CN101250503B - 一种晚香玉病毒的离体繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种晚香玉病毒的离体繁殖方法，属植物病毒繁殖技术领域，包括如下步骤：培养基的配制、毒源晚香玉的组织培养、病毒检测、毒源晚香玉病毒的离体繁殖。本发明的优点是：利用植物组织培养技术进行晚香玉病毒的离体繁殖，就可以无限制地繁殖下去，并保持了原有的侵染力；不仅解决了进境病毒病检疫中的毒源截获问题，还大大地简化了繁殖与保存毒源的步骤，省去以往为了保存某种毒源需要反复播种鉴别寄主、反复复活毒源及反复转接工作，以及播种前的土壤消毒工作，成倍地提高了工作效率，易提取制备高滴度病毒，为病毒检测抗血清制备中提供高纯度的病毒。
Description
技术领域
本发明涉及植物病毒的离体繁殖技术领域，尤其涉及一种晚香玉病毒的离体繁殖方法。
背景技术
晚香玉(Polianthes tuberosa L.)原本是在墨西哥和南美野生的一种石蒜科的植物，现在世界各地均有栽培，它的切花和精油具有很高的经济价值。自从300年多前传入中国后，目前已经成为重要的观赏植物，尤其是在台湾。晚香玉病毒病发生很能普遍，病毒在晚香玉植株体内的存在，使得晚香玉植株生长缓慢，植株的每株花序数、座花率降低、花期缩短、花小、花色淡，商品价值大大降低。
浙江省农业科学院从杭州晚香玉上发现轻斑驳的症状，电镜观察显示，病汁液中具有大量线状病毒粒子，并在植物细胞中聚集成束，伴有大量风轮状内含体，表明受马铃薯Y病毒属成员侵染。该病毒能摩擦接种侵染晚香玉，但不侵染普通烟，白肋烟、心叶烟、三先烟、蔓伦萝、豇豆、苋色藜、昆诺藜、番茄、千日红、豌豆和假酸浆等14种常用接种植物。测定该病毒基因组核苷酸序列，分析表明它具有典型的马铃薯Y病毒属成员基因组结构特征，与已报道的台湾晚香玉轻花叶病毒(Tuberose mild mosaic virus，TuMMV)最相似。用该杭州分离物原核表达的外壳蛋白所制备的抗血清进行Western blot分析，表明该杭州分离物与TuMMV血清学相关。根据ICTV马铃薯Y病毒属成员分类标准，杭州晚香玉病毒分离物应当为马铃薯Y病毒属的一个新成员，命名为晚香玉轻斑驳病毒(Tuberose mild mottle virus，TuMMoV)。在福建晚香玉样品上发现一种呈轻微花叶症状的马铃薯Y病毒属成员，序列分析表明与台湾已报道TuMMV所编码的CP氨基酸序列同源性为96.5％，从而将该病毒鉴定为TuMMV。这2种病毒单独或复合侵染是引起晚香玉种质严重退化的重要原因之一(林林、郑红英、张巧艳、陈炯、陈剑平，中国晚香玉上发现的一个马铃薯Y病毒属新成员，浙江省农业科学院第十二届青年学术论文报告会论文集，2003，P13～19)。
植物病毒的繁殖和纯种毒源的保存，是植物病毒检疫技术基础研究工作中必不可少的重要环节。进行引种时种子、种苗及繁殖材料的病毒的检疫时，发现了病毒病的可疑症状，而没有能力把它及时地截获下来，就谈不上对病毒进行定性的检疫。即使用血清学方法或分子生物学方法检测一下，出现了阳性反应，而没有获得该毒源的保存样品，其检疫结果同样是不可靠的。在植物病毒病的基础研究工作中，传统的繁殖毒源和保存毒源的方法是非常繁琐的。要想繁殖一种毒源或者要保存这种毒源，一般要经过下列步骤，繁殖该病毒的鉴别寄主—把某种病毒接种到该寄主上—分离病毒—纯化病毒—通过血清学检测。电镜观察后认可的病毒转接到表现系统侵染症状的繁殖寄主上繁殖。若要长久保存某种病毒，则需要反复地繁殖寄主，反复地转接，以免在寄主老化死亡时病毒丢失。就繁殖寄主来说，在使用半个月至两个月前就要播种，整个过程周期太长，若准备工作做得不及时，没等新的寄主长到可接种时，保存毒源的老寄主就已经老化死亡，以前必须一荐接一荐地播种，连续不断地繁殖寄主，反复地转接。不仅耗费了大量的劳动力，还占用了大量的温室空间。我们的研究表明晚香玉轻斑驳病毒(Tuberose mild mottle virus，TuMMoV)和晚香玉轻花叶病毒(Tuberose mildmosaic virus，TuMMV)能摩擦接种侵染晚香玉，但不侵染普通烟，白肋烟、心叶烟、三先烟、蔓伦萝、豇豆、苋色藜、昆诺藜、番茄、千日红、豌豆和假酸浆等14种常用接种植物。因此，迫切需要选择一种更佳的晚香玉病毒繁殖方法。
