CN102250176B

CN102250176B - 抗肿瘤抗生素安可霉素及其衍生物

Info

Publication number: CN102250176B
Application number: CN201110124932.3A
Authority: CN
Inventors: 张方博; 甄永苏; 许先栋; 刘秀均; 赵春燕; 李毅; 陈文君; 李电东; 胡继兰; 戚长菁
Original assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Current assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Priority date: 2011-05-16
Filing date: 2011-05-16
Publication date: 2014-12-31
Anticipated expiration: 2031-05-16
Also published as: WO2012155824A1; CN102250176A

Abstract

本发明涉及胞嘧啶核苷肽类化合物的衍生物，具体而言是指安可霉素甲酯、异丙酯和异戊酯，它们是将链霉菌C-9095发酵产物安可霉素己糖环上5’位羧基，通过不同的化学合成方法，分别连接甲基、异丙基、异戊基进行酯化，以获得相关安可霉素酯类衍生物；体内外实验研究证明，所述衍生物对相关肿瘤细胞具有抑制作用，有望开发成为抗肿瘤药物。

Description

抗肿瘤抗生素安可霉素及其衍生物

技术领域：

本发明涉及胞嘧啶核苷肽类化合物的衍生物及其制备和在抗肿瘤中的应用。

背景技术：

本研究所在筛选抗肿瘤抗生素的过程中，从我国云南省关平县土壤样品中分离得到一株链霉菌Streptomyces albulus C-9095(该产生菌已于2011年5月9日送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC No.4831)，从该菌株发酵液中提取到二肽核苷肽类化合物。该化合物经过酸化后分离得到单氨基酸核苷类化合物，命名为安可霉素(ancomycin)，其分子构成包括3个部分：丝氨酸、胞嘧啶和氨基己糖(酸)，其化学结构如式(1)所示。本实验室前期研究发现安可霉素具有抗肿瘤活性，例如对人肝癌细胞Bel-7402和HepG2均具杀伤作用，IC₅₀分别为36.54μmol/l和112.82μmol/l，与此同时，安可霉素化学结构中己糖环上5’位羧基可以进行结构修饰，例如连接甲基、异丙基、异戊基形成酯键，得到安可霉素酯类衍生物。

本发明的目的是，期望经过化学结构修饰，得到药效更强以及抗瘤谱更广的安可霉素衍生物。本发明所述安可霉素酯类衍生物及其抗肿瘤作用，迄今尚未见有相关报道。

发明内容：

本发明提供了安可霉素酯类衍生物，其化学结构如通式(2)所示，其中：R可为COOCH₃、COOCH₂(CH₃)₂或COO(CH₂)₂CH₃(CH₃)₂。

本发明提供了安可霉素酯类衍生物的制备路线。所说路线是，将安可霉素中己糖环上5’位羧基通过不同的化学合成方法分别连接甲基、异丙基、异戊基进行酯化，从而得到甲酯、异丙酯和异戊酯等三个酯类衍生物。

本发明还提供了安可霉素酯类衍生物抗肿瘤活性的生物学研究。MTT实验检测结果表明，所述衍生物对人肝癌细胞Bel-7402和HepG2的IC₅₀值(表1)，与安可霉素相比较，己糖环上5’位羧基形成酯键后抗肿瘤活性增加，此类衍生物的化学结构特点和药效结果，为核苷类似物的化学结构改造研究提供了新思路。本发明以安可霉素甲酯为代表，深入开展了一系列抗肿瘤作用研究。

本发明提供了以安可霉素甲酯为代表的安可霉素酯类衍生物体内外抗瘤药效学评价和抗瘤机制研究。所述化合物化学名为1-胞嘧啶基-4-D-丝氨酰氨-1，4-去二氧-β-D-吡喃型葡萄糖羧甲酯(methyl-1-cytosinyl-4-D-serylamino-1，4-dideoxy-β-glucopyranosylcarboxylate)，分子量387.35，分子式C₁₄H₂₁N₅O₈，质谱分析见(图2)，化学结构如式(3)所示。

