CN1921890A - 作为给药系统的抗体交联的阳性乳液 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种组合产品，该产品包括一种阳性水包油乳液和一种抗体，其中所述乳液含有一种在其自然状态、在油水界面具有自由NH2基团的化合物，并且其中所述化合物通过一种异双功能交联剂连接至所述抗体上，将所述NH2基团连接至抗体绞链区的SH基团上。
Description
技术领域
本发明涉及一种给药系统和一种生产该药物靶向系统的方法。
本发明还涉及一种有用的在哺乳动物体内确定靶向和将药物、诊断剂以及其它生理上有效的物质运送到靶点的方法。
背景技术
癌症是世界上的主要致死因素，并且是美国的第二大致死因素。在诸多癌症疾病中，乳腺癌是除黑色素瘤皮肤癌外在妇女中最常见的癌症。胰腺癌是美国癌症致死中的第四大主要原因，且据估计结肠直肠癌在2003年造成57000人死亡。传统的癌症疗法是攻击性的，引发显著的副作用并且甚至会损害与待治疗的恶化器官邻近的健康组织。对增加抗癌剂特异性达到靶向肿瘤的需求导致产生了大量新型的治疗策略。最近，随着单克隆抗体(MAb)被批准用于治疗性用途特别是癌症[1]，新的且令人兴奋的生物技术时代出现了。过去20年中已经观察到，癌症的发展通常伴有一种或几种被称为肿瘤抗原的蛋白的过度表达[2]。已经开发了一种靶向对抗p185HER2(HER2)受体酪氨酸激酶，曲妥单抗的代表性MAb。HER-2在乳腺癌，肺癌，卵巢癌以及其它癌症的发病机理中起重要作用[3]，并且在所述肿瘤中过度表达。HER-2过度表达显然与乳腺癌的不良预后(prognosis)有关[4，5]。因此，使用单克隆抗体治疗癌症已经作为靶向癌细胞的方法，同时不伤害正常细胞。市售MAbs中，美罗华和曲妥单抗(分别为Rituxan和Herceptin)在治疗癌症中展示出充满希望和令人鼓舞的结果，并且持续显著扩展[6]。
有时，以单一药物形式使用MAb不足以产生令人满意的治疗性应答。此外，在用肿瘤细胞系进行的临床前研究中，发现曲妥单抗与某些化疗药物具有辅助和协同作用[2，7]。对曲妥单抗与各种化疗试剂特别是紫杉醇联合使用的临床试验研究已经在肺癌中进行了[8]。研究者利用MAbs对肿瘤组织的高度亲和性，并且通过将MAb偶联至毒素或通过辐射破坏抗原携带细胞的放射性同位素(放射免疫疗法)设计了创新的且有效的治疗性策略[9]。最近，大量临床研究报道，虽然存在与恶性细胞中H-铁蛋白过度表达的矛盾数据[11]，但对患有复发性何杰金氏病(HD)的患者治疗性使用钇标记的多克隆抗铁蛋白得到了满意效果[10]。由此，为了得到更有效的肿瘤药物靶向，将单克隆抗体与能包埋有效亲水性和/或亲脂性药物的胶态载体偶联，所述胶态载体为脂质体(免疫脂质体)、纳米颗粒和乳液(免疫乳液)。这些免疫交联物应该确保抗体对抗原位点的特异性识别，以及确保胶体给药系统释放不同的细胞毒素试剂，所述胶体给药系统靠近难以接近的病理靶组织，所述病理靶组织可能位于过度表达所述肿瘤抗原的乳腺或结肠或胰腺中。实际上，正如近来报道，免疫脂质体代表一种新颖的和充满希望的增强肿瘤靶向给药的策略[12-19]。此外，已经表明，带有聚乙二醇偶联的Fab′片段的免疫脂质体在体内显示出延长的循环时间和高度外渗进入目标实体瘤[15]。然而，上述敏感性脂质体制剂众所周知的物理化学不稳定性形成一种障碍，如果意欲最终销售有活性的产品则需克服所述障碍。此外，大部分所述脂质体载体不能结合显著剂量的亲脂性/疏水性活性成分例如紫杉醇(这是治疗各种癌症实体瘤最有希望的细胞毒类药物之一)，所述的不能结合限制了他们潜在的临床效果，而乳液可以结合显著量的疏水性药物特别是紫杉醇[20]，则显示了其强于脂质体的优点。Lundberg et al.[21]偶联了用聚乙二醇稳定的磷脂酰乙醇胺改性的带负电长循环亚微粒乳液和抗B细胞淋巴瘤MAb LL2。它们显示，结合物(conjugate)可能是一种有用的药物载体系统，用于更特异性地向B细胞恶性肿瘤释放抗肿瘤药物。目前还没有体内数据，所述研究仍然处于初级阶段。
本发明人开发和研究的阳离子亚微粒乳液在生理性阳离子的存在下是稳定的，并且可以在体内与带负电的生物膜相互作用，同时避免被RES吸收[22]。此外，细胞培养研究已经显示，阳离子乳液增强治疗剂的细胞内渗透[23，24]。
对于基于免疫学的抗癌疗法来说，HER-2蛋白代表一种有吸引力的的靶向，这是由于它在非恶性组织中的限制性表达及其对转化细胞恶性表型的影响。以HER-2/nue为靶向的与化疗结合的曲妥单抗有利于患有过度表达HER-2的转移性乳腺癌的患者的存活，提高可类似地表达HER-2的其它类型恶性肿瘤利于治疗的可能性。此外，已经证明曲妥单抗在其它癌症中作为单一药物无效。