发明内容
本发明要解决上述现有技术的缺陷，提供一种晚香玉病毒的离体繁殖方法。
本发明目的通过以下技术方案来实现：这种晚香玉病毒的离体繁殖方法，按如下步骤进行：
1)、培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为：
(1)基本培养基：诱导、增殖及生长培养基用MS培养基；生根培养基用1/2MS培养基；其中，蔗糖或白糖20～40g/L，琼脂7～9g/L，pH5.6～6.0；
(2)诱导培养基：MS+BA 1.0～3.0mg/L和IAA 1.0～3.0mg/L；
(3)增殖培养基：MS+BA 0.5～2.0mg/L和IAA 0.5～2.0mg/L；
(4)生长培养基：MS+BA 0.1～1.0mg/L和IAA 0.1～1.0mg/L；
(5)生根培养基：1/2MS+IBA 0.5～2mg/L和IAA 0.1～0.5mg/L；
2)、毒源晚香玉的组织培养：
(1)外植体的选取与灭菌：选取毒源鳞茎，剥除鳞茎外皮用自来水冲洗洗净，经灭菌处理后，在无菌条件下，切取幼芽或将鳞茎切成0.5cm×0.5cm×0.5cm见方的切块作为组培用外植体；
(2)诱导培养：将幼芽或鳞茎切块接种在诱导培养基上，在培养条件下培养30～45天，从幼芽诱导成丛生芽或从鳞茎切块诱导形成幼芽；
(3)增殖培养：将丛生芽或幼芽转接到增殖培养基上，在培养条件下培养30～45天至增殖出丛生芽；根据对幼芽数量的需求，每隔30～45天按同样方法进行幼芽再增殖；
(4)生长培养：将增殖的丛生芽转接到生长培养基上，在培养条件下培养30～45天使丛生芽长高到3～5cm；
(5)生根培养：将长大的丛生芽切成单株转接在生根培养基中，在培养条件下培养20～30天，基部长出数根根系；
(6)移栽：当生根组培苗长高至5～7cm以上、长出5根以上根时，移栽至基质中，培育1～2个月后成苗。
3)、病毒检测：
(1)病毒提纯：
取组培苗叶片或移栽成苗的叶片，低温冰箱(-20℃)内保存。利用差速离心结合经二轮PEG沉淀的分离法，对组培苗叶片或移栽成苗的叶片的有关病毒进行分离、纯化，获得病毒制剂。
(2)病毒制剂含量检测：
利用免疫电镜捕获法及负染电镜法检测毒源晚香玉病毒含量、纯度。
(3)病毒ELISA检测：
将田间晚香玉发生的病毒，经扩增、克隆和原核表达所获得的相关病毒外壳蛋白，注射小鼠或家兔免疫并制备成病毒特异性抗血清后，对组培苗进行病毒ELISA检测，鉴定其病毒种类。
(4)病毒的致病力测定：
利用常规摩擦法，接种晚香玉测定毒源晚香玉体内病毒的致病力。
4)、毒源晚香玉病毒的离体繁殖：
将步骤2)增殖的组培苗经病毒检测后带有病毒的丛生芽，根据对毒源幼芽数量的需求，每隔30～45天按将步骤2)同样方法进行毒源幼芽再增殖。
所述的晚香玉病毒的离体繁殖方法，其特征在于：所述的培养基，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为：
(1)基本培养基：诱导、增殖及生长培养基用MS培养基；生根培养基用1/2MS培养基；其中，琼脂8g/L，pH5.8；
(2)诱导培养基：MS+BA 2.0mg/L和IAA 2.0mg/L+蔗糖30g/L；
(3)增殖培养基：MS+BA 1.0mg/L和IAA 1.0mg/L+白糖30g/L；
