CN1906294A - 改良的蛋白表达系统 - Google Patents

改良的蛋白表达系统 Download PDF

Info

Publication number
CN1906294A
CN1906294A CNA2004800407027A CN200480040702A CN1906294A CN 1906294 A CN1906294 A CN 1906294A CN A2004800407027 A CNA2004800407027 A CN A2004800407027A CN 200480040702 A CN200480040702 A CN 200480040702A CN 1906294 A CN1906294 A CN 1906294A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
gene
described method
sequence
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA2004800407027A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1906294B (zh
Inventor
J·C·施奈德
L·C·丘
A·K·巴杰利
T·M·拉姆塞耶尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Peliken Technology Holdings Ltd
Original Assignee
Dow Global Technologies LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dow Global Technologies LLC filed Critical Dow Global Technologies LLC
Publication of CN1906294A publication Critical patent/CN1906294A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1906294B publication Critical patent/CN1906294B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0026—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5)
    • C12N9/0028—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with NAD or NADP as acceptor (1.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/78—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Pseudomonas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/05—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in nitriles (3.5.5)
    • C12Y305/05001—Nitrilase (3.5.5.1)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了使用营养缺陷型选择标记的改良表达系统来用于重组多肽的生产。此外，本发明通过提高的表达调控提供了在宿主细胞中提高的重组蛋白生产。

Description

改良的蛋白表达系统
相关申请的交叉参考
本申请要求美国临时专利申请号为60/523,420的优先权，2003年11月19日提交，名称为“具有营养缺陷型选择标记的改良的假单胞菌表达系统”，以及美国临时专利申请60/537,147的优先权，2004年1月16日提交，名称为“具有改良抑制的细菌表达系统”。
技术领域
本发明提供了一种利用营养缺陷型选择标记的改良表达系统来生产重组多肽。另外，本发明通过改善的表达调节提供了宿主细胞中改善的重组蛋白生产。
发明背景
使用细菌细胞来生产用于治疗的蛋白在商业上越来越受到关注。发展细菌表达系统的目的之一是为了快速、有效、和大量地产生高质量目标多肽。这种表达系统的理想宿主细胞应该是可以有效使用碳源来产生目标多肽，在发酵过程中快速地达到高细胞密度，仅仅在诱导的时候表达目标多肽，并且可以在没有进行调整和环境控制的培养基上生长。
在生产杰出宿主细胞的时候存在很多的障碍。首先，为了生产重组多肽，需要将编码目标蛋白的表达载体插入到宿主细胞中。许多细胞能够回复到没有转染的状态，在其中表达载体是从宿主中消除的。这种回复会降低产生所需重组多肽的发酵过程的效率。
编码目标蛋白的表达载体典型地在载体中包括选择标记。通常，这种选择标记是基因其表达产品在发酵过程中是存活所需要的。缺乏选择标记的宿主细胞，例如回复体，是不能存活的。在发酵过程中选择标记的使用是为了保证只有含有表达载体的细菌可以存活，消除回复体和转染体之间的竞争并且降低发酵效率。
最经常使用的选择标记是抗生素抗性基因。细胞在添加了抗生素的培养基中生长，该抗生素可被选择的抗生素抗性基因产品降解。那些不含有具有抗生素抗性基因的表达载体的细胞被抗生素杀死。典型的抗生素抗性基因包括四环素，新霉素，卡那霉素，和氨苄青霉素。但是细菌宿主细胞中抗生素抗性基因的存在带来了环境的，调控的，和商业的问题。例如，包含抗生素抗性基因的产品(通过使用抗生素抗性基因生产的产品)已经被认为对于环境、人类和动物的健康具有潜在的生物安全风险。例如，参考M.Droge等人的，作为生物安全性课题的水平基因转移：公众关心的一种自然现象(Horizontal Gene Transfer as a Biosafety issue：A natural phenomenon of public concern)，J.Biotechnology.64(1)：75-90(9月17日.1998)；Gallagher，D.M.，和D.P.Sinn.1983，在低血压感觉麻痹的情况下由青霉素引起的患者的过敏反应(Penicillin-induced anaphylaxis in a patient under hypotensiveanaesthesia)，Oral Surg Oral Med.Oral Pathol.56：361-364；Jorro，G.，C.Morales，J.V.Braso，和A.Pelaez.1996。抗生素的过敏反应(Anaphylaxis to erythromycin)。Ann.Allergy Astthma Immunol.77：456-458；F.Gebhard & K.Smalla，利用转基因甜菜DNA对Acinetobacter sp.strain BD413的转染(Transformation of Acinetobacter sp.strainBD413 by transgenic sugar beet DNA)，Appl.& Environ.Microbiol.64(4)：1550-54(Apr.1998)；T.Hoffmann等人，在与转基因高产菌株混合培养后野生黑曲霉菌获得的外源DNA序列(Foreign DNA sequences are received by a wild type strain ofAspergillus niger after co-culture with transgenic higher plants)，Curr.Genet.27(1)：70-76(Dec.1994)；DK Mercer等人，游离DNA的命运以及由人类唾液质粒DNA对链球菌gordonoii DL1进行的转化(Fate of free DNA and transformation of the oralbacterium Streptococcus gordonoii DL1 by plasmid DNA in human saliva)，Appl.&Environ.Microbiol.65(1)：6-10(Jan 1999)；R.Schubbert等人，被小鼠吸收的外源(M13)DNA通过小肠壁粘膜到达了外周血、脾脏和肝脏并且可以与小鼠DNA共价结合(Foreign(M13)DNA ingested by mice reaches peripheral leukocytes，spleen，and liver via the intestinal wall mucosa and can be covalently linked to mouse DNA)，PNAS USA 94：961-66(Feb.4，1997)，和AA Salyers，哺乳动物肠道中的基因转移(Gene transfer in the mammalian intestinal tract)，Curr.Opin.in Biotechnol.4(3)：294-98(Jun 1993)。
作为这些论题的结果，许多政府的食品、药品、健康、和环境管理机构，以及许多最后的使用者，要求抗生素抗性基因核酸从产品中除去或者在商业使用的有机体中不存在。另外，要求必须证明所选择的抗生素从最终产品中的消除证据，以确保制消除调控。英国，加拿大，法国，欧共体，以及美国都已经标记了食品、动物饲料、药物和药物产品中抗生素抗性基因的使用，包括重组药物产品。这些物质的消除，以及特别是证明这种消除，是非常昂贵的，费时的，并且通常仅仅是最低限度地有效的。
因为这些在使用的用于抗生素抗性基因来对重组多肽产品进行选择过程中，已经研究出了可以替换的选择方法。
营养缺陷型选择标记
营养缺陷型选择标记已经在一些系统中用来代替抗生素选择标记。例如，营养缺陷型标记已经在酵母中广泛地使用，因为很大程度上抗生素抗性选择标记在这些宿主细胞中是无效的。参考，例如，JT Pronk，(2002)“机理和应用研究中的营养缺陷型酵母菌株(Auxotrophic yeast strains in fundamental and appliedresearch)，”App.& Envirn.Micro.68(5)：2095-2100，Boeke等人，(1984)“在酵母种缺少orotodine-5′-磷酸脱羧酶活性的阳性选择突变株，5-fluoro-orotic酸抗性(A positive selection for mutants lacking orotodine-5′-phosphate decarboxylaseactivity in yeast；5-fluoro-orotic acid resistance)，”Mol.Gen.Genet.197：345-346，Botstein & Davis，(1982)“利用酵母的重组DNA的原理和应用(Principles andpractice of recombinant DNA research with yeast)，”p.607-636，in JNStrathem，EWJones。和JR Broach(ed.)，啤酒酵母细胞的分子生物学，代谢和基因表达(Themolecular biology of the yeast Saccharomyce scerevisiae，Metabolism and geneexpression)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，Cost &Boeke，(1996)“与酵母选择的/相反地选择的标记MET15有关的有效克隆显色(Auseful colony color phenotype associated with the yeast selectable/counter selectablemarker MET15)，”Yeast 12：939-941。但是，酵母表达系统没有预期的为生产细菌系统产生的目标蛋白提供潜在的速度和效率。
在细菌中营养缺陷型标记选择同样也已经公开了。参考，例如，美国专利Nos.4,920,048；5,691,185；6,291,245；6,413,768；6,752,994，Struhl等人，(1976)PNAS USA 73；1471-1475，MacCormick，C.A.等人，(1995)“基于乳糖操纵子的乳球菌食品级宿主/载体系统的构建(Construction of a food-gradehost/vector system for Lactococcus lactis based on the lactose operon)，”FEMSMicrobiol.Lett.127：105-109，Dickely等人，(1995)，“乳球菌无效抑制物的分离和食品级克隆载体的构建(Isolation of Lactococcus lactis nonsense suppressors andconstruction of a food-grade cloning vector)，”Mol.Microbiol.15：839-847，Srensen等人，(2000)“乳球菌工业菌株的食品级克隆系统(A food-grade cloning system forindustrial strains of Lactococcus lactis)，”Appl.Environ.Microbiol.66：1253-1258，Fiedler & Skerra，(2001)“营养学缺陷型大肠杆菌菌株的proBA互补体在重组抗体片段的发酵生产过程中改良了质粒的稳定性和表达产量(proBA complementation ofan auxotrophic E.coli strain improves plasmid stability and expression yield duringfermenter production of a recombinant antibody fragment)，”Gene 274：111-118。
在前面描述的商业领域的细菌发酵系统中营养缺陷型选择标记的使用具有缺陷因此限制了它们的使用。一个主要的缺陷，如在美国专利NO.6,413,768中所提到的，是营养缺陷型选择标记系统通常经历了交叉传递。术语交叉传递(cross-feeding)是指第一个细胞的能力，其对于一个特定的代谢物是有缺陷的，为了在缺乏这种代谢物的情况下存活就需要从它的环境中获得那种代谢物的补偿，特别是，来自培养基通过使用代谢物的分泌中间物，代谢物自身，或者一种由第二个细胞产生原养型能力这种细胞对于其是营养缺陷型，其对于这种生长培养基中所缺乏的代谢物是原养型的。也可以参考GR Barker等人，Biochem.J.157(1)：221-27(1976)(大肠杆菌中胸苷的交叉传递)(cross feeding of thymine in E.coli)；TJ Kerr & GJ Tritz，J.Bact.115(3)：982-86(Sep.1973)(对于NAD合成是营养缺陷的大肠杆菌中NAD的交叉传递)(cross feeding of NAD in E.coli auxotrophicfor NAD synthesis)；GA Sprenger等人，FEMS Microbiol.Lett.37(3)：299-304(1986)(选择萘啶酮酸来防止交叉传递问题)(selection of nalidixic acid to avoid the crossfeeding problem)。
因为交叉传递使回复的细菌可以存活，交叉传递降低了整个发酵过程有效和最大水平产生所需产品的能力因为可以产生目标蛋白的宿主细胞很少。
表达载体控制
产生理想的宿主细胞的另一个障碍是发酵过程中多肽产生的低效率和低水平。控制目标蛋白的表达直到达到了理想的宿主细胞密度和发酵条件这样可以实现多肽的更有效和更大产量的生产。这一现象的原因有几个，包括对特定碳源的充足供应和宿主细胞长期代谢压力的减轻。
但是，在很多情况下，在细胞发育过程中对于目标蛋白表达的抑制是有缺点的，在特定的诱导阶段之前就产生了大量的表达产物。这一“漏掉的”抑制源于宿主细胞压力，碳源供应不足因为代谢能量被从正常的细胞发育转移到转基因了，以及延迟到达理想的细胞密度诱导点，产生了更为冗长的和昂贵的发酵运行，并且通常，降低的目标蛋白产量。
因此，本发明的一个目的是提供生产目标蛋白的改良表达系统，其中这种生产是高效的、可控制的，并且在一种将控制因素和环境因素最小化的培养基中进行。
本发明的另一个目的是提供生产目标蛋白的改良表达系统中用作宿主细胞的生物体。
本发明的另一个目的是提供改良目标蛋白生产的方法。
本发明的另一个目的是提供生产目标蛋白的改良表达系统中使用的新构建体和核酸。
发明内容
已经发现细菌蛋白生产可以通过选择假单胞菌作为宿主细胞来进行改良，该假单胞菌可以是非抗生素抗性的，营养缺陷型选择，和/或包含lacI基因或其衍生物的染色体插入片段。
特别是，已经发现假单胞菌生物体荧光假单胞菌特别适合这一目的。对于这一结果，已经惊奇地发现荧光假单胞菌在重组多肽的高细胞密度发酵过程中使用营养缺陷选择标记的情况下不表现出相反的交叉传递抑制。这一发现使得营养缺陷型荧光假单胞菌作为宿主细胞可以在高水平重组多肽的高效生产中使用，克服了由于使用抗生素抗性选择标记的存在的缺陷以及出现在其它细菌表达系统中的营养缺陷交叉传递的问题。
还惊奇地发现在假单胞菌(Pseudomonas)中LacI-编码基因的使用不同于作为整体的一部分或者截断的Plac-lacI-lacZYA操纵子惊奇地产生了对诱导前的重组蛋白表达的充分的改良抑制，商业领域发酵中更高的细胞密度，所需产品的更高的产率与先前教导的lacI-lacZYA假单胞菌染色体插入相比(美国专利No.5,169,760)。这一lacI插入可以有效地抑制Plac-Ptac家族启动子-控制的转基因其作为多拷贝质粒在荧光假单胞菌中编码lacI抑制蛋白，从而消除了对细胞中编码lacI抑制蛋白的单独质粒进行维持的需要并且减少了由于这种维持而产生的潜在的生产的低效率。
还发现双lacI操纵基因序列的使用为诱导前的重组蛋白表达提供了更好的抑制作用而没有相应的引发后续的荧光假单胞菌诱导产量的降低。
因此，本发明一方面，提供假单胞菌生物体作为宿主细胞用于改良的蛋白生产。
一实施方案中，假单胞菌生物体已经进行了基因修饰来诱导一种营养缺陷。特定实施方案中，假单胞菌生物体是荧光假单胞菌。一实施方案中，营养缺陷型是基因修饰的结果对于至少一种含氮碱基化合物(nitrogenous base compound)生物合成基因，或者至少一种氨基酸生物合成基因。进一步的实施方案中，基因修饰是对一种在尿嘧啶生物合成路径中的，胸苷生物合成途径的，或者脯氨酸生物合成途径的具有活性的酶的编码基因进行的遗传修饰。在更进一步的实施方案中，基因修饰是针对编码乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶的pyrF基因的，编码胸苷酸合成酶的thyA基因的，或者编码Δ1-吡咯啉-5-羧化物还原酶的proC基因的。
另一实施方案中，本发明提供了假单胞菌生物体，其已经进行了基因修饰来提供插入到染色体中的至少一个拷贝的LacI-编码基因，与作为整体一部分或者截断的Plac-lacI-lacZYA操纵子不同。优选实施方案中，假单胞菌宿主细胞是荧光假单胞菌。一实施方案中，假单胞菌包括天然的编码lacI抑制蛋白的大肠杆菌lacZ基因。另一实施方案中，假单胞菌细胞含有lacIQ基因。另一实施方案中，假单胞菌细胞包括lacIQI基因。
另一实施方案中，提供的假单胞菌生物体包含核酸构建体，该构建体包含核酸，该核酸含有至少一个在转基因表达抑制中应用的lacO序列。特定实施方案中，假单胞菌宿主细胞是荧光假单胞菌。一实施方案中，核酸构建体包括多于一个的lacO序列。另一实施方中，核酸构建体包括至少一个，并且优选多于一个的，lacOid序列。一实施方案中，核酸构架体包括lacO序列，或其衍生物，位于Plac家族启动子的3’端，以及lacO序列，或其衍生物，位于Plac家族启动子的5’端。一特定实施方案中，lacO的衍生物是lacOid序列。
进一步实施方案中，本发明提供了假单胞菌生物体其进行了基因修饰从而引起了一种营养缺陷并且进一步修饰来包含一种染色体插入一种天然的大肠杆菌lcaI基因，lcaIQ基因，或者lcaIQI基因而不同于作为整体的一部分或者截断的Plac-lacI-lacZYA操纵子。另一实施方案中，假单胞菌生物体进一步修饰包括一种核酸构建体其包括至少一种与抑制转基因表达有关的lacO序列。特定实施方案中，假单胞菌生物体是荧光假单胞菌。
本发明的另一方面，为改良的蛋白生产提供了所使用的核酸序列。
一实施方案中，给出了在营养缺陷型假单胞菌宿主细胞中使用的编码原养型回复酶(prototrophy-restoring enzyme)的核酸序列。特定实施方案中，给出了从荧光假单胞菌生物体中纯化的编码含氮碱基化合物生物合成酶的核酸序列。一实施方案中，给出了在荧光假单胞菌中编码pyrF基因的核酸序列(SEQ.ID No.s1和3)。另一实施方案中，给出了在荧光假单胞菌中编码thyA基因的核酸序列(SEQ.ID.No.4)。另一实施方案中，给出了从荧光假单胞菌生物体中纯化的编码一种氨基酸生物合成化合物的核酸序列。特定实施方案中，给出了在荧光假单胞菌中编码proC基因的核酸序列(SEQ.ID No.s 6和8)。
另一方面，本发明产生了新的氨基酸序列其是由新的核酸表达的产品。
本发明的另一方面，给出了在改良的多肽生产中使用的核酸构建体。
一实施方案中，用于转化假单胞菌宿主细胞的核酸构建体包括a)编码重组多肽的核酸序列，和b)给出了编码原养型-启动酶(prototrophy-enabling enzyme)的核酸序列。另一实施方案中，核酸构建体进一步包括c)一种Plac-ptac家族启动子。另一实施方案中，核酸构建体进一步包括d)至少一种lacO序列，或其衍生物，lac或tac家族启动子的3’端。另一实施方案中，核酸构建体进一步包括e)至少一种lacO序列，或其衍生物，lac或tac家族启动子的5’端。一实施方案中，衍生的lacO序列的可以是lacOid序列。特定实施方案中，假单胞菌生物体为荧光假单胞菌。
本发明的一实施方案中，给出的用作假单胞菌生物体表达载体的核酸构建体包括a)编码一种重组多肽的核酸序列，b)Plac-Ptac家族启动子，c)至少一种lacO序列，或衍生物，lac或tac家族启动子的3’端，d)至少一种lacO序列，或者衍生物，lac或tac家族启动子的5’端。一实施方案中，衍生的lacO序列可以是lacOid序列。一实施方案中，核酸构建体进一步包括e)一种在营养缺陷型假单胞菌细胞中使用的原养型能力(prototrophy-enabling)选择标记。特定实施方案中，假单胞菌生物体是荧光假单胞菌。
在本发明的另一方面，给出了在改良的蛋白生产中使用的修饰的细胞。
一实施方案中，给出的营养缺陷型的假单胞菌细胞其具有一个核酸构建体包含i)一个重组的多肽，和ii)一个原养型能力核酸。另一实施方案中，核酸构建体进一步包括iii)一个Plac-Ptac家族启动子。另一实施方案中，核酸构建体进一步包括iv)多于一个lacO序列。一实施方案中，假单胞菌是一种营养缺陷型的荧光假单胞菌细胞。进一步的实施方案中，本发明进一步包括营养缺陷型的假单胞菌生物体，包括荧光假单胞菌，其已经进一步基因修饰成包含一种在染色体插入天然的大肠杆菌lacI基因，lacIQ基因，或者lacIQI基因，其不同于作为整体的一部分或者截断的Plac-lacI-lacZYA操纵子。
另一实施方案中，给出的假单胞菌细胞包括一种lacI转基因，或其衍生物，不同于作为整体的一部分或者截断的Plac-lacI-lacZYA操纵子，插入到染色体中，以及b)一种核酸构建体包括i)重组的多肽，以及ii)Plac-Ptac家族启动子。另一实施方案中，核酸构建体进一步包括iii)至少一种lacO序列，并且优选，多于一种lacO序列。一实施方案中，lacO序列是一种lacOid序列。一实施方案中，假单胞菌已经进一步修饰成为诱导的营养缺陷型的。一实施方案中，假单胞菌细胞是荧光假单胞菌。
在本发明的一个方面，给出了在改良的蛋白生产中使用的重组多肽表达方法。
一实施方案中，方法给出了核酸构建体的表达，该核酸构建体包括的编码a)一种重组多肽，和b)在假单胞菌中一种原养型-回复酶其对于至少一种代谢物是营养缺陷的核酸。可替换实施方案中，假单胞菌对于多于一种的代谢物是营养缺陷的。一实施方案中，假单胞菌是荧光假单胞菌细胞。特定实施方案中，在假单胞菌中表达的重组的多肽是对于一种代谢物营养缺陷，或者代谢物的组合，选自含氮碱基化合物或氨基酸。一更特定实施方案中，重组多肽在对于选自尿嘧啶，脯氨酸，或胸苷的代谢物是营养缺陷的假单胞菌中表达。另一实施方案中，营养缺陷型可以是通过分别敲除宿主的pyrF，proC，或者thyA基因来实现。可替换实施方案中，重组的多肽是在一种营养缺陷的假单胞菌细胞中表达的，其已经通过插入不同于作为PlacI-lacI-lacZYA操纵子的一部分，天然的大肠杆菌lacI基因，lacIQ基因，或者lacIQI基因，到宿主细胞的染色体中进行了基因修饰。特定实施方案中，载体包含重组的多肽其在包括至少一种lacOid操纵基因序列的营养缺陷型中表达。特定实施方案中，载体包含重组的多肽在包括至少两种lacOid操纵基因序列或其衍生物的营养缺陷型中表达。进一步实施方案中，重组的多肽通过Plac家族启动子来启动。
另一实施方案中，方法包括使用假单胞菌宿主细胞，其已经进行了基因修饰来提供至少一个拷贝的LacI编码基因插入到假单胞菌宿主细胞的染色体中，其中lacI编码基因不同于PlacI-lacI-lacZYA操纵子的部分。一实施方案中，编码Lac抑制蛋白的基因是天然的大肠杆菌的lacI基因。一实施方案中，编码Lac抑制蛋白的基因是lacIQ基因。另一实施方案中，编码Lac抑制蛋白的基因是lacIQI基因。特定实施方案中，假单胞菌宿主细胞是荧光假单胞菌。另一实施方案中，假单胞菌是进一步基因修饰的来产生营养缺陷型细胞。另一实施方案中，方法产生的重组多肽水平为至少大约3g/L，4g/L，5g/L，6g/L，7g/L，8g/L，9g/L或至少大约10g/L。另一实施方案中，重组多肽的表达水平在3/L到100g/L之间。
附图说明
图1是使用pyrF标记的双质粒表达系统的荧光假单胞菌的实施情况(△和□)和仅仅使用抗生素抗性标记的双质粒表达系统的荧光假单胞菌的实施情况(◆)的比较。给出的所有数据是9-平行样的平均值，典型的20-L发酵，在中间-指数期加入了IPTG来诱导目标酶的表达。上面一组的三条线表示相应的细胞浓度数据，其从左侧竖直坐标轴上读出数据。下面一组的三条线表示在相关发酵中产生的目标酶的相应的酶活性数据，从右侧竖直坐标轴上读出数据。◆-含有pMYC质粒的荧光假单胞菌，具有一个tac启动子-控制的目标酶表达盒以及一个四环素抗性标记基因并包括一个具有lacI抑制子表达盒和一个卡那霉素抗性标记基因的pCN质粒。所示的方差线(variance bar)对这些数据点(n＝4)，并且代表了在不同的发酵运行过程中这种表达系统中所代表性地观察到的常态方差(normal variance)。△-具有非活性的基因组pyrF的荧光假单胞菌菌株包含pMYC质粒，其具有一个tac启动子-控制的目标酶表达盒和pyrF营养缺陷标记基因和包含具有lacI抑制表达盒和卡那霉素抗性标记基因的pCN质粒。□-具有非活性的基因组pyrF和proC的荧光假单胞菌菌株，包含pMYC质粒其具有一个tac启动子-控制的目标酶表达盒和pyrF营养缺陷标记基因和包含具有lacI抑制表达盒和proC营养缺陷标记基因的pCN质粒。
图2是质粒pDOW1249-2的图谱。
图3是质粒pDOW1269-2的图谱。