AMB8LK抗体对H-铁蛋白显示高度亲和性。铁蛋白是一种由大多数人类细胞表达的蛋白质，且其用于细胞内铁贮存。该分子的结构数据显示，它是由被称为去铁铁蛋白的含有一个金属铁原子核的糖蛋白外壳组成的大分子。去铁铁蛋白的分子量为440kD。具有两种类型的亚基，被称为H和L，以可变的比例组合。根据亚基类型，铁蛋白分为酸性的或者碱性的。虽然大家熟知碱性铁蛋白的作用，但仅仅近来才逐渐阐明酸性铁蛋白的确切作用。对铁蛋白和癌症关系的早期观点所源自的研究表明，患有各种恶性肿瘤患者的血清中总铁蛋白增加并向酸性(富含H)铁蛋白转移[26]。随后对肿瘤组织本身中铁蛋白浓度的评价显示了一个复杂的，也许是疾病特异性的景象：例如已经报道，某些情况下例如在结肠癌[27]、睾丸精原细胞瘤[28]以及乳腺癌[29-30]中，与可比较的正常组织相对，肿瘤组织中铁蛋白增加。Vriensendorp和Quadri近来报道[10]，在何杰金氏病中，循环铁蛋白量为500ng/ml。随机研究指出，静脉注射2.5mg兔抗人铁蛋白IgG会在循环中主要形成一对一免疫复合物[31]。该抗原抗体复合物不干扰肿瘤靶向或引起免疫复合物疾病。此外，Vriesendorp和Coll.[32]在临床研究中证明，在复发性HD患者中，放射性同位素标记的抗铁蛋白靶向肿瘤间质并且通过放疗而不是通过免疫作用来缩小肿瘤。在HD患者的尿中，小于5％的经注射的放射性同位素标记的抗铁蛋白被消除。此外，血液放射性的40小时有效第二半衰期和α∶β比例低于2.5表明，经放射性同位素标记的兔抗铁蛋白在体内是稳定的[33，34]。最后，抗铁蛋白还靶向在正常睾丸和血液中发现的铁蛋白，但是已经观察到HD患者中，血池放射性与血液毒性呈良好的相关性，所述血液毒性通常在10-16周后自发消失。HD患者中未发现急性副反应[10，31]。应该强调的是，用于早期临床研究的抗体是多克隆兔抗人铁蛋白。AMB8LK，公开于WO 01/52889中的由Monoclonal Antibodies Therapeutics(MAT)Ltd.Evry，France制备的单克隆抗体识别所有异铁蛋白(酸性的和碱性的)的共同表位。AMB8LK已经被证明对特定器官具有显著的亲和性，并且与同位素偶联之后，其可以用于何杰金氏病以及其它肿瘤如胰腺癌和肺(NSCLC)癌的诊断和治疗。
最后，Orphan Drug Status已经于近日被EC Orphan MedicinalProducts Committee批准可将抗铁蛋白多克隆抗体偶联至钇90，以治疗顽固性何杰金氏病(MAT，ltd.，Evry France)。所述识别提供令人信服的证据，及抗铁蛋白可以被HD患者的肿瘤优先吸收。
需要通过特异性配体来选择性地靶向负载有抗癌药物的乳液以对抗表达在恶性细胞上的抗原，从而增强所述免疫乳液制品的疗效以及降低与化疗相关的不良副作用。
发明内容
因此，本发明的一个目的是提供组合物和靶向药物的方法。
本发明涉及一种包括阳性水包油乳液和一种抗体的组合产品，其中所述乳液含有在其自然状态和在油水界面具有游离NH2基团的化合物，其中所述化合物通过异双功能交联剂连接至所述抗体上，将所述NH2基团连接至抗体绞链区上的SH基团上。
本发明更具体地涉及一种组合产品，其中所述产品具有正ζ电荷。
本发明还涉及一种组合产品，其中所述具有NH2自由基团的化合物是选自下列的至少一种阳离子脂质：C10-C24烷基胺、C10-C24烷醇胺或胆甾醇酯。
本发明还涉及一种组合产品，其中所述具有NH2自由基团的化合物是硬脂酰胺或油胺。
此外，本发明涉及一种组合产品，其中所述乳液包括具有由界面膜包围的油性中心的胶体微粒，其中所述界面膜包括在其自然状态具有自由NH2的化合物、非离子表面活性剂和一种阴离子表面活化剂或阴离子脂质，其中所述胶体微粒具有正ζ电位(potential)。
所述乳液公开于国际申请WO 03/053405中。
更特别地，本发明公开了一种组合产品，其中所述乳液含有一种药理学活性物质。
本发明还涉及一种组合产品，其中所述抗体选自多克隆抗体或单克隆抗体。所述单克隆抗体可以自然形式、合成形式、嵌合形式或人源化形式使用。
更特别地，在根据本发明的组合产品中，所述抗体靶向存在病理细胞表面上的抗原。
更具体地说，在根据本发明的组合产品中，所述抗体靶向的蛋白选自HER-2、H-铁蛋白、前列腺特异性膜抗原(PSMA)或粘蛋白(以高度糖基化为特征的高分子量糖蛋白。MUC 1是迄今为止九个克隆的粘蛋白中表征最好的。MUC 1在前列腺癌和转移性前列腺癌中过度表达)，CD 44(在所有七个AML(急性粒细胞性白血病)亚型的白血病细胞上表达的细胞表面抗原)和视黄醛S-抗原(通过杂交瘤制备的单克隆抗体，所述杂交瘤由视黄醛S-抗原(S-Ag)产生)，对所有受试种(人类，牛，豚鼠和大鼠)的视黄醛Muller细胞显示出强特异性结合，[35]。
更具体地说，所述抗体是AMB8LK抗体，更具体地说，是经胃蛋白酶消化后得到的片段形式F(ab)2。
本发明还涉及一种组合产品，其中所述异双功能交联剂选自N-1硬脂酰-马来酰亚胺(SM)、油烯基马来酰亚胺(oleylmaleimide)、琥珀酰亚胺反式-4-(马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯(SMCC)或琥珀酰亚胺3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP)。
此外，本发明涉及一种制备之前公开的组合产品的方法，所述方法包括下列步骤：
a)任选地还原一种抗体以在其绞链区得到自由SH基团，
b)混合一种阳性乳液和具有自由SH基团的抗体以得到所述组合产品，其中所述阳性乳液含有一种在其自然状态含有自由NH2基团的化合物，其中所述化合物通过所述NH2基团连接至异双功能交联剂上。
根据已知技术手段实现步骤a)，例如由Hermanson公开的技术[36]。
更特别地，本发明公开了一种方法，其中步骤b)所述阳性乳液通过如下获得：
i.将交联剂连接至天然存在于化合物上的自由NH2基团以得到经修饰的化合物，所述化合物用于获得阳性乳液，