体外研究结果表明，安可霉素甲酯对体外培养的多种肿瘤细胞有明显的抑制作用；Western blotting研究发现，安可霉素甲酯通过抑制EGFR-Raf-MEK-ERK信号通路，能抑制肿瘤细胞增殖；安可霉素甲酯可诱导肿瘤细胞凋亡，并使肿瘤细胞产生周期阻滞。体内研究结果表明，安可霉素甲酯可明显抑制昆明小鼠H22肝癌和人肝癌HepG2裸小鼠移植瘤等模型的肿瘤生长。

本发明的优点和积极效果在于，以安可霉素甲酯为代表的安可霉素酯类衍生物具有较为特殊的化学结构，由胞嘧啶、吡喃糖环和一个丝氨酸组成，在结构上比阿糖胞苷多一个氨基酸，而且可以口服产生抗瘤作用；与含氟类抗肿瘤药物如卡培他滨和吉西他滨相比较，安可霉素甲酯不含氟，但是具有肯定的抗肿瘤效果，这些衍生物的化学结构特点和药效结果(构效关系)为核苷类抗肿瘤药物的研究提供了新思路。

附图说明：

图1安可霉素质谱图，经ESI-MS鉴定，其分子离子峰(m/z)为374.2[M+H]⁺，以及396.2[M+Na]⁺，确定其分子量为373，分子式为C₁₃H₁₉N₅O₈。

图2安可霉素甲酯质谱图，经ESI-MS鉴定，其分子离子峰(m/z)为388.3[M+H]⁺，以及410.3[M+Na]⁺，确定其分子量为387，分子式为C₁₄H₂₁N₅O₈

图3安可霉素甲酯对EGFR和MAPK信号通路影响的Western blotting结果

其中：0、50、100、200-安可霉素甲酯的剂量，单位μmol/l；

1-EGFR蛋白表达水平； 2-p-EGFR蛋白表达水平；

3-C-Raf蛋白表达水平； 4-p-C-Raf蛋白表达水平；

5-MEK1/2蛋白表达水平； 6-p-MEK1/2蛋白表达水平；

7-ERK1/2蛋白表达水平； 8-p-ERK1/2蛋白表达水平；

9-PARP蛋白表达水平； 10-Caspase-8蛋白表达水平；

11-actin蛋白表达水平。

图4安可霉素甲酯在不同时间点对人肝癌HepG2细胞Caspase-3/7活性的影响X轴代表作用时间；Y轴代表Caspase-3/7活性；

其中：control50μmol/l；100μmol/l；200μmol/l

图5安可霉素甲酯不同浓度作用人肝癌HepG2细胞24h的细胞周期分布图

其中：A、B、C、D分别为0、50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l。

图6安可霉素甲酯对人肝癌HepG2细胞周期的影响

X轴代表细胞周期；Y轴代表各细胞周期所占的百分比；

其中：control50μmol/l；100μmol/l；200μmol/l，

^＊＊P＜0.01vs.controlG0/G1；^＊P＜0.05vs.controlG0/G1；

^★★P＜0.01vs.control G2/M；^◆◆P＜0.01vs.control S；^◆P＜0.05vs.control S。

图7安可霉素甲酯不同浓度作用人肝癌HepG2细胞48h细胞凋亡率图

其中：A、B、C、D分别为0、50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l

图8安可霉素甲酯对人肝癌HepG2细胞凋亡率的影响

X轴代表各浓度；Y轴代表细胞凋亡率；^**P＜0.01vs.control。

图9安可霉素甲酯对HepG2裸小鼠移植瘤生长的抑制作用

A图为安可霉素甲酯对体重的影响；

X轴表示接种天数；Y轴表示体重；

B图为安可霉素甲酯对肿瘤生长的影响；

X轴表示接种天数；Y轴表示肿瘤体积；

其中：control250mg/kg；200mg/kg；

150mg/kg；capecitabine 200mg/kg。

图10安可霉素甲酯对HepG2荷瘤裸小鼠骨髓造血功能的影响(×400)