(4)生长培养基：MS+BA 0.5mg/L和IAA 0.5mg/L+白糖40g/L；
(5)生根培养基：1/2MS+IBA 1.0mg/L和IAA 0.25mg/L+白糖20g/L。
所述的晚香玉病毒的离体繁殖方法，其特征在于：所述的灭菌处理是经75％酒精浸泡0.5～1.0min，再用0.1％升汞溶液灭菌10～15min，最后用无菌水冲洗3～5次。
所述的晚香玉病毒的离体繁殖方法，其特征在于，所述的各组培阶段的培养条件是，培养温度为25±2℃，光照光强为2200～2500Lx，光照时间为16h/d。
所述的晚香玉病毒的离体繁殖方法，其特征在于：所述的移栽基质由泥炭∶珍珠岩∶蛭石按体积比1∶3∶2配制而成。
本发明的有益效果是：
(1)利用植物组织培养技术进行晚香玉病毒的离体繁殖，易提取制备高滴度病毒，为病毒检测抗血清制备中提供高纯度的病毒。
(2)该方法只要获得了受某种病毒侵染的寄主植物，就可以无限制地繁殖下去，不仅解决了进境病毒病检疫中的毒源截获问题，还大大地简化了繁殖与保存毒源的步骤，省去以往为了保存某种毒源需要反复播种鉴别寄主、反复复活毒源及反复转接工作，以及播种前的土壤消毒工作，成倍地提高了工作效率。
(3)保证了毒源能很纯地在寄主上繁殖下去，并保持了原有的侵染力。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。
实施例1：
1)、培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为：
(1)基本培养基：诱导、增殖及生长培养基用MS培养基；生根培养基用1/2MS培养基；其中，琼脂8g/L，pH5.8；
(2)诱导培养基：MS+BA 2.0mg/L和IAA 2.0mg/L+蔗糖30g/L；
(3)增殖培养基：MS+BA 1.0mg/L和IAA 1.0mg/L+白糖30g/L；
(4)生长培养基：MS+BA 0.5mg/L和IAA 0.5mg/L+白糖40g/L；
(5)生根培养基：1/2MS+IBA 1.0mg/L和IAA 0.25mg/L+白糖20g/L。
2)、毒源晚香玉的组织培养：
(1)外植体的选取与灭菌：选取毒源鳞茎，剥除鳞茎外皮用自来水冲洗洗净，经灭菌处理后，在无菌条件下，切取幼芽作为组培用外植体；
(2)诱导培养：将幼芽接种在诱导培养基上，在培养条件下培养30～45天，从幼芽诱导成丛生芽；
(3)增殖培养：将丛生芽转接到增殖培养基上，在培养条件下培养30～45天至增殖出丛生芽；根据对幼芽数量的需求，每隔30～45天按同样方法进行幼芽再增殖；
(4)生长培养：将增殖的丛生芽转接到生长培养基上，在培养条件下培养30～45天使丛生芽长高到3～5cm；
(5)生根培养：将长大的丛生芽切成单株转接在生根培养基中，在培养条件下培养20～30天，基部长出数根根系；
(6)移栽：当生根组培苗长高至5～7cm以上、长出5根以上根时，移栽至基质中，培育1～2个月后成苗。
3)、病毒检测：
(1)病毒提纯：
取组培苗叶片或移栽成苗的叶片，低温冰箱(-20℃)内保存。利用差速离心结合经二轮PEG沉淀的分离法，对组培苗叶片或移栽成苗的叶片的有关病毒进行分离、纯化，获得病毒制剂。
(2)病毒制剂含量检测：
利用免疫电镜捕获法及负染电镜法检测毒源晚香玉病毒含量、纯度。
(3)病毒ELISA检测：
将田间晚香玉发生的病毒，经扩增、克隆和原核表达所获得的相关病毒外壳蛋白，注射小鼠或家兔免疫并制备成病毒特异性抗血清后，对组培苗进行病毒ELISA检测，鉴定其病毒种类。
(4)病毒的致病力测定：
利用常规摩擦法，接种晚香玉测定毒源晚香玉体内病毒的致病力。
4)、毒源晚香玉病毒的离体繁殖：
将步骤2)增殖的组培苗经病毒检测后带有病毒的丛生芽，根据对毒源幼芽数量的需求，每隔30～45天按将步骤2)同样方法进行毒源幼芽再增殖。
