CN1918959A - 一种烟草普通花叶病抗性的苗期鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种烟草普通花叶病抗性的苗期鉴定方法，包括接种体准备、病圃设计及管理、接种和鉴定分级等步骤。实现了用苗期鉴定结果替代传统大田鉴定结果，有效避免外部环境对鉴定结果的影响，大幅度地缩短了鉴定的时间，提高了鉴定的数量和质量，节省地力。该方法操作简便，成本低廉，具有良好的市场应用前景。
Description
技术领域
本发明属于植物抗病性鉴定技术领域，具体涉及烟草普通花叶病抗性的鉴定，特别是涉及一种对烟草普通花叶病抗性进行苗期鉴定的方法。
背景技术
目前已知的烟草侵染性病害有68种，主要包括烟草病毒病(TMV、CMV、PVY、TBTV)、赤星病、根结线虫病、炭疽病、黑胫病、野火病与角斑病等，给烟草生产造成了巨大的危害。这其中又以烟草普通花叶病----TMV的危害为重，其所造成的经济损失占侵染性病害所致总损失的37％。该病主要依靠汁液接触传染，苗期的初侵染源为混有病残体的农家肥、种子、土壤以及带病的其它寄主和野生植物，由沾染病毒的手和工具通过农事操作而传播。因此，如何提高现有烟草品种对TMV的抗病能力，培育出具有高抗病能力的烟草品种，就成为目前该领域研究的热点。
作为品种选育的关键，现有的烟草TMV抗性鉴定方法主要有以下三种：①室内离体叶片接种法，该方法虽然简单易行，但是其鉴定的结果只能反映离体叶片对病害的抗扩展能力，无法反映品种的实际抗性，只能作为抗性划分的参考指标。②自然诱发抗性鉴定方法，该方法虽然可以反映品种的自然抗病能力，但是该方法易受种植条件和气候的影响，同一品种在不同烟区鉴定的结果会存在较大差异。当测试年份间的环境条件不利于病害发生时，该方法无法得到准确地测定结果。③大田病圃人工诱发鉴定方法，该方法通过建立病圃，人工定量接种病原菌，模拟自然发病条件等手段，在一定程度上提高了测试的准确性，但是依然无法从根本上解决外部环境对鉴定结果的影响。同时，病原菌接种的量及接种时间等因素都会对最终的结果产生影响。因此，该方法还存在鉴定品种及数量有限，鉴定结果易发生波动等问题。而且该方法从育苗到鉴定的完成需要的时间较长。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种烟草普通花叶病抗性的苗期鉴定方法，用苗期鉴定结果替代传统大田鉴定结果，避免外部环境对鉴定结果的影响，提高烟草普通花叶病抗性鉴定的准确性，缩短鉴定时间。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现。
一种烟草普通花叶病抗性的苗期鉴定方法，包括以下顺序的步骤：
1.接种体准备
采集感染烟草普通花叶病的病叶，用PH值为7.0的磷酸缓冲液磨碎，将磨碎后的汁液摩擦接种于心叶烟上；分离心叶烟上的枯斑，再通过摩擦接种转接到K326上进行扩繁，得到烟草普通花叶病接种体，备用；
2.病圃设计及管理
将待鉴定品种置于育苗盘内栽培，每个品种56～60株，不设重复，苗期管理按常规进行；以Coker176品种为抗病对照，K326品种为感病对照，红花大金元品种为中感对照；
所述的育苗盘为128孔育苗盘。
3.接种
将备用的接种体用pH值7.0的磷酸缓冲液稀释过滤，设定接种浓度为2％，于大十字期至猫耳期进行高压喷枪接种；
喷枪接种时，接种枪距烟苗25～35cm，对准心叶，每株烟喷射二次，喷射压力设定为1.5～2kg/cm2。
4.鉴定分级
于接种后的第21天进行病情调查，所得病指作为测试品种的抗性指标，进而按国家标准对鉴定品种进行分级。
本发明率先提出一种具有实用价值的烟草普通花叶病苗期鉴定方法，实现了用苗期鉴定结果替代传统大田鉴定结果，有效避免外部环境对鉴定结果的影响，大幅度地缩短了鉴定的时间，提高了鉴定的数量和质量，节省地力。该方法操作简便，成本低廉，具有良好的市场应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明，但他们不是对本发明的限定。
实施例1
