腔巨噬细胞能量代谢水平，增强其吞噬能力，增加血浆SOD活性、减少MDA生成，对中暑内毒素血症模型小鼠有保护作用，是姜防治中暑的有效成分。

如上所述，可较好地实现本发明。

Claims (5)

1、一种筛选中药抗血小板聚集作用活性成分的细胞膜固相色谱法模型的建立方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)待筛选中药姜油树脂供试液指纹图谱的建立：精密称取5mg姜油树脂，以2％吐温-80溶解，得姜油树脂供试液，经水相滤膜滤过，滤液供HPLC分析，确定姜油树脂供试液中的共有指纹峰；

(2)鸡血小板悬液的分离：将鸡全血收集在含枸椽酸三钠的抗凝剂的塑料离心管中，再将抗凝血分装至塑料离心管中，在22℃以680转/分离心10min，吸取上层富血小板血浆，再将富血小板血浆以2800转/分离心10min，使血小板沉淀，将血小板用pH 7.4PBS洗涤后，调成10¹⁰个/ml血小板悬液；

(3)血小板细胞膜固相化待筛选中药姜油树脂供试液中的效应成分：取血小板悬液5ml加入1ml步骤(1)中配制的姜油树脂供试液，混匀后置于37℃水浴中振荡结合，使姜油树脂中活性成分充分与血小板膜受体结合；

(4)非特异性结合成分的洗脱：以2倍量22℃的pH7.4的PBS洗涤步骤(3)中的固相化效应成分后的血小板悬液，使成均匀悬液，2800转/分离心10min，弃上清液，取下层血小板洗涤，使非特异性结合成分洗脱；

(5)血小板固相化姜油树脂中活性成分的解离：向经步骤(4)洗涤后的结合有药物效应成分的血小板悬液中加入3ml pH 4的PBS溶液，使成均匀悬液，置于37℃水浴中振荡30min后，2800转/分离心10min，上清液为活性成分解离液；

(6)血小板固相化活性成分解离液的HPLC色谱分析：将活性成分解离液通过固相萃取柱，保留液过有机滤膜，氮气挥发浓缩至200μl，HPLC分析，通过比较活性成分解离液和姜油树脂指纹图谱中各吸收峰的比例，确定与血小板特异结合的特征峰，得到活性成分的特征峰。

2、根据权利要求1所述的筛选中药抗血小板聚集作用活性成分的细胞膜固相色谱法模型的建立方法，其特征在于：所述与血小板特异结合的特征峰为2号峰、3号峰、4号峰、5号峰、6号峰五个特征峰，所述五个特征峰是与血小板膜靶点结合的效应成分群。

3、根据权利要求2所述的筛选中药抗血小板聚集作用活性成分的细胞膜固相色谱法模型的建立方法，其特征在于：所述2号峰物质为6-姜酚、3号峰物质为8-姜酚、4号峰物质为6-姜脑、6号峰物质为10-姜酚。

4、根据权利要求2所述的筛选中药抗血小板聚集作用活性成分的细胞膜固相色谱法模型的建立方法，其特征在于：所述步骤(1)或步骤(6)中HPLC分析条件如下：色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18 150×4.6mm，5μm；色谱条件：采用梯度洗脱，流动相：A为水，B为乙腈；A+B＝100％，0～8min，55％A变为50％A；8～15min，50％A变为45％A；15～40min，45％A变为10％A；40～45min，90％B渐变至45％B；流速1ml/min；柱温：25℃；DAD检测波长280nm。

5、根据权利要求2所述的筛选中药抗血小板聚集作用活性成分的细胞膜固相色谱法模型的建立方法，其特征在于：所述步骤(4)中，下层血小板洗涤次数为3次。

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