CN105859806A

CN105859806A - 从油茶叶中提取3,3′-二甲基鞣花酸-4′-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的方法

Info

Publication number: CN105859806A
Application number: CN201610278240.7A
Authority: CN
Inventors: 曹清明; 王蔚婕; 刘晨曦; 钟海雁
Original assignee: Central South University of Forestry and Technology
Current assignee: Central South University of Forestry and Technology
Priority date: 2016-04-29
Filing date: 2016-04-29
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2036-04-29
Also published as: CN105859806B

Abstract

本发明提供了一种从油茶叶中提取3,3'‑二甲基鞣花酸‑4'‑O‑β‑D‑葡萄糖醛酸苷的方法。方法为：经浸提、D101大孔吸附树脂分离、硅胶层析分离、DAC色谱分离、硅胶层析分离、再次DAC色谱分离，中间结合色谱分析，从油茶叶中逐步分离出鞣花酸的纯品。本发明首次从山茶属植物中成功提取出了鞣花酸，并且该提取方法具有收率高、产品纯度高等优点。

Description

从油茶叶中提取3,3′-二甲基鞣花酸-4′-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的方法

技术领域

本发明涉及药物提取技术领域，尤其是涉及一种从油茶叶中提取3，3'-二甲基鞣花酸-4'-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的方法。

背景技术

油茶叶为山茶科植物油茶的叶，其富含多种药效成分，尤其是黄酮类化合物、苷类化合物。黄酮类化合物具有多种生物活性，例如心血管系统活性、抗菌及抗病毒活性、抗肿瘤活性、抗氧化自由基活性、镇痛活性、保肝活性等。苷类化合物具有祛痰止咳、抗肿瘤、抗真菌、抑菌及降胆固醇等生物活性。

如何从油茶叶中提取出鞣花酸类等生物活性成分，对深度开发油茶作物极其重要。

发明内容

本发明的目的在于提供从油茶叶中提取鞣花酸的方法，所述的提取方法首次从油茶叶中成功提取出了3，3'-二甲基鞣花酸-4'-O-β-D-葡萄糖醛酸苷，并且该提取方法具有收率高、产品纯度高等优点。

为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

从油茶叶中提取3，3'-二甲基鞣花酸-4'-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的方法，包括以下步骤：

A：以乙醇溶液为溶剂，对油茶叶进行浸提，得到粗提液；

B：以D101大孔吸附树脂为填料，依次用水、15-25wt％乙醇溶液、75-85wt％乙醇溶液对所述粗提液进行恒定洗脱；

C：将所述75-85wt％乙醇溶液洗脱得到的洗脱液进行硅胶层析分离，用10∶1～1∶3的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，分段收集洗脱液，经色谱分析，合并含有3，3'-二甲基鞣花酸-4'-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的流份段，为第一顺序组分；

D：采用DAC色谱柱，用55-65％甲醇-水为流动相对所述第一顺序组分进行恒定洗脱，分段收集洗脱液，经色谱分析，合并含有3，3'-二甲基鞣花酸-4'-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的流份段，命名为第二顺序组分；

E：对所述第二顺序组分进行硅胶层析，用90-110:10-14:1的二氯甲烷-甲醇-水进行恒定洗脱，分段收集洗脱液，经色谱分析，合并含有3，3'-二甲基鞣花酸-4'-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的流份段，命名为第三顺序组分；

F：采用DAC色谱柱，用65-75％甲醇-水对所述第三顺序组分进行恒定洗脱，分段收集洗脱液，经色谱分析，合并含有3，3'-二甲基鞣花酸-4'-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的流份段。

上述提取方法由粗至精的方式从油茶叶中逐步分离出3，3'-二甲基鞣花酸-4'-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(简称为CO-5)的纯品。

以干油茶叶为基准，本发明对CO-5的提取率在24.7mg/kg以上，并且产品的纯度均在90％以上。

本发明所述的流动相(即洗脱所用的液体)的比例均指体积比，流动相中的“％”指非水物质所占的体积百分数，乙醇溶液均指乙醇的水溶液，例如，15-25％乙醇溶液指乙醇体积百分比为15-25％水溶液。55-65％甲醇-水指甲醇体积百分比为55-65％的水溶液。

本发明所述的恒定洗脱是指流动相的组成比例固定。

本发明所述的梯度洗脱是指在洗脱过程中不断改变流动相的浓度配比，但起始浓度和终点浓度是固定的，例如步骤C中的梯度洗脱是指：二氯甲烷-甲醇按照起始浓度为9-11∶1、洗脱终点浓度为1∶2.5-3.5的方式进行梯度洗脱。