图4是lac操纵基因构建体的示意图。LacZ给出了天然的大肠杆菌lacO序列的位置。tac DC239，DC240给出了天然的大肠杆菌lac操纵基因在包括tac操纵基因和腈水解酶编码核酸的构建体上的位置。Opt lacO DC281是lacOid操纵基因序列在包括tac启动子和腈水解酶编码核酸的构建体上的位置。双lacO DC262给出了在构建体上的tac启动子的lacOid操纵基因序列的5’端，以及野生型lac启动子序列3’端的位置该构建体进一步包括腈水解酶编码核酸。
图5给出了含有lacI整合体的菌株在摇瓶基因表达培养基中生长时累积的LacI蛋白的Western印迹分析(UnBlot)。肉汤样品在OD600进行标准化，结合LDSNuPAGE样品缓冲液(Invitrogen)，50mM DTT并且在95℃加热40分钟，然后简单离心。取20μL样品放入10％，1mm NuPAGE Bis-Tris胶中在内室中具有抗氧化剂的条件下在MOPS中走胶。LacI蛋白的检测是通过原胶(in-gel)杂交方法(″UnBlot″，Pierce)完成的，对LacI使用1∶1000的多克隆兔子抗体(Stratagene cat.no.217449-51)以及第二种抗体，1∶500的稳定山羊抗-兔子辣根过氧化物酶偶联抗体(Pierce)。按照UnBlot试剂盒用UnBlot稳定过氧化物和UnBlot发光氨增强剂一起显现辣根过氧化物酶。
图6给出了DC140，DC239和DC240的腈水解酶组合物的图。数据是在从DC140(n＝5)，DC239(n＝5)到DC240(n＝4)的运行进行编辑的。DC140是■来表示。DC239以□来表示。DC240以□来表示。发酵运转进行超过48小时。
具体实施方式
一个实施方案中，假单胞菌生物体已经进行了基因修饰来引起一种营养缺陷。特定的实施方案中，假单胞菌生物体是荧光假单胞菌。一个实施方案中，营养缺陷是对于至少一种含氮碱基化合物的生物合成基因，或者至少一种氨基酸生物合成基因修饰的结果。进一步的实施方案中，基因修饰是对一种编码在尿嘧啶生物合成途径中的，胸苷生物合成途径中的，或者脯氨酸生物合成途径中的具有活性的酶的基因的修饰。更进一步的实施方案中，基因修饰是针对编码乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶的pyrF基因，编码胸苷酸(thymidilate)合成酶的thyA基因，或者编码Δ1-吡咯啉-5-羧化物还原酶的proC的基因。
另一个实施方案中，本发明提供的假单胞菌生物体是已经进行了基因修饰的以提供插入到染色体中的至少一个拷贝的LacI-编码基因，不同于作为PlacI-lacI-lacZYA操纵子的一部分。特定的实施方案中，假单胞菌宿主细胞是荧光假单胞菌。一个实施方案中，假单胞菌包含一个天然的编码lacI抑制蛋白的大肠杆菌lacI基因。另一个实施方案中，假单胞菌细胞包含lacIQ基因。另一个实施方案中，假单胞菌细胞包含lacIQI基因。
另一个实施方案中，提供的假单胞菌生物体包含一个核酸构建体，其包括一个包含至少一个与转基因表达抑制有关的lacO序列的核酸其。特定的实施方案中，假单胞菌宿主细胞是荧光假单胞菌。一个实施方案中，核酸构建体包括多于一个的lacO序列。另一个实施方案中，这种核酸构建体包括至少一个，优选多于一个，lacOid序列。一个实施方案中，核酸构建体包括lacO序列，或其衍生物，位于Plac家族启动子的3’端，以及lacO序列，或其衍生物，位于Plac家族启动子的5’端。在特定的实施方案中，lacO的衍生物是lacOid序列。
进一步的实施方案中，本发明提供的假单胞菌生物体已经进行了基因修饰来引起一种营养缺陷并且进一步修饰，以使染色体含有插入的不同于作为整体的一部分或者截断的Plac-lacI-lacZYA操纵子的天然的大肠杆菌lacI基因，lacIQ基因，或者lacIQI基因。另一个实施方案中，假单胞菌生物体进一步修饰包含一种核酸构建体其含有至少一个与转基因表达抑制有关的lacO序列。特定实施方案中，假单胞菌生物体是荧光假单胞菌。
本发明所提供的用于生产重组多肽的表达系统的宿主细胞可以选自“假单胞菌和接近的相关细菌”或者选自它们的亚群，如下面所说明的。一个实施方案中，宿主细胞选自假单胞菌的属。特定实施方案中，特定的假单胞菌的种为荧光假单胞菌。特定实施方案中，宿主细胞是荧光假单胞菌生物型A或者生物变型I。
定义
术语“分离的”是指核酸、蛋白、或者多肽其与其它的物质组分是充分地或者基本上地分开的，例如，那些组分可以是细胞成分。
术语“片段”是指一种核酸、蛋白、或者多肽的一部分或者部分的序列。
如这里所使用的，术语“总细胞蛋白百分比”是指宿主细胞中蛋白或者多肽的含量占细胞总蛋白的百分数。
术语“可操作的结合”，如这里所使用的，是指任意的结构其中转录的和任意的翻译的调控元件是以这样的方式(in such disposition(s))共价地连接到编码序列上，即对于编码序列，按照或者通过宿主细胞的行为，调控元件可以指导编码序列的表达。
术语“营养缺陷的”，如这里所使用的，是指对于一个细胞进行了修饰来消除或者减少它的生产生长和代谢所需要的特定物质的能力。
如这里所使用的，术语“总细胞蛋白百分比”是指总细胞蛋白的一部分的测量，其代表了该细胞表达的给定蛋白的相对含量。
术语“原养型”，如这里所使用的，是指一个细胞其可以生产一种生长和代谢所需的特定的物质。
如这里所使用的，术语“同源的”意味着i)一种蛋白或者肽，其具有与一种给定的原始的蛋白或者肽的序列基本相同的一个氨基酸序列(也就是说，至少70，75，80，85，90，95，或者98％)并且保持原始的蛋白的或者肽的所需功能或者ii)一种核酸其具有与一种给定的核酸序列基本相同的一个核酸序列(也就是说，至少70，75，80，85，90，95，或者98％)并且保持原始的核酸序列所需的功能。在本发明和公开内容的所有实施方案中，任意的所公开的蛋白，肽或者核酸可以被保持所需的功能的同源的或者基本相同的蛋白，肽或者核酸所代替。在本发明和公开内容的所有实施方案中，当公开任意一种核酸的时候，应该认为这种发明也包括与公开的核酸杂交的所有核酸。
一个非限定性实施方案中，同源的多肽的不同的氨基酸序列可以是表1中所示的15种保守或者半保守组中的任意一种氨基酸。
                 表1.相似氨基酸替代组
  保守组(8)   半保守组(7)
  Arg，Lys   Arg，Lys，His
  Asp，Glu   Asn，Asp，Glu，Gln
  Asn，Gln
  Ile，Leu，Val   Ile，Leu，Val，Met，Phe
  Ala，Gly   Ala，Gly，Pro，Ser，Thr
  Ser，Thr   Ser，Thr，Tyr
  Phe，Tyr   Phe，Trp，Tyr
  Cys(non-cystine)，Ser   Cys(non-cystine)，Ser，Thr
这里给出的氨基酸序列使用下面的缩写形式表示。
  APBQCRDSETFGV   AlaProGlnCysArgAspSerGluThrPheGlyVal   丙氨酸脯氨酸天冬氨酸或天冬酰胺谷氨酰胺胱氨酸精氨酸天冬氨酸丝氨酸谷氨酸苏氨酸苯丙氨酸甘氨酸缬氨酸
  HWIYZKLMN   HisTrpIleTyrLysLeuMetAsn   组氨酸色氨酸异亮氨酸酪氨酸谷氨酸或谷氨酰胺赖氨酸亮氨酸甲硫氨酸天冬酰胺
              I.选择假单胞菌和相关的细菌作为宿主细胞
本发明提供了假单胞菌和相关细菌作为蛋白改良生产中宿主细胞的用途。
营养缺陷型选择效率
已经发现假单胞菌具有利用营养缺陷型选择标记来保持蛋白表达质粒而没有其它系统所具有的显著缺陷例如质粒的不稳定性和交叉传递的能力。
营养缺陷型标记，在其它的的宿主细胞系统中，通常不足以保持所有细胞中的质粒，特别是在发酵过程中丢失质粒会带给质粒-减少细胞一种选择优势，导致了非生产性细胞大量的聚集，减少了产品的形成。这种回复的菌株如果具有从原养型能力细菌交叉传递营养缺陷代谢物的能力就会非常的麻烦。例如，在一个大肠杆菌色氨酸营养缺陷体中的质粒上使用trp操纵子就不足以防止大量质粒-减少细胞的累积，直到在valSts宿主中与valS基因(编码缬氨酰t-RNA合成酶)结合(Skogman，S.G.；Nilsson，J.，(大肠杆菌中色氨酸-操纵子-承受质粒的温度-依赖保持力)Temperature-dependent retention of a tryptophan-operon-bearing plasmid inEscherichia coli.Gene 1984，31，(1-3)，117-22)。大概，含有质粒上包含trp操纵子的细胞分泌了足够的色氨酸或者相关的分子从而允许质粒减少的细胞存活。同样，在leu2变异酵母中的木糖醇还原酶生产质粒上使用LEU2基因产生了质粒的丢失，批次发酵培养中高达80％是由没有生产质粒的细胞组成的，因为亮氨酸是由质粒-含有细胞分泌到发酵液中的(Meinander，N.Q.；Hahn-Haegerdal，B.，使用葡萄糖作为辅助底物，具有不同XYL1表达水平的两种重组酵母菌株的批次木糖醇生产：生产数据和菌株能力的比较(Fed-batch xylitol production with two recombinantSaccharomyces cerevisiae strains expressing XYL1 at different levels，using glucose asa cosubstrate：a comparison of production parameters and strain stability.)Biotechnology and Bioengineering 1997，54，(4)，391-399)。
已经发现荧光假单胞菌(Pf)不表现出在其它宿主细胞系统中发现的与交叉传递有关的内在问题，例如，在大肠杆菌和酵母中发现的。当不能被任意特定的原理进行解释的时候，营养缺陷的荧光假单胞菌被认为是特别适合用作宿主细胞的生物体因为发现了在一种包含了营养缺陷的代谢物的培养基上，荧光假单胞菌营养缺陷体细胞不能与含有原养型能力质粒的营养缺陷的细胞竞争，表示了荧光假单胞菌营养缺陷体不能输入这种需要的代谢物的先天的缺陷。因此，丢失了选择标记的质粒的荧光假单胞菌细胞不能获得具有这种选择标记的荧光假单胞菌细胞的选择优势，即使在提供了附加的代谢物的情况下，很大程度上减少了交叉传递的潜在作用。因为这种交叉传递减少的影响，在发酵运行过程中重组多肽的产率就不会因为非重组多肽生产细胞的存在而降低。
LacI插入片段
已经发现假单胞菌可以使用一种不同于作为整体的一部分或者截断的Plac-lacI-lacZYA操纵子单拷贝的lacI转基因，，染色体插入来有效地抑制蛋白的表达直到被诱导。
转录的开始来自于通过RNA聚合酶被激活或者通过结合或者释放出一种调控蛋白而失活从而调节启动子。因此，调节启动子包括那些参与负调控作用的部分(也就是说可抑制的启动子)，这里编码所需目标蛋白的基因只有在启动子不含有调控蛋白(也就是说一种“抑制”蛋白)的时候才被表达，和那些参与正调控的部分，这里只有这种启动子被调控蛋白(也就是说一种“激活”蛋白)结合的时候基因才进行表达。
在细菌表达系统中使用的可抑制启动子种类中一种最常用的是Plac基础(Plac-based)的启动子家族。Plac基础的启动子家族开始于天然的大肠杆菌乳糖操纵子，表示为“lac”操纵子，也表示为“lacZYA”，其调控是通过表达lacI基因来调控的。天然的大肠杆菌操纵子是“PlacI-lacI-PlacZ-lacZYA”，其中天然的大肠杆菌Plac启动子是由“PlacZ”来表示的(也称为“PlacZYA”)。“PlacI”表示对于lacI基因天然的启动子，并且“lacI”表示编码lac抑制剂，也就是说LacI蛋白的基因。“lacZYA”表示编码乳糖利用途径的操纵子。
LacI调控启动子包括，在其它情况中，天然的大肠杆菌乳糖操纵子启动子(“Plac”)。另外，也已经发现了改良的变异，也具有Plac内部的启动子(as have intrapromoter hybrids of Plac)，例如“Ptac”启动子，“Ptrc”启动子，以及“PtacII”启动子。例如，在大肠杆菌中的Ptac启动子当完全抑制的时候比Plac启动子强3倍。因此，它经常用于促进大肠杆菌中高水平的调控基因表达。但是，当Plac启动子被LacI 1000倍抑制的时候，Ptac启动子在相同条件下被仅50倍的抑制(Lanzer，M.& H.Bujard.1988.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.85：8973)。大肠杆菌Ptac启动子或者其它的lac相关启动子的抑制，取决于抑制剂LacI的浓度(De Boer，et al.，1983.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.78：21-25)。如上所述，从抑制中释放可以通过加入一种诱导物而出现，其可以减弱抑制剂和它的特定DNA结合位点的亲和力，在这种情况下，是lac操纵基因(lacO)。可以选择的，降低相应于质粒上特定DNA结合位点的摩尔浓度的抑制剂的浓度也可以解除对于启动子的阻遏。如果lacI基因位于一个高拷贝数的克隆质粒上，需要大量的诱导物来启动表达，因为在这系统中产生了大量的抑制剂。
在商业的生产系统中，lac抑制剂由特定的基因编码，其表达是组成型的，也就是说非调控的，因此提供一种细胞内环境，在其中编码所需的目标蛋白所需的转基因，是被抑制的直到达到所需的宿主细胞生物量或者细胞浓度。在那时，被认为是诱导物的可以有效地从转基因中分离抑制剂的大量的小分子加入到细胞培养物中并且被细胞所吸收，因此允许转基因的转录。在使用lac抑制蛋白的情况下，诱导物可以是乳糖或者一种非代谢的诱导物例如异丙基-β-D-硫代-半乳糖苷(“IPTG”)。所选择的加入诱导物的时间点被认为是“诱导期”。
已经确认了大量的lac抑制剂基因用于抑制出现在重组多肽表达载体上的Plac家族启动子。这些包括天然的大肠杆菌lacI基因和/或通过它们的变体，包括lacIQ和lacIQI基因其编码相同的lacI蛋白，但是处于一个更高的表达水平。例如，lacIQ突变是一个简单的在lacI启动子区域的-35位点的CG到TA的改变(Calos，M.1978.Nature 274：762)其导致了大肠杆菌中LacI表达的10倍的增长(Mueller-Hill，B.，etal.1968.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.59：1259)。野生型大肠杆菌细胞具有10-8M的LacI浓度或者大约每个细胞10个分子，其中99％的蛋白为一种四聚物(Fickert，R.& B.Mueller-Hill 1992.J.Mol.Biol.226：59)。而含有lacIQ突变的细胞其每个细胞包含大约100个分子或者10-7M LacI。作为结论，已经发展的大量细菌表达系统其中含有Plac家族启动子调控的转基因，位于质粒中，被维持在宿主细胞中不同水平地表达LacI蛋白，因此抑制了所需的转基因直到一种选定的细胞生长的“诱导期”。
但是，在许多情况下，细胞生长过程中目标蛋白的表达抑制是有缺陷的，因此在特定的诱导期之前就有了大量的表达。这种“渗漏”导致宿主细胞的压力，由于代谢能量已经从正常的细胞生长转移到转基因过程而不能有效利用碳源，并且延迟达到理想的细胞密度诱导点，产生了更为冗长和昂贵的发酵运行，并且通常，目标蛋白的产量降低了。
一个常用的对Plac-家族启动子-启动转基因的改进抑制的策略是通过放置一个lacI或者lacIQ基因到含有Plac-家族启动子-启动目标基因的质粒上(例如，参考MJR Stark in Gene 51：255-67(1987)和E Amann et al.in Gene：301-15(1988))。但是，这通常导致了Lac抑制蛋白的过度生产，其随后需要使用更高的诱导物浓度从而回复转基因的诱导水平来克服重组蛋白生产的降低。此外，使用包含lacI基因的第二个质粒，从包含Plac家族启动子启动目标基因的质粒分离，需要使用两个不同的选择标记基因来在表达宿主细胞中维持两个质粒：一个选择标记对应于两个不同质粒中的一个。第二个选择标记基因的出现，也就是说第二个质粒的选择标记基因，依次需要使用或者：1)在抗生素抗性选择标记基因的情况下一种单独的抗生素，其是昂贵的并且从健康/安全调控的角度来看是不利的；或者2)一种单独的在宿主细胞染色体中的代谢物缺陷，在营养缺陷选择标记基因的情况下，其需要附加的变异宿主细胞的工作。
已经惊奇的发现lacI的插入，不同于作为整体的一部分或者截断的Plac-lacl-lacZYA操纵子，可以有效的抑制Plac-Ptac家族启动子-调控的转基因作为一种在荧光假单胞菌中多拷贝编码LacI抑制蛋白质粒。这一惊奇的发现消除了对于细胞中单独的编码LacI抑制蛋白的质粒进行维持的需要，或者消除了对于一种附加的营养缺陷的选择标记进行限制的需要，并且进一步减少了潜在的由于维持这种包含lacI质粒所造成的生产的低效性。
在一个先前的试图调控假单胞菌表达的转基因中，一个被删除lacZ启动子区域，但是保留了组成型的PlacI启动子的大肠杆菌PlacI-lacI-lacZYA操纵子，被插入到染色体中的(参考美国专利NO.5,169,760)。这种删除允许了这种lac操纵子的基因产品的组成表达。但是，插入的操纵子包含大肠杆菌lacY基因，其编码乳糖运送蛋白乳糖透酶。乳糖透酶可以从培养基到宿主细胞转运乳糖，或者相似的衍生物，。乳糖透酶的存在可以导致从培养基中增加输入类似乳糖的污染物，最后产生了在诱导之前就抑制了Plac家族启动子。此外，lac操纵子lacZ，lacY，和lacA基因产品的表达可以产生所使用的碳源对这些产品的低效贡献，导致了在细胞上增加的代谢压力，并且延迟了诱导的高细胞浓度的建立。另外，更大的lacI-lacZYA融合操纵子相比于宿主细胞中单独的lacI插入可以产生更多的不稳定性信息。
惊奇的发现不同于作为整体的一部分或者截断的PlacI-lacI-lacZYA操纵子在假单胞菌中LacI-编码基因的使用惊奇地对于诱导前的重组蛋白表达产生了充分地改良的抑制，与以前教导的lacI-lacZYA假单胞菌染色体插入相比在商业领域发酵中更高的细胞浓度，以及更高的所需产品的产量(美国专利No.5,169,760)。
另外的使用lacI基因衍生物的试图，例如lacIQ和lacIQI，由于这种启动子修饰其与lacI相比可以更高水平地表达，已经进行了描述。CG Glascock和MJWeickert提到宿主细胞染色体中具有单独的LacI蛋白编码基因的大肠杆菌菌株用来测定质粒-产生的Ptac-启动目标基因的控制水平。参考CG Glascock & MJWeickert，“使用染色体laclQI来调控大肠杆菌中高拷贝数质粒基因的表达”(″Using chromosomal lacIQI to control expression of genes on high-copy numberplasmids in Escherichia coli，″)Gene 223(1-2)：221-31(1998)；也可以参考WO97/04110。在这里测试的LacI-蛋白编码基因为lacI，lacIQ和lacIQI。对于lacI基因和lacIQ基因得到的结果证明了当存在于一个高拷贝数质粒的时候Ptac-启动目标基因的更差水平的抑制，产生了充分水平的诱导前目标基因的表达。只有高水平表达的lacIQI基因在那个系统中提供了充足的抑制。
但是，这种策略，具有潜在的增加成本的问题因为需要增加诱导物的用量来在诱导时充分解除启动子的抑制作用，并且降低了产量，因为诱导物不能充分地结合全部组成型的抑制蛋白的表达。
比较地，惊奇地发现单拷贝lacI染色体插入可以充分抑制Plac-Ptac家族启动子启动转基因表达。这种发现提供了在诱导物使用量上的潜在的节约成本的方法，并且提供了额外的灵活性在假单胞菌作为宿主细胞改进蛋白生产的发展中。
假单胞菌生物体
假单胞菌和紧密相关的微生物，如这里所使用的，是延伸到这里限定为“革兰氏(-)变形杆菌纲(Proteobacteria)亚群1”的群体。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群1”进一步特殊限定为属于描述为落入名为“革兰氏阴性好氧杆菌和球菌”的分类学“部分”的科和/或属，通过R.E.Buchanan and N.E.Gibbons(eds.)，伯杰细菌鉴定手册(Bergey′s Manual of Determinative Bacteriology)，pp.217-289(8th ed.，1974)(The Williams & Wilkins Co.，Baltimore，MD，USA)(下文中称为″Bergey(1974)″)。表4给出了在这分类学“部分(part)”中的微生物的科和属。
表1.“革兰氏阴性好氧杆菌和球菌”部分中列出的科和属(Bergey(1974))
  科I.假单胞菌科(Pseudomonadaceae)   葡糖杆菌属(Gluconobacter)假单胞菌属(Pseudomonas)黄单胞菌属(Xanthomonas)动胶菌属(Zoogloea)
  科II.固氮菌科(Azotobacteraceae)   氮单胞菌属(Azomonas)固氮菌属(Azotobacter)拜叶林克氏菌属(Beijerinckia)德克斯氏菌属(Derxia)
  科III.根瘤菌科(Rhizobiaceae)   土壤杆菌属(Agrobacterium)根瘤菌属(Rhizobium)
  科IV.甲基单胞菌科(Methylomonadaceae)   甲基球菌属(Methylococcus)甲基单胞菌属(Metlzylomonas)
  科V.盐杆菌科(Halobacteriaceae)   盐杆菌属(Halobacterium)盐球菌属(Halococcus)
  其它的属   醋杆菌属(Acetobacter)产碱菌属(Alcaligenes)博德特氏菌属(Bordetella)布鲁氏菌属(Brucella)弗朗西斯氏菌属(Francisella)栖热菌属(Thermus)
“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群1”包含所有的变形杆菌纲分类下的，以及所有的变形杆菌纲其可以按照形成这一分类学“部分”时所使用的规则进行分类。作为结果，“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群1”排除了，例如：所有的革兰氏阳性细菌，那些革兰氏阴性细菌，例如肠细菌，其落入Bergey(1974)分类手册的其它的19个“部分”，这本Bergey(1974)的完整的“科V.盐杆菌科(Halobacteriaceae)”“部分”其已经被公认为古菌(Archaea)的非细菌科；并且属，栖热菌属(Thermus)，列于这本Bergey(1974)的“部分”中这个属其已经被公认为是非变形杆菌纲属中的细菌。
“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群1”进一步包括那些变形杆菌纲，属于(和先前所称作的种)在这本的Bergey(1974)的“部分”中所限定的属和科以及那些已经被给出的其它的变形杆菌纲分类学名称。在这些情况下，这些再次命名导致产生了完全新的变形杆菌属。例如，噬酸菌属(Acidovorax)，短波单胞菌属(Brevundimonas)，伯克氏菌属(Burkholderia)，噬氢菌属(Hydrogenophaga)，海洋假单胞菌属(Oceanimonas)，劳尔氏菌属(Ralstonia)，和寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)，由于重新分组产生的生物体属于(和先前所称作的种)假单胞菌属，如Bergey(1974)所限定的。同样，例如，鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)属(和芽生单胞菌(Blastomonas)属，源自它们的)是由于重新分组生物体产生的属于(和先前所称作的种)黄单胞菌(Xanthomonas)属如Bergey(1974)所限定的。相似地，例如，酸单胞菌(Acidomonas)属是由于重新分组生物体产生的属于(和先前所称作的种)醋菌(Acetobacter)属如Bergey(1974)所限定的。这种进一步再分配的种如这里所限定的也包括在“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群1”中。
在其它的情况中，落入这本Bergey(1974)“部分”中的属和科中所限定的变形杆菌纲种的被简单地再次分离到其它种下，已经存在的变形杆菌纲的属。例如，在假单胞菌属的情况下，Pseudomonas enalia(ATCC 14393)，生黑假单胞菌(Pseudomonas nigrifaciens)(ATCC 19375)，和腐败假单胞菌(Pseudomonasputrefaciens)(ATCC 8071)曾经被分别重新分类为假交替单胞菌(Alteromonashaloplanktis)，生黑交替单胞菌(Alteromonas nigrifaciens)，和腐败交替单胞菌(Alteromonas putrefaciens)。相似地，例如，噬酸假单胞菌(Pseudomonasacidovorans)(ATCC 15668)和睾丸酮假单胞菌(Pseudomonas testosteroni)(ATCC11996)曾经被分别重新分类为丛毛酸单胞菌(Comanonas acidovorans)和睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)；以及生黑假单胞菌(Pseudomonas nigrifaciens)(ATCC 19375)和杀鱼假单胞菌(Pseudomonas piscicida)(ATCC 15057)曾经被分别重新分类为生黑交替假单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)和杀鱼交替假单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)。这种随后的再分配的变形杆菌(Proteobacterial)种如这里所限定的也包括在“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群1”中。
“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群1”还包括已经被发现或者曾经被重新分类为属于这本Bergey(1974)“部分”中的变形杆菌科和/或种中的变形杆菌种。考虑到变形杆菌科，“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群1”还包括分类为属于任意的科的变形杆菌(Proteobacteria)，假单胞菌(Pseudomonadaceae)，固氮菌科(Azotobacteraceae)(目前通常称为同义的，假单胞菌(Pseudomonadaceae)的“固氮菌群”)，根瘤菌科(Rhizobiaceae)，和甲基单胞菌科(Methylomonadaceae)(目前通常称为同义的，“甲基球菌科(Methylococcaceae)”)。因此，除了这里所提到的那些属，进一步变形杆菌属落入“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群1”中的包括：1)固氮菌群细菌中的固氮根瘤菌(Azorhizophilus)属；2)假单胞菌科的纤维弧菌属(Cellvibrio)，Oligella和Teredinibacter属的细菌；3)根瘤菌科的Chelatobacter属，剑菌属(Ensifer)，Liberibacter属(也称为″Candidatus Liberibacter″)，和中华根瘤菌属(Sinorhizobium)的细菌；和4)甲基球菌科的甲基杆菌属(Methylobacter)，甲基暖菌属(Methylocaldum)，甲基微菌属(Methylomicrobium)，甲基八叠球菌属(Methylosarcina)和甲基球形菌属(Methylosphaera)属的细菌。
