CN1348813A - 抗流感病毒的药物有效部位及活性成分的分离制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗流感病毒的药物组合物及其有效部位和活性成分,本发明所获得的活性成分包括新化合物异甘草素－2’－O－芹糖(1—2)－葡萄糖苷和30种已知化合物,本发明有效部位及活性成分具有良好的杀灭流感病毒的作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药有效部位及活性成分，特别是涉及一种抗流感病毒的中药有效部位及活性成分。
背景技术
感冒是临床常见病、多发病，尤其是由流感病毒引起的流行性感冒，对人体危害更大。目前用于治疗感冒的中药制剂和西药制剂都很多见，但是从纯中药制剂中分离出具有抗流感病毒活性的药物有效部位及活性成分的方法及相关制剂并不多见。
技术方案
本发明的目的在于提供一种抗流感病毒的中药有效部位及活性成分的分离制备方法；本发明的目的还在于提供所述中药有效部位及活性成分的抗流感病毒新用途；本发明目的还在于提供一种由所述中药有效部位及活性成分制成的药剂；本发明目的还在于提供一种新的化合物。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
按比例称取金银花9重量份、连翘9重量份、牛蒡子9重量份、甘草5重量份、薄荷6重量份、荆芥6重量份、桔梗6重量份、淡豆豉6重量份、淡竹叶4重量份，混合均匀，加水煎煮2-3次，合并各次水煎液，浓缩，通过弱极性的大孔吸附树脂进行吸附，待水煎液全部通过树脂柱后，用水继续冲洗树脂柱，至水洗液近无色止，然后再用40-70％乙醇对树脂柱上吸附的物质进行洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收溶剂至干，即得到复方中药抗流感病毒活性部位。
本发明抗流感病毒活性部位为淡黄色粉末，具有一定的吸湿性，易溶于水和稀乙醇，难溶于氯仿、石油醚等亲脂性有机溶剂。三氯化铁反应阳性，盐酸-镁粉反应阳性，没食子酸-浓硫酸反应阳性，α-萘酚-浓硫酸反应阳性。主要含有黄酮类和木脂素类成分，其中总黄酮成分的含量为35.0％，总木脂素类成分的含量为21.1％。另含有一定量的三萜类、酚酸类和其它成分。
本发明抗病毒活性成分的分离方法：取本发明抗流感病毒活性部位300重量份，通过弱极性大孔吸附树脂，用30％、50％、70％、95％乙醇水溶液依次进行洗脱，各部分洗脱液减压回收溶剂后，分别得到30％乙醇洗脱物A72重量份，50％乙醇洗脱物B93重量份，70％乙醇洗脱物C12重量份，95％乙醇洗脱物D6重量份。
上述95％乙醇洗脱物D，用聚酰胺柱层析分离，水-乙醇混合溶剂梯度洗脱，分为30％乙醇洗脱部分、50％乙醇洗脱部分和70％乙醇洗脱部分。
30％乙醇洗脱部分用Sephadex LH-20柱层析分离，95％乙醇洗脱，得到化合物丙烯酸盐。
50％乙醇洗脱部分经硅胶柱层析分离，20∶1，18∶1，15∶1，12∶1氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱，其中15∶1氯仿-甲醇混合溶剂洗脱部分经SephadexLH-20柱层析分离，甲醇洗脱，得到化合物金合欢素。
上述70％乙醇洗脱物C，用聚酰胺柱层析分离，水-乙醇混合溶剂梯度洗脱，分为水洗脱部分、30％乙醇洗脱部分和50％乙醇洗脱部分，水洗脱部分用Sephadex LH-20柱层析分离，水洗脱，得到化合物甘草次酸和连翘苷；30％乙醇洗脱部分经Sephadex LH-20柱层析分离，95％乙醇洗脱，硅胶柱层析分离，19∶1氯仿-甲醇混合溶剂洗脱、Sephadex LH-20柱层析分离，甲醇洗脱，得到化合物醉鱼草苷；50％乙醇洗脱部分经Sephadex LH-20柱层析分离，95％乙醇洗脱，硅胶柱层析分离，10∶1，9∶1，7∶1，6∶1，5∶1，4∶1氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱，其中自6∶1氯仿-甲醇混合溶剂洗脱部分得到化合物连翘酯苷。
上述50％乙醇洗脱物B，用聚酰胺柱层析分离，水-乙醇混合溶剂梯度洗脱，分为水洗脱部分、10％乙醇洗脱部分、30％乙醇洗脱部分、50％乙醇洗脱部分和70％乙醇洗脱部分。
水洗脱部分用硅胶柱层析分离，分为水洗脱部分、10％乙醇洗脱部分、30％乙醇洗脱部分、50％乙醇洗脱部分和70％乙醇洗脱部分。
水洗脱部分用硅胶柱层析分离，98∶2∶0.1，95∶5∶0.1，90∶5∶0.1，85∶5∶0.1，80∶5∶0.1，75∶5∶0.1，70∶5∶0.1，65∶5∶0.1，60∶5∶0.1，55∶5∶0.1，50∶5∶0.1，40∶5∶0.1，35∶5∶0.1，30∶5∶0.1氯仿-甲醇-水混合溶剂梯度洗脱，依次分为14个部分。其中部分4用硅胶柱层析分离，9∶1氯仿-甲醇混合溶剂洗脱得到化合物牛蒡子苷；部分7用硅胶柱层析分离，11∶1氯仿-甲醇混合溶剂洗脱得到化合物橙皮苷；部分9经Sephadex LH-20柱层析分离，95％乙醇洗脱，得到化合物乌拉尔甘草皂苷甲，乌拉尔甘草皂苷乙；部分14经Sephadex LH-20柱层析分离，95％乙醇洗脱，得到化合物甘草酸。