ii.混合所述在其自然状态具有自由NH2基团的经修饰的化合物和另一种得到乳液所必需的产品，以得到阳性乳液。
本发明还涉及一种方法，其中步骤b)所述阳性乳液通过如下获得：
i.混合在其自然状态具有自由NH2基团的化合物和另一种为得到乳液所必需的产品，以得到阳性乳液，
ii.将交联剂连接至天然存在于所述化合物上的自由NH2基团上，以得到在所述阳性乳液内的经修饰的化合物。
绞链区的反应性巯基用于和带有马来酰亚胺基团例如SMCC的巯基反应性交联试剂的结合方案。
合成新型交联试剂的原理是通过混合化学结构与母体阳离子脂质非常类似的新型交联剂，即在乳液制备过程中分别为硬脂酰胺或油胺的交联剂来促进免疫乳液的形成并增加反应结合物的产量。通过选择性结合4种不同表面活性剂(分别为磷脂，泊洛沙姆，硬脂酰胺和烷基马来酰亚胺或油胺和油烯基马来酰亚胺)，在O/W界面制备混合的乳化界面膜。
此外，由于在抗体偶联之前不必再将交联剂与预先形成的乳液反应，而是直接将还原的抗体结合至包括已经位于O/W界面的包含交联剂的乳液，可以省略结合反应中的一个重要步骤。然后期望不发生交联反应(在油滴和交联剂或抗体分子之间)，同时由于还原的抗体在乳液的O/W界面直接面对反应性部分，因此交联反应的特异性和产量明显增加。
根据本发明，术语药理学活性物质包括治疗剂和诊断剂，其可以用于热血动物，特别是哺乳动物包括人类，兽类或家畜。
根据本发明，药物靶向系统可能包括一种药理学活性物质或多种药理学活性物质乃至更多种药理学活性物质，只要它们在同一药物靶向系统中相容。
在本发明药物靶向系统的一个优选实施方案中，药学上有效物质是亲脂性药物，选自：吉西他滨、米托蒽醌、丝裂霉素、长春新碱、表柔比星、氨甲喋呤、鬼臼亚乙苷、亚德利亚霉素、嘌呤或核苷、博来霉素、丝裂霉素、BCNU、紫杉酚、多西紫杉醇或其它紫杉烷衍生物，更具体地说是紫杉醇油酸盐或棕榈酸盐、喜树碱、N4-酰基-1-β-D-阿拉伯糖胞嘧啶(arabinofuranosylcystosines)、地塞米松、棕榈酸盐、氟羟脱氢皮醇(上述两种用于眼部应用)、环孢素、他克莫司或西罗莫司(具有确定的P-gp抑制作用的免疫抑制剂，其能降低多药耐药性)。所有上述药物应该溶于油滴中心中。
在一个更加优选的实施方案中，上述药理学活性物质是活性细胞毒素物质，所述活性细胞毒素物质在与抗体结合之前结合入所述乳液中，例如非水溶性药物如紫杉醇、紫杉醇油酸盐或吉西他滨碱单独或与环孢素A或他克莫司结合。
将含有紫杉醇或吉西他滨的阳离子(cationic)乳液与抗体例如曲妥单抗或AMB8LK偶联的优点是多重的，所述抗体例如曲妥单抗或AMB8LK可以特异性识别分别过度表达HER-2或H-铁蛋白的乳腺癌，结肠癌和胰腺癌症肿瘤，或MUC 1抗体或者能识别转移性前列腺癌的PMSA MAb，上述优点包括：通过转移抗体特异性至乳液界面的免疫靶向；延长生物体中的停留时间；在通过抗体确认的肿瘤位点释放大细胞毒剂量，以及抗体从乳液界面生物降解之后细胞毒类药物在肿瘤中较好地内化，以及回收负载药物的带正电荷的乳液，该乳液经证明可增强各种组织中的药物渗透。
根据本发明的组合物一方面确保抗体能特异性识别抗原位点或受体；另一方面通过靠近目标病理组织的胶体给药系统释放不同亲脂性细胞毒试剂。所述药物释放是由免疫乳液和肿瘤细胞的相互作用引发的。治疗剂被预期选择性地转移至细胞表面，并且随后通过原生质膜的结构性内吞或胞饮内陷而内化，最终将细胞毒试剂传递至其作用位点，所述位点对于大多数抗癌药是在细胞内的。上述给药途径可以是全身性途径(非肠道、静脉注射、腹膜内、脊柱内、肿瘤内)，眼部或局部途径。
根据本发明的有效给药系统显著地降低与不良耐受的非选择性分布和潜在的细胞毒试剂相关的副作用。
将含有选择性细胞毒类药物的带正电荷乳液和抗体偶联在肿瘤学中的优越性是多重，其包括：
-通过转移抗体特异性至乳液界面进行免疫靶向，
-延长在生物体中的保留时间，
-在抗体识别的肿瘤位点释放大细胞毒剂量，
-减少乳液的正电荷及肺向性，
-在抗体从乳液界面生物降解之后，细胞毒类药物在肿瘤中较好地内化，以及回收经证明能增强各种组织中药物渗透的负载药物的带正电荷乳液。
通过下列实施例和附图进一步举例说明本发明。
附图1表示结合至油滴乳液的抗体的百分比，以初始比值为45曲妥单抗分子/油滴作为增加阳离子乳液中交联剂SM的浓度的函数。
附图2是带正电荷亚微粒乳液与单克隆抗体通过SMCC技术偶联的原理图。
附图3是带正电荷亚微粒乳液与单克隆抗体通过SPDP技术偶联的原理图。
附图4表示Capan-1细胞对不同乳液制品的吸收。上述免疫乳液的密度为100Ab/微滴。
实施例1：原料和方法
1.1.制备阳离子乳液
阳离子空白乳液由水相和油相组成，水相包括蒸馏水，泊洛沙姆188(Poloxamer 188)(非离子表面活性剂)，甘油(渗透剂)，油相含有MCT(中链甘油三酯)，硬脂酰胺(阳离子脂质)，α-生育酚(抗氧化剂)和类脂E-80(磷脂混合物)。所述类脂E-80，维生素E和硬脂酰胺直接溶于油相，而泊洛沙姆和甘油直接溶于水相。两相分别加热至70℃。将水相缓慢混入油相并用磁性搅拌器混合。所得混合物进一步加热至85℃。使用高剪切Polytron混合器(Kinematica，Luzern，Switzerland)将得到的粗制乳液乳化5分钟以上，然后迅速冷却至20℃以下。在冰浴中冷却后，乳液使用两级均化阀装置(Gaulin homogenizer，APV Gaulin，Hilversum，The Netherlands)以9000psi均化5分钟。进一步快速冷却至低于20℃之后，使用0.1N盐酸调节pH值至7.0。然后通过孔径0.45μm的TE膜滤器(Schleicher&Schuell，Dassel，Germany)过滤所得乳液。最后，在氮气环境中用硅化玻璃瓶包装乳液并使用高压灭菌器在121℃灭菌15分钟。