一个实施方案中，宿主细胞选自如前面描述的“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群1”。
另一个实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群2”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群2”被定义成下面的属的变形杆菌群(group)(这里在括号中给出了保藏的菌株的目录号的总数，公众可以获得的，除非另外说明，都保藏在ATCC)：酸单胞菌(Acidomonas)(2)；醋菌(Acetobacter)(93)；葡糖杆菌(Gluconobacter)(37)；短波单胞菌(Brevundimonas)(23)；拜叶林克氏菌(Beijerinckia)(13)；德克斯氏菌(Derxia)(2)；布鲁氏菌(Brucella)(4)；土壤杆菌(Agrobacterium)(79)；Chelatobacter(2)；剑菌属(Ensifer)(3)；根瘤菌(Rhizobium)(144)；中华根瘤菌(Sinorhizobium)(24)；芽生单胞菌(Blastomonas)(1)；鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)(27)；产碱菌(Alcaligenes)(88)；博德特氏菌(Bordetella)(43)；伯克氏菌(Burkholderia)(73)；劳尔氏菌(Ralstonia)(33)；噬酸菌(Acidovorax)(20)；噬氢菌(Hydrogenophaga)(9)；动胶菌(Zoogloea)(9)；甲基杆菌属(Methylobacter)(2)；甲基暖菌属(Methylocaldum)(1在NCIMB)；甲基球菌属(Methylococcus)(2)；甲基微菌属(Methylomicrobium)(2)；甲基单胞菌属(Methylomonas)(9)；甲基八叠球菌属(Methylosarcina)(1)；甲基球形菌属(Methylosphaera)；氮单胞菌(Azomonas)(9)；固氮根瘤菌(Azorhizophilus)(5)；固氮菌(Azotobacter)(64)；纤维弧菌(Cellvibrio)(3)；Oligella(5)；假单胞杆菌(Pseudomonas)(1139)；弗兰西氏菌属(Francisella)(4)；黄单胞菌(Xanthomonas)(229)；寡养单胞菌(Stenotrophomonas)(50)；和海洋假单胞菌(Oceanimonas)(4)。
“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群2”中的典型的宿主细胞种类包括，但是不限于下面的细菌(在括号中显示的ATCC或者其它机构的典型菌株的保藏号)：甲醇酸单胞菌(Acidomonas methanolica)(ATCC 43581)；纹膜醋酸杆菌(Acetobacter aceti)(ATCC 15973)；Gluconobacter oxydans(ATCC 19357)；短波单胞菌(Brevundimonasdiminua)(ATCC 11568)；印度贝氏固氮菌(Beijerinckia indica)(ATCC 9039和ATCC 19361)；Derxia gummosa(ATCC 15994)；Brucella melitensis(ATCC 23456)，牛种布鲁氏菌(Brucella abortus)(ATCC 23448)；根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)(ATCC 23308)，放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)(ATCC19358)，发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)(ATCC 11325)；Chelatobacterheintzii(ATCC 29600)；Ensifer adhaerens(ATCC 33212)；根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum)(ATCC 10004)；Sinorhizobium fredii(ATCC 35423)；Blastomonasnatatoria(ATCC 35951)；鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)(ATCC 29837)；粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)(ATCC 8750)；百日咳杆菌(Bordetella pertussis)(ATCC 9797)；洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)(ATCC 25416)；Ralstoniapickettii(ATCC 27511)；敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)(ATCC 11228)；氢噬胞菌(Hydrogenophaga flava)(ATCC 33667)；生枝动胶菌(Zoogloea ramigera)(ATCC19544)；甲基细菌(Methylobacter luteus)(ATCC 49878)；Methylocaldumgracile(NCIMB 1912)；甲基球菌(Methylococcus capsulatus)(ATCC 19069)；Methylomicrobium agile(ATCC 35068)；甲烷甲基单胞菌(Methylononas methanica)(ATCC 35067)；Methylosarcina fibrata(ATCC 700909)；Methylosphaerahansonii(ACAM 549)；氮单胞菌(Azomonas agilis)(ATCC 7494)；Azorhizophiluspaspali(ATCC 23833)；圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)(ATCC 9043)；对褐纤维弧菌(Cellvibrio mixtus)(UQM 2601)；尿道寡源杆菌(Oligella urethralis)(ATCC17960)；绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)(ATCC 10145)；荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)(ATCC 35858)；土拉热弗朗西丝菌(Francisellatularensis)(ATCC 6223)；嗜麦寡养食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)(ATCC13637)；Xanthomonas campestris(ATCC 33913)；和Oceanimonas doudoroffii(ATCC27123)。另一个实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群3”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群3”被定义为下面属中的变形杆菌的群：短波单胞菌属(Brevundimonas)；土壤杆菌属(Agrobacterium)；根瘤菌(Rhizobium)；中华根瘤菌(Sinorhizobium)；芽生单胞菌(Blastomonas)；鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)；产碱杆菌属(Alcaligenes)；伯克氏菌属(Burkholderia)；劳尔氏菌属(Ralstonia)；酸单胞菌(Acidovorax)；噬氢菌属(Hydrogenophaga)；甲基杆菌属(Methylobacter)；甲基暖菌属(Methylocaldum)；甲基球菌属(Methylococcus)；甲基微菌属(Methylomicrobium)；甲基单胞菌属(Methylomonas)；甲基八叠球菌属(Methylosarcina)；甲基球形菌属(Methylosphaera)；氮单胞菌属(Azomonas)；固氮根瘤菌(Azorhizophilus)；固氮菌属(Azotobacter)；纤维弧菌属(Cellvibrio)；Oligella；假单胞杆菌(Pseudomonas)；Teredinibacter；弗兰西氏菌属(Francisella)；寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)；黄单胞菌属(Xanthomonas)；和海洋假单胞菌属(Oceanimonas)。
另一个实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群4”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群4”被定义为下面属中的变形杆菌的组：短波单胞菌属(Brevundimonas)；芽生单胞菌(Blastomonas)；鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)；伯克氏菌属(Burkholderia)；劳尔氏菌属(Ralstonia)；噬酸菌属(Acidovorax)；噬氢菌属(Hydrogenophaga)；甲基杆菌属(Methylobacter)；甲基暖菌属(Methylocaldum)；甲基球菌属(Methylococcus)；甲基微菌属(Methylomicrobium)；甲基单胞菌属(Methylomonas)；甲基八叠球菌属(Methylosarcina)；甲基球形菌属(Methylosphaera)；氮单胞菌属(Azomonas)；固氮根瘤菌(Azorhizophilus)；固氮菌属(Azotobacter)；纤维弧菌属(Cellvibrio)；Oligella；假单胞杆菌(Pseudomonas)；Teredinibacter；弗兰西氏菌属(Francisella)；寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)；黄单胞菌(Xanthomonas)；和海洋假单胞菌属(Oceanimonas)。
一个实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群5”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群5”被定义为下面属中的变形杆菌的组：甲基杆菌属(Methylobacter)；甲基暖菌属(Methylocaldum)；甲基球菌属(Methylococcus)；甲基微菌属(Methylomicrobium)；甲基单胞菌属(Methylomonas)；甲基八叠球菌属(Methylosarcina)；甲基球形菌属(Methylosphaera)；氮单胞菌属(Azomonas)；固氮根瘤菌(Azorhizophilus)；固氮菌属(Azotobacter)；纤维弧菌属(Celivibrio)；Oligella；假单胞杆菌(Pseudomonas)；Teredinibacter；弗兰西氏菌属(Francisella)；寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)；黄单胞菌(Xanthomonas)；和海洋假单胞菌属(Oceanimonas)。
宿主细胞可以选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群6”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群6”被定义为下面属中的变形杆菌的组：短波单胞菌属(Brevundimonas)；芽生单胞菌(Blastomonas)；鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)；伯克氏菌属(Burkholderia)；劳尔氏菌属(Ralstonia)；噬酸菌属(Acidovorax)；噬氢菌属(Hydrogenophaga)；氮单胞菌属(Azomonas)；固氮根瘤菌(Azorhizophilus)；固氮菌属(Azotobacter)；纤维弧菌属(Cellvibrio)；Oligella；假单胞杆菌(Pseudomonas)；Teredinibacter；寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)；黄单胞菌(Xanthomonas)；和海洋假单胞菌属(Oceanimonas)。
宿主细胞可以选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群7”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群7”被定义为下面属中的变形杆菌的组：氮单胞菌属(Azomonas)；固氮根瘤菌(Azorhizophilus)；固氮菌属(Azotobacter)；纤维弧菌属(Cellvibrio)；Oligella；假单胞杆菌(Pseudomonas)；Teredinibacter；寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)；黄单胞菌(Xanthomonas)；和海洋假单胞菌属(Oceanimonas)。
宿主细胞可以选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群8”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群8”被定义为下面属中的变形杆菌的组：短波单胞菌属(Brevundimonas)；芽生单胞菌(Blastomonas)；鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)；伯克氏菌属(Burkholderia)；劳尔氏菌属(Ralstonia)；噬酸菌属(Acidovorax)；噬氢菌属(Hydrogenophaga)；假单胞杆菌(Pseudomonas)；寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)；黄单胞菌(Xanthomonas)；和海洋假单胞菌属(Oceanimonas)。
宿主细胞可以选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群9”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群9”被定义为下面属中的变形杆菌的组：短波单胞菌属(Brevundimonas)；伯克氏菌属(Burkholderia)；劳尔氏菌属(Ralstonia)；噬酸菌属(Acidovorax)；噬氢菌属(Hydrogenophaga)；假单胞杆菌(Pseudomonas)；寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)；和海洋假单胞菌属(Oceanimonas)。
宿主细胞可以选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群10”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群10”被定义为下面属中的变形杆菌的组：伯克氏菌属(Burkholderia)；劳尔氏菌属(Ralstonia)；假单胞杆菌(Pseudomonas)；寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)；和黄单胞菌(Xanthomonas)。
宿主细胞可以选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群11”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群11”被定义为下面属中的变形杆菌的组：假单胞杆菌(Pseudomonas)；寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)；和黄单胞菌(Xanthomonas)。
宿主细胞可以选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群12”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群12”被定义为下面属中的变形杆菌的组：伯克氏菌属(Burkholderia)；劳尔氏菌属(Ralstonia)；假单胞杆菌(Pseudomonas)。
宿主细胞可以选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群13”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群13”被定义为下面属中的变形杆菌的组：伯克氏菌属(Burkholderia)；劳尔氏菌属(Ralstonia)；假单胞杆菌(Pseudomonas)和黄单胞菌(Xanthomonas)。
宿主细胞可以选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群14”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群14”被定义为下面属中的变形杆菌的组：假单胞杆菌(Pseudomonas)和黄单胞菌(Xanthomonas)。
宿主细胞可以选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群15”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群15”被定义为假单胞杆菌(Pseudomonas)属中的变形杆菌的组。
宿主细胞可以选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群16”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群16”被定义为下面假单胞杆菌(Pseudomonas)种的变形杆菌的组(括号中显示的ATCC或其它机构中的典型菌株的保藏号)：Pseudomonas abietaniphila(ATCC700689)；绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)(ATCC 10145)；产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)(ATCC 14909)；Pseudomonas anguilliseptica(ATCC33660)；Pseudomonas citronellolis(ATCC 13674)；Pseudomonas flavescens(ATCC51555)；门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)(ATCC 25411)；Pseudomonasnitroreducens(ATCC 33634)；解油极毛杆菌(Pseudomonas oleovorans)(ATCC8062)；假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)(ATCC17440)；Pseudomonas resinovorans(ATCC 14235)；Pseudomonas straminea(ATCC33636)；蘑菇假单胞菌(Pseudomonas agarici)(ATCC 25941)；Pseudomonasalcaliphila；Pseudomonas alginovora；Pseudomonas andersonii；Pseudomonasasplenii(ATCC 23835)；Pseudomonas azelaica(ATCC 27162)；Pseudomofaasbeijerinckii(ATCC 19372)；Pseudomonas borealis；Pseudomonas boreopolis(ATCC33662)；Pseudomonas brassicacearum；Pseudomonas butanovora (ATCC 43655)；Pseudomonas cellulosa(ATCC 55703)；Pseudomonas aurantiaca(ATCC 33663)；绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)(ATCC 9446，ATCC 13985，ATCC 17418，ATCC 17461)；草莓假单胞菌(Pseudomonas fragi)(ATCC 4973)；Pseudomonaslundensis(ATCC 49968)；腐臭假单胞菌(Pseudomonas taetrolens)(ATCC 4683)；Pseudomonas cissicola(ATCC 33616)；Pseudomonas coronfaciens；Pseudomonasditerpeniphila；Pseudomonas elongata(ATCC 10144)；Pseudomonas flectens(ATCC12775)；氮芽孢杆菌(Pseudomonas azotoformans)；Pseudomonas brenneri；Pseudomonas cedrella；Pseudomonas corrugata(ATCC 29736)；Pseudomonasextremorientalis；Pseudomonas fluorescens(ATCC 35858)；Pseudomonas gessardii；Pseudomonas libanensis；Pseudomonas mandelii(ATCC 700871)；边缘假单胞菌(Pseudomonas marginalis)(ATCC 10844)；Pseudomonas migulae；Pseudomonasmucidolens(ATCC 4685)；Pseudomonas orientais；Pseudomonas rhodesiae；Pseudomonas synxantha(ATCC 9890)；托拉斯假单胞杆(Pseudomonas tolaasii)(ATCC 33618)；威隆气单胞菌(Pseudomonas veronii)(ATCC 700474)；Pseudomonasfrederiksbergensis；Pseudomonas geniculata(ATCC 19374)；Pseudomonas gingers；Pseudomonas graminis；Pseudomonas grimontii；Pseudomonas halodenitrificans；Pseudomonas halophila；Pseudornonas hibiscicola(ATCC 19867)；Pseudomonashuttiensis(ATCC 14670)；噬氢假单胞菌(Pseudomonas hydrogenovora)；Pseudomonas jessenii(ATCC 700870)；Pseudomonas kilonensis；Pseudomonaslanceolata(ATCC 14669)；Pseudomonas lini；Pseudomonas marginata(ATCC 25417)；Pseudomonas mephitica(ATCC 33665)；脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)(ATCC 19244)；Pseudomonas pertucinogena(ATCC 190)；Pseudomonas pictorum(ATCC 23328)；Pseudomonas psychrophila；Pseudomonas fulva(ATCC 31418)；Pseudomonas monteilii(ATCC 700476)；Pseudomonas mosselii；Pseudomonasoryzihabitans(ATCC 43272)；Pseudomonas plecoglossicida(ATCC 700383)；恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)(ATCC 12633)；Pseudomonas reactants；Pseudomonasspinosa(ATCC 14606)；巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)；Pseudomonasluteola(ATCC 43273)；斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)(ATCC 17588)；Pseudomonas amygdali(ATCC 33614)；Pseudomonas avellanae(ATCC 700331)；Pseudomonas caricapapayae(ATCC 33615)；菊苣假单孢菌(Pseudomonas cichorii)(ATCC 10857)；Pseudomonas ficuserectae(ATCC 35104)；Pseudomonasfuscovaginae；Pseudomonas meliae(ATCC 33050)；丁香假单胞菌(Pseudomonassyringe)(ATCC 19310)；Pseudoinoizas viridiflava(ATCC 13223)；Pseudomonasthermocarboxydovorans(ATCC 35961)；Pseudomonas thermotolerans；Pseudomonasthivervalensis；Pseudomonas vancouverensis(ATCC 700688)；Pseudomonaswisconsinensis；和Pseudomonas xiamenensis。
