CN100335495C

CN100335495C - 一种海鞘多肽及其制备方法

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Publication number: CN100335495C
Application number: CNB2006100331921A
Authority: CN
Inventors: 万新祥; 胡文军; 曾凡林; 王瑞
Original assignee: Southern Medical University
Current assignee: Southern Medical University
Priority date: 2006-01-23
Filing date: 2006-01-23
Publication date: 2007-09-05
Anticipated expiration: 2026-01-23
Also published as: CN1803831A

Abstract

本发明海鞘多肽及其制备方法属于生化与生物医药领域。本发明海鞘多肽具有式(Ⅰ)所示序列，分子量是666.3。其制备方法首先用乙醇常温浸泡减压回收乙醇得浸膏；将浸膏用有机溶剂萃取，浓缩；依次使用大孔树脂色谱法、硅胶色谱法、Sephadex LH20色谱法分离提纯得到，其中硅胶色谱法用CHCl₃∶MeOH∶H₂O比为7∶3∶0.5的洗脱剂梯度洗脱，收集薄层色谱紫外光检识R_f为0.2～0.3的洗脱液浓缩。本发明海鞘多肽具有抗HBV作用，本发明海鞘多肽制备方法具有提取方法工艺简单，设备投资少，生产过程便于控制，原料来源广泛等优点。Ser-Ser-Leu-Ser-Lys-Ala-Ala(Ⅰ)。

Description

一种海鞘多肽及其制备方法

发明领域

本发明属于生化与生物医药领域，具体涉及海鞘多肽及其制备方法。

背景技术

海鞘(Ascidia)是尾索动物亚门(Uronordata)纲的尾索动物，从海鞘中提取的抗癌成分已有少数进入临床或临床前阶段。研究发现海鞘类生物计含有生物碱类、肽类、吲哚类、重金属螯合剂、多硫化物、大环内酯、萜类等数十种化合物，具有较强的抗肿瘤、抗病毒、抗菌、诱导肌浆网释钙、抑制钙调蛋白活性等多种生理活性，尤其以对抗肿瘤的研究报道较多(李志军，薛长湖，王长海.海鞘中的抗肿瘤生物活性物质.海洋通报，2004，23(5)：82-86；季宇彬，池文杰.海鞘中抗肿瘤活性物质的研究.哈尔滨商业大学学报(自然科学版)，2005，21(1)：6-10.)。中国专利CN03111710.4提及从海鞘中提取具有抑制血小板聚集和抗凝血作用的海鞘脂肪酸，中国专利CN01812043.1提及从海鞘中提取具有抗肿瘤和抗病毒活性作用的海鞘素，中国专利CN03807576.8提及海鞘素及其制备方法。目前海鞘类的专利申请在海鞘素和脂肪酸等方面有报道，而从海鞘中提取海鞘多肽的制备方法及其在治疗乙肝中的应用尚未见报道。

发明内容

本发明目的是提供一种具有抗HBV作用的海鞘多肽。

本发明另一目的是提供一种具有抗HBV作用的海鞘多肽的制备方法。

本发明所述的海鞘多肽用下序列式表示：

Ser-Ser-Leu-Ser-Lys-Ala-Ala(1)，

式中Ser是丝氨酸，Leu是亮氨酸，Lys是赖氨酸，Ala是丙氨酸。

本发明所述的式(1)表示的海鞘多肽，是浅黄色针状结晶，茚三酮反应阳性，分子量为666.3。

本发明所述的海鞘多肽制备方法，含有以下步骤：首先用乙醇浸泡海鞘，回收乙醇得到浸膏；将浸膏用水溶解，然后用有机溶剂萃取得到海鞘粗提物；最后使用色谱法分离提纯得到。

本发明海鞘多肽制备方法中海鞘粗提物制备方法是，用海鞘等重量的70～90％(体积浓度v/v)乙醇常温浸泡2周，减压回收乙醇得浸膏；将浸膏用水溶解，然后用有机溶剂萃取，浓缩水溶液得到海鞘粗提物。

本发明所述水的用量为浸膏2～3倍。其中所述倍数是指水的体积(ml)是浸膏质量(g)的倍数。

本发明所述有机溶剂是乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、正丁醇、乙醚、石油醚、正己烷、环己烷其中一种或两种以上。本发明所述的有机溶剂较好是二氯甲烷或氯仿其中一种，最好是氯仿。本发明所述的萃取次数为2～4次。本发明每次萃取所用有机溶剂用量和水的用量比为体积比1∶1。