30％乙醇洗脱部分用硅胶柱层析分离，9∶1氯仿-甲醇混合溶剂洗脱，按色带分别收集，得到第1、2、3部分；7∶1氯仿-甲醇混合溶剂洗脱，按色带分别收集，得到第4、5、6部分；4∶1氯仿-甲醇混合溶剂洗脱得到第7部分。其中自部分1得到化合物芒柄花素；部分2经Sephadex LH-20柱层析分离，甲醇洗脱，聚酰胺柱层析分离，19∶1氯仿-甲醇混合溶剂洗脱，得到化合物芦丁和异甘草素；部分7经Sephadex LH-20柱层析分离，95％乙醇洗脱，聚酰胺柱层析分离，9∶1氯仿-甲醇混合溶剂洗脱，1∶1甲醇-水混合溶剂为流动相半制备高效液相色谱分离制备，得到化合物异甘草素-2’-O-芹糖(1-2)-葡萄糖苷。
50％乙醇洗脱部分用硅胶柱层析分离，60∶1，50∶1，40∶1，30∶1，25∶1，20∶1，16∶1，12∶1氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱，依次分为8个部分，其中自部分1得到化合物大豆素；部分2经Sephadex LH-20柱层析分离，80％甲醇洗脱，得到化合物染料木素；部分8用硅胶柱层析分离，20∶1氯仿-甲醇混合溶剂洗脱得到化合物三十八烯醇。
上述30％乙醇洗脱物A，用聚酰胺柱层析分离，水-乙醇混合溶剂梯度洗脱，分为水洗脱部分、10％乙醇洗脱部分、30％乙醇洗脱部分、50％乙醇洗脱部分和70％乙醇洗脱部分。
水洗脱部分用硅胶柱层析分离，49∶1，39∶1，35∶1，30∶1，25∶1，20∶1，16∶1，12∶1，10∶1，8∶1，7∶1，6∶1，5∶1，4∶1氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱，依次分为14个部分。其中部分13经Sephadex LH-20柱层析分离，50％甲醇洗脱，得到化合物异甘草素-4’-O-芹糖(1-2)-葡萄糖苷。
10％乙醇洗脱部分用硅胶柱层析分离，9∶1氯仿-甲醇混合溶剂洗脱，按色带分别收集，得到10个部分。其中自部分2得到化合物甘草苷，自部分10得到化合物甘草素-4’-O-芹糖(1-2)-葡萄糖苷；部分9用聚酰胺柱层析分离，5∶1氯仿-甲醇混合溶剂洗脱，得到化合物金丝桃苷。
30％乙醇洗脱部分用硅胶柱层析分离，40∶1，35∶1，30∶1，25∶1，20∶1，16∶1，12∶1，10∶1，8∶1，7∶1，6∶1，5∶1氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱，依次分为12个部分，其中自部分12得到化合物异甘草素-4-O-芹糖(1-2)-葡萄糖苷；部分2经Sephadex LH-20柱层析分离，50％甲醇洗脱，得到化合物绿原酸；部分10用半制备高效液相色谱分离制备，1∶20甲醇-3％醋酸混合溶剂为流动相，得到化合物4，5-二咖啡酰基奎宁酸，3，5-二咖啡酰基奎宁酸，3，4-二咖啡酰基奎宁酸。
50％乙醇洗脱部分用硅胶柱层析分离，49∶1，39∶1，35∶1，30∶1，25∶1，20∶1，16∶1，12∶1，10∶1，8∶1，7∶1，6∶1，5∶1，4∶1，3∶1氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱，依次分为15个部分，其中自部分7得到化合物6-甲氧基大豆素；部分14经制备薄层层析，9∶1氯仿-甲醇混合溶剂为展开剂]制备得到化合物异甘草苷。
70％乙醇洗脱部分用硅胶柱层析分离，25∶1，20∶1，16∶1，12∶1，10∶1，8∶1，7∶1，6∶1氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱，依次分为8个部分。其中自部分5得到化合物3，3’，4-三甲氧基鞣花酸，自部分8得到化合物甘草素。
上述分离得到的31个化合物的结构均经理化常数测定及波谱学方法(紫外光谱、红外光谱、氢核磁共振光谱、碳核磁共振光谱和质谱等)予以测定。其中异甘草素-2’-O-芹糖(1-2)-葡萄糖苷为新化合物，丙烯酸盐、金合欢素、醉鱼草苷、大豆素、染料木素、三十八烯醇、6-甲氧基大豆素、3，3’，4-三甲氧基鞣花酸等8个化合物为首次从本发明各单味药中分离得到的已知化合物，其余22个化合物为首次从本发明中分离得到的已知化合物。
本发明活性部位及活性成份均可按常规工艺制成任何临床上可接受的剂型。
发明人采用鸡胚法和病毒致细胞病变作用(CPE)方法，考察了本发明煎剂和本发明抗流感病毒活性部位的抗流感病毒活性。
1.实验材料
病毒毒株：甲型流感病毒(A1京防86-1)，乙型流感病毒(B1京防93-184)，由北京市防疫站提供。