宿主细胞可以选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群17”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群17”被定义为现有技术中被认为是“荧光假单胞菌”的变形杆菌的组包括那些属于例如下面的假单胞菌的种：Pseudomonas azotoformans；Pseudomonas brenneri；Pseudomonas cedrella；皱纹假单胞菌(Pseudomonas corrugata)；Pseudomonasextremorientalis；荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)；Pseudomonas gessardii；Pseudomonas libanensis；Pseudomonas mandelii；边缘假单胞菌(Pseudomonasmarginalis)；Pseudomonas migulae；Pseudomonas mucidolens；Pseudomonas orientalis；Pseudomonas rhodesiae；产黄假单胞菌(Pseudomonas synxantha)；抗假单胞菌(Pseudomonas tolaasii)和威隆气单胞菌(Pseudomonas veronii)。
宿主细胞可以选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群18”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群18”被定义为荧光假单胞菌种的所有亚种，变体，菌株，和其它的亚种单元，包括那些属于例如下面的(括号中显示的是ATCC或其它机构中的典型菌株的保藏号)：荧光假单胞菌生物型A，也称为生物变体(biovar)1或者生物变体I(ATCC13525)；荧光假单胞菌生物型B，也称为生物变体2或者生物变体II(ATCC17816)；荧光假单胞菌生物型C，也称为生物变体3或者生物变体III(ATCC 17400)；荧光假单胞菌生物型F，也称为生物变体4或者生物变体IV(ATCC12983)；荧光假单胞菌生物型G，也称为生物变体5或者生物变体V(ATCC 17518)；荧光假单胞菌生物变体VI；荧光假单胞菌PfO-1；荧光假单胞菌Pf-5(ATCC BAA-477)；荧光假单胞菌SBW25和荧光假单胞菌subsp.cellulosa(NCIMB 10462)。
宿主细胞可以选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群19”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群19”被定义为荧光假单胞菌生物型A的所有菌株的组。这种生物型的特别优选的菌株是荧光假单胞菌菌株MB101(参考美国专利No.5,169,760(see US PatentNo.5,169,760 to Wilcox))，及其衍生物。
一个实施方案中，宿主细胞是假单胞菌的目(order)的任意的变形杆菌。特定实施方案中，宿主细胞是假单胞菌科的任意的变形杆菌。
特定实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群1”。特定实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群2”。特定实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群3”。特定实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群5”。特定实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群7”。特定实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群12”。特定实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群15”。特定实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群17”。特定实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群18”。特定实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群19”。
另外的可以在本发明中使用的荧光假单胞菌菌株包括荧光假单胞菌Migula和荧光假单胞菌Loitokitok，具有下面的ATCC编号：[NCIB 8286]；NRRL B-1244；NCIB 8865菌株CO1；NCIB 8866菌株C02；1291[ATCC 17458；IFO 15837；NCIB8917；LA；NRRL B-1864；吡咯烷；PW2[ICMP 3966；NCPPB 967；NRRL B-899]；13475；NCTC 10038；NRRL B-1603[6；IFO 15840]；52-1C；CCEB 488-A[BU 140]；CCEB 553[IEM15/47]；IAM 1008[AHH-27]；IAM 1055[AHH-23]；1[IFO15842]；12[ATCC 25323；NIH 11；den Dooren de Jong 216]；18[IFO 15833；WRRL P-7]；93[TR-10]；108[52-22；IFO 15832]；143[IFO15836；PL]；149[2-40-40；IFO 15838]；182[IFO 3081；PJ 73]；184[IFO 15830]；185[W2L-1]；186[IFO 15829；PJ 79]；187[NCPPB 263]；188[NCPPB 316]；189[PJ227；1208]；191[IFO 15834；PJ 236；22/1]；194[Klinge R-60；PJ 253]；196[PJ288]；197[PJ 290]；198[PJ302]；201[PJ 368]；202[PJ 372]；203[PJ 376]；204[IFO 15835；PJ 682]；205[PJ 686]；206[PJ 692]；207[PJ693]；208[PJ 722]；212[PJ 832]；215[PJ 849]；216[PJ 885]；267[B-9]；271[B-1612]；401[C71A；IFO 15831；PJ 187]；NRRL B-3178[4；IFO 15841]；KY 8521；3081；30-21；[IFO 3081]；N；PYR；PW；D946-B83[BU 2183；FERM-P 3328]；P-2563[FERM-P2894；IFO 13658]；IAM-1126[43F]；M-1；A506[A5-06]；A505[A5-05-1]；A526[A5-26]；B69；72；NRRL B-4290；PMW6[NCIB 11615]；SC 12936；A1[IFO15839]；F1847[CDC-EB]；F 1848[CDC 93]；NCIB 10586；P17；F-12；AmMS 257；PRA25；6133D02；6519E01；N1；SC15208；BNL-WVC；NCTC 2583[NCIB 8194]；H13；1013[ATCC 11251；CCEB 295]；IFO 3903；1062；或Pf-5。
                        II.营养缺陷选择标记
本发明提供了假单胞菌和相应的细胞其已经进行了基因修饰从而对至少一种代谢物是营养缺陷的。这种基因修饰可以是对于一个基因或者对于在一个编码例如一种合成代谢的生物合成途径或者分解代谢的利用途径的代谢途径中工作的酶的几个基因的修饰。优选的，这种宿主细胞所有的给定生物催化活性的编码基因都被删除了或者失活，从而保证消除这种生物催化活性。特定实施方案中，假单胞菌是荧光假单胞菌细胞。
一个或多于一个的代谢活性可以被选择敲除或者代替。在天然的营养缺陷的情况下，可以提供另外的代谢敲除或者代替。这里选择了多个活性，营养缺陷-回复选择标记可以是一种生物合成类型(合成代谢的)，或是一种利用型(分解代谢的)，或者可以选择两种类型。例如，对于选择的化合物在给定的生物合成路径中的一种或多于一种的活性可以被敲除；或者多于一种的活性可以被敲除，每一个来自不同的生物合成路径。相关的活性或者多个活性随后被至少一种重组载体所提供，其在转移到细胞中时，回复了细胞的原养特性。
生物合成或者利用的化合物和分子它们可以成为生产营养缺陷性宿主细胞的目标，它们包括：脂质，包括，例如，脂肪酸；单糖和二糖以及其取代的衍生物，包括，例如，葡萄糖，果糖，蔗糖，葡萄糖-6-磷酸，和葡萄糖醛酸，以及Entner-Doudoroff途径和戊糖磷酸途径中间物和产物；核苷，核苷酸，二核苷酸，包括，例如，ATP，dCTP，FMN，FAD，NAD，NADP，含氮碱基，包括，例如，吡啶，嘌呤，嘧啶，蝶呤，和氢化-，脱氢-，和/或取代的含氮碱基的衍生物，例如辅助因子，例如，生物素，腺苷钴胺，核黄素，硫胺素，有机酸和糖酵解和柠檬酸循环中间体和产物，包括，例如，羟基酸(hydroxyacids)和氨基酸；储藏碳水化合物和储藏聚合(羟基链烷酸)聚合物，包括，例如，纤维素，淀粉，多糖，胶淀粉，糖原，聚羟基丁酸，和聚酯。
一个实施方案中，生产营养缺陷的宿主细胞所敲除的生物催化活性选自：脂质；核苷，核苷酸，二核苷酸，含氮碱基，和含氮碱基的衍生物；以及有机酸或糖酵解和柠檬酸循环的中间物和产物。优选地，敲除的生物催化活性选自：核苷，核苷酸，二核苷酸，含氮碱基，和含氮碱基衍生物；以及有机酸和糖酵解和柠檬酸循环的中间物和产物。更优选，敲除的生物催化活性选自：嘧啶核苷，核苷酸，二核苷酸，含氮碱基，和含氮碱基衍生物或氨基酸。
给定的转基因宿主细胞可以使用一种或者多于一种的选择标记或选择标记系统。例如，按照本发明的一种或者多种生物合成选择标记或者选择标记系统可以互相联合使用，和/或与按照本发明的利用型的选择标记或选择标记系统联合使用。这些原养能力实施方案中的任意一种，宿者细胞还可以包括一种或多种非营养缺陷的选择标记或选择标记系统。非营养缺陷的选择标记和系统的例子包括，例如：毒素-抗性标记基因例如抗生素-抗性基因其编码降解一种抗生素的酶活性；毒素-抗性标记基因，比如，例如，乙酰乳酸合成酶的抗咪唑啉酮-抗性突变(“ALS”；EC2.2.1.6)其中表达的突变体使得酶对于其不包含这种突变体的酶表现的毒素-抑制剂的不敏感。这种化合物可以直接表现这种作用；或者化合物不直接表现这种作用，例如，结果是将这种化合物转变成了毒素的细胞代谢行为或者结果是与至少一种更多的化合物形成的化合物的结合。
编码这种标记酶的细菌-宿主-操作基因可以通过选择构建敲除细胞的细菌宿主细胞菌株来获得，从其它的细菌，或者从其它的生物体，并且可以用天然的形式或修饰的(例如，突变的或者序列重组的)形式。例如，表现为敲除生物催化活性的酶的DNA编码序列可以从一种或多种生物体来获得并且随后可操作地连接到宿主细胞中DNA调控元件上。特别是，所有的选择的宿主细胞内基因其编码一种选择的被破坏的酶活性；选择的被破坏的酶活性编码基因上；破坏的细菌宿主随后被一种包括至少一种可操作的天然的或非天然的基因拷贝其编码一种由于细菌破坏作用而活性丢失的酶的载体转化该载体。
编码这种酶的细菌和其它的基因可以通过本领域中普通技术人员已知的不同的方法来选择或获得。这些包括酶编码序列的核苷酸序列和种内-可操作(species-operative)的DNA调控序列。有用的在线网络资源包括，例如，：(1)来自瑞士生物信息学院(Batiment Ecole de Pharmacie，Room 3041；UniversitédeLausanne；1015 Lausanne-Dorigny；瑞士)的ExPASy数据库蛋白工具(参考酶(ENZYME)和生化途径图(BIOCHEMICAL PATHWAYS MAPS)的内容)已知位于，例如， http：//us.expasy.org/；和(2)GenBank工具和其它的网络资源(参考PUBMED，蛋白质数据库(PROTEIN)，核苷酸数据库(NUCLEOTIDE)，分子结构数据库(STRUCTURE)，基因组数据库(GENOME)，等内容)，其由美国国家生物技术信息中心提供(NCBI，国家医学图书馆，美国国立卫生研究院，美国健康和公共事业部，Building 38A；Bethesda，马里兰州，美国)已知位于http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi。
选择的编码序列可以通过修改其基因编码来进行修饰从而满足选择的细菌宿主细胞的需要，以及提高它的密码子序列来更好的接近于宿主细胞所使用的。基因密码选择和密码子频率提高可以按照本领域普通技术人员已知的的不同的方法来进行，例如，寡核苷酸定点突变。在这种方法中辅助使用的在线的网络资源包括，例如：(1)Kazusa DNA研究所的密码子使用数据库(2-6-7Kazusa-kamatari，Kisarazu，Chiba292-0818 Japan)并且位于 http：//www.kazusa.or.jp/codon/；和(2)可以从NCBI分类学数据库中得到的基因密码子表，其可以从http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Utils/wprintgc.cgi？mode＝c获得。例如，假单胞菌种被报道为使用NCBI分类学站点的基因编码转换表11，以及位于Kazusa站点中的表现密码子使用频率的表格位于 http：//www.kazusa.or.ip/codon/cgibin/。
特定实施方案中，荧光假单胞菌可以用作宿主细胞。一个实施方案中，荧光假单胞菌提供了至少一种营养缺陷的选择标记基因。可替换实施方案中，荧光假单胞菌提供了所有的营养缺陷选择标记基因。特定实施方案中，荧光假单胞菌可以既是宿主细胞并且也提供了至少一种，优选所有的营养缺陷选择标记基因。
生物合成的核苷和含氮碱基选择标记
一个实施方案中，一种合成代谢中的生物合成酶可以被选择作为营养缺陷选择标记。特别是，生物合成酶可以选自那些包含在核苷，核苷酸，二核苷酸，含氮碱基，和含氮碱基衍生物的生物合成中。
特定实施方案中，至少一种嘌呤型生物合成酶可以被选择作为一种营养缺陷的选择标记。这种嘌呤生物合成酶包括，例如，腺嘌呤磷酸核糖转移酶(adeninephosphoribosyltransferases)，腺苷酸琥珀酸裂解酶(adenylosuccinate lyases)，腺苷酸琥珀酸合成酶(adenylosuccinate synthases)，GMP合成酶(GMP synthases)，IMP环水解酶(IMP cyclohydrolases)，IMP脱氢酶(IMP dehydrogenases)，磷酸核糖胺-氨基乙酸连接酶(phosphoribosylamine-glycine ligases)，磷酸核糖-氨基咪唑羧基酰胺核苷酸甲酰基转移酶(phosphoribosyl-aminoimidazolecarboxamideformyltransferases)，磷酸核糖氨基咪唑羧化酶(phosphoribosylaminoimidazolecarboxylases)，磷酸核糖氨基咪唑琥珀酰羧基酰胺合成酶(phosphoribosylaminoimidazolesuccinocarboxamide synthases)，磷酸核糖-甲酰基甘氨脒环连接酶(phosphoribosyl-formylglycinamidine cyclo ligases)，磷酸核糖-甲酰基甘氨脒合成酶(phosphoribosyl-formylglycinamidine synthases)，磷酸核糖-甘氨脒甲酰基转移酶(phosphoribosyl-glycinamide formyltransferases)，核糖-磷酸二磷酸核苷激酶(ribose-phosphate diphosphokinases)，和核糖-5-磷酸-氨基连接酶(ribose-5-phosphate-ammonia ligases)。
另一特定实施方案中，一种嘧啶型生物合成酶可以被选择用作营养缺陷的选择标记。这种嘧啶型的生物合成包括在UMP生物合成中使用的酶，例如氨基甲酸激酶(EC 2.7.2.2)，氨基甲酰-磷酸合成酶(EC 6.3.5.5)，天冬氨酸氨甲酰转移酶(EC2.1.3.2)，二氢乳清酸酶(EC 3.5.2.3)，二氢乳清酸脱氢酶(EC 1.3.3.1)，或者乳清酸磷酸核糖转移酶(“OPRT”；EC 2.4.2.10)，和乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶(“ODCase”；EC 4.1.1.23)。
编码嘧啶型生物合成酶的基因的例子是公知的。在UMP细菌合成的情况下，有用的基因的例子包括：arcC基因，编码氨基甲酸激酶；carA和carB基因，共同的编码氨甲酰-磷酸合成酶；pyrB基因，编码天冬氨酸氨甲酰转移酶；pyrC基因，编码二氢乳清酸酶；pyrD基因，单独或者共同编码二氢乳清酸脱氢酶；pyrE基因编码乳清酸磷酸核糖转移酶；和pyrF基因，编码乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶。
特定实施方案中，按照本发明的一个表达系统可以利用pyrF营养缺陷的选择标记基因。PyrF基因编码乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶，是细菌嘧啶核苷酸生物合成途径中所需要的，通过其细胞表现出从头合成适当的嘧啶核苷酸(UTP，CTP)，以及嘧啶脱氧核苷酸(dTTP，dCTP)。路径的最初反应物是ATP，一种氨基基团来源(也就是铵基离子或者L-谷氨酰胺)，以及一种羧基基团来源(也就是二氧化碳或者重碳酸盐离子)；路径的最终产物是dTTP，以及dCTP，UTP，和CTP也可以在这个过程中形成。特别地，细菌嘧啶核苷酸从头生物合成途径从形成氨甲酰磷酸开始。氨甲酰磷酸是或者：(a)通过氨基甲酸激酶(EC 2.7.2.2)的作用，被arcC基因所编码；或者，更普遍地，(b)被谷氨酰胺水解的作用，氨甲酰磷酸合成酶(EC6.3.5.5)，其小的和大的亚基分别被carA和carB基因编码合成的。氨甲酰磷酸随后通过下面六个步骤的路线而被转化成UDP：1)氨甲酰磷酸转变成N-氨甲酰-L-天冬氨酸，通过天冬氨酸氨甲酰转移酶(EC 2.1.3.2)，由pyrB所编码；2)再将其转化成(S)-二氢乳清酸，通过二氢乳清酸酶(EC 3.5.2.3)，由pyrC所编码；随后3)再将其转化成乳清酸，通过二氢乳清酸脱氢酶(EC 1.3.3.1)，由pyrD基因所编码；随后4)在将其转化成乳清酸核苷-5’-一磷酸盐(“OMP”)，通过乳清酸磷酸核糖转移酶(“OPRT”；EC 2.4.2.10)，由pyrE所编码；以及随后5)再将其转化成尿苷-5’-一磷酸盐(“UMP”)，通过乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶(“ODCase”；EC4.1.1.23)，由pyrF所编码。随后UMP被大量的途径利用来合成嘧啶核苷酸(UTP，CTP，dTTP，dCTP)，核酸，核蛋白，以及其它的细胞代谢物。
在细菌中其中一种或多种carA，carB，或pyrB-pyrF基因已经成为失去活性的或者丢失的，或者变异而编码一种没有功能的酶，如果培养基中添加了尿嘧啶则这种细胞还可以存活，如果这种细胞包括一种功能性的尿嘧啶救助途径。大多数细胞包含一种天然的尿嘧啶救助途径，这包括假单胞菌和相关的菌种。在尿嘧啶救助途径中，细胞诱导并且转化外源的尿嘧啶成为UMP，来合成这种需要的嘧啶核苷酸。在这里，尿嘧啶与5-磷酸核糖-1-焦磷酸进行反应来形成UMP，或者通过尿嘧啶磷酸核糖转移酶(EC 2.4.2.9)的作用，由upp基因编码，或者通过两种功能的，嘧啶操纵子调控蛋白(“pyrR双功能蛋白”)，由pyrR编码。产生的UMP随后转化成UDP，并且随后转化成嘧啶核苷酸，如前面所描述的。
因此，pyrF(-)假单胞菌或者相关的细胞可以被供养在含有尿嘧啶的培养基上。在含有pyrF基因的DNA构建体被转染到pyrF(-)细胞中并且表达来形成一种有功能的ODCase酶后，结果是组合的pyrF(+)质粒-宿主细胞系统可以被供养在一种缺乏尿嘧啶的培养基中。
在假单胞菌或者相关的细胞中使用的pyrF基因的编码序列可以通过编码乳清核苷酸-5’-磷酸脱羧酶(“ODCase”)的任意基因来获得，前提是编码序列可以被选择的假单胞菌或者相关的宿主细胞转录，翻译，以及其它的处理方法来形成一种有功能的ODCase。PyrF编码序列可以是一种天然的序列，或者它可以是一种工程化的序列来自于，例如，应用一种或者多种本领域中已知的序列-修改，序列-结合，和/或序列生产技术。在作为pyrF选择标记基因的部分使用之前，选择的编码序列首先可以按照选择的假单胞菌或相关宿主细胞的基因密码和/或密码子使用频率进行改良或优化。可表达的密码子序列可以操作性地连接到一种可以在所选择的宿主细胞中发挥作用的转录启动子上，以及所有其它的所需转录和翻译调控序列。如前所述的一种pyrF基因的原始编码序列可以来自符合上面所述的要求的细菌或者来自于任意其它的生物体。
一个实施方案中，pyrF编码序列可以分离自假单胞菌或者相关的宿主细胞其中它被试图用作一种选择标记。完整的pyrF基因(包括编码序列和周围的调控区域)可以从那里分离得到。特定实施方案中，提供pyrF基因或编码序列的细菌可以选自假单胞菌目中的一个，假单胞菌亚目中的一个，假单胞菌科中的一个，假单胞菌族中的一个，假单胞菌属中的一个，以及荧光假单胞菌种中的一个(也就是“荧光假单胞菌”)。特定实施方案中，细菌将属于荧光假单胞菌种。
特定实施方案中，pyrF基因包含SEQ ID NO：1(表2)的核酸序列，或者它的变体。可选择地，由pyrF基因编码的ODCase包含SEQ ID NO：2(表3)的氨基酸序列，它的一个变体，或者一个与之相比具有冗余的密码子序列的变体，按照本发明所述的一个给定的宿主细胞所使用的基因密码。
可选择地，包含一种编码ODCase酶核酸序列的pyrF基因选自一种与SEQ IDNo：1有至少70％，75％，80％，85％，88％，90％和95％同源性的核酸序列。同样，编码一种ODCase的pyrF基因选自一种与SEQ ID No：2有至少70％，75％，80％，85％，88％，90％和95％同源性的氨基酸序列。
另一个实施方案中，pyrF基因含有一种编码序列其具有的核酸序列与SEQ IDNO：1的974-1669的核酸序列具有至少90％，93％，95％，96％，97％，98％或99％的同源性。
一特定实施方案中，pyrF基因可以包含一种编码序列其具有可以与SEQ IDNO：3(表4)的反密码子序列杂交的一个密码子序列，当在高度严格杂交条件下进行杂交的时候，或者可以具有与之相比冗余的密码子序列。特定实施方案中，pyrF基因可以含有SEQ ID NO：3的核苷酸序列。
                                 表2-荧光假单胞菌pryF核酸序列
gatcagttgcggagccttggggtcatcccccagtttctgacgcaggcgcgacaccagcaagtcgatgctgcggtcgaaagcctcgatggaacgcccacgggccgcgtccagcagctgttcgcggctcagcacacgccgcgggcgttcgataaacacccacaacaaacgaaactcggcgttggacagcggcaccaccaggccgtcatcggccaccagctggcgcagtacgctgttcaggcgccaagtgtcgaaacggatattggcccgctgttcggtgcggtcatcacgcacccggcgcaggatggtctggatacgcgcgaccagttcccggggttcgaacggcttggacatatagtcgtctgcccccagttccaggccgatgatgcggtcggtgggttcgcagcgggcggtgagcatcaggatcggaatgtccgattcggcgcgcagccagcggcacaatgtcagcccgtcttcgcccggcagcatcaggtcgagcaccaccacatcgaaggtctccgcttgcatggcctggcgcatggcgatgccgtcggtgacgcctgaggcgagaatattgaagcgtgccaggtagtcgatcagcagttcgcggatcggcacgtcgtcgtcgacaatcagcgcgcgggtgttccagcgcttgtcttcggcgatcaccgcgtcttttggcgcttcgtttacagggtcgcaaggggtatgcatagcgaggtcatctgcctggttgtggctgtcagcataggcgcccagttccagggctggaagtgctgggcgggcggtcatgtgcgcgaggctagccgggcggcgtattgggggcgtgtcgtgaatgtatcgggcttgaaacaattgccttgaatcgccggtattgggcgcttgatcggtatttaccgatcatcggatcccgcaacggcgctgcttgcgctacaatccgcgccgatttcgacttgcctgagagcccattccaatgtccgtctgccagactcctatcatcgtcgccctggattaccccacccgtgacgccgcactgaagctggctgaccagttggaccccaagctttgccgggtcaaggtcggcaaggaattgttcaccagttgcgcggcggaaatcgtcggcaccctgcgggacaaaggcttcgaagtgttcctcgacctcaaattccatgacatccccaacaccacggcgatggccgtcaaagccgcggccgagatgggcgtgtggatggtcaatgtgcactgctccggtggcctgcgcatgatgagcgcctgccgcgaagtgctggaacagcgcagcggccccaaaccgttgttgatcggcgtgaccgtgctcaccagcatggagcgcgaagacctggcgggcattggcctggatatcgagccgcaggtgcaagtgttgcgcctggcagccctggcgcagaaagccggcctcgacggcctggtgtgctcagccctggaagcccaggccctgaaaaacgcacatccgtcgctgcaactggtgacaccgggtatccgtcctaccggcagcgcccaggatgaccagcgccgtatcctgaccccgcgccaggccctggatgcgggctctgactacctggtgatcggccggccgatcagccaggcggcggatcctgcaaaagcgttggcagcggtcgtcgccgagatcgcctgatttttagagtgagcaaaaaatgtgggagctggcttgcctgcgatagtatcaactcggtatcacttagaaaccgagttgcttgcatcgcaggcaagccagctcccacatttgtttttgtggtgtgtcagctgactttgagcaccaacttcccgaagttctcgccgttgaacagcttcatcagcgtttccgggaatgtctccagcccttcgacaatatcttccttgctcttgagcttgccctgggccatccagccggccatttcctgacccgccgccgcgaagttcgccgcgtggtccatcaccacaaagccttccatacgcgcacggttgaccagcaatgacaggtagttcgccgggcctttgaccgcttccttgttgttgtactggctgattgcaccgcaaatcaccacgcgggctttgagcgccaggcggctgagcaccgcgtcgagaatatcgccgccgacgttatcgaaatacacgtccacgcctttggggcactcgcgcttgagggcggcgggcacgtcttcgcttttgtagtcgatggcggcgtcgaagcccagctcatcgaccaggaacttgcacttctcggcgccaccggcgatccccactacgcgacagcctttgagcttagcgatctgcccggcgatgctgcccacggcaccggcggcgccggagatcaccacggtgtcaccggctttcggtgcgccggtctccagcagagcaaagtaggccgtcatgccggtcatgcccagggcggacaggtagcggggcaggggcgccagcttggggtccaccttatagaaaccacggggctcgccaaggaagtaatcctgcacgcccagtgcaccgttcacgtagtcccccaccgcgaagttcggatggttcgaggcaagcaccttgcctacgcccagggcgcgcatcacttcgccgatgcctaccggtgggatgtaggacttgccttcattcatccagccacgca   SEQID NO.1