典型的配方是由下述组成的(w/w％)：MCT(5)，泊洛沙姆188(1)，甘油(2.25)，类脂E80(1)，硬脂酰胺(0.25)，α-生育酚(0.01)和水(直至100)。
对于免疫乳液制品，添加0.02％合成的交联剂，得到4 000交联剂/微滴。
对于流细胞计数法、荧光和共焦显微学分析，使用以相对于乳液MCT含量的以1∶200的摩尔比溶于四氢呋喃(THF)的香豆素6制备荧光标记的乳液(香豆素最终浓度490μM或0.17mg/ml)。2小时适度加热后，香豆素平衡并渗透入乳液中，同时通过蒸发除去THF。使用SephadexG-25柱除去未负载标记。
1.2.乳液特征
1.2.1.粒径分析
使用ALV非扩散性背散射高性能颗粒填料器(ALV-NIBS HPPS，Langen，Germany)在25℃测定液滴尺寸，并使用水(折射率：1.332；粘度：0.894543)作为溶剂。使用波长为632nm的激光束。灵敏度范围是0.5nm～5μm。
1.2.2.测量ζ电位
使用Malvern zetasizer(Malvern，UK)测定在10mM NaCl(150mV)中稀释的乳液的ζ电位。
1.3.制备阴离子乳液
使用与Levy和Coll.[37]所描述相同的方法，用油酸代替硬脂酰胺制备阴离子乳液。确切的配方是MCT 6.6％，油酸2.3％，类脂E80 1％，维生素E 0.01％，甘油2.25％，普卢兰尼克F-681％和DDW 100％。
2.制备抗体片段
根据已知的赫尔曼森(Hermanson)[36]方法还原曲妥单抗和AMB8LK F(ab)2片段。在37℃，通过2-半胱胺(MEA，最终浓度0.05M)还原纯化的曲妥单抗和AMB8LK F(ab)2抗体(4mg/ml)90min，以制备用于与乳液结合的巯基基团。
一旦被2-半胱胺还原，免疫球蛋白就裂成两部分，形成两个MW75 000-80 000的重链-轻链分子，并且每个含有一个抗原结合位点(应该强调，该方法不引起蛋白质变性)。类似地，F(ab′)2片段可以被还原产生两个Fab′片段，每个含有一个抗原结合位点。在SephadexG-25柱上洗脱溶液，以1ml馏分收集Fab′片段级分。使用280nm处的UV测定含有Fab′的级分，并合并收集液。4℃氮气环境中保存Fab′片段(50kD)直至偶联至乳液。通过SDS-PAGE确定Fab′片段的产生，并且通过夹心ELISA证实其抗原特异性。
3.偶联反应
使用1N HCl将根据1新鲜制备的乳液的pH值调至6.5，并且在4℃连续搅动和氮气环境下与AMB8LK Fab′片段(最终浓度0.1-0.5mg/ml)培养过夜。通过与2-巯基乙醇(2mM)培养30分钟来封闭未反应的马来酰亚胺基团。通过Sepharose CL-4B柱凝胶过滤，将未结合的抗体和2-巯基乙醇从免疫乳液中分离出来。通过共焦显微镜和射电显微术(TEM)，分别使用FITC或黄金标记的羊抗-小鼠/人IgG，对最终的免疫乳液进行形态学评价。通过ELISA测定与乳液结合的Fab′片段总数。对于使用不同量的结合抗体制备免疫乳液来说，Fab′对马来酰亚胺-活化的乳液的初始比例是不同的。
4.药物掺入
在与抗体结合之前，将经选择的亲脂性或疏水性细胞毒药物例如环孢素A首先溶于乳液的油相中，以制备有效治疗肿瘤细胞的负载药物的免疫乳液，而这些肿瘤细胞通过常规化疗难于接近。
5.乳液-抗体结合物的稳定性研究
体外通过促进试验例如升温、搅拌以及使用长期储存评价来研究经偶联的乳液的稳定性。
检验下列性质：液滴尺寸分布，ζ电位，pH值和使用HPLC测定的药物含量[36]。
6.体外药物释放动力学评价
使用超滤技术在低压下对从阳离子乳液中的体外药物释放分布特征的测定如下所述：将0.4ml含药乳液(含有1mg环孢素A)直接置于含有100ml释放介质(维持下沉条件)的Amicon 8 200搅拌容器中(Amicon，Danvers，MA，U.S.A)。在给定时间间隔下，在低压条件下(小于7.25psi)使用氮气，通过YM-100超滤膜过滤释放介质。使用HPLC测定1ml等分澄清滤液的紫杉醇含量[38]。必须考虑膜吸附和排斥，以准确地测量药物中的水量，从而在使用超滤技术之前进行证实。
7.细胞培养研究
免疫染色以用于测定H-铁蛋白和HER-2过度表达。
在不同癌细胞系(用于胰腺癌的CAPAN-1，用于结肠癌的Caco-2和用于乳腺癌的SK-BR-3)和非癌细胞例如成纤维细胞和平滑肌细胞中测定H-铁蛋白的过度表达。
细胞融合之后用胰酶消化并转移(每孔105细胞)入覆盖有18mm盖玻片的16孔板中。细胞在37℃，5％CO2条件下，在盖玻片上粘附24小时。弃去培养基并且使用新鲜的4％多聚甲醛固定10分钟。用PBS洗涤细胞并且用50mM NH4Cl及随后用5％BSA阻断自身荧光。洗涤细胞并且在4℃用AMB8LK 1∶50稀释物培养过夜。洗涤细胞并且在室温下用FITC 1∶50稀释物结合山羊抗小鼠IgG 1小时。用PBS洗涤第二抗体5次，随后封片，接着使用荧光显微镜或共焦显微镜观察细胞。使用相同过程测定HER-2，使用曲妥单抗和FITC结合的山羊抗人IgG作为第二抗体。