一种烟草普通花叶病抗性的苗期鉴定方法，采集感染烟草普通花叶病的病叶，用PH值为7.0的磷酸缓冲液磨碎，将磨碎后的汁液摩擦接种于心叶烟上。分离心叶烟上的枯斑，再通过摩擦接种转接到K326上进行扩繁，得到烟草普通花叶病接种体，备用。将待鉴定品种置于128孔育苗盘内栽培，每个品种56株，不设重复，苗期管理按常规进行。以Coker176品种为抗病对照，K326品种为感病对照，红花大金元品种为中感对照。将备用的接种体用pH值7.0的磷酸缓冲液稀释过滤，设定接种浓度为2％，于大十字期至猫耳期进行高压喷枪接种。接种时，接种枪距烟苗25cm，对准心叶，每株烟喷射二次，喷射压力设定为1.5kg/cm2。于接种后的第21天进行病情调查，所得病指作为测试品种的抗性指标。按国家行业标准YC/T39-1996将病害分为四级：抗病(R)：病指25以下；中抗(MR)；病指在25.1-50.0；中感(MS)：病指在50.1-75.0；感病(S)：病指75以上。
实施例2
重复实施例1，有以下不同点：每个品种栽培58株。
实施例3
重复实施例1，有以下不同点：每个品种栽培60株。
实施例4
重复实施例1，有以下不同点：接种枪距烟苗30cm。
实施例5
重复实施例1，有以下不同点：接种枪距烟苗35cm。
实施例6
重复实施例1，有以下不同点：接种枪喷射压力设定为1.8kg/cm2。
实施例7
重复实施例1，有以下不同点：接种枪喷射压力设定为2.0kg/cm2。
TMV苗期鉴定与大田鉴定结果相关性分析。
实验例1：
1.材料和方法
1.1参试品种
TMV抗性鉴定品种包括云南省区试品种、全国区试品种、中美巴品种和白肋烟品种，详见表1。以Coker176为抗病对照，K326品种为感病对照，红花大金元品种为中感对照。
1.2接种体的准备
1.2.1TMV接种体的准备
将TMV病叶置于冰箱内冷冻保存，次年用PH7.0的磷酸缓冲液磨碎，然后摩擦接种于心叶烟上进行枯斑分离，取心叶烟上的枯斑，再通过摩擦接种转接到K326上进行扩繁备用。
1.3试验方法
1.3.1TMV大田鉴定
各鉴定品种在大田病圃随机排列，3次重复，每重复种植10株，行株距为0.9m×0.5m，每千株烟施纯氮8kg，N∶P2O5∶K2O为1∶1∶2.5，大田管理按优质烟栽培技术执行。
1.3.2TMV苗期鉴定
各鉴定品种在育苗盘内进行，不设重复，每份品种种植60株，各鉴定品种苗期管理按常规进行。
1.3.3TMV接种方法
大田和温室鉴定品种(系)均采用人工接种诱发鉴定，用病毒稀释过滤液(pH为7.0的磷酸缓冲液稀释)进行高压喷枪接种，每个点喷2次，接种枪距烟苗(烟株)约30cm。大田接种于移栽后15～20d进行，接种浓度为1％；温室接种于大十字期至猫耳期进行，设两个实验组，接种浓度分别为1％和2％。
1.3.4TMV调查方法
大田鉴定于接种后10、20、30d，苗期鉴定于接种后7、14、21d分3次进行病情调查，以最后一次调查的病指进行相关性分析；
TMV病害的分级标准均按国家行业标准YC/T39-1996规定执行。
1.4抗性划分标准
根据最后确定的病指，将品种的抗性划分为四级：
抗病(R)：病指25以下；
中抗(MR)；病指在25.1-50.0；
中感(MS)：病指在50.1-75.0；
感病(S)：病指75以上。
2.鉴定结果：如表1所示。
表1 TMV苗期和大田期鉴定结果
| 品种名称 | 病情指数 | |||
| 苗期1 | 大田 | 苗期2 | 大田 | |
| RGH51 | 44.56 | 89.4 | 75 | 89.4 |
| PVH09 | 32.73 | 3.7 | 0 | 3.7 |
| YH02 | 24.55 | 1.8 | 0.4 | 1.8 |
| CF964 | 41.96 | 90.2 | 73.7 | 90.2 |
| 9308 | 47.77 | 89.3 | 73.2 | 89.3 |
| PVH01 | 2.23 | 1.9 | 1.8 | 1.9 |
| 9823 | 29.46 | 55.8 | 74.1 | 89.2 |
| RGH04 | 50.89 | 2.8 | 2.2 | 2.8 |
| 8902-42 | 11.82 | 0 | 0 | 0 |
| 8541 | 37.96 | 98.3 | 73.7 | 98.3 |
续表1
| 951-5 | 34.38 | 88.6 | 73.2 | 88.6 |
| 99305 | 4.91 | 0 | 1.8 | 0 |
| NC55 | 30.36 | 73.4 | 62.5 | 73.4 |
| NC89 | 57.14 | 95.4 | 74.1 | 95.4 |