细胞株：MDCK细胞，由国家流感中心提供。细胞生长液为含小牛血清、青霉素、链霉素和谷胺酰胺的Eagle’s液。维持液同生长液，但不含小牛血清，而含终浓度为2mg/L的胰酶。
样品(本发明煎剂)：按本发明原方比例(金银花∶连翘∶牛蒡子∶甘草∶薄荷∶荆芥∶桔梗∶淡豆豉∶淡竹叶为9∶9∶9∶5∶6∶6∶6∶6∶4)，取金银花、连翘等9味药共60g，混合均匀，加水煎煮2次(第一次加水1000mL，煎煮2小时；第二次加水800mL，煎煮1.5小时)。合并2次水煎液，共计1300mL，水浴浓缩至干。实验前，以高纯水配置成相当于生药0.01g/mL的浓度。
样品(本发明抗病毒活性部位)：取本发明抗流感病毒活性部位以高纯水配置成相当于生药0.01g/mL的浓度。
阳性对照药：病毒唑，湖北省医药工业研究所出品。实验前，以高纯水配置成0.005g/mL的浓度。
2.抗病毒实验
2.1 鸡胚法
将鸡胚在实验室39℃下孵育至10天胚龄，于尿囊腔分别接种100EID50甲型和乙型流感病毒，接种量为0.1ml/胚，每组实验均接种20枚鸡胚。室温放置1小时后，对照组尿囊腔给予生理盐水0.2ml，实验组分别给予本发明煎剂和本发明抗流感病毒活性部位0.2ml，阳性对照组给予病毒唑0.2ml。石蜡封口，置孵箱内孵化，48小时后将鸡胚置冰箱内2小时，收获尿囊液，进行血凝实验。
表1对鸡胚内甲/乙流感病毒的作用*
组别 n 血 凝
(枚) 阳性 阴性
生理盐水 20/20 20/20 0/0
本发明煎剂** 20/20 4/3 16/17
本发明抗病毒活性部位** 20/20 0/0 20/20
病毒唑*** 20/20 0/0 20/20
* 甲：A/京防86-1，乙：B/京防93-184
** 本发明、本发明抗病毒活性部位相当于生药0.01g/mL
*** 病毒唑0.005g/mL
表2对甲/乙流感病毒杀灭、预防和治疗作用*
给药时间 本发明煎剂** 本发明活性部位** 病毒唑***病毒对照病毒感染同时 3.5/3.0 2.0/1.5 1.5/1.3 6.5/5.5病毒感染前 3.0/3.5 1.5/1.8 1.5/1.5 7.0/6.0病毒感染后 4.0/2.5 2.5/1.5 2.0/1.5 6.5/4.5
*甲：A/京防86-1，乙：B/京防93-184
**本发明、本发明抗病毒活性部位相当于生药0.01g/mL
***病毒唑0.005g/mL
表3 不同浓度本发明抗流感病毒活性部位在细胞中抗甲/乙流感病毒作用*
病毒 给药时间 本发明抗病毒活性部位浓度 病毒对照
0.01g/mL 0.005g/mL 0.0025g/mL
甲/乙 病毒感染同时 2.0/1.5 3.5/2.5 5.0/4.5 6.5/5.5
*甲：A/京防86-1，乙：B/京防93-184
2. 2 毒致细胞病变作用(CPE)
取成片MDCK细胞，弃去生长液，用Hank’s液洗一次。将A1京防86-1和B1京防93-184病毒配置成10-1～10-8稀释液，然后分别加入试管中。2小时后倒掉病毒液，用Hank’s液洗一次，在分别加入相当于生药浓度0.01g/ml的本发明煎剂和本发明抗流感病毒活性部位以及终浓度为0.005g/ml的病毒唑，对照组分别加入1ml维持液。置37℃5％CO2培养箱中培养，72小时后在倒置显微镜下观察。
表4本发明抗流感病毒活性部位在MDCK细胞中的抗病毒作用
样品 TCID50
甲型流感病毒 乙型流感病毒
生理盐水 6.5 4.5
本发明煎剂 4.0 2.5
本发明抗病毒活性部位 2.5 1.5
病毒唑 2.0 1.5
3.实验结果
由表1～3可知，本发明抗病毒活性部位和阳性对照组均未出现血凝现象，说明本发明抗病毒活性部位对甲型和乙型流感病毒均有显著的抑制作用，使流感病毒滴度降低。由表4可知，本发明抗病毒活性部位对甲型和乙型流感病毒，其TCID50比病毒对照组低1.5log以上，说明本发明抗流感病毒活性部位在这两种病毒感染过程中具有治疗作用。发明人还对抗流感病毒活性部位的抗流感病毒作用机理进行了研究：
1实验材料
1.1 药物与试剂
受试药物：本发明抗流感病毒活性部位
阳性对照药：病毒唑(virazole)，湖北省滨湖制药厂产品，为原料药(批号970512)，体外实验时以高纯水配制成药物浓度为0.5mg/ml的原药液。
试剂：细胞培养液：含10％小牛血清、0.29g/ml谷氨酰胺、100u/ml青、链霉素的Eagle’s MEM(日本日水制药株式会社出品)；细胞维持液：除所含小牛血清为2％外，其它含量均同培养液。
1.2 病毒与细胞
病毒：呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒-I型(HN-I)、流感病毒A3型，购自中国预防医学科学院病毒研究所及儿科研究所，中国中医研究院中药研究所病毒室传代，-70℃保存备用。
细胞：人喉癌传代细胞Hep-2株，由卫生部药品生物制品检定所提供。