8.AMB8LK-免疫乳液的体外结合分析
将用香豆素6标记的AMB8LK-免疫乳液和对照乳液(没有结合AMB8LK的阳离子乳液和阴离子乳液)添加至1×106CAPAN-1细胞中，并在4℃培养30分钟。用1ml免疫荧光(IF)缓冲液(PBS中1％(w/v)BSA，pH值7.4)洗涤细胞。此后，将已经与用荧光标记的乳液培养过的细胞再次悬浮于500ul IF-缓冲液中，并通过流细胞计数法分析。
9.免疫乳液的细胞吸收的共焦激光扫描显微学(CLSM)分析
CAPAN-1细胞在盖玻片上生长至亚融合。将细胞与香豆素6标记的乳液(阳离子乳液和AMB8LK免疫乳液)在补充血清的生长培养基中在37℃条件下培养0分钟，30分钟和1小时，用PBS充分洗涤，在甘油中封片并用共焦显微镜观察。
10.测定细胞对AMB8LK-免疫乳液和药物的吸收
CAPAN-1在24孔板上生长至亚融合。细胞与香豆素6标记的乳液(阳离子乳液，阴离子乳液和AMB8LK免疫乳液)，在PBS中37℃条件下培养1小时，并用PBS充分洗涤。使用BMG Labtechnologies的FluoStar-Galaxy测定平板的荧光，激发波长485nm且发射波长520nm。每个平板读数4次并计算平均值。没有经洗涤并与相同样品培养的孔作为总荧光的参照。
实施例1B：结果
1.1.AMB8LK Fah′产生
通过SDS-PAGE确定AMB8LK Fab′片段的产生，证实F(ab)2通过半胱胺(MEA)的适度还原裂解为Fab′片段。使用铁蛋白作为包被抗原的夹心ELISA证实了AMB8LK Fab′的抗原特异性。
以半胱氨酸作为标准，通过监控343nm处吸光度的改变，用Aldrithiol测定自由巯基基团。经该步骤后，抗体暴露3个自由巯基基团。
1.2.AMB8LK-免疫乳液特征
使用O/W界面的不同抗体密度(从10多至100抗体分子/油滴)以检验其对乳液最终液滴尺寸和ζ电位的影响。有人指出，抗体密度对液滴尺寸和ζ电位没有影响，分别是110-130nm和+35mV。通过ELISA测定的偶联效率也未受表面抗体密度的影响。不管起始Ab/液滴比例是多少，除去未反应的Ab后测量到的效率范围是55～63％。共焦显微镜和TEM观察进一步证实上述情况，分别通过它们可以明显地推论出，大部分Ab分子在O/W界面附着于油滴，而自由Ab分子集中于外部水介质中。
与使用完整的IgG分子得到的结果相比，这些发现说明了明显的改进。效率从25％增加至63％，而AMB8LK片段的密度进一步从40Ab分子/液滴增加至100Ab分子/液滴。该观察指出与Ab分子尺寸相关的立体位阻效应的重要性。由此，与MW 150 000的IgG相比，用Fab′AMB8LK片段(MW 50 000)可以实现最高密度。可以推断，随着MAb片段的分子量降低，偶联效率增加。
1.3.H-铁蛋白的免疫染色
为了测定在不同癌细胞系中例如CAPAN-1(胰腺癌细胞)，SK-BR-3(乳腺癌细胞)，Caco-2(结肠癌细胞)和两种对照正常细胞系例如成纤维细胞和平滑肌细胞中H-铁蛋白的过度表达而进行免疫染色。将细胞与AMB8LK Fab2片段培养以检测H-铁蛋白的过度表达。将不与AMB8LK Fab2片段培养的而仅仅与第二抗体培养的细胞作为对照。仅仅在癌症细胞中观察到清楚的荧光说明了铁蛋白的表达，而正常细胞不显示荧光则证实不存在铁蛋白。
因此，似乎可以证实H-铁蛋白分子能被用作乳腺癌，结肠癌和胰腺癌疗法靶分子的假设，并进一步研究其优点。
1.4.使用流细胞计数法进行的体外结合分析
FACS分析揭示，与由于其负电荷性质而不与细胞结合的阴离子乳液相比，AMB8LK-免疫乳液和阳离子乳液与CAPAN-1细胞系结合。
1.5.通过共焦显微镜显示的体外吸收
与空白阳离子乳液相比较，AMB8LK免疫乳液制剂会更迅速且有效地定性结合至Capan-1细胞系上。
1.6.测定定量吸收
与使用阴离子乳液(34％)相比较，使用阳离子乳液时，包含于渗透入细胞内的乳液中的荧光亲脂性探针的份额更高(42.7％)，这证实了先前的结果，该结果已经证明与阴离子乳液相比，阳离子乳液会增强不同亲脂性药物对不同组织和器官的渗透，与给药途径无关[22]。可以推断，AMB8LK偶联至酸性乳液不仅不阻止或降低荧光探针的吸收，反而使其显著增加(增加50％)。
探针渗透性增强清楚地表明，内化过程不仅被阳离子油滴的静电效应调节，还可能被细胞-受体调节的内吞作用调节，所述内吞作用通过受到AMB8LK MAb影响的细胞表面内化受体配体进行。
实施例2：使用N-(l-硬脂酰)-马来酰亚胺的结合方法
2.1.合成交联剂N-(1-硬脂酰)-马来酰亚胺(SM)
在室温下，搅拌在氯仿(10ml)中的硬脂酰胺(0.01摩尔)和马来酐(0.01摩尔)的混合物超过3小时。滤出沉淀的晶体，用少量的氯仿洗涤以得到纯N-(1-硬脂酰)马来酸。在乙酸酐(30ml)中回流后一化合物(4毫摩尔)和醋酸钠(0.03g，相当于0.3毫摩尔)超过30分钟，然后立即在冰浴中冷却。收集沉淀的晶体并用水洗涤以得到标题化合物N-(1-硬脂酰)-马来酰亚胺，收率为85％(流程图-1)。
流程图1
2.2.曲妥单抗抗体通过硫醚方法结合至乳液
2.2.1.曲妥单抗的硫醇化