本发明所述色谱法可以是大孔树脂色谱法、硅胶色谱法、Sephadex LH20色谱法其中一种或两种以上。本发明所述色谱分离提纯方法最好是依次采用大孔树脂色谱法、硅胶色谱法、Sephadex LH20色谱法。

本发明所述的大孔树脂色谱法是本领域常用的大孔树脂色谱方法。其具体步骤为：海鞘粗提物上大孔树脂色谱柱后，用50％乙醇洗脱至柱无色，浓缩干燥。本发明所述的大孔树脂最好是非极性大孔树脂。本发明所述的大孔树脂是非极性或弱极性聚苯乙烯大孔树脂，例如HPD-100、D-101、AB-8、HP-20、HPD-300等。本发明所述的大孔树脂最好是D-101大孔吸附树脂。

本发明所述的硅胶柱色谱方法，是本领域常用的硅胶色谱方法。本领域技术人员可以依据本领域知识得到最佳的参数。本发明硅胶色谱方法具体步骤为：将海鞘多肽粗提物上硅胶色谱柱后，用CHCl₃∶MeOH∶H₂O比为7∶3∶0.5的洗脱剂梯度洗脱，流速为2～3ml/分钟，收集薄层色谱紫外光检识Rf为0.2～0.3的洗脱液，浓缩。其中薄层色谱条件：展开剂是正丁醇∶水∶醋酸为4∶5∶1；显色剂是5％硫酸乙醇液。

本发明所述的Sephadex LH20色谱法，具体步骤为：将海鞘多肽粗提物上Sephadex LH20凝胶色谱柱，用CH₃OH∶H₂O以1∶1的洗脱剂洗脱，流速为1～2ml/分钟，收集薄层色谱紫外光检识R_f约为0.23的洗脱液，浓缩。其中薄层色谱条件：展开剂是正丁醇∶水∶醋酸为4∶5∶1；显色剂是5％硫酸乙醇液。

本发明所述的Sephadex LH20为羟丙基葡聚糖凝胶。

本发明所述的海鞘(Ascidian)可以是尾索动物亚门(Uronordata)海鞘纲的尾索动物皱瘤海鞘[Styela plicata(lesueur)]。

本发明所述的海鞘多肽制备方法，还可以对海鞘进行预处理，具体步骤是将新鲜海鞘清洗、沥干、干燥、粉碎；干燥温度低于80度；干燥包括风干、烘干、真空干燥等。

本发明所述的海鞘多肽的制备方法最好是，首先将海鞘用等重量的70～90％(体积浓度)乙醇常温浸泡2周，减压回收乙醇得浸膏；将浸膏2～3倍的水溶解，然后用和水用量相同(体积)的氯仿萃取2～4次，浓缩得到海鞘粗提物；将海鞘粗提物上大孔树脂色谱柱后，用50％乙醇洗脱至柱无色，浓缩干燥得到海鞘多肽粗提取物；将上述海鞘多肽粗提物上硅胶色谱柱后，用CHCl₃∶MeOH∶H₂O比为7∶3∶0.5的洗脱剂梯度洗脱，流速为2～3ml/分钟，收集薄层色谱紫外光检识R_f为0.2-0.3的洗脱液，浓缩得到海鞘多肽粗提取；将上述海鞘多肽粗提物上Sephadex LH20凝胶色谱柱后，用CH₃OH∶H₂O以1∶1的洗脱剂洗脱，流速为1～2ml/分钟，收集薄层色谱紫外光检识R_f约为0.23的洗脱液，浓缩得到海鞘多肽。

本发明海鞘多肽有抗HBV作用。为了更好的理解本发明，下面用本发明的相关药理试验及结果来说明其用途。

本发明所述的抗HBV细胞实验的方法：用0.25％胰蛋白酶将2.2.15细胞分散成单个细胞悬液，按3×10⁴细胞/孔分种于96孔板，2天后换用含药培养液，每个浓度加4孔。样品用细胞培养液分别稀释成16、8、4mg/ml 3个浓度，与细胞作用12天后，吸取细胞上清液，用ELISA法测定HBsAg、HBeAg滴度。余下细胞用MTT法测定药物的细胞毒性。实验以拉米呋定作为阳性对照药物，以未加任何药物的细胞作为细胞对照组。

