CN109824746B - 一种友霉素类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
一种友霉素类化合物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种友霉素类化合物，结构式如式(I)所示：
其中，R1＝H或
R2＝H或OH；R3＝CH3、CH2CH3、
或
Description
技术领域
本发明涉及海洋微生物药物技术领域，具体涉及一种友霉素类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
1953年，人们第一次从一株土壤来源的链霉菌次级代谢产物中发现了友霉素(Amicetin)，研究者发现其对大肠杆菌、结核分枝杆菌具有良好的抑制作用，因此可作为一个良好的潜在药物前体进行后续研究。
此后，研究者陆续从土壤来源或从海洋来源的链霉菌中发现该嘧啶核苷类化合物，如cytosaminomycin、oxyplicacetin、streptcytosine等。此核苷嘧啶类化合物结构相似，以一个单糖胞嘧啶为母核，区别在于在胞嘧啶氨基端以及糖环4’位取代基团不同。
据报道，此类嘧啶核苷类化合物发现数量不过十数个，大多具有抗结合分支杆菌、抗球虫、抗革兰氏阳性菌等多种作用，如贝友霉素对结合分枝杆菌的MIC值为8μg/mL，友霉素的抗球虫IC50小于1.7μg/mL。同时，该类化合物也具有一定抗癌活性，但是该方向研究却十分鲜有，针对目前医学界对癌症治疗的窘迫，以及逐年提高的癌症发病率，开发更多的抗癌药物迫在眉睫。
公开号为CN 102250176 A的专利说明书公开了一种抗肿瘤抗生素安可霉素及其衍生物，涉及胞嘧啶核苷肽类化合物的衍生物，具体而言是指安可霉素甲酯、异丙酯和异戊酯，它们是将链霉菌C-9095发酵产物安可霉素己糖环上5’位羧基，通过不同的化学合成方法，分别连接甲基、异丙基、异戊基进行酯化，以获得相关安可霉素酯类衍生物；体内外实验研究证明，所述衍生物对相关肿瘤细胞具有抑制作用，有望开发成为抗肿瘤药物。
公开号为CN 109134567 A的专利说明书公开了一种通过发酵方法制备得到的具有抗菌活性的核苷类化合物：1-尿嘧啶-4-丝氨酰氨基-1,4-二脱氧-β-D-吡喃葡萄糖醛酸，即，丝氨酰氨尿嘧啶核苷，可以开发为一种新的抗生素。
发明内容
针对本领域存在的不足之处，本发明提供了一种友霉素类化合物，测试发现该类化合物具有抗结肠癌活性。海洋放线菌采用大米培养基发酵，该类化合物从发酵产物中分离制备得到。
一种友霉素类化合物，结构式如式(I)所示：
其中，
R1＝H或
R2＝H或OH；
R3＝CH3、CH2CH3、
优选地，所述的友霉素类化合物为以下化合物：
本发明还提供了一种所述友霉素类化合物的制备方法，由海洋放线菌大米发酵产生，经色谱技术分离纯化得到，易于操作和实施。
一种所述友霉素类化合物的制备方法，包括：
(1)将放线菌的孢子接入高氏一号液体培养基内，摇床中培养7～10天获得种子液；
(2)将步骤(1)中培养好的种子液在无菌环境中接种于大米固体培养基中，静置培养30～60天获得发酵物；
(3)将发酵物萃取后得到浸膏，浸膏以色谱分离技术手段进行分离纯化，得到所述友霉素类化合物。
步骤(1)中，优选地，所述的摇床的温度为25～30℃、转速为150～210rpm，有利于培养。
所述的放线菌，可采用市售产品，如采用北京北纳创联生物技术研究院下的北纳生物出售的编号为BNCC337575的链霉菌。
步骤(2)中，优选地，所述的大米固体培养基中，大米质量和海水体积之比为30～50g：50～70mL。
配置好的大米固体培养基放置在250mL锥形瓶中用灭菌锅高温杀菌后方可使用。
所述的静置培养的温度为23～33℃，适宜发酵物的获得。
所述步骤(3)的具体步骤为：发酵物由等体积乙酸乙酯萃取获得浸膏，再经硅胶柱色谱粗分、高效液相制备色谱纯化获得所述友霉素类化合物。
所述硅胶柱色谱采用的流动相为体积比不大于70:1的二氯甲烷-甲醇溶液或纯甲醇。
所述高效液相制备色谱采用的填料为十八烷基键合硅胶，采用的流动相为体积百分数为20％～80％的甲醇-水溶液，或体积百分数为20％～40％的乙腈-水溶液，或体积百分数为10％～20％的含三氟乙酸乙腈-水溶液。
本发明还提供了一种所述友霉素类化合物在制备抑制结肠癌症类的药物中的应用。
对所述友霉素类化合物进行了新的抗癌活性研究，发现该类友霉素类化合物具有良好的抗人结肠癌细胞的作用，且其作用优于友霉素，打开了该类化合物的新的研究方向，在抗癌药物的开发中具有良好的前景。
本发明与现有技术相比，主要优点包括：
本发明所述友霉素类化合物，极好地填补了近年来该类化合物的研究空白，解决了该类化合物数量稀少的问题。同时除了抗菌活性，抗癌活性测试表明该类化合物对结肠癌细胞具有较强的杀伤作用，且活性远高于友霉素，在结肠癌治疗药物的开发上具有良好前景，同时打开了该类化合物在抗结肠癌领域的研究方向。本发明获得的具有不同程度活性的一系列化合物在数量的基础上可以推测化合物的构效关系，为今后该类化合物的进一步研究提供基础。
本发明对海洋来源的链霉菌采用陆生大米固体培养的方式进行发酵，乙酸乙酯萃取后，再用硅胶柱色谱、凝胶柱色谱和反相色谱进行分离纯化，相比于常规的液体摇床培养，设备要求低、操作安全方便、物产丰度高、发酵产量大，易于操作和实施，易于大规模工业化培养，具备广阔的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