1.3 仪器
CO2培养箱，日本Yamato科学株式会社制造；倒置显微镜，德国产Olympus牌。
2实验方法
2.1 本发明抗流感病毒活性部位对Hep-2培养细胞的毒性试验
将本发明抗流感病毒活性部位样品液(实验前用高纯水配制成药物浓度为100mg/ml的原药液，过滤除菌)以细胞培养液作1∶2～1∶256倍比稀释。取已长成单层的Hep-2细胞，倒掉培养液，加入不同稀释度的药液，每孔加100μl，每个稀释度各加4个复孔，同时设正常细胞对照。将培养板置37℃5％CO2培养箱中培养4天，每日用倒置显微镜观察药液对细胞的影响，以细胞不出现退变的最小稀释度判定为药物对细胞的最大无毒浓度。
通过毒性试验观察到1∶256倍比稀释的本发明抗流感病毒活性部位原药液对细胞生长无明显影响，故定为最大无毒浓度(即最大有效浓度)，实验时以最大有效浓度顺延至最小有效浓度。
2.2 本发明抗流感病毒活性部位对病毒致细胞病变作用(CPE)的影响
2.2.1 先感染后加药
取已长成单层细胞的96孔培养板，倒掉培养液，分别接种100TCID50的不同病毒液50μl/孔，置37℃5％CO2培养箱中吸附1h；倒掉病毒液，用不含小牛血清的细胞维持液洗细胞面3次，然后加入相应稀释度的药液100ul/孔，每个稀释度作4个复孔，同时设病毒对照、正常细胞对照及阳性药对照。置37℃5％CO2培养箱中培养，每日在倒置显微镜下镜检1次，观察细胞有无病变及病变进展情况。
2.2.2 先加药后感染
取已长成单层细胞的96孔培养板，倒掉培养液，加入相应稀释度的药液100μl/孔，置37℃5％CO2培养箱中作用1h；倒掉药液，再感染100TCID50的不同病毒液50μl/孔，置37℃5％CO2培养箱中吸附1h；倒掉病毒液，用细胞维持液洗细胞面3次，然后每孔加入100μl细胞维持液，置37℃5％CO2培养箱中培养，每日在倒置显微镜下镜检1次，观察细胞有无病变及病变进展情况。
2.2.3 对病毒的直接杀灭作用
把100TCID50的不同病毒液加入到相应稀释度的药液中，置37℃5％CO2培养箱中作用1h；之后将其加入到已长成单层细胞的96孔培养板中，置37℃5％CO2培养箱中吸附1h；倒掉溶液，用细胞维持液洗细胞面3次，然后每孔加入100μl细胞维持液，置37℃5％CO2培养箱中培养，每日在倒置显微镜下镜检1次，观察细胞有无病变及病变进展情况。
3实验结果
上述实验中，当病毒对照组细胞病变达到“++++”时记录实验结果。细胞病变程度(CPE)的判断按以下6级分类标准，结果采用秩和检验进行统计学处理。细胞病变程度(CPE)判断的6级分类标准：“-”：细胞正常生长，无病变出现；“±”：细胞病变少于整个单层细胞的10％；“+”：细胞病变约占整个单层细胞的25％；“++”：细胞病变约占整个单层细胞的50％；“+++”：细胞病变约占整个单层细胞的75％；“++++”：细胞病变约占整个单层细胞的75％以上。同时计算相应的有效浓度范围、抑制50％细胞病变的药物浓度(IC50)及治疗指数(TI)。实验结果见表5、6、7。
有效浓度＝原药液浓度/稀释倍数
治疗指数＝最大无度浓度/最小有效浓度
IC50按Reed-Muench法计算。
表5本发明抗流感病毒活性部位的抗病毒活性
| 药物 | 浓度(mg/ml) | 先感染后加药 先加药后感染 |
| 流感病毒A3 HN-1 RSV 流感病毒A3 HN-1 RSV | ||
| 本发明抗流感病毒活性部位病毒唑 | 0.3900.1950.0970.0490.0240.5000.2500.1250.0620.031 | -------** ------** 4444 3333 4444 4444±±±±** ±±±±* 4444 3333 4444 44441111** 2322** 4444 3333 4444 44443333 4444 4444 3333 4444 44443333 4444 4444 3333 4444 4444-------** ------** 3333 1111** ±±±±**4444-------** ------** 4444 2222* 1111** 4444±±±±** ±±±±**4444 3333 3333 44443333 4444 4444 3333 4444 44443333 4444 4444 3333 4444 44443333 4444 4444 3333 4444 4444 |
| 生理盐水 | ||
注：表中的数字为每个细胞孔的细胞病变程度(CPE)相应的病变等级。
与病毒对照组比较：**P＜0.01 *P＜0.05
表5结果显示，药物直接作用于病毒及先给药物后再感染病毒时，本发明抗流感病毒活性部位均没有表现出抑制作用；而当先感染病毒后再给药时，本发明抗流感病毒活性部位对流感病毒A3和副流感病毒所致细胞病变则表现出明显的抑制作用，与病毒对照组比较有显著性差异(P＜0.05)；而对RSV则无效。