A图为生理盐水对照组；

B图为安可霉素甲酯250mg/kg。

具体实施方式：

以下实施例仅为帮助本领域技术人员更好的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

<实施例1>安可霉素的制备

将甘油管保藏的链霉菌菌株C-9095接种到斜面(葡萄糖1％，天门冬素0.1％，磷酸氢二钾0.05％，琼脂1.5％，PH 7.2-7.4，灭菌，28℃培养7-10天)培养基上，28℃恒温培养箱培养7-10天。将斜面培养物挖块接种于100ml一级种子培养基中(葡萄糖10g，可溶性淀粉15g，牛肉膏5g，鱼蛋白胨5g，黄豆饼粉10g，氯化钠3g，调PH至7.0，双蒸水配成1000ml，高压灭菌)，28℃在转速为180转/min的旋转摇床培养48小时，取培养好的一级种子，按10％的接种量转种于100ml二级种子培养基中(同一级种子培养基)，28℃旋转摇床培养24小时。取培养好的二级种子，按10％的接种量转种于1000ml发酵培养基中(葡萄糖10g，可溶性淀粉15g，酵母粉10g，黄豆饼粉10g，氯化钠3g，调PH至7.0，双蒸水配成1000ml，高压灭菌)，28℃在90往复/min的往返摇床培养96小时后收获发酵液。

发酵液经助滤粉过滤，滤液经活性炭柱(20％，g/ml)吸附，无盐水冲洗，用丙酮∶水＝1∶1的混合溶液洗脱，收集对大肠杆菌显示活性的部分，减压去除丙酮，将水溶液调pH至3.0，通过强酸性阳离子树脂柱(铵型)，用1mol/L氨水洗脱，活性部份除氨，冷冻干燥，得淡黄色粉末。将该粉末用制备薄层硅胶层析板分离纯化，展开剂为70％甲醇水溶液，取R_f＝0.60的条带，得到二肽核苷类化合物。该核苷肽类化合物再经过酸化(浓HCl，37℃水解24h)得到安可霉素。质谱分析见(图1)，ESI-MS m/z 374.2[M+H]⁺，396.2[M+Na]⁺(分子式为C₁₃H₁₉N₅O₈，分子量为373)。

<实施例2>安可霉素甲酯的制备

取甲醇12ml于反应瓶中，冰盐浴中缓慢滴加二氯亚砜(SOCl₂)3ml，控制温度在0℃以下，滴加完毕后维持0℃左右继续反应1h。称取500mg安可霉素，使溶于甲醇-二氯亚砜溶液中，室温搅拌反应，TLC检测跟踪反应，溶剂甲醇∶乙酸乙酯∶氨水(5∶3∶2)，共计反应48h，减压蒸干得黄色油状液。将黄色油状液2ml用甲醇溶解，再加入20ml乙醚，有白色固体析出，减压抽滤得固体物。将固体物用制备薄层硅胶层析板分离，展开剂为甲醇∶氨水＝5∶1，取R_f＝0.50的条带，以乙醇∶水＝3∶2的洗脱液洗脱，洗脱液减压蒸干，得安可霉素甲酯397mg，质谱分析见(图2)，ESI-MS m/z 388.3[M+H]⁺，410.3[M+Na]⁺(分子式C₁₄H₂₁N₅O₈，分子量为387)。

<实施例3>安可霉素异丙酯的制备

向反应瓶中投入安可霉素200mg和二甲基亚砜(DMSO)2ml，温热状态下搅拌至溶解，缓慢滴加3ml丙酮(aceton)，无明显浑浊。然后分别加入1ml碘代异丙烷和100mg K₂CO₃粉末，反应液呈现少浑浊，保持内温(50-55)℃，搅拌反应过夜，共计反应17h。反应液减压蒸干得固体物，将固体物用制备薄层硅胶层析板分离，展开剂为甲醇∶乙酸乙酯∶氨水＝2∶0.4∶0.1，取R_f＝0.35的条带，以甲醇洗脱，洗脱液减压蒸干，得到安可霉素异丙酯28mg。经ESI-MS m/z416[M+H]⁺(分子式C₁₆H₂₅N₅O₈，分子量为415)。