                         表3-荧光假单胞菌ODCase氨基酸序列
  Met Ser Val Cys Gln Thr Pro Ile Ile Val Ala Leu Asp Tyr Pro Thr Arg Asp AlaAla Leu Lys Leu Ala Asp Gln Leu Asp Pro Lys Leu Cys Arg Val Lys Val GlyLys Glu Leu Phe Thr Ser Cys Ala Ala Glu Ile Val Gly Thr Leu Arg Asp LysGly Phe Glu Val Phe Leu Asp Leu Lys Phe His Asp Ile Pro Asn Thr Thr AlaMet Ala Val Lys Ala Ala Ala Glu Met Gly Val Trp Met Val Asn Val His CysSer Gly Gly Leu Arg Met Met Ser Ala Cys Arg Glu Val Leu Glu Gln Arg SerGly Pro Lys Pro Leu Leu Ile Gly Val Thr Val Leu Thr Ser Met Glu Arg GluAsp Leu Ala Gly Ile Gly Leu Asp Ile Glu Pro Gln Val Gln Val Leu Arg LeuAla Ala Leu Ala Gln Lys Ala Gly Leu Asp Gly Leu Val Cys Ser Ala Leu GluAla Gln Ala Leu Lys Asn Ala His Pro Ser Leu Gln Leu Val Thr Pro Gly IleArg Pro Thr Gly Ser Ala Gln Asp Asp Gln Arg Arg Ile Leu Thr Pro Arg GlnAla Leu Asp Ala Gly Ser Asp Tyr Leu Val Ile Gly Arg Pro Ile Ser Gln Ala AlaAsp Pro Ala Lys Ala Leu Ala Ala Val Val Ala Glu Ile Ala   SEQID NO.2
                               表4-荧光假单胞菌pryF核酸序列
  atgtccgtctgccagactcctatcatcgtcgccctggattaccccacccgtgacgccgcactgaagctggctgaccagttggaccccaagctttgccgggtcaaggtcggcaaggaattgttcaccagttgcgcggcggaaatcgtcggcaccctgcgggacaaaggcttcgaagtgttcctcgacctcaaattccatgacatccccaacaccacggcgatggccgtcaaagccgcggccgagatgggcgtgtggatggtcaatgtgcactgctccggtggcctgcgcatgatgagcgcctgccgcgaagtgctggaacagcgcagcggccccaaaccgttgttgatcggcgtgaccgtgctcaccagcatggagcgcgaagacctggcgggcattggcctggatatcgagccgcaggtgcaagtgttgcgcctggcagccctggcgcagaaagccggcctcgacggcctggtgtgctcagccctggaagcccaggccctgaaaaacgcacatccgtcgctgcaactggtgacaccgggtatccgtcctaccggcagcgcccaggatgaccagcgccgtatcctgaccccgcgccaggccctggatgcgggctctgactacctggtgatcggccggccgatcagccaggcggcggatcctgcaaaagcgttggcagcggtcgtcgccgagatcgcc   SEQID NO.3
可替换实施方案中，按照本发明的一种表达系统可以使用一种thyA营养缺陷的选择性标记。ThyA基因编码胸腺嘧啶核苷合成酶(EC 2.1.1.45)，细菌嘧啶核苷酸生物合成途径中所需要的一种酶。因为DNA包含胸腺嘧啶(5-甲基尿嘧啶)作为主要的碱基代替尿嘧啶，胸苷单磷酸酯的合成(dTMP或胸腺嘧啶核苷)对于提供dTTP(胸苷三磷酸酯)是必要的，dTTP与dATP，dGTP和dCTP一起是DNA复制所必需的。通过胸腺嘧啶核苷合成酶的作用对dUMP进行甲基化使用5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶作为甲基基团的来源产生胸腺嘧啶核苷。胸腺嘧啶核苷的合成可以通过除去，抑制，或者分解胸腺嘧啶核苷合成酶来中断，并且因此DNA的合成被限制。
在细菌中其中这种thyA基因已经成为失去活性的或者丢失的，或者变异为编码一种非功能的酶，如果向培养基中加入了外源的胸腺嘧啶则这种细胞还可以生长。
在荧光假单胞菌中，加入编码胸苷激酶大肠杆菌tdk基因，，是必需的以在外源的胸苷上生存。因此，在选择之前，包含一种tdk基因的质粒可以用于转化thyA(-)假单胞菌宿主细胞，来生产thyA(-)/ptdk细胞，允许在含有胸苷的培养基上生长。可以选择地，产生一种使用外源胸苷的功能性胸腺嘧啶核苷合成酶的tdk基因可以插入到荧光假单胞菌的基因组中，生产一种thyA(-)/ptdk(+)宿主细胞。在含有thyA基因的DNA构建体被转染到thyA(-)/ptdk细胞中并且表达形成一种功能性的胸腺嘧啶核苷合成酶后，获得结合了thyA(+)质粒的宿主细胞系统可以在一种缺乏胸苷的培养基上供养。
在假单胞菌或相关的宿主细胞中使用的thyA基因的编码序列可以通过任意的编码胸腺嘧啶核苷合成酶(“TS”)的基因来提供，假如这种编码序列可以在选择的假单胞菌或者相关的宿主细胞被转录，翻译，和其它的过程来形成一种功能性的TS。这种thyA基因可以是一种天然的序列，或者它可以是一种工程序列，例如，来自于使用本领域中已知的序列-改变，序列-联合，和/或序列产生技术。在使用thyA选择标记基因的部分之前，这种选择的编码基因可以首先按照选择的假单胞菌或者相关宿主细胞的遗传密码和/或密码子使用频率进行改进和优化。表达的密码序列可以可操作地连接到在宿主细胞中起作用的转录子调控子上，以及其它需要的转录和翻译调控序列。如上所述的原始编码序列可以从细菌或者从任意的生物体获得，如果它符合上面提到的需要。
一个实施方案中，thyA编码序列分离自假单胞菌或者相关的宿主细胞在其中它将被作为一种选择标记。完整的thyA基因(包括编码的序列和周围的调控区域)可以从中分离得到。特定实施方案中，提供thyA基因或者编码序列的细菌可以选自假单胞菌目中的一员，假单胞菌亚目中的一员，假单胞菌科中的一员，假单胞菌族中的一员，假单胞菌属中的一员，以及荧光假单胞菌种中的一员(也就是，“荧光假单胞菌”)。特定实施方案中，细菌可以属于荧光假单胞菌种。
特定实施方案中，thyA基因包含SEQ ID NO.4(表5)的核酸序列。可以选择地，这种被thyA基因编码的TS包含SEQ ID NO.5(表6)的氨基酸序列，其突变体，或者一种与之相比具有一个冗余密码子序列的突变体，按照本发明所述的给定宿主细胞中所使用的遗传密码。
                           表5.-荧光假单胞菌thyA核酸序列
  atgaagcaatatctcgaactactgaacgacgtcgtgaccaatggattgaccaagggcgatcgcaccggcaccggcaccaaagccgtatttgcccgtcagtatcggcataacttggccgacggcttcccgctgctgaccaccaagaagcttcatttcaaaagtatcgccaacgagttgatctggatgttgagcggcaacaccaacatcaagtggctcaacgaaaatggcgtgaaaatctgggacgagtgggccaccgaagacggcgacctgggcccggtgtacggcgagcaatggaccgcctggccgaccaaggacggcggcaagatcaaccagatcgactacatggtccacaccctcaaaaccaaccccaacagccgccgcatcctgtttcatggctggaacgtcgagtacctgccggacgaaaccaagagcccgcaggagaacgcgcgcaacggcaagcaagccttgccgccgtgccatctgttgtaccaggcgttcgtgcatgacgggcatctgtcgatgcagttgtatatccgcagctccgacgtcttcctcggcctgccgtacaacaccgccgcgttggccttgctgactcacatgctggctcagcaatgcgacctgatccctcacgagatcatcgtcaccaccggcgacacccatgcttacagcaaccacatggaacagatccgcacccagctggcgcgtacgccgaaaaagctgccggaactggtgatcaagcgtaaacctgcgtcgatctacgattacaagtttgaagactttgaaatcgttggctacgacgccgacccgagcatcaaggctgacgtggctatctga   SEQID NO.4
                               表6.-荧光假单胞菌TS氨基酸序列
  MKQYLELLNDVVTNGLTKGDRTGTGTKAVFARQYRHNLADGFPLLTTKKLHFKSIANELIWMLSGNTNIKWLNENGVKIWDEWATEDGDLGPVYGEQWTAWPTKDGGKINQIDYMVHTLKTNPNSRRILFHGWNVEYLPDETKSPQENARNGKQALPPCHLLYQAFVHDGHLSMQLYIRSSDVFLGLPYNTAALALLTHMLAQQCDLIPHEIIVTTGDTHAYSNHMEQIRTQLARTPKKLPELVIKRKPASIYDYKFEDFEIVGYDA DPSIKADVAI   SEQID NO.5
生物合成的氨基酸选择标记
在一个可选择的实施方案中，选择作为营养缺陷选择标记的合成代谢中的生物合成酶可以选择自那些氨基酸生物合成中的酶。特定实施方案中，生物合成的氨基酸酶选自的组包括以下氨基酸的生物合成活性中的酶：谷氨酸家族(Glu；Gln，Pro，和Arg)；天冬氨酸家族(Asp；Asn，Met，Thr，Lys和Ile)；丝氨酸家族(Ser，Gly和Cys)；丙酮酸家族(Ala，Val，和Leu)；芳香家族(Trp，Phe，和Tyr)；和组氨酸家族(His)。在这些生物合成路径中的基因和酶的例子包括：谷氨酸家族成员arg，gdh，gln，和pro基因，包括，例如，argA-argH，gdhA，glnA，proA，proC；天冬氨酸家族成员asd，asn，asp，dap，lys，met，和thr基因，包括，例如，asnA，asnB，aspC，dapA，dapB，dapD-dapF，lysA，lysC，metA-metC，metE，rnetH，metL，thrA-thrC；丝氨酸家族成员cys，gly和ser基因，包括，例如，cysE，cysK，glyA，serA-serC；芳香家族成员aro，phe，trp，和tyr基因，包括，例如，aroA-aroH，aroK，aroL，trpAtrpE，tyrA，和tyrB；以及组氨酸家族成员his基因，包括hisA-hisD，hisF-hisH。
进一步的特定实施方案中，营养缺陷选择标记可以选自谷氨酸族成员的生物合成中的酶。所使用的谷氨酸族营养缺陷的选择标记的例子包括下面的，列举的有代表性的它们的编码基因：argA，编码N-乙酰化谷氨酸合成酶，氨基酸乙酰化转移酶；argB，编码乙酰化谷氨酸激酶；argC，编码N-乙酰化-γ谷氨酸磷酸还原酶；argD，编码乙酰鸟氨酸Δ-氨基转移酶；argE，编码乙酰鸟氨酸脱酰基酶；argF和argI，编码鸟氨酸氨甲酰转移酶；argG，编码精氨酸代琥珀酸合成酶；argH，编码精氨酸代琥珀酸裂解酶；gdhA，编码谷氨酸脱氢酶；glnA，编码谷氨酸合成酶；proA，编码γ-谷氨酸磷酸还原酶；proB，编码γ-谷氨酸激酶；和proC，编码吡咯啉-5-羧化物还原酶。
一个实施方案中，一种氨基酸生物合成选择标记基因可以是脯氨酸生物合成族的至少一个成员，特别是proA，proB，或proC。特定实施方案中，这种脯氨酸生物合成选择标记基因可以包括一种proC基因。proC基因编码一种酶催化脯氨酸生物合成途径的最后一步。在细菌中，脯氨酸(也就是，L-脯氨酸)生物合成途径包含一个三-酶步骤，起始于L-谷氨酸。这一过程的步骤为：1)L-谷氨酸转化成L-谷氨酸-5-磷酸，通过谷氨酸-5-激酶(“GK”；EC 2.7.2.11)，由proB编码；随后2a)转化成L-谷氨酸-5-半醛，通过谷氨酸-5-半醛脱氢酶(EC 1.2.1.41)，也称为谷氨酸-5-磷酸还原酶(“GPR”)，由proA编码，进而进行2b)它们的自发的环化作用形成1-吡咯啉-5-羧酸酯；并且随后3)转化成L-脯氨酸，通过Δ1-吡咯啉-5-羧化物还原酶(“P5CR”；EC 1.5.1.2)，由proC编码。在大多数细菌中，编码P5CR亚基的proC，具有活性的它的人类-多聚体形式的P5CR酶。
在细菌中其中一种或者多种proA，proB，或proC基因已经失去活性或者丢失，或者突变成为编码一种非功能的酶，如果向培养基中添加脯氨酸则这种细胞也可以生长。因此，一种proC(-)假单胞菌或者相关的细胞可以维持在一种含有脯氨酸的培养基上。在将含有proC基因的DNA构建体转染到proC(-)细胞并且表达形成一种功能的P5CR酶，得到的结合的proC(+)质粒宿主细胞系统可以在一种缺少脯氨酸的培养基上供养。
在假单胞菌或者相关的宿主细胞中使用的ProC基因的编码序列可以通过任意的编码Δ1-吡咯啉-5-羧化物还原酶(P5CR)的基因来提供，如果这种编码序列可以被选择的宿主细胞或者相关的宿主细胞转录，翻译，和其它的过程来形成功能性的P5CR。这种proC编码序列可以是天然的序列，或者它可以是一种工程化的序列来自于，例如，使用本领域已知的一种或者多种序列-修改，序列-结合，和/或序列生成技术。在使用作为proC选择标记基因一部分之前，这种选择的编码序列可以按照所选择的假单胞菌或者相关的宿主细胞的遗传密码和/或密码子使用频率进行改良或优化。可以表达的密码组列可以操作性地连接到可以在选择的细胞中起作用的转录启动子，以及所有其它的需要的转录和翻译调控序列。一种前面描述的天然的proC基因密码子序列可以从一种细菌或者任意的其它生物体中获得，如果它符合上面描述的条件。
一个实施方案中，这种proC编码序列分离自假单胞菌或相关的宿主细胞其中它可以被用作一种选择标记。完整的proC基因(包括编码序列和周围的调控区域)可以从它们中分离出来。特定实施方案中，一种提供proC基因或编码序列的细菌可以选自的组包括假单胞菌目中的一员，假单胞菌亚目中的一员，假单胞菌科中的一员，假单胞菌族中的一员，假单胞菌属中的一员，和荧光假单胞菌种组中的一员(也就是，“荧光假单胞菌”)。特定实施方案中，这种细菌属于这种品种，荧光假单胞菌。
特定实施方案中，proC基因包含SEQ ID NO.6(表7)的核酸序列，或者它的突变体。可以选择地，由proC基因编码的P5CR包含SEQ ID NO.7(表8)的氨基酸序列，它的突变体，或者一种与其相比具有冗余密码子序列的突变体，按照本发明所述的指定宿主细胞中使用的遗传密码。
可以选择地，这种proC基因包含编码一种P5CR酶的核酸序列，其与SEQ IDNo.6具有至少70％，75％，80％，85％，88％，90％，和95％的同源性。同样地，编码ODCase的proC基因与SEQ ID No.7具有至少70％，75％，80％，85％，88％，90％，和95％的同源性。
另一个实施方案中，proC基因可以包含一种编码序列其与SEQ.ID NO.8(表9)的核酸序列具有至少90％，93％，95％，96％，97％，98％或99％的同源性。
特定实施方案中，proC可以包含一种编码序列，其具有可以与SEQ ID NO.8的反密码子序列杂交的密码子序列，当在高严格杂交条件下进行杂交的时候，或者可以具有一种与之相比冗余的密码子序列。特别优选的实施方案中，proC基因可以包含SEQ ID NO.8的核酸序列。
                            表.7-荧光假单胞菌proC核酸序列
  gcccttgagttggcacttcatcggccccattcaatcgaacaagactcgtgccatcgccgagcacttcgcttgggtgcactccgtggaccgcctgaaaatcgcacaacgcctgtccgaacaacgcccggccgacctgccgccgctcaatatctgcatccaggtcaatgtcagtggcgaagccagcaagtccggctgcacgcccgctgacctgccggccctggccacagcgatcagcgccctgccgcgcttgaagctgcggggcttgatggcgattcccgagccgacgcaagaccgggcggagcaggatgcggcgttcgccacggtgcgcgacttgcaagccagcttgaacctggcgctggacacactttccatgggcatgagccacgaccttgagtcggccattgcccaaggcgccacctgggtgcggatcggtaccgccctgtttggcgcccgcgactacggccagccgtgaaatggctgacatccctcgaaataaggacctgtcatgagcaacacgcgtattgcctttatcggcgccggtaacatggcggccagcctgatcggtggcctgcgggccaagggcctggacgccgagcagatccgcgccagcgaccccggtgccgaaacccgcgagcgcgtcagagccgaacacggtatccagaccttcgccgataacgccgaggccatccacggcgtcgatgtgatcgtgctggcggtcaagccccaggccatgaaggccgtgtgcgagagcctgagcccgagcctgcaaccccatcaactggtggtgtcgattgccgctggcatcacctgcgccagcatgaccaactggctcggtgcccagcccattgtgcgctgcatgcccaacaccccggcgctgctgcgccagggcgtcagcggtttgtatgccactggcgaagtcaccgcgcagcaacgtgaccaggcccaggaactgctgtctgcggtgggcatcgccgtgtggctggagcaggaacagcaactggatgcggtcaccgccgtctccggcagcggcccggcttacttcttcctgttgatcgaggccatgacggccgcaggcgtcaagctgggcctgccccacgacgtggccgagcaactggcggaacaaaccgccctgggcgccgccaagatggcggtcggcagcgaggtggatgccgccgaactgcgccgtcgcgtcacctcgccaggtggtaccacacaagcggctattgagtcgttccaggccgggggctttgaagccctggtggaaacagcactgggtgccgccgcacatcgttcagccgagatggctgagcaactgggcaaatagtcgtcccttaccaaggtaatcaaacatgctcggaatcaatgacgctgccattttcatcatccagaccctgggcagcctgtacctgctgatcgtactgatgcgctttatcctgcaactggtgcgtgcgaacttctacaacccgctgtgccagttcgtggtgaaggccacccaaccgctgctcaagccgctgcgccgggtgatcccgagcctgttcggcctggacatgtcgtcgctggtgctggcgctgttgctgcagattttgctgttcgtggtgatcctgatgctcaatggataccaggccttcaccgtgctgctgttgccatggggcctgatcgggattttctcgctgttcctgaagatcattttctggtcgatgatcatcagcgtgatcctgtcctgggtcgcaccgggtagccgtagcccgggtgccgaattggtggctcagatcaccgagccggtgctggcacccttccgtcgcctgattccgaacctgggtggcctggatatctcgccgatcttcgcgtttatc   SEQID NO.6
                          表.8-荧光假单胞菌P5CR氨基酸序列
  Met Ser Asn Thr Arg Ile Ala Phe Ile Gly Ala Gly Asn Met Ala Ala Ser LeuIle Gly Gly Leu Arg Ala Lys Gly Leu Asp Ala Glu Gln Ile Arg Ala Ser AspPro Gly Ala Glu Thr Arg Glu Ar g Val Arg Ala Glu His Gly Ile Gln Thr PheAla Asp Asn Ala Glu Ala Ile His Gly Val Asp Val Ile Val Leu Ala Val LysPro Gln Ala Met Lys Ala Val Cys Glu Ser Leu Ser Pro Ser Leu Gln Pro HisGln Leu Val Val Ser Ile Ala Ala Gly Ile Thr Cys Ala Ser Met Thr Asn TrpLeu Gly Ala Gln Pro Ile Val Arg Cys Met Pro Asn Thr Pro Ala Leu LeuArg Gln Gly Val Ser Gly Leu Tyr Ala Thr Gly Glu Val Thr Ala Gln GlnArg Asp Gln Ala Gln Glu Leu Leu Ser Ala Val Gly Ile Ala Val Trp LeuGlu Gln Glu Gln Gln Leu Asp Ala Val Thr Ala Val Ser Gly Ser Gly ProAla Tyr Phe Phe Leu Leu Ile Glu Ala Met Thr Ala Ala Gly Val Lys LeuGly Leu Pro His Asp Val Ala Glu Gln Leu Ala Glu Gln Thr Ala Leu GlyAla Ala Lys Met Ala Val Gly Ser Glu Val Asp Ala Ala Glu Leu Arg ArgArg Val Thr Ser Pro Gly Gly Thr Thr Gln Ala Ala Ile Glu Ser Phe Gln AlaGly Gly Phe Glu Ala Leu Val Glu Thr Ala Leu Gly Ala Ala Ala His ArgSer Ala Glu Met Ala Glu Gln Leu Gly Lys   SEQID NO.7
                           表.9-荧光假单胞菌proC核酸序列
  atgagcaacacgcgtattgcctttatcggcgccggtaacatggcggccagcctgatcggtggcctgcgggccaagggcctggacgccgagcagatccgcgccagcgaccccggtgccgaaacccgcgagcgcgtcagagccgaacacggtatccagaccttcgccgataacgccgaggccatccacggcgtcgatgtgatcgtgctggcggtcaagccccaggccatgaaggccgtgtgcgagagcctgagcccgagcctgcaaccccatcaactggtggtgtcgattgccgctggcatcacctgcgccagcatgaccaactggctcggtgcccagcccattgtgcgctgcatgcccaacaccccggcgctgctgcgccagggcgtcagcggtttgtatgccactggcgaagtcaccgcgcagcaacgtgaccaggcccaggaactgctgtctgcggtgggcatcgccgtgtggctggagcaggaacagcaactggatgcggtcaccgccgtctccggcagcggcccggcttacttcttcctgttgatcgaggccatgacggccgcaggcgtcaagctgggcctgccccacgacgtggccgagcaactggcggaacaaaccgccctgggcgccgccaagatggcggtcggcagcgaggtggatgccgccgaactgcgccgtcgcgtcacctcgccaggtggtaccacacaagcggctattgagtcgttccaggccgggggctttgaagccctggtggaaa cagca ctg ggtgc cg ccgcac atcgttcagcc gagatggctgagcaact gggcaaa   SEQID NO.8
使用选择标记
一个实施方案中，一种包含在代谢物中的分解利用的酶可以选择作为营养缺陷的选择标记。特别是，这种酶可以选自那些碳源的利用中的酶。这种酶的例子包括，例如，蔗糖酶，乳糖酶，麦芽糖酶，淀粉分解代谢酶，糖元分解代谢酶，纤维素酶，和聚合(羟基链烷酸酯(hydroxyalkanoate))解聚酶。如果这种细菌宿主细胞表现出选择的类型的天然的分解代谢活性，它可以在营养缺陷-回复载体的转化之前被敲除。对这些化合物表现出天然的营养缺陷的细菌也可以按照它们的原始形态来用作这种转化。在那些实施方案中其中不能被引进或者不能扩散到细胞中的化合物可以被选择和提供给培养基，原养回复(prototrophy restoring)或者原养能力(prototrophy-enabling)的酶可以被分泌来使用。在这种情况下，选择的酶可以在细胞外降解这种化合物来生产更小的化合物，例如葡萄糖，其可以散播或者进口到细胞中，通过选择或者设计这种酶的密码子序列来包括一种可以在所选择的宿主细胞中起作用的分泌信号肽的编码序列。在这些实施方案中，这种原养回复基因可以被选择或着被设计成包括一种可以在所选择的宿主细胞中起作用的分泌信号肽的编码序列来实现这种酶在细胞质膜上的转移。在这些实施方案中的另一个中，或者那些其中所选择的化合物可以在引进或者扩散进细胞中，这种细胞可以在不提供除选择的化合物外没有其它的碳源的培养基上生长。