1.1ELISA法测HBsAg、HBeAg

1.1.1每孔加入待测标本50μl，设阴性、阳性对照各2孔，并设空白对照1孔。

1.1.2每孔加入酶结合物50μl(除空白对照外)，充分混匀后封板，置37℃孵育8小时。

1.1.3手工洗板：弃去孔内液体，洗涤液储满各孔，静置5秒后甩干，重复5次后拍干。

1.1.4每孔加入显色剂A液、B液各50μl，充分混匀，封板，置37℃孵育15分钟；

1.1.5每孔加入终止液50μl，混匀；

1.1.6用酶标仪测定。取波长450nm，先用空白孔校零，然后读取各孔OD值，阴性对照OD值低于0.05作为0.05计算，高于0.05按照实际OD计算。

1.2MTT法测定药物对细胞生长的半数毒性浓度

向细胞中加入400μg/ml MTT液0.1ml/孔，37℃5％CO₂孵育4h，可见黄黑色甲瓒颗粒，弃去MTT液，加入100％DMSO 0.1ml/孔，待甲瓒颗粒完全溶解(约10min)后，用紫外分光光度计于波长570nm处测定吸光度A值，以4孔未加细胞的100％DMSO为空白对照。

1.3实验结果的计算。

半数抑制浓度(IC₅₀)是HBsAg或HBeAg抑制率为50％时的药物浓度，半数毒性浓度(TC₅₀)是实验孔存活细胞为细胞对照孔50％时的浓度。

海鞘多肽的抗HBV效果如表1所示，海鞘多肽对细胞的毒性作用如表2所示。根据计算，本发明所述的海鞘多肽抑制HBsAg的半数有效浓度分别3.28mg/ml，抑制HBeAg的半数有效浓度分别为4.48mg/ml。该多肽在高浓度时均表现出一定的毒性，但在所测浓度中，细胞破坏率均未达到50％，故其半数毒性浓度TC₅₀大于64mg/ml，其抑制HBsAg治疗指数TI大于19.51，抑制HBeAg治疗指数TI大于14.29。

表1海鞘多肽的抗HBV效果

样品	剂量mg.mL¹	HBsAg		HBeAg
		HBsAg		HBeAg		OD±S	抑制率％	OD±S	抑制率％
		海鞘多肽拉米呋定	64321684421	0.069±0.0010.087±0.0020.099±0.0040.231±0.0470.519±0.0990.110±0.0040.275±0.0080.541±0.010	93.05^91.06^89.74^75.16^43.38^88.52^70.31^40.94^	OD±S	抑制率％	OD±S	抑制率％	0.107±0.0070.179±0.0110.288±0.0710.482±0.0330.708±0.0790.299±0.0670.464±0.0410.793±0.123	92.12^86.61^78.27^63.43^46.14^77.43^64.80^39.63^
细胞对照空白对照		海鞘多肽拉米呋定	64321684421		93.05^91.06^89.74^75.16^43.38^88.52^70.31^40.94^	0.912±0.0070.006		1.311±0.0070.004			92.12^86.61^78.27^63.43^46.14^77.43^64.80^39.63^

*与细胞对照相比，p＜0.05。

表2海鞘多肽对细胞的毒性作用

样品	剂量mg.mL¹	OD±S	破坏率(％)
样品	剂量mg.mL¹	OD±S	破坏率(％)	海鞘多肽拉米呋定	64321684421	0.685±0.067^0.841±0.058^1.001±0.0871.098±0.0651.104±0.1531.090±0.1141.241±0.2011.115±0.123	38.2724.199.75--1.71--
空白对照细胞对照		0.0011.109±0.095		海鞘多肽拉米呋定	64321684421		38.2724.199.75--1.71--