本发明所述的DAC色谱柱指轴向动态压缩工业色谱柱。

本发明所述的提取方法适用于不同种属的油茶叶，尤其适合普通油茶(Camellia oleifera Abel)，其提取率高。

本发明所述的提取方法的各个步骤可以进一步改进，例如：

步骤A中，浸提所用的溶剂、料液比、温度对粗提液中的杂质含量以及有效成分的提取率都有影响。溶剂优选用40-60％的乙醇-水溶液，更优选50％的乙醇-水溶液。料液比优选为1：2.5-3.5(1g固体：2.5-3.5mL溶剂)，更优选1：2.5-3。浸提温度优选为70-80℃，并且以回流浸提为最佳。采用以上浸提条件能降低粗提液中的杂质含量，提高鞣花酸的提取率。

另外，为了降低后期分离的难度，在浸提之后可以浓缩干燥粗提液，除去乙醇。

步骤B中，每个梯度洗脱所用流动相的体积优选为柱体积的3.5-4.5倍，更优选为4-4.5倍，保证待提取成分能够被充分洗脱出来。所用流动相的浓度优选水、15-20％乙醇溶液、75-80％乙醇溶液。

步骤C中，硅胶层析分离为分离手段，色谱分析为评价分离结果的手段，两者互相配合，筛选出含有CO-5目标提取物的洗脱液。筛选通常为粗筛选，一般是经色谱分析，先将色谱图相似的洗脱液合并，然后与目标提取物的标准品色谱图对比，从中筛选出含有目标提取物的洗脱液，将其合并。当然，也可以不经过合并，直接与目标提取物的标准品色谱图对比来选出有用的洗脱液，这种做法工作量较大，但是结果更精确。

所述步骤C中，所用的硅胶的粒径优选为200-300目，所述梯度洗脱优选为：用9-10∶1至1∶2.5-3梯度的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，采用以上进一步优化的条件，可以提高分离度和柱效。

在所述步骤C中，所述硅胶层析分离之前还包括：将所述75-85％乙醇溶液洗脱得到的洗脱液浓缩干燥，可以避免乙醇对后续硅胶层析的干扰。

另外，所述步骤C中的色谱分析可以是薄层色谱(TLC)、高效液相色谱等任意能用于定性的方法，其中后者更准确。

另外，在进行硅胶层析时，为了保证待分离物均匀分散在硅胶之中，优选将二氯甲烷-甲醇稀释待分离物，同时拌入硅胶，之后再水浴蒸干。经过以上处理后的物质再装入硅胶柱中进行层析。

同样，所述步骤D、E、F中，经色谱分析可以为：高效液相色谱分析，和/或薄层分析等。

所述步骤D中，流动相的浓度优选55-60％甲醇-水时，具有更高的分离度。

所述步骤E中，所用的硅胶的粒径优选为200-300目，所述二氯甲烷-甲醇-水的比例优选为90-100:10-12:1，以提高分离度和柱效。所采用的色谱分析可以为高效液相色谱分析、薄层分析等。

所述步骤F中，流动相优先用70％甲醇-水，提高柱效。

与现有技术相比，本发明能达到以下技术效果：

(1)首次从油茶叶中提取了出高纯度的3，3’-二甲基鞣花酸-4’-O-β-D-葡萄糖醛酸苷；

(2)由粗到精的提取方式利于提取方法的规模化推广；

(3)提取收率高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1提供的80％乙醇洗脱后收集的样品的液相色谱图；

图2为CO-5的¹H-NMR谱图；

图3为CO-5的¹³C-NMR谱图。

具体实施方式

下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明中所述的流动相的比例均指体积比。

实施例1

第一步：

将自然阴干的油茶干燥叶粉碎过60目筛，取20kg分两批用50％乙醇按料液比1∶3在70-80℃加热回流，重复提取2次，每次提取2h，合并所得上清液，过滤获得上清液，减压浓缩至无醇味，得到原体积约一半的粗提液样品，备用。

第二步：

用工业酒精处理约10L的D101型大孔吸附树脂，用水洗到无醇味，将第一步得到的提取液分两次上样，依次用水、20％乙醇、80％乙醇洗脱，每个梯度洗脱4倍柱体积，根据TLC和HPLC分析结果，各部位合并浓缩。

80％乙醇洗脱后收集的样品浓缩干燥(约150g，其HPLC谱图如图1所示，洗脱程序：0-10min50％甲醇水溶液，10-20min80％甲醇水溶液，20-21 min100％甲醇；检测波长254nm，进样量10μL)，溶解于10∶1的二氯甲烷-甲醇中，拌入300g薄层层析硅胶(200～300目)，水浴挥干，分两次装柱，其中每次空白层装填硅胶约800g。