| PVH02 | 10.71 | 7 | 0.9 | 7 |
| PVH03 | 19.2 | 0 | 1.8 | 0 |
| PVH05 | 3.57 | 0 | 0 | 0 |
| PVH06 | 29.09 | 0 | 1.8 | 0 |
| PVH08 | 26.79 | 0 | 2.7 | 0 |
| RGH12 | 40.18 | 93.9 | 72.8 | 93.9 |
| K326 | 33 | 95 | 73.6 | 95 |
| Va427 | 34.9 | 91.3 | 74.1 | 91.3 |
| Coker371-Gold | 64.58 | 90.8 | 73.2 | 90.8 |
| YNH06 | 0 | 2.5 | 0 | 2.5 |
| YNH09 | 0 | 0 | 1.3 | 0 |
| KM9701 | 46.35 | 92.3 | 74.1 | 92.3 |
| YH01 | 28.13 | 7.5 | 1.3 | 7.5 |
| Coker176 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 相关系数 | R1＝0.7286 | R2＝0.9977 | ||
苗期鉴定设置了2个实验组，第1组在成苗时接种，接种浓度为1％；第2组在大十字期至猫耳期接种，接种浓度为2％。经过计算，大田鉴定结果与温室第1组鉴定结果的相关系数为R1＝0.7286，大田鉴定结果与温室第2组鉴定结果的相关系数为R2＝0.9977。
实验例2：
1.材料和方法
1.1参试品种
TMV抗性鉴定品种包括云南省区试品种、全国区试品种、中美巴品种和白肋烟品种，详见表2。以Coker176为抗病对照，K326品种为感病对照，红花大金元品种为中感对照。
1.2接种体的准备
1.2.1TMV接种体的准备
将TMV病叶置于冰箱内冷冻保存，次年用PH7.0的磷酸缓冲液磨碎，然后摩擦接种于心叶烟上进行枯斑分离，取心叶烟上的枯斑，再通过摩擦接种转接到K326上进行扩繁备用。
1.3试验方法
1.3.1TMV大田鉴定
各鉴定品种在大田病圃随机排列，3次重复，每重复种植10株，行株距为0.9m×0.5m，每千株烟施纯氮8kg，N∶P2O5∶K2O为1∶1∶2.5，大田管理按优质烟栽培技术执行。
1.3.2TMV苗期鉴定
各鉴定品种在育苗盘内进行，不设重复，每份品种种植60株，各鉴定品种苗期管理按常规进行。
1.3.3TMV接种方法
大田和温室鉴定品种(系)均采用人工接种诱发鉴定，用病毒稀释过滤液(pH为7.0的磷酸缓冲液稀释)进行高压喷枪接种，每个点喷2次，接种枪距烟苗(烟株)约30cm。大田接种于移栽后15～20d进行，接种浓度为1％；温室接种于大十字期至猫耳期进行，设两个实验组，接种浓度分别为1％和2％。
1.3.4TMV调查方法
大田鉴定于接种后10、20、30d，苗期鉴定于接种后7、14、21d分3次进行病情调查，以最后一次调查的病指进行相关性分析；
TMV病害的分级标准均按国家行业标准YC/T39-1996规定执行。
1.4抗性划分标准
根据最后确定的病指，将品种的抗性划分为四级：
抗病(R)：病指25以下；
中抗(MR)；病指在25.1-50.0；
中感(MS)：病指在50.1-75.0；
感病(S)：病指75以上。
2.鉴定结果：如表2所示。
表2 TMV苗期与大田期鉴定结果
| 品种名称 | 病情指数 | |||
| 苗期3 | 大田 | 苗期4 | 大田 | |
| 6614 | 60.27 | 51.2 | / | 51.2 |
| 951-5 | 57.14 | 69.8 | 62.3 | 69.8 |
| RG51 | 70.09 | 74.1 | / | 74.1 |
| PVH09 | 58.93 | 2.8 | / | 2.8 |
| 8541 | 66.52 | 75.9 | / | 75.9 |
| RGH04 | 16.07 | 4 | / | 4 |
| NC89 | 46.88 | 76.9 | 71.8 | 76.9 |
| CF986 | 36.16 | 76.9 | 63.4 | 76.9 |
| 8902-42 | 72.77 | 0 | 0 | 0 |
| 39511 | 61.82 | 28.2 | 20.1 | 28.2 |