*与细胞对照相比，p＜0.05。

本发明所述的海鞘多肽及其制备方法中，海鞘广泛分布于南海海域，产量丰富，便于采集，提取方法工艺简单，设备投资少，生产过程便于控制。

具体实施方式

以下实施例使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

新鲜皱瘤海鞘50Kg，去内脏，洗净，在室温下用50kg75％乙醇浸泡2周，用旋转蒸发器回收酒精，得提取物1000g。取提取物200g用500ml蒸馏水溶解，用相同体积的二氯甲烷萃取，收干溶剂取得水溶性部分825g；再用500ml蒸馏水尽量溶解，以相同体积的正丁醇萃取，收干溶剂得水溶性部分712g；接着取水溶性部分100g，上D-101大孔树脂柱色谱，用50％乙醇500ml洗脱，流速为3ml/分钟，收干溶剂得产物14g；以此进行硅胶柱色谱，用CHCl₃∶MeOH∶H₂O比为7∶3∶0.5的洗脱剂梯度洗脱，流速为3ml/分钟，收集薄层色谱紫外光检识R_f为0.2-0.3的洗脱液，收干溶剂得海鞘多肽粗提物，最后以此上Sephadex LH20凝胶柱色谱，用CH3OH∶H2O以1∶1的洗脱剂洗脱，流速为1ml/分钟，收集薄层色谱紫外光检识R_f约为0.23的洗脱液，收干溶剂得到海鞘多肽146mg。上述薄层层洗条件：展开剂是正丁醇∶水∶醋酸为4∶5∶1；显色剂用5％硫酸乙醇液。

实施例2

新鲜皱瘤海鞘50Kg，去内脏，洗净，在室温下以75％乙醇50kg浸泡2周，用旋转蒸发器60℃回收酒精至无味，得提取物1000g。取提取物200g用500ml蒸馏水尽量溶解，以相同体积的氯仿萃取，收干溶剂取得水溶性部分805g；再用500ml蒸馏水尽量溶解，以相同体积的正丁醇萃取，收干溶剂得水溶性部分683g；接着取水溶性部分100g，上AB-8大孔树脂柱色谱，用50％乙醇500ml洗脱，流速为2.5ml/分钟，收干溶剂得产物10g；以此进行硅胶柱色谱，用CHCl₃∶MeOH∶H₂O比为7∶3∶0.5的洗脱剂梯度洗脱，流速为2.5ml/分钟，收集薄层色谱紫外光检识R_f为0.2-0.3的洗脱液，收干溶剂得粗产物，最后以此分别上SephadexLH20凝胶柱色谱，用CH3OH∶H2O以1∶1的洗脱剂洗脱，流速为1.5ml/分钟，收集薄层色谱紫外光检识R_f约为0.23的洗脱液，收干溶剂得到海鞘多肽102mg。上述薄层色谱条件：展开剂是正丁醇∶水∶醋酸为4∶5∶1；显色剂用5％硫酸乙醇液。

实施例3

新鲜皱瘤海鞘50Kg，去内脏，洗净，在室温下以90％乙醇50kg浸泡2周，用旋转蒸发器60℃回收酒精至无味，得提取物1300g。取提取物200g用600ml蒸馏水溶解，用相同体积的氯仿萃取，收干溶剂取得水溶性部分830g；上述萃取方法重复3次，收干溶剂得水溶性部分730g；接着取水溶性部分100g，上HDP-100大孔树脂柱色谱，用50％7醇500ml洗脱，流速为2ml/分钟，收干溶剂得产物15g；以此进行硅胶柱色谱，用CHCl₃∶MeOH∶H₂O比为7∶3∶0.5的洗脱剂梯度洗脱，流速为3ml/分钟，收集薄层色谱紫外光检识Rf为0.2-0.3的洗脱液，收干溶剂得海鞘多肽粗提物，最后以此上Sephadex LH20凝胶柱色谱，用CH3OH ∶H2O以1∶1的洗脱剂洗脱，流速为2ml/分钟，收集薄层色谱紫外光检识R_f约为0.23的洗脱液，收干溶剂得到海鞘多肽126mg。上述薄层色谱条件：展开剂是正丁醇∶水∶醋酸为4∶5∶1；显色剂用5％硫酸乙醇液。