所述的晚香玉病毒的离体繁殖方法，其特征在于：所述的灭菌处理是经75％酒精浸泡0.5～1.0min，再用0.1％升汞溶液灭菌13min，最后用无菌水冲洗3～5次。
所述的晚香玉病毒的离体繁殖方法，其特征在于，所述的各组培阶段的培养条件是，培养温度为25±2℃，光照光强为2200～2500Lx，光照时间为16h/d。
所述的晚香玉病毒的离体繁殖方法，其特征在于：所述的移栽基质由泥炭∶珍珠岩∶蛭石按体积比1∶3∶2配制而成。
实施例2：
本例中，其基本培养基的琼脂7g/L，pH5.6；诱导培养基：MS+BA 1.0mg/L和IAA 1.0mg/L+蔗糖30g/L；增殖培养基：MS+BA 0.5mg/L和IAA 0.5mg/L+白糖30g/L；生长培养基：MS+BA 0.1mg/L和IAA 0.1mg/L+白糖40g/L；生根培养基：1/2MS+IBA 0.5mg/L和IAA0.1mg/L+白糖20g/L。切取幼芽，经75％酒精浸泡0.5min，再用0.1％升汞水溶液浸泡10min，最后用无菌水冲洗3～5次进行灭菌处理，作为组培用外植体的材料。其余步骤，条件均同于实施例1。
实施例3：
本例中，其基本培养基的琼脂9g/L，pH6.0；诱导培养基：MS+BA 3.0mg/L和IAA 3.0mg/L+蔗糖30g/L；增殖培养基：MS+BA 2.0mg/L和IAA 2.0mg/L+白糖30g/L；生长培养基：MS+BA 1.0mg/L和IAA 1.0mg/L+白糖40g/L；生根培养基：1/2MS+IBA 2.0mg/L和IAA0.5mg/L+白糖20g/L。将鳞茎切成0.5cm×0.5cm×0.5cm见方的切块，经75％酒精浸泡1.0min，再用0.1％升汞水溶液浸泡15min，最后用无菌水冲洗3～5次进行灭菌处理，作为组培用外植体的材料。其余步骤，条件均同于实施例1。
实施例4：
本例中，其基本培养基的蔗糖或白糖20～40g/L，琼脂7～9g/L，pH5.6～6.0；诱导培养基：MS+BA 1.0～3.0mg/L和IAA 1.0～3.0mg/L；增殖培养基：MS+BA 0.5～2.0mg/L和IAA0.5～2.0mg/L；生长培养基：MS+BA 0.1～1.0mg/L和IAA 0.1～1.0mg/L；生根培养基：1/2MS+IBA 0.5～2mg/L和IAA 0.1～0.5mg/L；切取幼芽或将鳞茎切成0.5cm×0.5cm×0.5cm见方的切块，经75％酒精浸泡0.5～1.0min min，再用0.1％升汞水溶液浸泡10～15min，最后用无菌水冲洗3～5次进行灭菌处理，作为组培用外植体的材料。其余步骤，条件均同于实施例1。
试验例：(病毒检测)
1)、对照材料：从田间采集的晚香玉病叶为材料。
2)、处理材料：以实施例1或实施例2或实施例3或实施例4获得的组培苗叶片和移栽成苗的叶片为材料。
3)、病毒提纯：
取田间采集的晚香玉病叶、组培苗叶片和移栽成苗的叶片，低温冰箱(-20℃)内保存。利用差速离心结合经二轮PEG沉淀的分离法，进行病毒的分离、纯化，获得病毒制剂。
4)、病毒制剂含量
利用免疫电镜捕获法及负染电镜法检测毒源晚香玉病毒含量、纯度。
5)、病毒ELISA检测：
将田间晚香玉发生的病毒，经扩增、克隆和原核表达所获得的相关病毒外壳蛋白，注射小鼠或家兔免疫并制备成病毒特异性抗血清后，对组培苗进行病毒ELISA检测，鉴定其病毒种类。
6)、病毒的致病力测定：
利用常规摩擦法，接种晚香玉测定毒源晚香玉体内病毒的致病力。
7)、检测结果如下表所示：
| 处理 | 病毒含量 | ELISA检测 | 致病力测定 |
| 田间采集的晚香玉病叶 | 很多 | 阳性 | 具有侵染力 |
| 组培苗叶片 | 多 | 阳性 | 与田间毒源有相同的侵染力 |
| 移栽成苗的叶片 | 很多 | 阳性 | 与田间毒源有相同的侵染力 |