| GL939 | 41.96 | 69.4 | 51.8 | 69.4 |
| 9823 | 36.16 | 74 | 74.1 | 74 |
| RGH12 | 56.25 | 76.9 | 80.4 | 76.9 |
| 9601 | 41.52 | 74.1 | 75 | 74.1 |
| CF964 | 45.54 | 71.3 | 67.9 | 71.3 |
| YH02 | 13.84 | 1.4 | / | 1.4 |
| YH01 | 6.94 | 1 | / | 1 |
| K326 | 50.89 | 77.8 | 74.6 | 77.8 |
| ETWN35 | 75 | 70.4 | / | 70.4 |
| QY01 | 58.04 | 76.4 | / | 76.4 |
| A2 | 26.82 | 73.2 | 51.3 | 73.2 |
| YNH09 | 8.48 | 0 | / | 0 |
| YH03 | 8.93 | 2 | / | 2 |
| 9803 | 9.4 | 43.6 | 43.8 | 43.6 |
| MsVa509×TN86 | 25 | 87 | 75.5 | 87 |
| TN90 | 61.16 | 9.1 | 0 | 9.1 |
| Va1061 | 59.82 | 8.3 | 0 | 8.3 |
| KY907 | 100 | 99 | / | 99 |
| 99i-6-2-1 | 36.16 | 19.4 | / | 19.4 |
| 99E-5-1-2 | 52.68 | 25 | / | 25 |
| Coker176 | 4.46 | 1.9 | 0 | 1.9 |
| 相关系数 | r3＝0.4251 | R4＝0.9751 | ||
表中“/”为苗期未作鉴定。
苗期鉴定进行了两次，第1次为猫耳期时接种，接种浓度为2％。用苗期鉴定结果与大田鉴定结果差异较大的品种再进行第2次接种鉴定，接种时期为大十字期至猫耳期，接种浓度为2％。
用大田鉴定结果分别与温室第1次接种结果和第2次接种结果进行相关性分析。大田鉴定结果与温室第1次接种结果的相关系数为r3＝0.4251，大田鉴定结果与温室第2次接种结果的相关系数为R4＝0.9751。两次苗期接种时期相同，但r3＝0.4251而R4＝0.9751，结果之间有一定的差异，可能与高压喷枪接种时的接种高度和接种时间有关。
查r与R的5％和1％显著性值表，R1、R2、R4在1％水平上均达显著正相关，r3在5％水平上达显著正相关。由此可见，苗期鉴定和大田鉴定存在一定的正相关，且相关性明显，说明完全可以用苗期鉴定代替大田鉴定。从几次鉴定结果看，接种的最佳时期为大十字至猫耳期，接种的最佳浓度为1∶50。
Claims (4)
1、一种烟草普通花叶病抗性的苗期鉴定方法，该方法包括以下顺序的步骤：
①接种体准备
采集感染烟草普通花叶病的病叶，用PH值为7.0的磷酸缓冲液磨碎，将磨碎后的汁液摩擦接种于心叶烟上；分离心叶烟上的枯斑，再通过摩擦接种转接到K326上进行扩繁，得到烟草普通花叶病接种体，备用；
②病圃设计及管理
将待鉴定品种置于育苗盘内栽培，每个品种56～60株，不设重复，苗期管理按常规进行；以Coker176品种为抗病对照，K326品种为感病对照，红花大金元品种为中感对照；
③接种
将备用的接种体用pH值7.0的磷酸缓冲液稀释过滤，设定接种浓度为2％，于大十字期至猫耳期进行高压喷枪接种；
④鉴定分级
于接种后的第21天进行病情调查，所得病指作为测试品种的抗性指标，进而按国家标准对鉴定品种进行分级。
2、根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于：步骤(2)所述的育苗盘为128孔育苗盘。
3、根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于：按步骤(3)所述进行喷枪接种时，接种枪距烟苗25～35cm，对准心叶，每株烟喷射二次，喷射压力设定为1.5～2kg/cm2。
4、根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于：步骤(4)所述的国家标准为国家行业标准YC/T39-1996。
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