流动相系统为二氯甲烷-甲醇(10∶1至1∶3梯度洗脱)，每500mL收集为一次，经过TLC检测合并为1-2+2’(表示：将第一次硅胶柱的第一个流份、第二个流份以及第二次硅胶柱的第二个流份合并)，3-7+3’-7’，8-10+8’-10’，11-13+11’，14-16+12’-13’，17-19+14’，20-22+15’-18’，19’-21’，23-26+22’-27’，27-40，28’-34’，35’-44’，41-47，48-64，65，66-67，68-70，71，72-78，45’-51’，52’-63’，64’-67’，68’-71’，72’-84’共计24个组分(两次硅胶柱的流份用序号后面的符号“’”加以区分，部分流份进行交叉合并，用加号衔接(同一次硅胶柱的流份用-衔接)，例如，第一次装柱的提取液经洗脱后，收集的液体编号分别为1、2……78，第二次装柱的提取液经洗脱后，收集的液体编号分别为1’、2’……84’)。

第三步：

27-40利用DAC制备色谱分离，60％甲醇-水恒定洗脱，得到化合物CO-1(56.4mg)，CO-2(39.2mg)，CO-3(9.1mg)，以及一个含多个化合物的复杂组分fr.A(865mg)。

第四步：

将fr.A流份溶解于一定比例的二氯甲烷-甲醇中，拌入2.5g薄层层析硅胶(200-300目)，水浴挥干，空白层装填硅胶约40g。流动相系统为二氯甲烷-甲醇-水(100:12:1恒定洗脱)，每40mL收集为一个流份，经过TLC检测合并为1，2，3，4-12(编号方法同第二步)。

第五步：

将第四步的4-12利用DAC制备色谱分离，70％甲醇-水恒定洗脱，分段收集洗脱液，经色谱分析，仅收集含有CO-5的流份，得到化合物CO-5 (4.7mg)。

第六步：表征提取物

将CO-5进行质谱检测，如图2所示。

将CO-5进行核磁共振图谱检测，CO-5的¹H-NMR、¹³C-NMR分别如图2和3所示。经检测，CO-5的纯度为93.2％。

结合上述表征结果可以确定CO-5的分子式如下式(一)。

实施例2

第一步：

将自然阴干的油茶干燥叶粉碎过60目筛，取20kg分两批用40％乙醇按料液比1∶2.5在70-80℃加热回流，重复提取2次，每次提取2h，合并所得上清液，过滤获得上清液，减压浓缩至无醇味，得到原体积约一半的粗提液样品，备用。

第二步：

用工业酒精处理约10L的D101型大孔吸附树脂，用水洗到无醇味，将第一步得到的提取液分两次上样，依次用水、15％乙醇、75％乙醇洗脱，每个梯度洗脱4.5倍柱体积，根据TLC和HPLC分析结果，各部位合并浓缩。

80％乙醇洗脱后收集的样品浓缩干燥(约150g)，溶解于10∶1的二氯甲烷-甲醇中，拌入300g薄层层析硅胶(200～300目)，水浴挥干，分两次装柱，其中每次空白层装填硅胶约800g。

流动相系统为二氯甲烷-甲醇(9∶1至1∶2.5梯度洗脱)，每500mL收集为一次，经过TLC检测合并含有3，3'-二甲基鞣花酸-4'-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(CO-5)的流份段，命名为第一顺序组分。

第三步：

第一顺序组分利用DAC制备色谱分离，55％甲醇-水恒定洗脱，经色谱分析，合并含CO-5的复杂组分，命名为第二顺序组分。

第四步：

将第二顺序组分溶解于一定比例的二氯甲烷-甲醇中，拌入2.5g薄层层析硅胶(200-300目)，水浴挥干，空白层装填硅胶约40g。流动相系统为二氯甲烷-甲醇-水(90:10:1恒定洗脱)，每40mL收集为一个流份，经过TLC检测，将含有CO-5的流份段合并，命名为第三顺序组分。

第五步：

将第四步的第三顺序组分利用DAC制备色谱分离，65％甲醇-水恒定洗脱，分段收集洗脱液，经色谱分析，仅收集含有CO-5的流份，得到化合物CO-5(5.1mg)。

第六步：表征提取物

同样，采用质谱和¹H-NMR、¹³C-NMR进行表征，结果与实施例1相同，CO-5为3，3’-二甲基鞣花酸-4’-O-β-D-葡萄糖醛酸苷。

实施例3

第一步：

将自然阴干的油茶干燥叶粉碎过60目筛，取20kg分两批用60％乙醇按料液比1∶3.5在70-80℃加热回流，重复提取2次，每次提取2h，合并所得上清液，过滤获得上清液，减压浓缩至无醇味，得到原体积约一半的粗提液样品，备用。

第二步：

用工业酒精处理约10L的D101型大孔吸附树脂，用水洗到无醇味，将第一步得到的提取液分两次上样，依次用水、25％乙醇、85％乙醇洗脱，每个梯度洗脱3.5倍柱体积，根据TLC和HPLC分析结果，各部位合并浓缩。