在碳源-利用-基础的标记系统中，每一种原养回复或者原养能力的碳源利用酶可以包含在单一碳源的利用中。例如，来自同一分解代谢途径的两种基因可以在一种载体上一起进行表达或者可以分别在不同的载体上进行共表达从而提供原养。这种多基因碳源利用基础的标记系统的特定的实施例包括，例如，使用糖元作为单一的碳源，具有糖元磷酸化酶和(α-1，4)葡聚糖转移酶的转基因表达；并且使用淀粉作为单一的碳源，具有α-淀粉酶，和α(1-＞6)-葡萄糖苷酶两种酶的转基因表达。但是，选择的单一-或多-基因碳源标记系统可以在宿主细胞中与其它的标记系统一起使用，如果提供给细胞的单一碳源是选择的在碳源分解代谢选择标记系统中的使用的化合物。
生化-利用-型活性的有用的酶的其它的实施例是本领域所公知的，并且可以包括消旋酶和差向异构酶，其可以转化提供给细胞的非-利用的D-碳源为营养的L-碳源。这些系统的实施例包括，例如：D-酸或D-酰基化合物与相关的消旋酶的转基因表达一起使用；并且乳酸盐和转基因表达的乳酸消旋酶一起使用。
相似地，其中氨基酸生物合成活性被选择在标记系统中使用，这种营养缺陷体也可以通过向这种细胞提供一种不可利用的R-氨基酸和一种R-氨基酸消旋酶或者差向异构酶(EC 5.1.1)而被克服，消旋酶或者差向异构酶可以为这种营养缺陷型的细胞将R-氨基酸转化成相关的L-氨基酸在。
特性堆积
按照本发明也可以对一种宿主细胞进行大量的表型的改变，在插入一种营养缺陷的选择标记基因之前或之后，来实现目标基因的表达。例如，这种细胞可以是遗传工程化的，或者是同时进行地或者按次序地，来表现大量的增强的表型特点，这一过程被称为“特性堆积”(trait stacking)。pryF删除可以作为这种表型的特性之一。在这样一个菌株中，pyrF基因，按照本发明，可以被用作一种自毁的载体，即可作为选择的标记又可作为反向选择的标记(在提供5’-氟乳清酸下)从而实现与其它的所需特性插入/删除的等位基因交换，因此，按照本发明pyrF基因可以在宿主细胞中的“特性堆积”过程中进行使用。在这种过程中，包含这种pyrF基因的自毁载体可以在这种宿主细胞菌株中在大量的分离转化中进行转化；在每一个这种程序中所重新建立的pyrF显型可以用于生产，无限地，进一步遗传地提高的表型改变。因此，不仅pyrF基因自身可以提供一种特性，它可以在特性-堆积过程中用作获得另外的显型特性。
一个实施方案中，本发明提供了营养缺陷的假单胞菌和相关的细菌其已经进一步地基因修饰来引起额外的营养缺陷。例如，pyrF(-)营养缺陷可以进一步修饰来使在合成代谢或者分解代谢途径中的另一种生物合成酶失去活性，例如通过将proC基因或thyA基因失去活性。在这种方法中，在宿主细胞中可以产生多个营养缺陷。
另一个实施方案中，可以对宿主细胞进行基因改变来对宿主细胞中的重组多肽表达进行改善。进一步修饰可以包括遗传改变其允许更有效的利用一种特定的碳源，因此优化这种整个的发酵的全功效。
特定实施方案中，营养缺陷的宿主细胞可以通过向宿主染色体中插入一种包含lacI转基因来进一步修饰。优选地，这种lacI转基因，或者它的突变体，不同于整体的一部分或者截断的含有PlacI-lacI-lacZYA构建体的结构基因。
诱导营养缺陷的修饰
选择作为本发明所述的表达系统中使用的假单胞菌或相关的宿主细胞在它的能力上不能表达任意的表现选择的营养缺陷活性的功能性生物催化剂。例如，这里选择的是乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶(orotodine-5’-phosphate decarboxylase)活性，宿主细胞在它的能力上不能表达a)任意的pyrF基因产物(也就是任意的功能性ODCase酶)，和b)任意的有效的替换(也就是任意的其它具有ODCase活性的生物催化剂)。一个实施方案中，这种宿主细胞通过改变它的染色体基因而制成对于选择的活性生物催化-无效的，因此这种细胞不能从它的染色体表达在目标的营养缺陷体(也就是ODCase)中使用一种功能性的酶的。换句话，这种原养型的细胞(活性(+)细胞)将通过“敲除”目标的原养型的途径(也就是一种活性(-)细胞)中的功能性酶的编码基因来实现成为营养缺陷。这种改变可以通过改变细胞中的编码所选择活性的基因的染色体编码序列来实现。一个实施方案中，这种编码序列改变可以通过诱导来实现：插入或删除突变，其改变编码序列的阅读框；替换或者倒置突变其改变密码子的足够数量；和/或删除突变，其从可以生产一种无功能性的酶中删除了足够大组(sufficiently large group)的连续密码子。
一个实施方案中其中这种宿主细胞菌株也已经提供了营养缺陷基因来作为选择标记使用，优选地选择的基因的转录启动子和转录终止子序列中的每一个也可以通过诱导突变而失去活性，包括删除突变。例如，除了上面所述的编码序列改变外转录序列失活可以随意地进行。一个实施方案中，其中宿主细胞菌株也可以提供营养缺陷的选择标记基因，所有的选择基因的DNA可以从宿主细胞染色体中删除。
这种敲除的菌株可以按照本领域中已知的认为有效的任意不同的方法来制备。例如，含有同源的目标基因序列所需的的5′和3′端删除的核酸序列的同源编码载体可以被转化到宿主细胞中。理想地，一旦同源重组体，可以生产一种所需的目标酶基因敲除。
基因敲除方法的特定实施例包括，例如：通过前面已经描述的一种多聚核苷酸的插入来使基因失活。参考，例如，DL Roeder和A Coller，Marker-exchangemutagenesis of a pectate lyase isozyme gene in Erwinia chrysanthemi，J Bacteriol.164(1)：51-56(1985)。可以选择地，对于所需的显型(例如不能代谢安息香酸盐或氨基苯甲酸盐)的转位子突变形成和选择可以被用于分离细菌菌株其中目标基因已经通过插入而失活。参考，例如，K Nida和PP Cleary，Insertional inactivation ofstreptolysin S expression in Streptococcus pyogenes，J Bacteriol.155(3)：1156-61(1983)。在特定的基因中特定的突变或删除可以使用盒突变来进行构建，例如，如JA Wells等人所描述的，Cassette mutagenesis：an efficient method for generation ofmultiple mutations at defined sites，Gene 34(2-3)：315-23(1985)；在一种基因的选择的部分上进行定点的或者随意的突变，并且随后通过同源性重组体组合到基因的染色体拷贝中。
一个实施方案中，得到选择标记基因的生物体或者使用这种选择标记基因的宿主细胞可以选自一种原核生物。特定实施方案中，得到选择标记基因的生物体或者使用这种选择标记基因的宿主细胞可以选自一种细菌。另一个实施方案中，得到选择标记基因的细菌或者使用这种选择标记基因的细菌宿主细胞，将可以选自变形杆菌。另一个实施方案中，得到选择标记基因的细菌或者使用这种选择标记基因的细菌宿主细胞，可以选自假单胞菌和紧密相关的细菌或者来自于它的亚群，如下面所描述的。
特定实施方案中，选择标记基因来源的生物体和宿主细胞可以选自相同的种。优选地，该种可以是原核生物；更优选是一种细菌，进一步优选一种变形杆菌。在另一特定实施方案中，选择标记基因来源的生物体或者宿主细胞可以选自假单胞菌和紧密相关的细菌或者来自于它的亚群的属相同的种，如下面定义的。一个实施方案中，选择标记基因来源的生物体或者宿主细胞可以选自一个假单胞菌属的种，特别是荧光假单胞菌的种，并且优选是荧光假单胞菌生物型A的种。
                          III.LACI插入
本发明提供了假单胞菌和相关的细胞其已经进行了基因修饰来包含不同于整体的一部分或者截断的PlacI-lacI-lacZYA操纵子的lacI转基因或者衍生物的染色体插入。一个实施方案中，lacI插入提供了严紧的表达载体调控，通过LacI抑制蛋白的表达其在这个载体上结合了lacO序列或衍生物，并且抑制了载体上的Plac-Ptac家族启动子。结果是在诱导前重组多肽表达的基础水平降低了。
一个实施方案中，提供含有一种天然的大肠杆菌lacI基因的染色体插入，或者lacI基因衍生物例如lacIQ或lacIQI假单胞菌宿主细胞，其中这种lacI插入不是作为整体的一部分或者截断的含有PlacI-lacI-lacZYA构建体的结构基因。在本发明中使用的其它lacI转基因的衍生物包括：已经改变了密码子序列不同于天然的lacI基因的lacI衍生物(例如，含有一种“gtg”起始密码子的天然的大肠杆菌lacI基因，并且这可以被一种可以替换的在所选择表达载体细胞中可以有效的起始翻译的起始密码子替换，例如“atg”)；lacI衍生物，其编码具有突变的氨基酸序列的LacI蛋白，包括温度-敏感性lacI突变体，例如其被lacIts(或“lacI(Ts)”)编码，其对应于一种温度的变更来获得目标基因诱导，例如，升高到42℃(参考，例如，Bukrinsky etal.，Gene 70：415-17(1989)；N Hasan & W Szybalski，Gene 163(1)：35-40(1995)；H Adari etal.，DNA Cell Biol.14：945-50(1995))；lacI突变体对应于提供可选择的蔗糖代替乳糖来实现诱导，例如，树胶醛糖，核糖，或者半乳糖(参考，例如，WO 99/27108对于具有改变的敏感度的Lac抑制蛋白)；以及LacI突变体，其表现出至少野生型的结合到lac操纵基因的能力，但是提高了对于一种诱导物的敏感度(例如，IPTG)，或者其表现出提高的连接到lac操纵基因的能力，但是至少野生型的去抑制能力(参考，例如，L Swint-Kruse et al.，Biochemistry 42(47)：14004-16(2003))。
特定实施方案中，编码Lac抑制蛋白的基因插入到染色体中与天然的大肠杆菌lacI基因相同，并且具有SEQ ID NO.9(表10)的核酸序列。另一个实施方案中，插入到宿主染色体中的基因编码Lac抑制蛋白，其具有SEQ ID NO.10(表11)的氨基酸序列。
                      表10-天然大肠杆菌lacI基因的核酸序列
  Gacaccatcgaatggcgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattcagggtggtgaatgtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttatcagaccgtttcccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaaaagtggaagcggcgatggcggagctgaattacattcccaaccgcgtggcacaacaactggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgccacctccagtctggccctgcacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgggtgccagcgtggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggtgcacaatcttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgccattgctgtggaagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacacccatcaacagtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagcatctggtcgcattgggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcgtctggctggctggcataaatatctcactcgcaatcaaattcagccgatagcggaacgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaaatgctgaatgagggcatcgttcccactgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgctgggcgcaatgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggatatctcggtagtgggatacgacgataccgaagacagctcatgttatatcccgccgtcaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacggattcactggccgtcgttttacaacgtcgtga   SEQID NO.9
                     表.11-LacI阻遏物的氨基酸序列
  Met Lys Pro Val Thr Leu Tyr Asp Val Ala Glu Tyr Ala Gly ValSer Tyr Gln Thr Val Ser Arg Val Val Asn Gln Ala Ser His ValSer Ala Lys Thr Arg Glu Lys Val Glu Ala Ala Met Ala Glu LeuAsn Tyr Ile Pro Asn Arg Val Ala Gln Gln Leu Ala Gly Lys GlnSer Leu Leu Ile Gly Val Ala Thr Ser Ser Leu Ala Leu His AlaPro Ser Gln Ile Val Ala Ala Ile Lys Ser Arg Ala Asp Gln LeuGly Ala Ser Val Val Val Ser Met Val Glu Arg Ser Gly Val GluAla Cys Lys Ala Ala Val His Asn Leu Leu Ala Gln Arg Val SerGly Leu Ile Ile Asn Tyr Pro Leu Asp Asp Gln Asp Ala Ile AlaVal Glu Ala Ala Cys Thr Asn Val Pro Ala Leu Phe Leu Asp ValSer Asp Gln Thr Pro Ile Asn Ser Ile Phe Ser His Glu Asp GlyThr Arg Leu Gly Val Glu His Leu Val Ala Leu Gly His Gln GlnIle Ala Leu Leu Ala Gly Pro Leu Ser Ser Val Ser Ala Arg LeuArg Leu Ala Gly Trp His Lys Tyr Leu Thr Arg Asn Gln Ile GlnPro Ile Ala Glu Arg Glu Gly Asp Trp Ser Ala Met Ser Gly PheGln Gln Thr Met Gln Met Leu Asn Glu Gly Ile Val Pro Thr AlaMet Leu Val Ala Asn Asp Gln Met Ala Leu Gly Ala Met Arg AlaIle Thr Glu Ser Gly Leu Arg Val Gly Ala Asp Ile Ser Val ValGly Tyr Asp Asp Thr Glu Asp Ser Ser Cys Tyr Ile Pro Pro SerThr Thr Ile Lys Gln Asp Phe Arg Leu Leu Gly Gln Thr Ser ValAsp Arg Leu Leu Gln Leu Ser Gln Gly Gln Ala Val Lys Gly AsnGln Leu Leu Pro Val Ser Leu Val Lys Arg Lys Thr Thr Leu AlaPro Asn Thr Gln Thr Ala Ser Pro Arg Ala Leu Ala Asp Ser LeuMet Gln Leu Ala Arg Gln Val Ser Arg Leu Glu Ser Gly Gln   SEQIDNO.10
可替换实施方案中，插入的lacI转基因是天然大肠杆菌lacI基因的衍生物。特定实施方案中，lacI衍生的基因是具有SEQ ID NO.11(表12)的核酸序列的lacIQ基因。LacIQ突变体与天然的大肠杆菌lacI基因是同一的除了在启动子的-35区域具有单一的点突变，其在大肠杆菌中10倍地增加了lacI阻遏物的水平。参见，例如，MP Calos，Nature 274(5673)：762-65(1978)。
                          表.12-LacIQ基因的核酸序列
  gacaccatcgaatggtgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattcagggtggtgaatgtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttatcagaccgtttcccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaaaagtggaagcggcgatggcggagctgaattacattcccaaccgcgtggcacaacaactggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgccacctccagtctggccctgcacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgggtgccagcgtggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggtgcacaatcttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgccattgctgtggaagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacacccatcaacagtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagcatctggtcgcattgggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcgtctggctggctggcataaatatctcactcgcaatcaaattcagccgatagcggaacgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaaatgctgaatgagggcatcgttcccactgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgctgggcgcaatgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggatatctcggtagtgggatacgacgataccgaagacagctcatgttatatcccgccgtcaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacggattcactggccgtcgttttac   SEQIDNO.11
另一个实施方案中，lacI衍生基因是具有SEQ ID NO.12(表13)核酸序列的lacIQI基因。LacIQI突变具有一个重排，其取替了与大肠杆菌-35区域保守序列严格匹配的-35区域的核酸序列，产生的表达其比大肠杆菌中的原始启动子高出100倍。参见，例如，MP Colas & JH Miller，Mol.& Gen.Genet.183(3)：559-60(1980)。
                           表.13-LacIQI基因的核酸序列
  agcggcatgcatttacgttgacaccacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattcagggtggtgaatgtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttatcagaccgtttcccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaaaagtggaagcggcgatggcggagctgaattacattcccaaccgcgtggcacaacaactggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgccacctccagtctggccctgcacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgggtgccagcgtggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggtgcacaatcttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgccattgctgtggaagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacacccatcaacagtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagcatctggtcgcattgggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcgtctggctggctggcataaatatctcactcgcaatcaaattcagccgatagcggaacgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaaatgctgaatgagggcatcgttcccactgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgctgggcgcaatgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggatatctcggtagtgggatacgacgataccgaagacagctcatgttatatcccgccgtcaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacggattcactggccgtcgttttac   SEQIDNO.12
本发明中，宿主细胞染色体可以通过插入至少一种含有至少一个编码LacI蛋白基因的拷贝的核酸序列，这种基因可以被细胞所使用来，优选地，组成地表达编码的LacI蛋白，并且含有这种基因的多聚核苷酸不是PlacI-lacI-lacZYA核酸序列(也就是PlacI-lacl-lacZYA操纵子的Plac(-)变体)或者PlacI-lacI-lacZ多聚核苷酸(也就是一种包含这种Plac(-)操纵子的一部分的结构的lac利用操纵子基因，例如至少部分地截断的PlacI-lacI-lacZYA核酸序列变体)。
编码选择的LacI蛋白的基因优选组成型地表达。这可以通过任意在所选择的表达宿主细胞中是组成型表达的启动子来完成。例如，一种天然的大肠杆菌PlacI可以操作地连接到选择的lacI编码基因，或者不同的组成型表达启动子可以操作性地连接到其上。在一些情况下，一种调控的启动子可以被使用，如果这种调控的启动子在整个发酵过程中维持一种状态其中LacI蛋白在那里是连续表达的。在一个特定的实施方案中，本发明中使用的是一种lac或tac家族启动子，包括Plac，Ptac，Ptrc，PtacII，PlacUV5，lpp-Plac W5，lpp-lac，nprM-lac，T7lac，T5lac，T3lac，和Pmac。
染色体组插入位点
染色体插入可以按照本领域中已知的任意技术来完成。例如，参考：DS Toder，″Gene replacement in Pseudomonas aeruginosa，″Methods in Enzymology 235：466-74(1994)；和J Quandt & MF Hynes，″Versatile suicide vectors which allow direct selectionfor gene replacement in Gram negative bacteria，″Gene 127(1)：15-21(1993)。转位子插入技术例如是本领域中所公知的，随着选择，也可以被使用；参考，例如，IYGoryshin & WS Reznikoff，″Tn5 in vitro transposition，″Journal of Biological Chemistry273(13)：7367-74(1998)。可选择地，通过(非裂解的)噬菌体转化实现的基因转染也可以被用作染色体插入；参考，例如，JH Miller，Experiments in MolecularGenetics(1972)(Cold Spring Harbor Lab.，NY)。
在细菌表达宿主细胞染色体中的位点，其对插入了lacI基因，或其衍生物是有用的位点，包括任意其在所使用的发酵条件下对于细胞功能是不需要的位置，例如在任意的基因中其存在，转录，或者表达在所使用的发酵条件下对于细胞的健康功能是重要的。这种插入位点的说明性的实施例包括，但是不限于，蔗糖引入和代谢基因(例如，sacB)，果糖引入和代谢基因(例如，果糖激酶基因，1-磷酸果糖激酶基因)，芳香族的碳源引入和利用基因(例如，氨基苯甲酸盐操纵子基因，例如antABC基因，安息香酸盐操纵子基因，作为benABCD基因)，β-内酰胺酶基因(例如，ampC，blII，blc基因，blo基因，blp基因)，碱性磷酸酶基因(例如，phoA)，核酸酶或核酸生物合成基因(例如，pyrBCDEF基因)，氨基酸生物合成基因(例如，proABC基因)，天冬氨酸半醛脱氢酶基因(例如，asd)，3-异丙基脱氢酶基因(例如，leuB)，和氨基苯甲酸盐合成基因(例如，trpE)。
在任意的实施方案中其中这种基因插入导致了或者伴随营养缺陷，随后或者将宿主细胞在一种提供有效的替代代谢物培养基上培养，使细胞克服(和避免)致命影响，或者在宿主细胞中提供一种替代基因，其表达生物催化效用来回复相应的原养型(protorophy)，例如，作为一种选择标记基因。构建一种代谢作用的营养缺陷的失活(如敲除)或者删除所选择的基因或多个基因可以是任意编码其在代谢途径中是有作用的酶的基因。这种酶可以是一种对于细胞存活是必需的合成代谢生物催化中的分子。可以选择地，这种酶可以是一种对于细胞存活是必需的分解代谢生物催化中的分子。优选地，所有的编码一种给定的生物催化活性基因被可操作删除或者失活来保证在构建的营养缺陷宿主细胞中从宿主细胞中删除目标酶活性。可选择地，宿主细胞可以表现出一种预先存在的营养缺陷(也就是，天然的营养缺陷)，其中没有通过所需的删除或者失活(如敲除)来实现进一步遗传修饰。