表6本发明抗流感病毒活性部位有效浓度范围(mg/ml)
本发明抗流感病毒活性部位 病毒唑
流感病毒A3 0.097～0.390 0.125～0.500
HN-I 0.097～0.390 0.250～0.500
RSV - -注：“-”表示对所试病毒无效
表6结果显示，在体外本发明抗流感病毒活性部位对对流感病毒A3和副流感病毒有明显的抑制作用，有效浓度在0.097～0.390mg/ml之间，与阳性药病毒唑作用相当。
表7本发明抗流感病毒活性部位IC50(mg/ml)和治疗指数TI
本发明抗流感病毒活性部位 病毒唑
IC50 TI IC50 TI
流感病毒A3 0.071 4 8.91 4
HN-I 0.083 4 8.91 2
RSV - - - -注：“-”表示对所试病毒无效
表7结果显示，在体外本发明抗流感病毒活性部位对流感病毒A3和副流感病毒的IC50在0.071～0.083之间，治疗指数均为4。
实施例1
按比例称取金银花0.9kg、连翘0.9kg、牛蒡子0.9kg、甘草0.5kg、薄荷0.6kg、荆芥0.6kg、桔梗0.6kg、淡豆豉0.6kg、淡竹叶0.4kg，取金银花、连翘等9味药共6kg，混合均匀，加水煎煮2次，第一次加水100L，煎煮2小时；第二次加水80L，煎煮1.5小时；合并2次水煎液，浓缩至60L；通过弱极性的AB-8大孔吸附树脂进行吸附，树脂体积为15L，吸附流速为2L/h；待水煎液全部通过树脂柱后，用8倍树脂体积，即约120L的水继续冲洗树脂柱，至水洗液近无色止，然后再用8倍树脂体积，即约120L的50％乙醇对树脂柱上吸附的物质进行洗脱，洗脱流速为2L/h；收集50％乙醇洗脱液，减压回收溶剂至干，即得到本发明抗流感病毒活性部位350g。计算本发明抗流感病毒活性部位的得率为5.83％。
实施例2
按比例称取金银花0.9kg、连翘0.9kg、牛蒡子0.9kg、甘草0.5kg、薄荷0.6kg、荆芥0.6kg、桔梗0.6kg、淡豆豉0.6kg、淡竹叶0.4kg，取金银花、连翘等9味药共6kg，混合均匀，加水煎煮3次，第一次加水100L，煎煮2小时；第二、三次加水80L，煎煮1.5小时；合并3次水煎液，浓缩至60L；通过弱极性的AB-8大孔吸附树脂进行吸附，树脂体积为15L，吸附流速为2L/h；待水煎液全部通过树脂柱后，用8倍树脂体积，即约120L的水继续冲洗树脂柱，至水洗液近无色止，然后再用8倍树脂体积，即约120L的60％乙醇对树脂柱上吸附的物质进行洗脱，洗脱流速为2L/h；收集60％乙醇洗脱液，减压回收溶剂至干，即得到本发明抗流感病毒活性部位350g。计算本发明抗流感病毒活性部位的得率为5.83％；将活性部位常规赋性剂制成胶囊。
实施例3：
活性成份的分离方法：取本发明抗流感病毒活性部位300g，通过弱极性大孔吸附树脂，用30％、50％、70％、95％乙醇水溶液依次进行洗脱，各部分洗脱液减压回收溶剂后，分别得到30％乙醇洗脱物A72g，50％乙醇洗脱物B93g，70％乙醇洗脱物C12g，95％乙醇洗脱物D6g。
上述95％乙醇洗脱物D，用聚酰胺柱层析分离，水-乙醇混合溶剂梯度洗脱，分为30％乙醇洗脱部分、50％乙醇洗脱部分和70％乙醇洗脱部分。
30％乙醇洗脱部分用Sephadex LH-20柱层析分离，95％乙醇洗脱，得到化合物丙烯酸盐5mg。
50％乙醇洗脱部分经硅胶柱层析分离，20∶1，18∶1，15∶1，12∶1氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱，其中15∶1氯仿-甲醇混合溶剂洗脱部分经SephadexLH-20柱层析分离，甲醇洗脱，得到化合物金合欢素18mg。
上述70％乙醇洗脱物C，用聚酰胺柱层析分离，水-乙醇混合溶剂梯度洗脱，分为水洗脱部分、30％乙醇洗脱部分和50％乙醇洗脱部分，水洗脱部分用Sephadex LH-20柱层析分离，水洗脱，得到化合物甘草次酸10mg和连翘苷22mg；30％乙醇洗脱部分经Sephadex LH-20柱层析分离，95％乙醇洗脱，硅胶柱层析分离，19∶1氯仿-甲醇混合溶剂洗脱、Sephadex LH-20柱层析分离，甲醇洗脱，得到化合物醉鱼草苷18mg；50％乙醇洗脱部分经Sephadex LH-20柱层析分离，95％乙醇洗脱，硅胶柱层析分离，10∶1，9∶1，7∶1，6∶1，5∶1，4∶1氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱，其中自6∶1氯仿-甲醇混合溶剂洗脱部分得到化合物连翘酯苷5mg。
上述50％乙醇洗脱物B，用聚酰胺柱层析分离，水-乙醇混合溶剂梯度洗脱，分为水洗脱部分、10％乙醇洗脱部分、30％乙醇洗脱部分、50％乙醇洗脱部分和70％乙醇洗脱部分。
水洗脱部分用硅胶柱层析分离，分为水洗脱部分、10％乙醇洗脱部分、30％乙醇洗脱部分、50％乙醇洗脱部分和70％乙醇洗脱部分。