实施例4

新鲜皱瘤海鞘50Kg，去内脏，洗净，在室温下以80％乙醇50kg浸泡2周，用旋转蒸发器60℃回收酒精至无味，得提取物1300g。取提取物200g用400ml蒸馏水溶解，用相同体积的氯仿萃取，收干溶剂取得水溶性部分825g；用600ml蒸馏水溶解，用相同体积的乙酸乙酯萃取，收干溶剂取得水溶性部分725g；用600ml蒸馏水溶解，用相同体积的正己烷萃取，收干溶剂取得水溶性部分605g，收干溶剂得水溶性部分512g；接着取水溶性部分100g，上D-101大孔树脂柱色谱，用50％乙醇500ml洗脱，流速为2ml/分钟，收干溶剂得产物13g；以此进行硅胶柱色谱，用CHCl₃∶MeOH∶H₂O比为7∶3∶0.5的洗脱剂梯度洗脱，流速为3ml/分钟，收集薄层色谱紫外光检识R_f为0.2-0.3的洗脱液，收干溶剂得海鞘多肽粗提物，最后以此上Sephadex LH20凝胶柱色谱，用CH3OH∶H2O以1∶1的洗脱剂洗脱，流速为2ml/分钟，收集薄层色谱紫外光检识R_f约为0.23的洗脱液，收干溶剂得到海鞘多肽146mg。薄层色谱条件：展开剂是正丁醇∶水∶醋酸为4∶5∶1；显色剂用5％硫酸乙醇液。

实施例5

新鲜皱瘤海鞘50Kg，去内脏，洗净，在室温下以75％乙醇50kg浸泡2周，用旋转蒸发器60℃回收酒精至无味，得提取物1000g。取提取物200g用500ml蒸馏水溶解，用相同体积的二氯甲烷萃取，再用相同体积的乙酸乙酯萃取，收干溶剂得水溶性部分712g；接着取水溶性部分100g，上D-101大孔树脂柱色谱，用50％乙醇500ml洗脱，流速为3ml/分钟，收干溶剂得产物14g；以此进行硅胶柱色谱，用CHCl₃∶MeOH∶H₂O比为7∶3∶0.5的洗脱剂梯度洗脱，流速为3ml/分钟，收集薄层色谱紫外光检识R_f为0.2-0.3的洗脱液，收干溶剂得海鞘多肽粗提物，最后以此上Sephadex LH20凝胶柱色谱，用CH3OH∶H2O以1∶1的洗脱剂洗脱，流速为2ml/分钟，收集薄层色谱紫外光检识R_f约为0.23的洗脱液，收干溶剂得到海鞘多肽146mg。薄层色谱条件：展开剂是正丁醇∶水∶醋酸为4∶5∶1；显色剂用5％硫酸乙醇液。

<110>南方医科大学

<120>一种海鞘多肽及其制备方法

<160>1

<170>PatentIn Version 3.1

<210>1

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：肽片断

<400>1

Ser Ser Leu Ser Lys Ala Ala

5

Claims

1.一种海鞘多肽，其特征在于具有如下序列：

Ser-Ser-Leu-Ser-Lys-Ala-Ala，

式中Ser是丝氨酸，Leu是亮氨酸，Lys是赖氨酸，Ala是丙氨酸。

2.一种权利要求1所述的海鞘多肽的制备方法，首先用海鞘等重量的70～90％体积浓度的乙醇常温浸泡2周，减压回收乙醇得浸膏；将浸膏用2～3倍水溶解，然后用和水同体积的有机溶剂萃取2～4次，浓缩水溶液得到海鞘粗提物；最后依次使用大孔树脂色谱法、硅胶色谱法、Sephadex LH20色谱法对海鞘粗提物分离提纯得到，其中

大孔树脂色谱法是将海鞘粗提物上D-101大孔树脂色谱柱后，用50％乙醇洗脱至柱无色，浓缩干燥；

硅胶色谱法是将海鞘多肽粗提物上硅胶色谱柱后，用CHCl₃∶MeOH∶H₂O比为7∶3∶0.5的洗脱剂梯度洗脱，流速为2～3ml/分钟，收集薄层色谱紫外光检识R_f为0.2-0.3的洗脱液，浓缩，其中薄层色谱条件：展开剂是正丁醇∶水∶醋酸为4∶5∶1；显色剂是5％硫酸乙醇液；

Sephadex LH20色谱法是将海鞘多肽粗提物上Sephadex LH20凝胶色谱柱，用CH₃OH∶H₂O以1∶1的洗脱剂洗脱，流速为1～2ml/分钟，收集薄层色谱紫外光检识R_f，约为0.23的洗脱液，浓缩，其中薄层色谱条件：展开剂是正丁醇∶水∶醋酸为4∶5∶1；显色剂是5％硫酸乙醇液。

3.权利要求2所述的海鞘多肽制备方法，其特征在于有机溶剂是乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、正丁醇、乙醚、石油醚、正己烷、环己烷其中一种或两种以上。

4.权利要求3所述的海鞘多肽制备方法，其特征在于有机溶剂是氯仿。