例如，一种氨基酸生物合成基因(例如，proA，proB，或者proC基因)或者一种核酸酶或者核酸生物合成基因(例如，pyrB，pyrC，pyrD，pyrE，或pyrF)可以被用作插入位点，在这种情况下一种所需的生物催化活性是正常地破坏的，因此产生一种营养缺陷。在这种情况下，或者：1)这种培养基是补偿脯氨酸或者尿嘧啶补偿物来避免在生物催化途径中的代谢依赖，补偿；或者2)营养缺陷的宿主细胞被一种另外的例如proC，pyrF，或thyA的代谢选择标记基因基因进行转化其表达并且随后替代从生物合成途径中丢失的生物催化剂，因此回复了细胞的原养性。特定实施方案中，lacI转基因，或者它的突变体，被插入到一种细胞中，其是通过一种基因的敲除或者与基因结合引起的伴随的或者随后的营养缺陷，其选自的组包括pyrF，thyA，和proC。特定实施方案中，天然的大肠杆菌lacI，lacIQ，或lacIQI转基因被插入到细胞中，其是通过proF的敲除而伴随的或者随后来提供营养缺陷。另一实施方案中，天然的大肠杆菌lacI，lacIQ，或lacIQI转基因被插入到细胞中，其是通过proC的敲除而伴随的或者随后来提供营养缺陷。另一个实施方案中，一种天然的大肠杆菌lacI，lacIQ，或lacIQI转基因被插入到细胞中，其是伴随的或者随后通过pyrF和proC的敲除来提供营养缺陷。
另一个实施方案中，天然的大肠杆菌lacI，lacIQ，或lacIQI转基因，或其衍生物，可以被插入到宿主细胞的果聚糖蔗糖酶位点。例如，特定实施方案中，天然的大肠杆菌lacI，lacIQ，或lacIQI转基因，或其衍生物，可以被插入到荧光假单胞菌的果聚糖蔗糖酶基因位点。特别是，天然的大肠杆菌lacI，lacIQ，或lacIQI转基因，或其衍生物，可以被插入到具有SEQ ID.NO.13(表14)的核酸序列的荧光假单胞菌的果聚糖蔗糖酶基因位点。
                  表.14-荧光假单胞菌的果聚糖蔗糖酶基因位点的开放阅读框
  ctacccagaacgaagatcagcgcctcaatggcctcaaggttctactggtcgatgattcagccgaagtcgttgaggtgctgaacatgctgctggaaatggaaggcgcccaagtgagcgccttcagcgaccctttgagcgcgcttgaaacagcccgggatgcccattacgacgtgattatttcggacatcggcatgccgaaaatgaatggccatgagctgatgcagaagctgcgtaaagtaggccaccttcgacaggctcccgccatcgccttaacgggctatggcgctggcaatgaccagaaaaaggcgactgaatcgggctttaatgcgcatgtcagcaaacccgttggccatgattcgctcatcaccttgatcgaaaaactgtgccgctcccgcccctaggcgtggggcaggcgttcaagggtagatgaactgagaaaagcgcacggacgcgcccgtttctggtcgcgacacctgggtatccacgctgcccaccgtgtcgctgcgcaaggtcaggtacaacacggcctggccggcgctgtcactcagcatccagacgctcacaccctccccggccgccctggccttgagcggctgaggctgcagcatctcgatattgaaaccgcgcagcagctcaccgctcaactcgacctccaggggttcctgggccttaccttgcacatgaatcaccagcccatcggaggcgccattgcgcaaaaagcgttggtactccacgcgcaactgcccatcggcactgcgcacctcgcggctgctcagcggcccgctggaaaacagccctgccaagctcaagccgatcagcaccagcagcgcgtaccaacccacccgctcaaagcgccagaccttgcgctgcaaggccatgttttcctgcaccggataattgcggctgtgtaagtcgtcagggtctgggttgttcatagcggggcccggactcaacccttgctgtgctcgggagaagacggccccttggtgacaccccgtgggccggcaatcgcccatatcgcagcgcccagaaacggcagcaccacgactaccgcactccagcctgccttgctggccgaggcgttatcgctgcgccagatgctgttgatgatccacgcatcgagcagtacgaggatcactgccaggcctatccagaagtaagtggtttgcatgatgcacctccaggttatgtaacttttggtgcgcgggtgcgggcagggttcattatttttaggttctctgcctggcgcttggtttgccgccatcatgcgggcaacttcgccgatctacttaatgatcgaacctcttcaaacaagacaagctgaaacgtctcagctcctataaaaagccaaatcatgcacaaatgcattttttgccttgaccacgggaatcgagtcttctaaagtcaaatcactgtatatgaatacagtaatttgattcccttcatggacgagacttactatgaaaagcaccccttcgaaatttggcaaaacaccccatcaacccagcctgtggacccgcgccgatgcgcttaaagtgcatgcggacgaccccaccaccacccagccgctggtcagcgcgaacttcccggtattgagtgacgaggtgtttatctgggacaccatgccgctgcgtgatatcgacggcaacatcacctccgtcgatggctggtcggtgatcttcaccctcaccgcggatcgccacccgaacgacccgcaatacctcgatcagaatggcaactacgacgtcatccgcgactggaacgatcgccatggccgggcaaagatgtactactggttctcccgcaccggcaaagactggaagctcggcggccgagtgatggctgaaggggtttcgcccaccgtgcgcgaatgggccggcacgccgatcctgttgaacgagcaaggcgaagtagacctgtactacaccgccgtcacgcccggcgcgaccatcgtcaaggtgcgtggccgcgtggtgaccaccgagcatggcgtcagcctggtgggctttgagaaggtcaagccgctgttcgaggcggacggcaagatgtaccagaccgaagcgcaaaatgcgttctggggctttcgcgatccatggccgttccgcgacccgaaagacggcaagctgtacatgctgttcgaaggtaacgtggccggcgaacgcggctcgcacaaggtcggtaaagccgaaatcggcgacgtgccgccaggttatgaagacgtcggtaactcgcgcttccagactgcctgcgtcggtatcgccgtggcccgcgacgaagacggcgacgactgggaaatgctgccaccgctgctgaccgcggtgggcgtcaacgaccagaccgaacgcccgcacttcgtgttccaggacggcaagtactacctgttcaccatcagccacaccttcacctacgccgacggcgtgaccggcccggacggcgtgtacggcttcgtcgccgattcgctgttcggtccgtatgtgccgttgaacggctctggtctggtactgggcaacccgtcctcccaaccgttccagacctactcgcactgcgtcatgcccaacggcctggtgacctccttcatcgacagcgtaccgaccgacgacaccggcacgcagatccgtatcggcggcaccgaagcaccgacggtgggcatcaagatcaaagggcagcaaacgtttgtggtcgctgagtatgactacggttacatcccgccgatgctcgacgttacgctcaagtaaccggaggctatgaggtagcggctttgagctcgatgacaaacccgcggtgaatattcgctgcacctgtggcgagggagcttgctcccggttgggccggacagccgccatcgcaggcaagccagctcccacattttggttcctggggcgtcagggaggtatgtgtcggctgaggggccgtcacgggagcaagctccctcgccacaggttcaacagcccattgggtggatattcaggaaatagaaatg cctgcacc att ga gttgagtc   SEQ IDNO.13
                           IV.LacO序列
抑制启动子泄漏的尝试必须在目标的重组聚合肽表达中被潜在的伴随的缩减来平衡。进一步抑制一种启动子和减少启动子的泄漏的目的是为了对被认为是操纵基因序列的调控序列来修饰，来增加相关的抑制蛋白结合到操纵基因序列的能力，而没有在诱导中减少目标重组多肽的潜在表达。
已经发现在荧光假单胞菌中双重lac操纵基因的使用提供了对于预先诱导重组蛋白表达的更好的抑制，而没有诱导蛋白产量的相应减少。
一个实施方案中，假单胞菌生物体被提供包含一种核酸构建体，其包含一种核酸，该核酸具有至少一种参与转基因表达的抑制的lacO序列。特定实施方案中，假单胞菌宿主细胞是荧光假单胞菌。一个实施方案中，这种核酸构建体包含多于一种的lacO序列。另一个实施方案中，核酸构建体包括至少一种，并且优选多于一种的lacOid序列。一个实施方案中，这种核酸构建体包括lacO序列，或其衍生物，位于启动子的3’端，以及lacO序列，或其衍生物，位于启动子的5’端。特定实施方案中，这种lacO衍生物是lacOid序列。
本发明另一个实施方案中，提供了在假单胞菌宿主细胞中使用的核酸构建体含有多于一种的lac操纵基因序列，或其衍生物。一个实施方案中，至少一种lac操纵基因可以是lacOid序列。
天然的大肠杆菌在诱导剂缺乏的情况下，充当调低lac操纵基因表达的作用。为了这个目的，lac操纵基因被LacI抑制蛋白所结合，抑制了操纵子的转录。已经确定了在相同的DNA分子上LacI蛋白可以同时地结合到两个lac操纵基因。参考，例如，Muller et al.，(1996)″Repression of lac promoter as a function of distance，phase，and quality of an auxiliary lac operator，″J.Mol.Biol.257：21-29。这种抑制可以通过接近启动子的操纵基因O1和两个辅助的操纵基因O2和O3进行调整，O2和O3在lacZ基因的密码子区域中分别位于O1下游的401碱基对和O1上游的92碱基对(参考图4)。使用一个理想的lac操纵基因(Oid)来代替天然的大肠杆菌lac操纵基因序列，从而导致在大肠杆菌中原始lac操纵子抑制的增加。参考Muller et al.，(1996)″Repression of lac promoter as a function of distance，phase，and quality of anauxiliary lac operator，J.Mol.Biol.257：21-29。
lacO序列或者衍生物可以在大肠杆菌中位于一种启动子的天然的O1位置。可以选择地，lacO序列或衍生物可以位于一种启动子的O3位置。另一个实施方案中，这种lacO序列或者替代物可以位于大肠杆菌天然的O1位置，天然的O3位置，或者对于一种启动子的两者的位置。一个实施方案中，这种核酸构建体包括至少一种lacOid序列或者位于启动子序列的5’端或者位于启动子序列的3’端。特定实施方案中，核酸构建体包含启动子3’端的lacOid序列，以及至少一种lacO序列，或其衍生物，启动子的5’端。可替换实施方案中，核酸构建体包含lacOid序列的启动子的5’端，以及至少一种lacO序列，或其衍生物，启动子的3’端。另一个实施方案中，这种核酸构建体包含lacOid序列的启动子5’和3’端。
特定实施方案中，这种lacO序列是SEQ ID NO.14所代表的lacOid，或者基本同源的序列。另一个实施方案中，使用SEQ ID.NO.59的lacOid序列，或者与SEQ ID NO.59的序列基本同源的序列。
                     表.15-LacOID序列
  5’-AATTGTGAGCGCTCACAATT-3’   SEQ ID NO.14
  5’-tgtgtggAATTGTGAGCGCTCACAATTccacaca-3’   SEQ ID NO.59
V.分离的核酸和氨基酸
本发明的另一个方面，提供在改进的蛋白生产中使用的核酸序列。
一个实施方案中，提供在营养缺陷的假单胞菌宿主细胞中使用的编码原养型回复酶的核酸序列。特定实施方案中，提供了纯化于荧光假单胞菌的编码含氮碱基化合物生物合成酶的核酸序列。一个实施方案中，提供了在荧光假单胞菌中编码pyrF基因的核酸序列(SEQ.ID No.s1和3)。另一个实施方案中，提供了在荧光假单胞菌中编码thyA基因的核酸序列(SEQ.ID No.4)。另一个实施方案中，提供了从荧光假单胞菌生物体中纯化的编码种氨基酸生物合成化合物的核酸序列。特定实施方案中，提供了在荧光假单胞菌中编码proC基因的核酸序列(SEQ.ID No.s6 and 8)。
另一个实施方案中，本发明提供了在改良的蛋白生产中使用的新的氨基酸序列。
一个实施方案中，提供了从荧光假单胞菌生物体中纯化到的含氮碱基化合物生物合成酶的氨基酸序列。一个实施方案中，提供了一种含有SEQ.ID No.2的氨基酸序列。另一个实施方案中，提供了一种包含SEQ.ID.No.5的氨基酸序列。另一个实施方案中，提供了从荧光假单胞菌中分离到的氨基酸生物合成酶的氨基酸序列。特定实施方案中，提供了一种含有SEQ.ID No.7的氨基酸序列。
本发明一个实施方案是新的分离的荧光假单胞菌pyrF基因的核酸序列(表2，Seq.ID No.1；表4，Seq.ID No.3)。本发明的另一个方面提供了荧光假单胞菌pyrF基因的分离的肽序列(表3，Seq.ID No.2)。提供了含有与Seq.ID Nos.1，2，或3至少90％，95％，98％或99％同源性的核酸和氨基酸序列。另外，也提供了核苷酸和肽的序列，其含有Seq ID Nos 1，2，或3的至少10，15，17，20或25，30，40，50，75，100，150，250，350，500，或1000个连续的核酸或氨基酸。进一步提供的是Seq ID Nos 1，2，或3的片段，衍生物和类似物。Seq ID Nos 1，2，或3的片段可以包括任意连续的核酸或肽序列，其包括至少大约10bp，15bp，17bp，20bp，50bp，100bp，500bp，1kbp，5kbp或10kpb。
本发明的另一实施方案是新的分离的荧光假单胞菌thyA基因的核酸序列(表5，Seq.ID No.4)。本发明的另一个方面提供了分离的荧光假单胞菌thyA基因的肽序列(表6，Seq.ID No.5)。提供了含有与Seq.ID Nos.4或5至少90，95，98或99％同源性的核酸和氨基酸序列。另外，也提供了核苷和肽序列，其含有与Seq IDNos 4或5至少10，15，17，20或25，30，40，50，75，100，150，250，350，500，或1000个连续的核酸或氨基酸。进一步提供的是Seq.ID Nos.4或5的片段，衍生物和类似物。Seq.ID Nos.4或5的片段可以包括任意的连续的核酸或肽序列其包括至少大约10bp，15bp，17bp，20bp，50bp，100bp，500bp，1kbp，5kbp或10kpb。
本发明的另一个实施方案是新的分离的荧光假单胞菌proC基因的核酸序列(表7，Seq.ID No.6；表9，Seq.ID.No.8)。本发明的另一个方面提供了分离的荧光假单胞菌proC基因的氨基酸序列(表8，Seq.ID No.7)。提供了含有与Seq.IDNos.6，7，或8至少90，95，98或99％同源性的核酸和氨基酸序列。另外，也提供了核苷和肽序列，其含有Seq ID Nos 6，7，或8的至少10，15，17，20或25，30，40，50，75，100，150，250，350，500，或1000个连续的核酸或氨基酸。进一步提供的是Seq.ID Nos.6，7，或8的片段，衍生物和类似物。Seq.ID Nos.6，7，或8的片段可以包括任意连续的核酸或肽序列其包括至少大约10bp，15bp，17bp，20bp，50bp，100bp，500bp，1kbp，5kbp或10kpb。
序列同源性
序列同源性被按照本领域中公知的任意不同的方法来进行测定。有用的序列比对和同源性确定方法的实例包括下面所述的那些。
同源性序列的比对和搜索可以利用美国国家生物技术信息中心提供(NCBI)程序，MegaBLAST(通常位于http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行。使用这一程序并且选项为氨基酸序列设定为70％的百分比同一性，或者核酸序列设定为90％的百分比同一性，将确定那些与所提交的序列有70％，或90％，或更高的同一性的序列。根据本发明，本领域已知的其它的软件也是可以利用来比对和/或搜索同源性序列，例如，与一个含有一种本发明所述的启动子碱基序列或编码催化剂蛋白碱基序列的信息串具有至少70％或90％同源性的序列。例如，用于与提交的序列相比具有至少70％或90％同源性的确定序列比对的可以使用以下程序进行，例如，GAP，BESTFIT，BLAST，FASTA，和TFASTA程序，已知存在于GCG程序分析软件包(已知来自于遗传学计算机小组(Genetics Computer Group)，维斯康星大学生物技术中心(University of Wisconsin Biotechnology Center)，1710University Avenue，Madison，Wis.53705)，使用默认的参数作为那里所制定的，加上用于将同一性程度设定成70％或90％的参数。而且，例如，也可以使用CLUSTAL程序(已知位于PC/Gene软件包，来自于Intelligenetics，Mountain View，Cal.)。
这些和其它的序列比对方法是本领域中已知的并且可以被进行，通过手工比对，通过视觉检查，或者通过一种序列比对运算的手工的或者自动的使用，例如上面所述的程序中所收录的任意的方法。不同的有用的运算法则包括，例如，相似的搜索方法描述在W.R.Pearson & D.J.Lipman，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 85：2444-48(Apr 1988)；当地的同源性方法描述在T.F.Smith & M.S.Waterman，in Adv.Appl.Math.2：482-89(1981)和在J.Molec.Biol.147：195-97(1981)；同源性比对方法描述在S.B.Needleman & C.D.Wunsch，J.Molec.Biol.48(3)：443-53(Mar1970)；以及不同的方法描述在，例如，由W.R.Pearson，在Genoinics 11(3)：635-50(Nov 1991)；由W.R.Pearson，在Methods Molec.Biol.24：307-31和25：365-89(1994)；和由D.G.Higgins & P.M.Sharp，在Comp.Appl′ns in Biosci.5：151-53(1989)以及在Gene 73(1)：237-44(15 Dec 1988)中。
在高度严紧的杂交条件下实施的核酸杂交也是有用的技术，用来获得在这里使用的充足同源性的序列。
                           VI.核酸构建体
在本发明的另一个方面，提供了在肽的改良生产中使用的核酸构建体来。
一个实施方案中，在转化假单胞菌宿主细胞中使用的核酸构建体包括a)编码重组多肽的核酸序列，以及b)提供了编码一种具有原养型能力的酶的核酸序列。另一个实施方案中，核酸构建体进一步包括c)一种Plac-Ptac家族启动子。另一个实施方案中，核酸构建体进一步包括d)至少一种lacO序列，或衍生物，lac或tac家族启动子的3’端。另一个实施方案中，这种核酸构建体进一步包括e)至少一种lacO序列，或衍生物，lac或tac家族启动子的5’端。一个实施方案中，衍生的lacO序列可以是lacOid序列。特定实施方案中，假单胞菌生物体是荧光假单胞菌。
本发明一个实施方案中，被提供的在假单胞菌生物体中用作表达载体的核酸构建体包括a)编码一种重组多肽的核酸序列，b)一种Plac-Ptac家族启动子，c)至少一种lacO序列，或衍生物，lac或tac家族启动子的3’端，d)至少一种lacO序列，或者衍生物，lac或tac家族启动子的5’端。一个实施方案中，衍生的lacO序列可以是一种lacOid序列。一个实施方案中，核酸构建体进一步包括e)在营养缺陷的假单胞菌细胞中使用的原养性能力的选择标记。特定实施方案中，假单胞菌生物体是荧光假单胞菌。
本发明一个实施方案中，提供的核酸构建体包括核酸，其编码至少一种可以将营养缺陷的宿主细胞转化为原养型的生物合成酶。这种生物合成酶是任意的可以使营养缺陷的宿主细胞在选择的培养基上存活的酶，没有生物合成酶的表达，这种宿主细胞就由于缺乏营养缺陷代谢物而不能存活。因此，这种生物合成酶可以是一种酶其可以通过回复原养型的能力为营养缺陷的宿主补偿这种代谢物缺陷，从而在没有营养缺陷的代谢物添加的培养基上生长。
特定实施方案中，本发明提供了一种核酸构建体，其编码一种功能性的乳清酸核苷(orotodine)-5’-磷酸脱羧酶，其补偿pyrF(-)营养缺陷宿主。特定实施方案中，核酸构建体包含一种SEQ ID NO.1或3的核酸序列。可替换实施方案中，核酸构建体包括一种核酸序列，其编码SEQ IDNO.2的氨基酸序列。
另一特定实施方案中，本发明提供了一种核酸构建体，其编码一种功能性的胸苷酸合成酶，其补偿了thyA(-)营养缺陷宿主。特定实施方案中，核酸构建体包含SEQ ID NO.4的核酸序列。可选择实施方案中，核酸构建体包含一种核酸序列其编码SEQ ID NO.5的氨基酸序列。
进一步的特定实施方案中，本发明提供了一种核酸构建体，其编码功能性的Δ1-吡咯啉-5-羧基还原酶，其补偿了proC(-)营养缺陷宿主。特定实施方案中，这种核酸构建体包括SEQ ID NO.6或8的核酸序列。可替换实施方案中，核酸构建体包含核酸序列，其编码SEQ ID NO.7的氨基酸序列。
可替换实施方案中，本发明提供了一种核酸构建体，其编码至少一种可以将营养缺陷的宿主细胞转化成原养型的生物合成酶以及另外的非-营养缺陷的选择标记。这种非-营养缺陷的选择标记的例子在本领域中是公知的，并且可以包括标记，其增加了比色的/发色的或者一种发光的反应，例如lacZ基因、GUS基因、CAT基因、luxAB基因、抗生素抗性选择标记例如两性霉素B，杆菌肽，碳青霉烯，头孢霉素，乙胺丁醇，氟喹诺酮类(fluoroquinolones)，异烟肼(isonizid)，头孢霉素(cephalosporin)，新青霉素(methicillin)，苯甲异噁唑青霉素，万古霉素，链霉素，喹啉，利福平，利福平(rifampicin)，磺胺药物，氨苄青霉素，四环素，新霉素，先锋霉素，红霉素，链霉素，卡那霉素，硫酸庆大霉素，，青霉素，和氯霉素抗性基因，或者其它的经常使用的非-营养缺陷选择标记。
另一个实施方案中，表达载体可以包括多于一种的可以将营养缺陷宿主细胞转化成原养型的生物合成酶。生物合成酶可以是任意的允许营养缺陷宿主细胞在所选择的培养基上存活的酶，没有生物合成酶的表达，这种宿主细胞由于营养缺陷代谢物的缺乏将不能存活。因此，这种生物合成酶可以是这样的酶其通过回复原养型的能力补偿营养缺陷的宿主的代谢缺陷来在非-营养缺陷的补偿代谢物的培养基上生长。例如，一种包含第一和第二原养型能力的选择标记基因的表达载体，允许包含构建体的宿主细胞维持在任一的或者两种的条件下其中宿主细胞存活所需要提供选择标记基因。当只提供了一种存活依赖的标记-基因条件的时候，相关的标记基因必须被表达，并且其它的标记基因随后可以是活性的或者非活性的，虽然对于仍然是营养缺陷性的细胞所所有必须营养物将仍由培养基提供。这准许了在宿主细胞中相同的目标基因，或者相同的共价连接的目标基因的，编码所需的转基因产品和/或所需的转基因活性，的连续地维持，当宿主细胞在不同的条件下转化的时候。每一个所选择的选择标记基因的单独的编码序列可以操作性地连接到组成型的或者调控的启动子上。
特定实施方案中，核酸载体包含一种核酸构建体，其编码一种功能性的乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶和一种功能性的Δ1-吡咯啉-5-羧基还原酶，其可以补偿补偿pyrF(-)营养缺陷性宿主细胞，proC(-)营养缺陷的宿主细胞，或者pyrF(-)/proC(-)双营养缺陷的宿主细胞。特定实施方案中，核酸构建体包括SEQ ID NO.1或3和SEQID.NO.6或8的核酸序列。可替换实施方案中，核酸构建体包含一种核酸序列，其编码SEQ ID NO.2和7的氨基酸序列。
可替换的特定实施方案中，核酸载体包含一种核酸构建体，其编码功能性的乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶和功能性的胸苷酸合成酶(thymidylate synthase enzyme)，其可以补偿一种pyrF(-)营养缺陷的宿主细胞，thyA(-)营养缺陷的宿主细胞，或者pyrF(-)/thyA(-)双-营养缺陷的宿主细胞。特定实施方案中，核酸构建体包含SEQ IDNO.1或3，和SEQ ID.NO.4的核酸序列。可替换实施方案中，这种核酸构建体包含一种核酸序列，其编码SEQ ID NO.2和5的氨基酸序列。
特定实施方案中，核酸载体包含核酸构建体，其编码一种功能性的Δ1-吡咯啉-5-羧基还原酶和胸苷酸合成酶，其可以补偿proC(-)营养缺陷宿主细胞，thyA(-)营养缺陷宿主细胞，或者proC(-)/thyA(-)双-营养缺陷的宿主细胞。特定实施方案中，这种核酸构建体包含SEQ ID NO.4，和SEQ ID NO.6或8的核酸序列。可替换实施方案中，核酸构建体包含一种核酸序列其编码SEQ ID NO.5和7的氨基酸序列。
启动子
在发酵过程中，一旦目标重组多肽的表达被诱导，具有高水平的生产是理想的从而将表达系统的功效最大化。启动子启动了转录并且通常位于核糖体结合位点上游的10-100核苷酸。理想地，启动子可以是充分强大的从而允许重组多肽累积占宿主细胞的细胞总蛋白的大约50％，服从严格的调控，并且容易地诱导(并且是便宜的)。
按照本发明所使用的启动子可以是组成型的启动子或者调控的启动子。通常地所使用的可诱导的启动子和它们的伴随的诱导剂包括lac(IPTG)，lacUV5(IPTG)，tac(IPTG)，trc(IPTG)，Psyn(IPTG)，trp(色氨酸饥饿)，araBAD(1-树胶醛糖)，lppa(IPTG)，lpp-lac(IPTG)，phoA(磷酸盐饥饿)，recA(萘啶酸)，proU(同渗容摩(osmolarity))，cst-1(葡萄糖饥饿)，tetA(tretracylin)，cadA(pH)，nar(厌氧条件)，PL(热量迁移(shift to)到42℃)，cspA(热量变化到20℃)，T7(热诱导)，T7-lac操纵基因(IPTG)，T3-lac操纵基因(IPTG)，T5-lac操纵基因(IPTG)，T4基因32(T4噬菌体)，nprM-lac操纵基因(IPTG)，Pm(烷基-或卤-安息香酸盐)，Pu(烷基-或卤-甲苯(toluenes))，Psal(水杨酸盐)，和VHb(氧)。参考，例如，Makrides，S.C.(1996)Microbiol.Rev.60，512-538；Hannig G.& Makrides，S.C.(1998)TIBTECH 16，54-60；Stevens，R.C.(2000)Structures 8，R177-R185。参考，例如，J.Sanchez-Romero & V.DeLorenzo，Genetic Engineering of Nonpathogenic Pseudomonas strains as Biocatalystsfor Industrial and Environmental Processes，in Manual of Industrial Microbiology andBiotechnology(A.Demain & J.Davies，eds.)pp.460-74(1999)(ASM Press，Washington，D.C.)；H.Schweizer，Vectors to express foreign genes and techniques tomonitor gene expression for Pseudomonads，Current Opinion in Biotechnology，12：439-445(2001)；和R.Slater & R.Williams，The Expression of Foreign DNA inBacteria，in Molecular Biology and Biotechnology(J.Walker & R.Rapley，eds.)pp.125-54(2000)(The Royal Society of Chemistry，Cambridge，UK)。