水洗脱部分用硅胶柱层析分离，98∶2∶0.1，95∶5∶0.1，90∶5∶0.1，85∶5∶0.1，80∶5∶0.1，75∶5∶0.1，70∶5∶0.1，65∶5∶0.1，60∶5∶0.1，55∶5∶0.1，50∶5∶0.1，40∶5∶0.1，35∶5∶0.1，30∶5∶0.1氯仿-甲醇-水混合溶剂梯度洗脱，依次分为14个部分。其中部分4用硅胶柱层析分离，9∶1氯仿-甲醇混合溶剂洗脱得到化合物牛蒡子苷95mg；部分7用硅胶柱层析分离，11∶1氯仿-甲醇混合溶剂洗脱得到化合物橙皮苷16mg；部分9经Sephadex LH-20柱层析分离，95％乙醇洗脱，得到化合物乌拉尔甘草皂苷甲24mg，乌拉尔甘草皂苷乙18mg；部分14经Sephadex LH-20柱层析分离，95％乙醇洗脱，得到化合物甘草酸18mg。
30％乙醇洗脱部分用硅胶柱层析分离，9∶1氯仿-甲醇混合溶剂洗脱，按色带分别收集，得到第1、2、3部分；7∶1氯仿-甲醇混合溶剂洗脱，按色带分别收集，得到第4、5、6部分；4∶1氯仿-甲醇混合溶剂洗脱得到第7部分。其中自部分1得到化合物芒柄花素8mg；部分2经Sephadex LH-20柱层析分离，甲醇洗脱，聚酰胺柱层析分离，19∶1氯仿-甲醇混合溶剂洗脱，得到化合物芦丁33mg和异甘草素21mg；部分7经Sephadex LH-20柱层析分离，95％乙醇洗脱，聚酰胺柱层析分离，9∶1氯仿-甲醇混合溶剂洗脱，1∶1甲醇-水混合溶剂为流动相半制备高效液相色谱分离制备，得到化合物异甘草素-2’-O-芹糖(1-2)-葡萄糖苷12mg。
50％乙醇洗脱部分用硅胶柱层析分离，60∶1，50∶1，40∶1，30∶1，25∶1，20∶1，16∶1，12∶1氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱，依次分为8个部分，其中自部分1得到化合物大豆素23mg；部分2经Sephadex LH-20柱层析分离，80％甲醇洗脱，得到化合物染料木素18mg；部分8用硅胶柱层析分离，20∶1氯仿-甲醇混合溶剂洗脱得到化合物三十八烯醇12mg。
上述30％乙醇洗脱物A，用聚酰胺柱层析分离，水-乙醇混合溶剂梯度洗脱，分为水洗脱部分、10％乙醇洗脱部分、30％乙醇洗脱部分、50％乙醇洗脱部分和70％乙醇洗脱部分。
水洗脱部分用硅胶柱层析分离，49∶1，39∶1，35∶1，30∶1，25∶1，20∶1，16∶1，12∶1，10∶1，8∶1，7∶1，6∶1，5∶1，4∶1氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱，依次分为14个部分。其中部分13经Sephadex LH-20柱层析分离，50％甲醇洗脱，得到化合物异甘草素-4’-O-芹糖(1-2)-葡萄糖苷42mg。
10％乙醇洗脱部分用硅胶柱层析分离，9∶1氯仿-甲醇混合溶剂洗脱，按色带分别收集，得到10个部分。其中自部分2得到化合物甘草苷33mg；自部分10得到化合物甘草素-4’-O-芹糖(1-2)-葡萄糖苷5mg；部分9用聚酰胺柱层析分离，5∶1氯仿-甲醇混合溶剂洗脱，得到化合物金丝桃苷15mg。
30％乙醇洗脱部分用硅胶柱层析分离，40∶1，35∶1，30∶1，25∶1，20∶1，16∶1，12∶1，10∶1，8∶1，7∶1，6∶1，5∶1氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱，依次分为12个部分，其中自部分12得到化合物异甘草素-4-O-芹糖(1-2)-葡萄糖苷12mg；部分2经Sephadex LH-20柱层析分离，50％甲醇洗脱，得到化合物绿原酸13mg；部分10用半制备高效液相色谱分离制备，1∶20甲醇-3％醋酸混合溶剂为流动相，得到化合物4，5-二咖啡酰基奎宁酸6mg，3，5-二咖啡酰基奎宁酸4mg，3，4-二咖啡酰基奎宁酸12mg。
50％乙醇洗脱部分用硅胶柱层析分离，49∶1，39∶1，35∶1，30∶1，25∶1，20∶1，16∶1，12∶1，10∶1，8∶1，7∶1，6∶1，5∶1，4∶1，3∶1氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱，依次分为15个部分，其中自部分7得到化合物6-甲氧基大豆素4mg；部分14经制备薄层层析，9∶1氯仿-甲醇混合溶剂为展开剂]制备得到化合物异甘草苷12mg。
70％乙醇洗脱部分用硅胶柱层析分离，25∶1，20∶1，16∶1，12∶1，10∶1，8∶1，7∶1，6∶1氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱，依次分为8个部分。其中自部分5得到化合物3，3’，4-三甲氧基鞣花酸50mg，自部分8得到化合物甘草素15mg。
Claims (7)
1、一种抗流感病毒的药物组合物，其特征在于该方法是由下述重量份的原料制成的：金银花9重量份、连翘9重量份、牛蒡子9重量份、甘草5重量份、薄荷6重量份、荆芥6重量份、桔梗6重量份、淡豆豉6重量份、淡竹叶4重量份。