<实施例4>安可霉素异戊酯的制备

向反应瓶中投入安可霉素400mg和25％NaOH的水溶液5ml，室温搅拌至安可霉素完全溶解，缓慢滴加4ml六甲基磷酰三胺(HMPA)，半小时后加入0.5ml溴代异戊烷，保持内温(28-30)℃，搅拌反应过夜，共计反应22h。反应液减压蒸干得固体物，将固体物用制备薄层硅胶层析板分离，展开剂为甲醇∶乙酸乙酯∶氨水＝2∶0.2∶0.2，取R_f＝0.45的条带，以甲醇洗脱，洗脱液减压蒸干，得到安可霉素异戊酯65mg。经ESI-MS m/z 444[M+H]⁺(分子式C₁₈H₂₉N₅O₈，分子量为443)。

<实施例5>安可霉素甲酯的体外细胞毒性试验

采用MTT法进行体外细胞毒性实验，取对数生长期人肝癌Bel-7402细胞、人肝癌HepG2细胞、人神经胶质瘤U87细胞、人卵巢癌OVCR3细胞、人乳腺MCF-7细胞、人肺腺癌A549细胞，按每孔(3-5)×10⁴接种于96孔板中，培养箱中孵育24h后加药，设空白对照组用于调零，药物浓度组10μmol/l，25μmol/l，50μmol/l，100μmol/l，200μmol/l，400μmol/l，每组重复3孔，培养箱中孵育48h。各孔加入MTT(5mg/ml)20μl，继续孵育4h，弃上清，加入150μl DMSO，震荡15min待Formazan结晶(在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下，MTT的四唑环开裂，生成蓝色结晶)充分溶解后，使用酶标仪在570nm处测定吸光值(A)。每个检测点取3个平行孔的平均值，实验重复3次，计算IC₅₀值。细胞存活率％＝(加药组细胞A值-本底A值)/(对照组细胞A值-本底A值)×％。

结果表明：安可霉素甲酯对Bel-7402、HepG2、U87、OVCR3、MCF-7、A549细胞的IC₅₀值(μmol/l)分别为22.26、89.67、146.23、239.98、7.95和＞400(表1)。

<实施例6>安可霉素异丙酯的体外细胞毒性试验

采用MTT法进行体外细胞毒性实验，取对数生长期Bel-7402、HepG2细胞，按每孔(3-5)×10⁴/孔接种于96孔板中，培养箱中孵育24h后加药，设空白对照组用于调零，药物浓度组5μmol/l，10μmol/l，20μmol/l，40μmol/l，80μmol/l，160μmol/l，余操作方法同实施例5。

结果表明：安可霉素异丙酯对人肝癌Bel-7402和HepG2细胞的IC₅₀值(μmol/l)分别为16.73和62.51(表1)。

<实施例7>安可霉素异戊酯的体外细胞毒性试验

采用MTT法进行体外细胞毒性实验，取对数生长期Bel-7402、HepG2细胞，按每孔(3-5)×10⁴接种于96孔板中，培养箱中孵育24h后加药，设空白对照组用于调零，药物浓度组5μmol/l，10μmol/l，20μmol/l，40μmol/l，80μmol/l，160μmol/l，余操作方法同实施例5。

结果表明：安可霉素异戊酯对人肝癌Bel-7402和HepG2细胞的IC₅₀值(μmol/l)分别为18.48和59.43(表1)

表1安可霉素衍生物对人肝癌细胞的IC₅₀值

由表1可见：安可霉素酯类衍生物对相关肿瘤细胞的增殖有抑制作用，与安可霉素相比较，酯类衍生物的IC₅₀下降，细胞毒性增强。

<实施例8>安可霉素甲酯对MAPK分子信号通路及凋亡信号通路相关分子表达的影响

将人肝癌HepG2细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养液，在37℃、5％CO2培养箱中培养。取对数生长期的HepG2细胞按10⁴细胞/cm²密度接种于培养瓶中，24h细胞贴壁后加入安可霉素甲酯50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l处理24h，收集正常对照组细胞以及各浓度处理组细胞并提取蛋白，测蛋白浓度并定量，上样前将蛋白质煮沸5min，每孔30μg上样，进行SDS-PAGE电泳，以半干转法转移至PVDF膜上。常规方法孵育一抗和二抗，以预染分子量标准确定目的蛋白的条带位置，ECL plus超敏免疫印迹法检测蛋白表达，化学发光成像系统ChemiImager 5500捕获图像，以β-actin为内参。