抗体使用2-亚胺巯醇(Traut′s reagent，Aldrich Chemicals co.Milwaukee Wisconsin)进行硫醇化。将抗体溶于由50mM Tris，1mMEDTA和150mM NaCl组成的pH值为8.5的缓冲溶液中。然后以相对于抗体600∶1的分子比添加2-亚胺巯醇，然后在室温下培养超过45分钟。反应混合物上HiTrapTM脱盐柱(Amersham Bioscience，Uppsala，Sweden)以除去过量的2-亚胺巯醇。
使用Traut′s试剂修饰抗体不影响其特异性识别SK-BR3细胞上过度表达的抗原HER2的能力。不存在曲妥单抗时没有荧光，而存在曲妥单抗时记录到显著的细胞表面荧光。
2.2.2.结合方法
将硫醇化的抗体立即添加至含有N-(1-硬脂酰)-马来酰亚胺(SM)交联剂的酸性乳液(pH值6.5)中。反应混合物室温下过夜，同时混合并处于氮气环境下。使用1.5×25cm Sepharose CL-4B柱(AmershamBioscience，Uppsala，Sweden)，用水洗脱混合物以除去未结合的抗体。
2.3.对结合反应效果的评价
2.3.1.ELISA
根据下列方案的半定量ELISA方法(酶联免疫吸收测定)，以新型交联剂N-(1-硬脂酰)-马来酰亚胺(SM)的浓度为函数来评价结合效率(抗体结合到乳液的百分比)：
·用免疫乳液或空白乳液(在包覆缓冲液pH值9.5中稀释)包覆小孔，
·37℃培养过夜，
·用PBS-Tween洗涤20×3，
·通过2％BSA阻断非特异性结合超过1.5小时，
·用PBS-Tween洗涤20×3，
·添加第二抗体(Horseraddish结合的抗人IgG，Jackson ImmunoresearchLtd.，West Grove，Pennsylvania，USA)并培养2小时RT，
·用PBS-Tween洗涤20×3，
·添加底物(TMB/E，Single Oak Drive-Temecula，California)，
·使用荧光分光计读取展开颜色在650nm的UV吸光度。
结合效率随乳液制品中SM交联剂量的增加而增加，初始比例45曲妥单抗分子/油滴时几乎达到30％结合。
2.3.2.免疫金染色
使用其它作者之前报道的技术(6)，用12nm黄金结合的第二抗人IgG抗体(Jackson Immunoresearch Ltd.，West Grove，.Pennsylvania，USA)检测乳液油滴上的曲妥单抗。在曲妥单抗和黄金第二抗体之间的免疫反应之后，就可以看见实际上是黄金纳米微粒的黑点并使用射电显微术进行局部化。
可以明显地注意到，曲妥单抗位于乳液的油滴上。而且，单一油滴上的黑点数目接近多至5-6Ab分子/液滴。此外，乳液的外部水相中几乎没有自由黑点并且发生随机结合。该结果证实ELISA发现。
实施例3：活性测定
3.1.细胞培养研究
在研究的全过程使用已知会过度表达HER2抗原的乳腺癌细胞，SK-BR3细胞(ATCC，Manassas，Virginia，USA)的沿用已久的细胞系模型以在评估曲妥单抗亲和性和免疫乳液制品的比活性。
3.2.结合研究
将细胞固定于盖玻片上，用5％BSA阻断非特异性结合。然后，细胞与空白乳液或者免疫乳液(最终稀释度1∶1000)培养过夜。使用PBS连续洗液3次以除去未结合的油滴，然后添加FITC-结合的抗人抗体(最终稀释度1∶50)以检测曲妥单抗。进行一次额外的洗涤。
使用Zeiss共焦显微镜检验荧光。将抗体附着于乳液上并与细胞结合。此外，由于第二抗体识别曲妥单抗，表明制备过程之后曲妥单抗没有变性。
然而，为了使空白乳液也显相，还用亲脂性荧光探针香豆素-6(Polyscience Inc，Warrington，Pennsylvania)以油相中香豆素对类脂E801∶1000的比例标记乳液(7)。
将细胞固定于盖玻片上，用5％BSA阻断非特异性结合。在室温下与标记的空白乳液和免疫乳液(最终稀释度1∶1000)培养超过1小时。
用PBS连续洗涤细胞3次，然后使用共焦显微镜观察。观察到空白乳液和免疫乳液与SK-BR3细胞结合的定性显著差异，其反映为荧光密度上的差异。可以明显看出，免疫乳液广泛地结合于细胞上，而在室温下培养超过1小时后空白乳液的结合最低。
为了证明，使用FACS分析(荧光激活细胞分类分析)进行额外的研究。将细胞固定，单独用曲妥单抗或者与免疫乳液(两个样品中曲妥单抗浓度相同)培养超过1小时。用PBS连续洗涤细胞3次，然后添加FITC-结合的第二抗体(最终稀释度1∶50)。再次用PBS洗涤细胞，然后通过FACS分析。
显然，与相同量的自由抗体相比，免疫乳液的亲和程度为约5％。
然而，与对照相比，发生显著的油滴结合，并且可以促进负载于阳离子油滴的显著药物用量的内化。
3.3.吸收研究
将SK-BR3细胞在37℃与空白乳液或用香豆素-6标记的免疫乳液培养不同时间：5，15，30分钟。
用PBS连续洗涤细胞3次，然后固定并用Zeiss共焦显微镜检测。
可以明显记录到，空白乳液以最低程度与细胞结合，然而定性地免疫乳液更强烈地与细胞结合并且结合程度随时间更加显著。
实施例4：使用SMCC进行的结合方法
附图2.说明，可以使用两种不同方法将SMCC偶联至硬脂酰胺(SA)上。首先制备乳液，并且将SMCC添加至乳液中，所以反应会在O/W界面发生。或者，SMCC可以首先附着于天然SA上，在乳液形成之前将新型偶联剂掺入油相中。在第二阶段中，1，4-二硫赤藓糖醇(DTT)存在时在温和条件下还原抗体。