2、一种抗流感病毒的药物有效部位，其特征在于该有效部位是由下述方法制得的：取金银花9重量份、连翘9重量份、牛蒡子9重量份、甘草5重量份、薄荷6重量份、荆芥6重量份、桔梗6重量份、淡豆豉6重量份、淡竹叶4重量份，混合均匀，加水煎煮2-3次，合并各次水煎液，浓缩，通过弱极性的大孔吸附树脂进行吸附，待水煎液全部通过树脂柱后，用水继续冲洗树脂柱，至水洗液近无色止，然后再用40-70％乙醇对树脂柱上吸附的物质进行洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收溶剂至干，即得到复方中药抗流感病毒活性部位。
3、如权利要求2所述的一种抗流感病毒的药物有效部位，其特征在于该有效部位是由下述方法制得的：按比例称取金银花0.9kg、连翘0.9kg、牛蒡子0.9kg、甘草0.5kg、薄荷0.6kg、荆芥0.6kg、桔梗0.6kg、淡豆豉0.6kg、淡竹叶0.4kg，取金银花、连翘等9味药共6kg，混合均匀，加水煎煮2次，第一次加水100L，煎煮2小时；第二次加水80L，煎煮1.5小时；合并2次水煎液，浓缩至60L；通过弱极性的AB-8大孔吸附树脂进行吸附，树脂体积为15L，吸附流速为2L/h；待水煎液全部通过树脂柱后，用8倍树脂体积，即约120L的水继续冲洗树脂柱，至水洗液近无色止，然后再用8倍树脂体积，即约120L的50％乙醇对树脂柱上吸附的物质进行洗脱，洗脱流速为2L/h；收集50％乙醇洗脱液，减压回收溶剂至干，即得到本发明抗流感病毒活性部位350g。
4、如权利要求2或3所述的有效部位，特征在于该有效部位在制备抗流感病毒的药物中的应用。
5、抗流感病毒的药物活性成分，其特征在于该活性成分是由下述方法制得的：按比例称取金银花9重量份、连翘9重量份、牛蒡子9重量份、甘草5重量份、薄荷6重量份、荆芥6重量份、桔梗6重量份、淡豆豉6重量份、淡竹叶4重量份，混合均匀，加水煎煮2-3次，合并各次水煎液，浓缩，通过弱极性的大孔吸附树脂进行吸附，待水煎液全部通过树脂柱后，用水继续冲洗树脂柱，至水洗液近无色止，然后再用40-70％乙醇对树脂柱上吸附的物质进行洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收溶剂至干，即得到复方中药抗流感病毒活性部位；
取本发明抗流感病毒活性部位300重量份，通过弱极性大孔吸附树脂，用30％、50％、70％、95％乙醇水溶液依次进行洗脱，各部分洗脱液减压回收溶剂后，分别得到30％乙醇洗脱物A72重量份，50％乙醇洗脱物B93重量份，70％乙醇洗脱物C12重量份，95％乙醇洗脱物D6重量份；
上述95％乙醇洗脱物D，用聚酰胺柱层析分离，水-乙醇混合溶剂梯度洗脱，分为30％乙醇洗脱部分、50％乙醇洗脱部分和70％乙醇洗脱部分；
30％乙醇洗脱部分用Sephadex LH-20柱层析分离，95％乙醇洗脱，得到化合物丙烯酸盐；
50％乙醇洗脱部分经硅胶柱层析分离，20∶1，18∶1，15∶1，12∶1氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱，其中15∶1氯仿-甲醇混合溶剂洗脱部分经Sephadex LH-20柱层析分离，甲醇洗脱，得到化合物金合欢素；
上述70％乙醇洗脱物C，用聚酰胺柱层析分离，水-乙醇混合溶剂梯度洗脱，分为水洗脱部分、30％乙醇洗脱部分和50％乙醇洗脱部分，水洗脱部分用Sephadex LH-20柱层析分离，水洗脱，得到化合物甘草次酸和连翘苷；30％乙醇洗脱部分经Sephadex LH-20柱层析分离，95％乙醇洗脱，硅胶柱层析分离，19∶1氯仿-甲醇混合溶剂洗脱、Sephadex LH-20柱层析分离，甲醇洗脱，得到化合物醉鱼草苷；50％乙醇洗脱部分经Sephadex LH-20柱层析分离，95％乙醇洗脱，硅胶柱层析分离，10∶1，9∶1，7∶1，6∶1，5∶1，4∶1氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱，其中自6∶1氯仿-甲醇混合溶剂洗脱部分得到化合物连翘酯苷；
上述50％乙醇洗脱物B，用聚酰胺柱层析分离，水-乙醇混合溶剂梯度洗脱，分为水洗脱部分、10％乙醇洗脱部分、30％乙醇洗脱部分、50％乙醇洗脱部分和70％乙醇洗脱部分；
水洗脱部分用硅胶柱层析分离，分为水洗脱部分、10％乙醇洗脱部分、30％乙醇洗脱部分、50％乙醇洗脱部分和70％乙醇洗脱部分；
水洗脱部分用硅胶柱层析分离，98∶2∶0.1，95∶5∶0.1，90∶5∶0.1，85∶5∶0.1，80∶5∶0.1，75∶5∶0.1，70∶5∶0.1，65∶5∶0.1，60∶5∶0.1，55∶5∶0.1，50∶5∶0.1，40∶5∶0.1，35∶5∶0.1，30∶5∶0.1氯仿-甲醇-水混合溶剂梯度洗脱，依次分为14个部分；其中部分4用硅胶柱层析分离，9∶1氯仿-甲醇混合溶剂洗脱得到化合物牛蒡子苷；部分7用硅胶柱层析分离，11∶1氯仿-甲醇混合溶剂洗脱得到化合物橙皮苷；部分9经Sephadex LH-20柱层析分离，95％乙醇洗脱，得到化合物乌拉尔甘草皂苷甲，乌拉尔甘草皂苷乙；部分14经Sephadex LH-20柱层析分离，95％乙醇洗脱，得到化合物甘草酸；