一、化合物的发酵
放线菌采用的是从海洋沉积物里分离得到的SS-A28菌株，经鉴定为链霉菌Streptomyces sp.BNCC337575；
1)将放线菌接种于容量为500mL的锥形瓶中，每瓶预装250mL高氏一号液体培养基，在28℃、180rpm的摇床中培养3天，得到长有放线菌球状菌体的种子液；
2)将步骤1)的长有放线菌菌体的种子液接至大米培养基，大米培养基组成：大米40g、海水60mL，高压灭菌锅灭菌后方可使用，接种用量为8mL/瓶，接种完毕后在28℃下静置培养45天，得到含有本发明的具有抗肿瘤活性的友霉素类化合物的固体发酵产物。
二、化合物的制备纯化
将含有本发明的具有抗肿瘤活性的友霉素类固体发酵产物用等体积乙酸乙酯萃取3次，溶剂回收浓缩，获得粗体物浸膏。将所得粗体物采用硅胶柱色谱分离，采用体积比不大于70:1的二氯甲烷-甲醇溶液或纯甲醇梯度洗脱，TLC分析后合并含有目标化合物的组馏分。
所得含有目标化合物的组分采用高效液相制备色谱分离(Agilent Pursuit C-18(10μm,21.2×250mm)色谱柱，检测波长254nm)，采用的流动相为体积百分数20％～60％乙腈-水体系60min以10mL/min梯度洗脱，收集具有紫外特征吸收峰的色谱峰，回收溶剂，得到具有抗癌活性的友霉素类新化合物。
三、化合物鉴定
化合物1-16结构如下：
1H NMR数据列于表1、表2中，13C NMR数据列于表3中。
四、化合物的抗癌活性
结肠癌细胞株HCT-116细胞的增殖抑制实验。取对数生长期的细胞，配置成5×104个/mL，以100μL/孔铺于96孔培养板，CO2培养箱中培养24小时，取出培养板后于每孔中加入不同浓度的待测样品，每个浓度设3个复孔，加药完成后，置于CO2培养箱中继续培养72小时后取出培养板，弃去培养液，每孔加入100μL 4℃冰箱预冷的10％的三氯醋酸(TCA)固定，静置5分钟后，再将培养板移至4℃冰箱过夜。倒掉固定液，每孔用去离子水洗涤5遍，甩干，空气干燥。每孔加入70μL SRB溶液，室温25℃放置20分钟，去上清液，用1％醋酸洗涤5次，空气干燥。结合的SRB用100μL/孔10mmol/L Tris碱液，pH＝10.5，振荡溶解。置于酶标仪中测定各孔光吸收，测定波长为515nm。根据各孔OD值计算药物对细胞增殖抑制率：抑制率＝[1-(OD515给药孔/OD515对照孔)]×100％，根据各浓度抑制率计算半数抑制浓度IC50，结果如表4所示。
表4(HCT-116抑制活性测试)
| 化合物 | IC<sub>50</sub>(μg/mL) | 化合物 | IC<sub>50</sub>(μg/mL) |
| 1 | 0.3 | 10 | 0.6 |
| 2 | 1.3 | 11 | 3.9 |
| 3 | 3.2 | 12 | 10.7 |
| 4 | 2.6 | 13 | 25 |
| 5 | 3.1 | 14 | 28.3 |
| 6 | 2.2 | 15 | 2.1 |
| 7 | 0.5 | 16 | 4.4 |
| 8 | 0.4 | 友霉素 | 4.1 |
| 9 | 1.3 | 阿霉素 | 0.06 |
此外应理解，在阅读了本发明的上述描述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (8)
1.一类友霉素类化合物，其特征在于，所述的友霉素类化合物为以下化合物：
2.一种友霉素类化合物的制备方法，包括：
(1)将放线菌的孢子接入高氏一号液体培养基内，摇床中培养7～10天获得种子液；所述的放线菌为链霉菌Streptomyces sp.BNCC337575；
(2)将步骤(1)中培养好的种子液在无菌环境中接种于含有海水的大米固体培养基中，静置培养30～60天获得发酵物；
(3)将发酵物萃取后得到浸膏，浸膏经硅胶柱色谱粗分、高效液相制备色谱纯化，得到所述友霉素类化合物；所述的友霉素类化合物为以下化合物：
3.根据权利要求2所述的友霉素类化合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的摇床的温度为25～30℃、转速为150～210rpm。
4.根据权利要求2所述的友霉素类化合物的制备方法，其特征在于，所述的静置培养的温度为23～33℃。
5.根据权利要求2所述的友霉素类化合物的制备方法，其特征在于，所述的大米固体培养基中，大米质量和海水体积之比为30～50g：50～70mL。
6.根据权利要求2所述的友霉素类化合物的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，发酵物由等体积乙酸乙酯萃取获得浸膏。
7.根据权利要求6所述的友霉素类化合物的制备方法，其特征在于，所述硅胶柱色谱采用的流动相为体积比不大于70:1的二氯甲烷-甲醇溶液或纯甲醇；
所述高效液相制备色谱采用的填料为十八烷基键合硅胶，采用的流动相为体积百分数为20％～80％的甲醇-水溶液，或体积百分数为20％～40％的乙腈-水溶液，或体积百分数为10％～20％的含三氟乙酸乙腈-水溶液。
8.一种权利要求1所述的友霉素类化合物在制备抑制结肠癌症的药物中的应用。
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