室温下，2mg/ml PBS缓冲液中的抗体溶液与20mM DTT培养30分钟，或与50nM半胱胺在37℃搅拌下培养1小时。然后，使用SephadexG25对部分还原的抗体溶液进行凝胶过滤，以除去过量未反应的DTT，并且用2.25％甘油溶液(不含PBS)替换溶液介质。然后，将100g上述还原的抗体添加至10ml马来酰亚胺衍生的乳液(活化的乳液)中，室温下恒定搅拌过夜。
实施例5：使用SPDP进行的结合方法
附图3.说明，首先将SPDP添加至乳液中，在O/W界面与SA的NH2部分反应，形成二硫键。然后，所得的混合的二硫键与还原剂(DTT)反应超过2小时，导致释放吡啶二硫代丙酰结合物并且在液滴表面形成自由SH基团。该过程结束后，进行vivaspin20(10kDa)透析，以除去吡啶二硫代丙酰副产物、未反应的DTT和任何可能过量的SPDP。然后所得乳液(具有自由SH基团)与活化的抗体(与SMCC反应的IgG)培养，以产生最终的抗体-乳液结合物。
实施例6：ANB8LK的结合
6.1.1.制备乳液
如前所述制备AMB8LK免疫乳液。使用香豆素6探针制备荧光乳液。以1∶200的摩尔比将探针掺入乳液中。由于MCT浓度是5％(～97.6μmol/ml)，添加的香豆素6剂量是0.488μmol/ml。简要地，SepharoseCL-4B分离之后，将4μl9.3mM香豆素6四氢呋喃(THF)溶液添加至500μl乳液中。混合物涡流并在37℃培养2小时。
6.1.2.FACS分析
对于FACS分析，Capan-1细胞系生长至融合。细胞用胰酶消化并以1200rpm离心5分钟。除去上清液并添加1ml FACS缓冲液。整个过程中细胞始终置于冰上。洗涤FACS管中的1-2×105细胞并再次离心，然后将每个色斑置于100μl FACS缓冲液中，所述缓冲液以1∶1000的稀释度含有不同乳液配方。在冰上培养30分钟。再次洗涤细胞，离心并悬浮于0.5-1ml FACS缓冲液中。然后进行FACS分析。
6.1.3.荧光显微学分析
Capan-1细胞达到融合之后用胰酶消化，并且转移(每孔105细胞)至用18mm盖玻片覆盖的16孔板上。
将细胞粘附于盖玻片24小时，37℃，5％CO2。24小时之后，弃去培养基，37℃下细胞与标记的乳液对PBS1∶1000培养0，30和60分钟。之后，使用新鲜的4％多聚甲醛固定10分钟。弃去多聚甲醛并用PBS×3洗涤细胞。用50mM NH4ClPBS阻断自身荧光5分钟。再次用PBS×3洗涤细胞，并用荧光显微镜和共焦显微镜观察。
6.1.4.定量分析
Capan-1细胞达到融合之后用胰酶消化，并且转移(每孔105细胞)至24孔板上。37℃且5％CO2条件下，将细胞附着于平板直至达到融合。下一步，用各种标记的乳液样品与细胞(PBS中1∶1000)37℃培养超过45分钟。用PBS×3洗涤细胞样品，而不洗涤对照。使用BMG Labtechnologies的Fluo Star-Galaxy测定平板的荧光，激发波长485nm且发射波长520nm。每个平板读数4次并计算平均值。
6.2.结果
6.2.1.标记乳液
共焦显微学观察得出结论，即用香豆素6标记油滴。
6.2.2.比较AMB8LK免疫乳液和阳离子乳液(标记的制剂)37℃时，它们与Capan-1细胞培养不同时间间隔0，30和60分钟。使用共焦和荧光显微镜对两种制剂进行比较。
6.2.3.阳离子乳液，阴离子乳液和免疫乳液的结合研究
还使用FACS分析(4℃，30分钟)研究不同乳液制剂的结合。所有制剂，除阴离子乳液之外，在4℃与Capan-1细胞系结合30分钟。当在37℃培养1小时时，可更好地观察到阳离子乳液和AMB8LK免疫乳液之间差异。
6.2.4.吸收研究
使用FlouStar-Galaxy进行荧光测定，以测定Capan-1细胞对乳液样品的定量吸收。可以从附图4的数据得知，与阴离子乳液相比较，渗透入细胞内的乳液所包含的荧光亲脂性探针的份额对于阳离子乳液更高。AMB8LK偶联至阳离子乳液，不仅不阻止或降低荧光探针的吸收，反而显著地增强(50％)探针的渗透，这清楚地表明内化过程不仅仅被阳离子油滴的静电效应调节，而且被细胞受体调节的内吞作用调节，所述内吞作用是通过受AMB8LK单克隆抗体影响的细胞表面内化受体配体进行的。
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权利要求书
(按照条约第19条的修改)
1、一种组合产品，其包括一种阳性水包油乳液和一种抗体，其中所述乳液含有在其自然状态、在油水界面具有自由NH2基团的至少一个阳离子脂质，所述脂质选自C10-C24烷基胺、C10-C24烷醇胺或胆甾醇酯，其中所述化合物通过异双功能交联剂连接至所述抗体上，所述交联剂选自N-1硬脂酰-马来酰亚胺(SM)、油烯基马来酰亚胺、琥珀酰亚胺反式-4-(马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)或琥珀酰亚胺3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP)，将所述NH2基团连接至抗体绞链区上的SH基团，并且其中所述异双功能交联剂在化学结构上与所述阳离子脂质非常相似。
2、根据权利要求1所述的组合产品，其中所述产品具有正ζ电荷。
3、根据权利要求2所述的组合产品，其中所述具有NH2自由基团的阳离子脂质是硬脂酰胺或油胺。