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
Claims (3)
1.一种晚香玉病毒的离体繁殖方法，其特征在于：该方法按以下步骤进行：
1)、培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为：
(1)基本培养基：诱导、增殖及生长培养基用MS培养基；生根培养基用1/2MS培养基；其中，蔗糖或白糖20～40g/L，琼脂7～9g/L，pH5.6～6.0；
(2)诱导培养基：MS+6-苄基嘌呤1.0～3.0mg/L和吲哚乙酸1.0～3.0mg/L；
(3)增殖培养基：MS+6-苄基嘌呤0.5～2.0mg/L和吲哚乙酸0.5～2.0mg/L；
(4)生长培养基：MS+6-苄基嘌呤0.1～1.0mg/L和吲哚乙酸0.1～1.0mg/L；
(5)生根培养基：1/2MS+吲哚丁酸0.5～2mg/L和吲哚乙酸0.1～0.5mg/L；
2)、毒源晚香玉的组织培养：
(1)外植体的选取与灭菌：选取毒源鳞茎，剥除鳞茎外皮用自来水冲洗洗净，经灭菌处理后，在无菌条件下，切取幼芽或将鳞茎切成0.5cm×0.5cm×0.5cm见方的切块作为组培用外植体；
(2)诱导培养：将幼芽或鳞茎切块接种在诱导培养基上，在培养条件下培养30～45天，从幼芽诱导成丛生芽或从鳞茎切块诱导形成幼芽；
(3)增殖培养：将丛生芽或幼芽转接到增殖培养基上，在培养条件下培养30～45天至增殖出丛生芽；根据对幼芽数量的需求，每隔30～45天按同样方法进行幼芽再增殖；
(4)生长培养：将增殖的丛生芽转接到生长培养基上，在培养条件下培养30～45天使丛生芽长高到3～5cm；
(5)生根培养：将长大的丛生芽切成单株转接在生根培养基中，在培养条件下培养20～30天，基部长出数根根系；
(6)移栽：当生根组培苗长高至5～7cm以上、长出5根以上根时，移栽至基质中，培育1～2个月后成苗；
3)、病毒检测：
(1)病毒提纯：
取组培苗叶片或移栽成苗的叶片，低温保存，利用差速离心结合经二轮PEG沉淀的分离法，对组培苗叶片或移栽成苗的叶片的病毒进行分离、纯化，获得病毒制剂；
(2)病毒制剂含量检测：
利用免疫电镜捕获法及负染电镜法检测毒源晚香玉病毒含量、纯度；
(3)病毒ELISA检测：
将田间晚香玉发生的病毒，经扩增、克隆和原核表达所获得的相关病毒外壳蛋白，注射小鼠或家兔免疫并制备成病毒特异性抗血清后，对组培苗进行病毒ELISA检测，鉴定其病毒种类；
(4)病毒的致病力测定：
利用常规摩擦法，接种晚香玉测定毒源晚香玉体内病毒的致病力；
4)、毒源晚香玉病毒的离体繁殖：
将步骤2)增殖的组培苗经病毒检测后带有病毒的丛生芽，根据对毒源幼芽数量的需求，每隔30～45天按将步骤2)同样方法进行毒源幼芽再增殖。
2.根据权利要求1所述的晚香玉病毒的离体繁殖方法，其特征在于，所述的各组培阶段的培养条件是，培养温度为25±2℃，光照光强为2200～2500Lx，光照时间为16h/d。
3.根据权利要求1所述的晚香玉病毒的离体繁殖方法，其特征在于：所述的移栽基质由泥炭∶珍珠岩∶蛭石按体积比1∶3∶2配制而成。
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| 赵国防.晚香玉品种简介.《天津农林科技》.2004,(第2期),16. * |
| 高尚士.晚香玉的栽培.《现代园林》.2006,(第5期),34. * |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20110615 Termination date: 20150327 |
|
| EXPY | Termination of patent right or utility model |