流动相系统为二氯甲烷-甲醇(11∶1至1∶3.5梯度洗脱)，每500mL收集为一次，经过TLC检测合并含有3，3'-二甲基鞣花酸-4'-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(CO-5)的流份段，命名为第一顺序组分。

第三步：

第一顺序组分利用DAC制备色谱分离，65％甲醇-水恒定洗脱，经色谱分析，合并含CO-5的复杂组分，命名为第二顺序组分。

第四步：

将第二顺序组分溶解于一定比例的二氯甲烷-甲醇中，拌入2.5g薄层层析硅胶(200-300目)，水浴挥干，空白层装填硅胶约40g。流动相系统为二氯甲烷-甲醇-水(110:14:1恒定洗脱)，每40mL收集为一个流份，经过TLC检测，将含有CO-5的流份段合并，命名为第三顺序组分。

第五步：

将第四步的第三顺序组分利用DAC制备色谱分离，75％甲醇-水恒定洗脱，分段收集洗脱液，经色谱分析，仅收集含有CO-5的流份，得到化合物CO-5(4.3mg)。

第六步：表征提取物

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.从油茶叶中提取3,3'-二甲基鞣花酸-4'-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A：以乙醇溶液为溶剂，对油茶叶进行浸提，得到粗提液；

C：将所述75-85wt％乙醇溶液洗脱得到的洗脱液进行硅胶层析分离，用9-11∶1至1∶2.5-3.5梯度的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，分段收集洗脱液，经色谱分析，合并含有3,3'-二甲基鞣花酸-4'-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的流份段，为第一顺序组分；

D：采用DAC色谱柱，用55-65％甲醇-水为流动相对所述第一顺序组分进行恒定洗脱，分段收集洗脱液，经色谱分析，合并含有3,3'-二甲基鞣花酸-4'-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的流份段，命名为第二顺序组分；

E：对所述第二顺序组分进行硅胶层析，用90-110:10-14:1的二氯甲烷-甲醇-水进行恒定洗脱，分段收集洗脱液，经色谱分析，合并含有3,3'-二甲基鞣花酸-4'-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的流份段，命名为第三顺序组分；

F：采用DAC色谱柱，用65-75％甲醇-水对所述第三顺序组分进行恒定洗脱，分段收集洗脱液，经色谱分析，合并含有3,3'-二甲基鞣花酸-4'-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的流份段。

2.根据权利要求1所述的从油茶叶中提取3,3’-二甲基鞣花酸-4’-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的方法，其特征在于，所述步骤A中，浸提的方法为：料液比为1：3，在70-80℃下回流提取，乙醇溶液优选为40-60％的乙醇-水溶液。

3.根据权利要求1所述的从油茶叶中提取3,3’-二甲基鞣花酸-4’-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的方法，其特征在于，所述步骤B中，每个梯度洗脱所用流动相的体积为柱体积的3.5-4.5倍。

4.根据权利要求1所述的从油茶叶中提取3,3’-二甲基鞣花酸-4’-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的方法，其特征在于，所述步骤C中，所用的硅胶的粒径为200-300目；所述梯度洗脱优选为：用9-10∶1至1∶2.5-3梯度的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱。

5.根据权利要求1所述的从油茶叶中提取3,3’-二甲基鞣花酸-4’-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的方法，其特征在于，所述步骤D中的经色谱分析为：经高效液相色谱分析。

6.根据权利要求1或5所述的从油茶叶中提取3,3’-二甲基鞣花酸-4’-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的方法，其特征在于，所述步骤D中，所述55-65％甲醇-水优选为55-60％甲醇-水。

7.根据权利要求1所述的从油茶叶中提取3,3’-二甲基鞣花酸-4’-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的方法，其特征在于，所述步骤E中，所用的硅胶的粒径为200-300目，所述二氯甲烷-甲醇-水的比例优选为90-100:10-12:1。

8.根据权利要求1所述的从油茶叶中提取3,3’-二甲基鞣花酸-4’-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的方法，其特征在于，所述步骤F中，合并含有3,3’-二甲基鞣花酸-4’-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的流份段优选为：经液相色谱分析，合并仅含有槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷的流份段。

9.根据权利要求1所述的从油茶叶中提取3,3’-二甲基鞣花酸-4’-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的方法，其特征在于，所述步骤F中，所述甲醇-水为：65～70％甲醇-水。

10.根据权利要求1所述的从油茶叶中提取3,3’-二甲基鞣花酸-4’-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的方法，其特征在于，在所述步骤C中，所述硅胶层析分离之前还包括：将所述75-85wt％乙醇溶液洗脱得到的洗脱液浓缩干燥。