4.根据权利要求3所述的组合产品，其中如果所述的具有NH2自由基团的阳离子脂质是硬脂酰胺，则所述的异双功能团交联剂为硬脂酰亚胺，如果所述的具有NH2自由基团的阳离子脂质是油胺，则所述的异双功能团交联剂为油烯基马来酰亚胺。
5.根据权利要求4所述的组合产品，其中所述乳液含有磷脂和泊洛沙姆。
6、根据权利要求1-5任一项所述的组合产品，其中所述乳液包括具有由界面膜包围的油性中心的胶体微粒，其中所述界面膜包括在其自然状态具有自由NH2的化合物、非离子表面活性剂和阴离子表面活化剂或阴离子脂质，其中所述胶体微粒具有正ζ电位。
7、根据权利要求6所述的组合产品，其中所述乳液含有活性成分(药物)。
8、根据权利要求1-7任一项所述的组合产品，其中所述抗体是多克隆抗体。
9、根据权利要求1-7任一项所述的组合产品，其中所述抗体是单克隆抗体，选自自然形式、合成形式、嵌合形式或人源化形式。
10、根据权利要求1-9任一项所述的组合产品，其中所述抗体靶向蛋白质，所述蛋白质选自HER-2、H-铁蛋白、PSMA、粘蛋白、MUC 1、CD 44或视黄醛S-Ag。
11、根据权利要求10所述的组合产品，其中所述抗体是AMB8LK抗体。
12、一种制备根据权利要求1所述的组合产品的方法，包括下列步骤：
a)任选地还原抗体以在其绞链区得到自由SH基团，
b)混合阳性乳液和具有自由SH基团的抗体以得到所述组合产品，其中所述乳液含有一种在其自然状态具有自由NH2基团的化合物，其中所述化合物通过所述NH2基团连接至异双功能交联剂上。
13、根据权利要求12所述的方法，其中步骤b)中的所述阳性乳液通过下述得到：
i.将交联剂连接至天然存在于化合物上的自由NH2基团上，该化合物用于获得阳性乳液，以得到经修饰的化合物，
ii.混合所述在其自然状态具有自由NH2基团的经修饰的化合物和另一种得到乳液所必需的产品，以得到阳性乳液。
14、根据权利要求12所述的方法，其中步骤b)中的所述阳性乳液通过下述得到：
i.混合在其自然状态具有自由NH2基团的化合物和另一种为得到乳液所必需的产品，以得到阳性乳液，
ii.将交联剂连接至天然存在于所述化合物上的自由NH2基团上，以得到在所述阳性乳液中的经修饰的化合物。
Claims (15)
1、一种组合产品，其包括一种阳性水包油乳液和一种抗体，其中所述乳液含有一种在其自然状态、在油水界面具有自由NH2基团的化合物，其中所述化合物通过异双功能交联剂连接至所述抗体上，将所述NH2基团连接至抗体绞链区上的SH基团。
2、根据权利要求1所述的组合产品，其中所述产品具有正ζ电荷。
3、根据权利要求1或2所述的组合产品，其中具有NH2自由基团的化合物是至少一种阳离子脂质，其选自C10-C24烷基胺、C10-C24烷醇胺或胆甾醇酯。
4、根据权利要求3所述的组合产品，其中所述具有NH2自由基团的化合物是硬脂酰胺或油胺。
5、根据权利要求1-4任一项所述的组合产品，其中所述乳液包括具有由界面膜包围的油性中心的胶体微粒，其中所述界面膜包括在其自然状态具有自由NH2的化合物、非离子表面活性剂和阴离子表面活化剂或阴离子脂质，其中所述胶体微粒具有正ζ电位。
6、根据权利要求5所述的组合产品，其中所述乳液含有活性成分(药物)。
7、根据权利要求1-6任一项所述的组合产品，其中所述抗体是多克隆抗体。
8、根据权利要求1-6任一项所述的组合产品，其中所述抗体是单克隆抗体，选自自然形式、合成形式、嵌合形式或人源化形式。
9、根据权利要求1-8任一项所述的组合产品，其中所述抗体靶向存在于病理细胞表面的抗原。
10、根据权利要求1-9任一项所述的组合产品，其中所述抗体靶向蛋白质，所述蛋白质选自HER-2、H-铁蛋白、PSMA、粘蛋白、MUC 1、CD 44或视黄醛S-Ag。
11、根据权利要求1-6和8-10任一项所述的组合产品，其中所述抗体是AMB8LK抗体。
12、根据权利要求1-11任一项所述的组合产品，其中所述交联剂选自N-1硬脂酰-马来酰亚胺(SM)、油烯基马来酰亚胺、琥珀酰亚胺反式-4-(马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)或琥珀酰亚胺3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP)。
13、一种制备根据权利要求1所述组合产品的方法，包括下列步骤：
a)任选地还原抗体以在其绞链区得到自由SH基团，
b)混合阳性乳液和具有自由SH基团的抗体以得到所述组合产品，其中所述乳液含有一种在其自然状态具有自由NH2基团的化合物，其中所述化合物通过所述NH2基团连接至异双功能交联剂上。
14、根据权利要求13所述的方法，其中步骤b)中的所述阳性乳液通过下述得到：
i.将交联剂连接至天然存在于化合物上的自由NH2基团上，该化合物用于获得阳性乳液，以得到经修饰的化合物，
ii.混合所述在其自然状态具有自由NH2基团的经修饰的化合物和另一种得到乳液所必需的产品，以得到阳性乳液。
15、根据权利要求13所述的方法，其中步骤b)中的所述阳性乳液通过下述得到：
i.混合在其自然状态具有自由NH2基团的化合物和另一种为得到乳液所必需的产品，以得到阳性乳液，
ii.将交联剂连接至天然存在于所述化合物上的自由NH2基团上，以得到在所述阳性乳液中的经修饰的化合物。
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