结果表明，安可霉素甲酯能抑制表皮生长因子家族EGFR和p-EGFR蛋白的表达，进一步研究发现，其通过抑制C-Raf-MEK1/2-ERK1/2信号通路，抑制肿瘤细胞的增殖。同时安可霉素甲酯还能抑制凋亡相关分子PARP和Caspase-8的表达，从而诱导细胞凋亡(图3)。

<实施例9>安可霉素甲酯对凋亡相关信号分子Caspase 3/7活性的影响

按3/7活性测试试剂盒(美国Promega公司)步骤操作：开始检测之前，制备好试剂，让试剂平衡到室温，混合均匀。HepG2细胞经不同浓度的安可霉素甲酯50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l处理2h、6h、12h、24h后，将培养HepG2细胞的96孔板从孵育箱中取出，平衡至室温。在含有100μl空白对照、阴性对照细胞和安可霉素甲酯处理过的细胞的全白96孔板各孔中各加入100μl试剂，混匀，室温孵育2h，然后上荧光酶标仪检测。

结果表明，HepG2细胞在加入安可霉素甲酯后，在6h、12h、24h等不同时间点的Caspase 3/7活性发生明显改变，启动凋亡通路，导致细胞凋亡(图4)。

<实施例10>安可霉素甲酯对细胞周期的影响

HepG2细胞经安可霉素甲酯50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l处理24h后，收集正常对照组细胞和各浓度组细胞，加入冰冷的PBS缓冲液，将细胞轻轻吹打成单个细胞，离心，PBS洗2遍，用约500μl的PBS重悬细胞，一边振荡一边加入5ml预冷的70％乙醇，4℃固定过夜。染色前细胞用PBS洗2遍，沉淀重悬于PI染液(50μg/ml PI+200μg/ml RNase A)中，37℃避光染色30min。细胞经200目尼龙网过滤后，用流式细胞仪测定DNA含量并分析细胞周期变化。

结果显示，与对照组比较，安可霉素甲酯作用HepG2细胞24h后，G2/M期和S期的细胞均有明显增加(见表2)，并且随着浓度的增加，阻滞作用更加显著，表明安可霉素甲酯可使HepG2细胞产生G2/M期和S期阻滞(图5，图6)。

表2安可霉素甲酯对HepG2细胞周期的影响(24h)

注：^**与对照组G0/G1期相比较P＜0.01；^*与对照组G0/G1期相比较P＜0.05；

^★★与对照组G2/M期相比较P＜0.01；^◆◆与对照组S期相比较P＜0.01，

^◆与对照组S期相比较P＜0.05。

<实施例11>Annexin V-FITC/PI双染结合流式细胞仪检测细胞的凋亡率：

HepG2细胞经安可霉素甲酯50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l处理48h后，胰酶消化收集正常对照组和各浓度组的细胞，将待测细胞的浓度调整为5×10⁵-1×10⁶cells/ml；取1ml细胞悬液，1000rpm，4℃离心10min，弃上清；加入1ml冷PBS，轻轻振荡使细胞悬浮；1000rpm，4℃离心10min，弃上清，重复此步骤两次；将细胞重悬于500μl binding buffer，加入10μl Annexin V-FITC/PI，轻轻摇匀，室温反应1h；加入5μl PI轻轻摇匀，室温反应15min；细胞经200目尼龙网过滤后，在流式细胞检测仪上进行检测，采集荧光强度并用自带软件FACScan进行数据处理。

结果表明，不同浓度安可霉素甲酯作用HepG2细胞48h后，细胞凋亡率随浓度增加而升高。50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l安可霉素甲酯作用于HepG2细胞凋亡率分别为17.25％±1.05％、20.67％±2.96％、32.84％±4.71％，显著高于对照组1.36％±0.96％(图7，图8)。