30％乙醇洗脱部分用硅胶柱层析分离，9∶1氯仿-甲醇混合溶剂洗脱，按色带分别收集，得到第1、2、3部分；7∶1氯仿-甲醇混合溶剂洗脱，按色带分别收集，得到第4、5、6部分；4∶1氯仿-甲醇混合溶剂洗脱得到第7部分；其中自部分1得到化合物芒柄花素；部分2经SephadexLH-20柱层析分离，甲醇洗脱，聚酰胺柱层析分离，19∶1氯仿-甲醇混合溶剂洗脱，得到化合物芦丁和异甘草素；部分7经Sephadex LH-20柱层析分离，95％乙醇洗脱，聚酰胺柱层析分离，9∶1氯仿-甲醇混合溶剂洗脱，1∶1甲醇-水混合溶剂为流动相半制备高效液相色谱分离制备，得到化合物异甘草素-2’-O-芹糖(1-2)-葡萄糖苷；
50％乙醇洗脱部分用硅胶柱层析分离，60∶1，50∶1，40∶1，30∶1，25∶1，20∶1，16∶1，12∶1氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱，依次分为8个部分，其中自部分1得到化合物大豆素；部分2经Sephadex LH-20柱层析分离，80％甲醇洗脱，得到化合物染料木素；部分8用硅胶柱层析分离，20∶1氯仿-甲醇混合溶剂洗脱得到化合物三十八烯醇；
上述30％乙醇洗脱物A，用聚酰胺柱层析分离，水-乙醇混合溶剂梯度洗脱，分为水洗脱部分、10％乙醇洗脱部分、30％乙醇洗脱部分、50％乙醇洗脱部分和70％乙醇洗脱部分；
水洗脱部分用硅胶柱层析分离，49∶1，39∶1，35∶1，30∶1，25∶1，20∶1，16∶1，12∶1，10∶1，8∶1，7∶1，6∶1，5∶1，4∶1氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱，依次分为14个部分；其中部分13经Sephadex LH-20柱层析分离，50％甲醇洗脱，得到化合物异甘草素-4’-O-芹糖(1-2)-葡萄糖苷；
10％乙醇洗脱部分用硅胶柱层析分离，9∶1氯仿-甲醇混合溶剂洗脱，按色带分别收集，得到10个部分；其中自部分2得到化合物甘草苷，自部分10得到化合物甘草素-4’-O-芹糖(1-2)-葡萄糖苷；部分9用聚酰胺柱层析分离，5∶1氯仿-甲醇混合溶剂洗脱，得到化合物金丝桃苷；
30％乙醇洗脱部分用硅胶柱层析分离，40∶1，35∶1，30∶1，25∶1，20∶1，16∶1，12∶1，10∶1，8∶1，7∶1，6∶1，5∶1氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱，依次分为12个部分，其中自部分12得到化合物异甘草素-4-O-芹糖(1-2)-葡萄糖苷；部分2经Sephadex LH-20柱层析分离，50％甲醇洗脱，得到化合物绿原酸；部分10用半制备高效液相色谱分离制备，1∶20甲醇-3％醋酸混合溶剂为流动相，得到化合物4，5-二咖啡酰基奎宁酸，3，5-二咖啡酰基奎宁酸，3，4-二咖啡酰基奎宁酸；
50％乙醇洗脱部分用硅胶柱层析分离，49∶1，39∶1，35∶1，30∶1，25∶1，20∶1，16∶1，12∶1，10∶1，8∶1，7∶1，6∶1，5∶1，4∶1，3∶1氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱，依次分为15个部分，其中自部分7得到化合物6-甲氧基大豆素；部分14经制备薄层层析，9∶1氯仿-甲醇混合溶剂为展开剂]制备得到化合物异甘草苷；
70％乙醇洗脱部分用硅胶柱层析分离，25∶1，20∶1，16∶1，12∶1，10∶1，8∶1，7∶1，6∶1氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱，依次分为8个部分；其中自部分5得到化合物3，3’，4-三甲氧基鞣花酸，自部分8得到化合物甘草素。
6、一种新的化合物，其特征在于该化合物为：异甘草素-2’-O-芹糖(1-2)-葡萄糖苷。
7、如权利要求5或6所述的活性成分，特征在于该活性成分在制备抗流感病毒的药物中的应用。
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Legal Events
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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Granted publication date: 20050105 Termination date: 20111112 |