<实施例12>安可霉素甲酯抑制小鼠肝癌H22肿瘤生长：

实验采用雌性昆明小鼠，体重(18～22)g(购自军事医学科学院)。取小鼠腹腔悬液传代的肝癌H22细胞，每只小鼠腋窝皮下接种200万个细胞(0.2ml)。实验按照体重随机分为四组：灌胃生理盐水对照组，安可霉素甲酯200mg/kg、150mg/kg、100mg/kg，每组10只。给药方案：从腋窝接种24h后开始灌胃给药，共给药8天，对照组每天灌胃等体积的生理盐水，停药一天，然后处死小鼠称体重，剥离肿瘤称瘤重。

实验结果表明：安可霉素甲酯可以抑制小鼠肝癌H22肿瘤的生长，口服安可霉素甲酯200mg/kg、150mg/kg、100mg/kg对肿瘤生长的抑制率分别为71.5％、48.9％、30.6％(见表3)。

表3安可霉素甲酯对昆明小鼠肝癌H22肿瘤生长的抑制作用

注：^**与对照组相比较P＜0.01；^*与对照组相比较P＜0.05。

<实施例13>安可霉素甲酯对人肝癌HepG2裸小鼠移植瘤生长抑制作用

1.1实验动物采用BALB/c裸鼠，雌性，(4～6)周龄，体重(18～22)g(购自北京维通利华有限公司)。将HepG2细胞置于含10％胎牛血清的DMEM培养液中培养。当细胞生长至对数生长期收集细胞，细胞浓度2.5×10⁷/ml，每只裸鼠左侧皮下接种0.2ml，共接种三只。当裸小鼠肿瘤生长至1×1×1cm³后，处死小鼠，取出瘤组织，用眼科剪，剪成2×2×2mm³的组织块，应用套管针将肿瘤块接种于裸小鼠左侧腋窝皮下。HepG2瘤块接种一周后用游标卡尺测量肿瘤长颈(L)和肿瘤短颈(W)，按照肿瘤体积计算公式TV＝(L×W²)/2，计算肿瘤体积，根据肿瘤体积大小将裸小鼠随机分成五组，对照组，安可霉素甲酯250mg/kg、200mg/kg、150mg/kg，卡培他滨200mg/kg，每组6只。同时开始口服给药，连续给药5天，停药2天，共三个疗程，最后一次给药后，停药7天，处死小鼠，称体重，剥离肿瘤称瘤重，每4天测量小鼠体重和肿瘤体积，期间观察小鼠的营养状况和活动情况。

1.2取出对照组和安可霉素甲酯各剂量组实验动物的股骨以及心、肺、肝、脾、肾、胃、小肠标本，放置于10％甲醛固定液中固定，取出固定股骨组织，依次放入75％、80％、85％、90％酒精中各2h，95％酒精过夜，无水乙醇脱水2h，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋，在LeicaRM2315切片机上制备(4-5)μm石蜡切片。取水化切片，苏木素染色5min，蒸馏水冲洗，盐酸酒精分色，自来水返蓝；伊红染色2min，蒸馏水冲洗，常规脱水透明；中性树胶封片。光镜下观察股骨骨髓组织以及各脏器的病理学改变。

实验结果表明：各组裸小鼠体重和肿瘤体积生长情况如图9A、B所示，安可霉素甲酯灌胃给药可以抑制HepG2裸小鼠移植瘤生长。安可霉素甲酯250mg/kg、200mg/kg、150mg/kg以及卡培他滨200mg/kg，对肿瘤生长的抑制率分别为62.5％(P＜0.01)、46.3％(P＜0.01)、33.2％(P＜0.05)和58.3％(P＜0.01)。对照组和安可霉素甲酯250mg/kg组动物股骨病理切片的结果如图10A、B，股骨髓的细胞密度以及粒细胞系、红细胞系和巨核细胞系均无明显改变，说明此治疗剂量下不影响骨髓的造血功能。

Claims

1.安可霉素及其酯类衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征是，所述安可霉素的结构如式1所示：

所述安可霉素酯类衍生物的通式结构如式2所示：

其中：R选自COOCH₃，COOCH₂(CH₃)₂或COO(CH₂)₂CH₃(CH₃)₂。