一种启动子具有与所选择的细菌细胞的天然启动子的核酸序列也可以用来调控编码目标多肽的转基因表达，例如，一种假单胞菌氨基苯甲酸盐或者安息香酸盐操纵子启动子(Pant，Pben)。也可以使用串连的启动子其中多于一种启动子共价连接到另一个上，不管在序列上相同或者不同的，例如，一种Pant-Pben串连的启动子(内部启动子混合物(hybrid))或者一种Plac-Plac串连的启动子。
使用启动子调控蛋白调控的启动子从而调控基因的转录其中这种启动子是分离的(a part)。这里使用了一种调控的启动子，一种相应的启动子调控蛋白也可以是根据本发明所述的表达系统的一部分。启动子调控蛋白的例子包括，激活剂蛋白，例如，大肠杆菌新陈代谢激活剂蛋白，MaIT蛋白；AraC家族转录激活剂；抑制蛋白，例如，大肠杆菌LacI蛋白；和双-基团(dual-faction)调控蛋白，例如，大肠杆菌NagC蛋白。许多调控的-启动子/启动子-调控-蛋白对是本领域所公知的。
启动子调控蛋白与一种效应剂化合物相互作用，也就是一种化合物其可逆地或者不可逆地与调控蛋白相结合，从而使这种蛋白或者释放或者结合至少一种基因的DNA转录调控区域，其中这种基因是在启动子的调控下的，因此允许或者阻止在启动基因转录过程中的转录酶的作用。效应剂化合物可以分为诱导剂或者共抑制物，并且这些化合物包括天然的效应剂化合物和义务诱导物化合物。许多调控的-启动子/启动子-调控-蛋白/效应剂化合物三聚体是本领域所公知的。虽然效应剂化合物可以在整个细胞培养或发酵过程中使用，特定实施方案中，其中使用了一种调控的启动子，在宿主细胞生长到所需量或密度的生物体后，适当的效应剂化合物被添加到培养基中从而直接地或者非直接地产生了所需的目标基因的表达。
通过实施例的方法，其中使用lac家族启动子，lacI基因，或其衍生物例如lacIQ或lacIQI基因，也可以被提供到系统中。这种lacI基因，其是(通常地)一种组成型表达的基因，编码Lac抑制蛋白(LacI蛋白)其连接到这些启动子的lac操纵基因。因此，使用的lac家族启动子，这种lacI基因也可以在表达系统中包括和表达。在使用lac启动子家族成员的情况下，例如，tac启动子，效应剂化合物是一种诱导物，优选地一种义务诱导物例如IPTG(异丙基-β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷，也称为“异丙基硫代半乳糖苷”)。
特定实施方案中，一本发明种所使用的lac或tac家族启动子，包括Plac，Ptac，Ptrc，PtacII，PlacUV5，lpp-PlacUV5，lpp-lac，nprM-lac，T7lac，T5lac，T3lac，和Pmac。
其它序列
表达构建体可以包括其它的调控序列，包括lacO序列和衍生物，如上所述。这种序列包括，但是不限于，例如，转录增强子序列，翻译增强子序列，其它的启动子，激活剂，翻译启示和终止信号，转录终止子，顺反子调控子，多顺反子调控子，tag序列，例如核苷序列“tags”和“tag”肽编码序列，其促进了表达多肽的确认，分离，纯化，或者分离，包括His-tag，Flag-tag，T7-tag，S-tag，HSV-tag，B-tag，Strep-tag，多精氨酸，多半胱氨酸，多苯丙氨酸，多天冬氨酸，(Ala-Trp-Trp-Pro)n，硫氧还蛋白，β-牛乳糖，氯霉素乙酰转移酶，环麦芽糊精糖苷转移酶，CTP：CMP-3-脱氧-D-manno-octulosonatecytidyltransferase，trpE或trpLE，抗生物素蛋白，链霉亲和素，T7基因10，T4gp55，葡萄球菌蛋白A，链球菌蛋白G，GST，DHFR，CBP，MBP，半乳糖结合结构域，钙调素结合结构域GFP，KSI，c-myc，ompT，ompA，pelB，NusA，泛素(ubiquitin)，和hemosylin A。
最小，本发明所述的蛋白编码基因可以包括，除了蛋白编码序列，操作地连接到其上的下列的调控序列：启动子，核糖体结合蛋白(RBS)，转录终止子，翻译启示和终止信号。使用的RBSs可以从本发明所述的表达系统中作为宿主细胞使用的种中获得，优选来自于所选的宿主细胞。许多特定的和大量相同的RBSs是已知的，例如，那些描述在或者参考于D.Frishman等人，Starts of bacterial genes：estimating the reliability of computer predictions，Gene 234(2)：257-65(8 Jul 1999)；和B.E.Suzek等人，A probabilistic method for identifying start codons in bacterialgenomes，Bioinformatics 17(12)：1123-30(Dec 2001)。另外，或者天然的或者合成的RBSs也可以使用，例如，那些在EP 0207459所描述的(合成的RBSs)；O.Ikehataetal.，Primary structure of nitrile hydratase deduced from the nucleotide sequenceof aRhodococcus species and its expression in Escherichia coli，Eur.J.Biochem.181(3)：563-70(1989)(AAGGAAG的天然的RBS序列)。本发明中所使用的方法，载体，和翻译和转录序列，和其它的序列的进一步的例子被描述在，例如，美国专利Gilroy的No.5,055,294和Gilroy等人的美国专利No.5,128,130；Rammler等人的美国专利No.5,281,532；Barnes等人的美国专利Nos.4,695,455和4,861,595；Gray等人的美国专利No.4,755,465；和Wilcox的美国专利No.5,169,760。
载体
通过假单胞菌宿主对编码本发明酶的DNA的转录可以通过将增强子序列插入载体或质粒中来进一步提高。典型的增强子是DNA的顺式作用序列，通常大小约从10到300bp，在启动子上作用来提高转录。
一般地，重组表达载体可以包括复制起点和允许假单胞菌宿主细胞的转化选择标记的，例如，本发明的原养型回复基因，以及来自于高表达基因的启动子来指导下游的结构序列转录。这种启动子已经在上面描述了。异源结构序列适当时机与翻译起始和终止序列进行组装，并且在一个确定的实施方案中，引导序列可以引导翻译蛋白的分泌。随意地，按照本发明，这种异源的序列可以编码一种融合多肽，其包括具有所需特性的N-末端辨认肽，例如，这种特性是为了表达重组产品的稳定性和简单的纯化。
荧光假单胞菌在表达酶中所使用的有用的表达载体可以通过插入编码所需目标多肽和适当翻译起始和终止信号与功能启动子处于可操作阅读状态的结构DNA序列来构建。这种载体将包括一种或多种表型的选择标记和复制的原点来保证载体在宿主中的维持和，如果需要，提供扩大化。按照本发明公开内容用于转化的适当宿主包括假单胞菌属中的不同的种，并且特别优选是荧光假单胞菌的宿主细胞菌株。
本领域中已知的用于在宿主细胞中表达重组蛋白的载体，这些中的任意一个可以被修饰和用于表达本发明所述的基因。这种载体包括，例如，质粒，粘粒，和噬菌体表达载体。可以被修饰用于本发明的有用的质粒载体的实施例包括，但是不限于，表达质粒pBBRlMCS，pDSK519，pKT240，pML122，pPS10，RK2，RK6，pRO1600，和RSF1010。进一步的实施粒可以包括pALTER-Exl，pALTER-Ex2，pBAD/His，pBAD/Myc-His，pBAD/gIII，pCal-n，pCal-n-EK，pCal-c，pCal-Kc，pcDNA 2.1，pDUAL，pET-3a-c，pET 9a-d，pET-lla-d，pET-12a-c，pET-14b，pET15b，pET-16b，pET-17b，pET-19b，pET-20b(+)，pET-21a-d(+)，pET-22b(+)，pET-23a-d(+)，pET24a-d(+)，pET-25b(+)，pET-26b(+)，pET-27b(+)，pET28a-c(+)，pET-29a-c(+)，pET-30a-c(+)，pET31b(+)，pET-32a-c(+)，pET-33b(+)，pET-34b(+)，pET35b(+)，pET-36b(+)，pET-37b(+)，pET-38b(+)，pET-39b(+)，pET-40b(+)，pET-41a-c(+)，pET-42a-c(+)，pET-43a-c(+)，pETBlue-1，pETBlue-2，pETBlue-3，pGEMEX-1，pGEMEX-2，pGEXlλT，pGEX-2T，pGEX-2TK，pGEX-3X，pGEX-4T，pGEX-5X，pGEX-6P，pHAT10/11/12，pHAT20，pHAT-GFPuv，pKK223-3，pLEX，pMAL-c2X，pMAL-c2E，pMAL-c2g，pMAL-p2X，pMAL-p2E，pMAL-p2G，pProEX HT，pPROLar.A，pPROTet.E，pQE-9，pQE-16，pQE-30/31/32，pQE-40，pQE-50，pQE-70，pQE-80/81/82L，pQE-100，pRSET，和pSE280，pSE380，pSE420，pThioHis，pTrc99A，pTrcHis，pTrcHis2，pTriEx-1，pTriEx-2，pTrxFus。这种有用的载体的其它实施例包括那些被描述于，例如，N.Hayase，in Appl.Envir.Microbiol.60(9)：3336-42(Sep1994)；A.A.Lushnikov et al.，in Basic Life Sci.30：657-62(1985)；S.Graupner & W.Wackernagel，inBiomolec.Eng.17(1)：11-16.(Oct 2000)；H.P.Schweizer，in Curr.Opin.Biotech.12(5)：439-45(Oct 2001)；M.Bagdasarian & K.N.Timmis，in Curr.Topics Microbiol.Immunol.96：47-67(1982)；T.Ishii et al.，in FEMS Microbiol.Lett.116(3)：307-13(Mar1，1994)；I.N.Olekhnovich & Y.K.Fomichev，in Gene 140(1)：63-65(Mar 11，1994)；M.Tsuda & T.Nakazawa，in Gene 136(1-2)：257-62(Dec 22，1993)；C.Nieto et al.，in Gene 87(1)：145-49(Mar 1，1990)；J.D.Jones & N.Gutterson，in Gene 61(3)：299-306(1987)；M.Bagdasarian et al.，in Gene 16(1-3)：237-47(Dec1981)；H.P.Schweizer et al.，in Genet.Eng.(NY)23：69-81(2001)；P.Mukhopadhyayet al.，in J.Bact.172(1)：477-80(Jan 1990)；D.O.Wood et al.，in J.Bact.145(3)：1448-51(Mar 1981)；和R.Holtwick et al.，in Microbiology 147(Pt 2)：337-44(Feb2001)。
进一步的实施例，其可以用于假单胞菌宿主细胞的表达载体包括那些列于表16中的衍生自所指出的复制子。
 表16.有用表达载体的一些实例
  复制子   载体
  pPS110   pCN39，pCN51
  RSF1010   pKT261-3
  pMMB66EH
  pEB8
  pPLGN1
  pMYC1050
  RK2/RP1   pRK415
  pJB653
  pRO1600   pUCP
  pBSP
表达质粒，RSF1010，被描述于，例如，由F.Heffron et al.，in Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 72(9)：3623-27(Sep 1975)；和由K.Nagahari & K.Sakaguchi，in J.Bact.133(3)：1527-29(Mar1978)。质粒RSF1010及其衍生物是本发明中特别有用的载体。在本领域中是公知的有用的RSF1010的衍生物的实例，包括，例如，pKT212，pKT214，pKT231和相关的质粒，以及pMYC1050和相关的质粒(参考，例如，Thompson等人的美国专利Nos.5,527,883和5,840,554)，比如，例如，pMYC1803。质粒pMYC1803是从RSF1010-基础的质粒pTJS260得到的(参考Wilcox的美国专利5,169,760)，其携带了一种调控的四环素抗性标记和来自于RSF1010质粒的复制和启动位点(loci)。其它的代表性的有用的载体包括那些在Puhler等人的美国专利4,680,264中所描述的。
一个实施方案中，表达质粒被用作表达载体。另一个实施方案中，RSF1010或它的衍生物被用作表达载体。另一个实施方案中，pMYC1050或者它的衍生物，或者pMYC1803或其衍生物，被用作表达载体。
             VII.在一种假单胞菌宿主细胞中重组多肽的表达
本发明的一个方面，提供了在改进的蛋白生产中使用的重组多肽的表达方法(process)。
一个实施方案中，这种方法提供了核酸构建体的表达其包括的核酸编码a)重组多肽，和b)对于至少一种代谢物是营养缺陷的假单胞菌中的原养型-回复酶。可替换实施方案中，这种假单胞菌对于多于一种代谢物是营养缺陷的。一个实施方案中，假单胞菌是荧光假单胞菌细胞。特定实施方案中，重组多肽被表达在假单胞菌中其对于一种代谢物，或者代谢物的组合体是营养缺陷的，选自的组包括含氮碱基化合物和氨基酸。更特定实施方案中，重组多肽被表达在对一种代谢物是营养缺陷的假单胞菌中，代谢物选自的组包括尿嘧啶，脯氨酸，和胸苷。另一个实施方案中，营养缺陷体可以分别通过宿主pyrF，proC，或thyA基因的敲除来实现。可替换实施方案中，重组多肽被表达在一种营养缺陷的假单胞菌中其已经进行了遗传修饰，即通过插入一种不同于PlacI-lacI-lacZYA操纵子的部分的天然大肠杆菌lacI基因，lacIQ基因，或lacIQI基因，，到宿主细胞的染色体中。特定实施方案中，含有重组多肽的载体表达在营养缺陷的宿主细胞其包含至少两种lac操纵基因序列或其衍生物。另一个实施方案中，这种重组多肽由Plac家族启动子来启动。
另一个实施方案中，这种过程包括使用假单胞菌宿主细胞，其已经被遗传修饰来提供至少一个插入到假单胞菌宿主细胞的染色体中的LacI编码基因的一个拷贝，其中这种lacI编码基因不同于PlacI-lacI-lacZYA操纵子的部分。一个实施方案中，编码Lac抑制蛋白的基因与大肠杆菌天然lacI基因相同。另一个实施方案中，编码Lac抑制蛋白的基因是lacIQ基因。另一个实施方案中，编码Lac抑制蛋白的基因是lacIQI基因。特定实施方案中，假单胞菌宿主细胞是荧光假单胞菌。另一个实施方案中，这种假单胞菌是进一步遗传修饰来形成一种营养缺陷的细胞。另一个实施方案中，这种方法产生重组多肽的水平至少大约3g/L，4g/L，5g/L，6g/L，7g/L，8g/L，9g/L或者至少大约10g/L。另一个实施方案中，重组多肽的表达水平在3g/L到100g/L之间。
这种方法通常包括：
a)提供一种假单胞菌宿主细胞，优选一种荧光假单胞菌，如在本发明中所描述的，
b)利用至少一个核酸表达载体转染这种宿主细胞，该表达载体包含i)所需要的目标重组多肽，并且，在使用一种营养缺陷的宿主的情况下，ii)编码原养型能力的酶的基因其，当表达的时候，克服了宿主细胞的营养缺陷。
c)在一种生长培养基上培养宿主细胞，其提供了一种有效的选择压力用于维持宿主细胞中的这种含有重组多肽的核酸表达载体；和
d)表达所需要的目标重组多肽。
这种方法可以进一步包括使用至少一个核酸表达载体转染宿主细胞，该表达载体进一步包括iii)Plac家族启动子，和随意地iv)多于一种lac操纵基因序列。一个实施方案中，至少一种lac操纵基因序列可以是一种lacOid序列。优选地，表达系统可以以多肽的总产量表达目标多肽为至少1g/L到至少80g/L。在特定实施方案中，重组多肽的表达水平至少为3g/L，4g/L，5g/L，6g/L，7g/L，8g/L，9g/L，10g/L，12g/L，15g/L，20g/L，25g/L，30g/L，35g/L，40g/L，45g/L，50g/L，60g/L，70g/L，或至少80g/L。特定实施方案中，lac或者tac家族启动子使用在本发明中，包括Plac，Ptac，Ptrc，PtacII，PIacUV5，lpp-PlacUV5，lpp-lac，nprM-lac，T7lac，T5lac，T3lac，和Pmac。
一个实施方案中，至少一种重组多肽可以被表达在假单胞菌中，其对一种代谢物是营养缺陷的，其中这种营养缺陷作为一种选择标记来维持核酸表达载体，该核酸表达载体编码所需要的多肽和原养型能力酶。可选择地，多于一种重组多肽可以被表达在假单胞菌细胞中，其对于一种代谢物是营养缺陷的，其中这种编码重组多肽的核酸可以包含在相同的载体上，或者可以选择地，在多种载体上。
另一个实施方案中，多于一种的编码不同目标多肽的表达载体可以包含在假单胞菌宿主细胞中，其对至少一种代谢物是营养缺陷的，其中一种表达载体含有编码原养型能力酶以及所需要的第一目标多肽的核酸，以及第二表达载体，其包含编码一种可选的、非-营养缺陷选择标记和所需要的第二多肽的核酸。
另一个实施方案中，至少一种重组多肽可以被表达在一种假单胞菌细胞中，其对于多于一种代谢物是营养缺陷的，其中这种多营养缺陷作为选择标记用来维持核酸表达载体。例如，一种表达载体可以被使用，其中提供了第一和第二原养型能力选择标记基因。如果两种标记基因位于相同的DNA构建体上，这种含有构建体的宿主细胞可以维持在任意一种或者两种条件下，其中宿主细胞的存活需要选择标记基因的存在。当只有一种标记基因依赖的存活条件存在时候，相关的标记基因必须是被表达的，其它的标记基因随后可以是活性的或者非活性的，虽然对于细胞仍然是营养缺陷的所有所需营养物依然通过培养基提供。这允许编码所需的转基因产品和/或所需要的转基因活性的相同的目标基因，或者共价连接到目标基因的相同的组，来连续地维持在宿主细胞中，当这种宿主细胞在不同的条件下转换的时候。如果两个选择标记基因的任意一个位于不同DNA构建体上的时候，随后，为了在宿主细胞中维持两种DNA构建体，提供依赖两种标记-基因的存活条件，以及两种相关标记基因必须被表达。这允许多于一种非-共价结合的标记基因或者目标基因组来分别维持在宿主细胞中。每一个所选的选择标记基因独立的编码序列可以操作性地连接到一种组成的或者一种调控的启动子上。
这种多-目标-基因系统的例子双-目标-基因包括，但是不限于：(1)一个目标基因的表达产品与其它的目标基因自身相互作用的系统；(2)一个目标基因的表达产品与其它目标基因的表达产品相互作用的系统，例如，一种蛋白和它的结合蛋白或者αn-和βn-蛋白的α-和β-多肽；(3)两个基因的表达产品都与第三化合物作用的系统，例如，第三化合物存在于宿主细胞中；(4)都参与到普通的生物催化途径中的两种基因的表达产品的系统；和(5)独立地发挥作用的两种基因的两种表达产品的系统，例如，一种双-克隆抗体表达系统。
在上面列出的类型(1)中双-目标-基因系统的一个例子中，第一目标基因可以编码所需的目标蛋白，其中这种第一基因在调控的启动子的调控下；第二目标基因随后可以编码蛋白参与第一目标基因的启动子的调控中，例如，第二目标基因可以编码第一目标基因的启动子激活剂或抑制蛋白。在一个实施例中，其中第二基因编码第一基因的启动子调控蛋白，这种第二基因的编码序列可以在组成型的启动子的调控下。一个实施方案中，第二基因可以是分离的DNA构建体的一部分，其在细胞中维持作为一种高拷贝数构建体，具有的拷贝数至少10，20，30，40，50，或多于50个拷贝数被维持在宿主细胞中。
另一个实施方案中，本发明提供在假单胞菌中重组多肽的生产中提供了在一个表达载体上多于一种的lacO序列的使用，特别是，在荧光假单胞菌中。
另一方面，本发明提供了一种生产重组多肽的方法，其包括转化一种细菌，该细胞是假单胞菌和紧密相关的细菌，其具有至少一种染色体插入的编码lacI转基因、或者例如lacIQ或lacIQI的衍生物的Lac抑制蛋白的核酸拷贝，其中转基因不同于整体的一部分或者截断的含有PlacI-lacI-lacZYA构建体的结构基因，其中具有编码至少一种目标重组多肽的核酸构建体。这种编码至少一种目标重组多肽的核酸可以操作性地连接到Plac家族启动子上，其中存在于宿主细胞中的所有的Plac家族启动子被Lac抑制蛋白所调控，其中该蛋白被插入到染色体中的lacI转基因所单独表达。随意地，这种表达系统可以以总产量为至少3g/L到至少10g/L表达目标多肽。优选地，表达系统可以表达目标多肽以总产量为至少3g/L，4g/L，5g/L，6g/L，7g/L，8g/L，9g/L，或至少10g/L。
一个实施方案中，本发明提供了在一个表达系统中表达重组多肽的方法，使用营养缺陷假单胞菌或者相关的已经进一步遗传修饰的细菌，以提供至少编码插入到细胞染色体中的lacI基因的拷贝，该基因不同于PlacI-laeI-lacZYA操纵子的一部分。特定实施方案中，重组的多肽在含有lacI转基因插入的营养缺陷的荧光假单胞菌宿主细胞中表达。另一特定实施方案中，重组的多肽在含有lacIQ转基因插入的营养缺陷的荧光假单胞菌宿主细胞中表达。进一步的另一特定实施方案中，重组的多肽在含有lacIQI转基因插入的营养缺陷的荧光假单胞菌宿主细胞中表达。荧光假单胞菌宿主对于一种细胞存活的生物化学需求是营养缺陷的。特定实施方案中，荧光假单胞菌细胞对于含氮碱基是营养缺陷的。特定实施方案中，荧光假单胞菌细胞对于一种选自胸苷或尿嘧啶的含氮碱基是营养缺陷的。在一个特别优选的实施方案中，荧光假单胞菌宿主细胞的营养缺陷体是被遗传修饰所诱导的，这种pyrF或thyA基因的遗传修饰提供有关的非功能性编码产品。可替换实施方案中，荧光假单胞菌细胞对一种氨基酸是营养缺陷的。特定实施方案中，这种荧光假单胞菌对于氨基酸脯氨酸是营养缺陷的。特定实施方案中，荧光假单胞菌宿主细胞的营养缺陷是被一种proC基因的遗传修饰来诱导的，其中这种遗传修饰提供了相关的非功能性编码产品。
转化
载体对假单胞菌宿主细胞的转化可以利用本领域中已知的任意转化方法来实现，并且细菌宿主细胞可以作为完整的细胞或者作为原生质体(也就是包括细胞质)被转化。转化方法的例子包括穿孔方法，例如，电穿孔方法，原生质体融合，细菌结合，和二价阳离子处理，例如，氯化钙处理或者CaCl/Mg2+处理，或者其它的本领域中已知的方法。参考，例如，Morrison，J.Bact.，132：349-351(1977)；Clark-Curtiss & Curtiss，Methods in Enzymology，101：347-362(Wu et al.，eds，1983)；Sambrook etal.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(2nd ed.1989)；Kriegler，Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual(1990)；和Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel et al.，eds.，1994))。
选择
优选地，选择那些相应于下面的转化的没有成功转化的细胞，并且在整个发酵中连续地进行。这种选择标记可以是营养缺陷的选择标记或者一种传统的抗生素选择标记。当细胞对于多种营养化合物是营养缺陷的时候，这种营养缺陷细胞可以在添加了所有的营养化合物的培养基上生长，直到用原养型回复载体进行转化。其中宿主细胞是或者已经被处理成对多个生物合成活性是缺陷的，原养型-回复标记系统可以被选择来回复一种或者多种或者所有的生物合成活性，剩余的仍然缺少的营养物通过在培养基中连续添加。在选择标记系统中，其中多于一种生物合成活性，和/或多于一种原养型被回复，大量的选择标记基因可以与一种载体一起被表达或者可以在不同的载体上分别地共表达。即使一个单一的代谢物是选择标记系统的目标，多重生物合成活性可以包含在选择标记系统。例如，来自于相同的合成代谢途径两个或者多个基因编码活性可以在一种载体上一起进行表达，或者可以在不同的载体上分别地共表达，从而回复与化合物的生物合成相关的原养型，该化合物是途径中的产品。
其中选择标记是一种抗生素抗性基因，相关的抗生素可以添加到培养基中来选择没有转化的和回复的细胞，如本领域中所公知的。
发酵
如这里所需要的，术语“发酵”包括两种实施方案，其中使用了精确的(literal)的发酵实施方案以及其中使用了其它的、非发酵培养模式的实施方案。发酵可以以任意的规模水平进行。一个实施方案中，这种发酵培养基可以选自丰富培养基，基本培养基(minimal media)，矿物盐培养基；丰富培养基可以被使用，但是优选不使用。另一个实施方案中，或者选择基本培养基或者选择一种矿物盐培养基。
另一个实施方案中，选择了一种基本培养基。另一个实施方案中，选择一种矿物盐培养基。矿物盐培养基是特别优选的。
在利用编码原养型能力酶的核酸构建体转化这种宿主细胞之前，宿主细胞可以维持在含有补偿的代谢物或者其类似物培养基上，，，该代谢物或者其类似物补偿了营养缺陷。在转化之后，这种宿主细胞可以在缺乏这种宿主细胞所缺乏的补偿代谢物的培养基上生长。在这种方法中，不含有选择标记回复原养型的宿主细胞被选择。同样的，在一种缺乏选择所需要的相关抗生素的培养基上，在转化之前，表达来自于含有抗生素抗性选择标记基因的表达载体的表达重组蛋白的细胞可以被保持。在转化之后和发酵的过程中，抗生素可以被添加到培养基中，以本领域中所公知的浓度，来选择非转化的和回复的细胞。
矿物盐培养基包括矿物盐和碳源比如，例如，葡萄糖，蔗糖，或甘油。矿物盐培养基的例子包括，例如，M9培养基，假单胞菌培养基(ATCC 179)，Davis和Mingioli培养基(参考，BD Davis & ES Mingioli，in J.Bact.60：17-28(1950))。用于准备矿物盐培养基的矿物盐包括那些选自，例如，磷酸钾，硫酸铵或氯化铵，硫酸镁或氯化镁，以及微量元素例如氯化钙，硼酸盐，和铁、铜、锰、和锌的硫酸盐。没有有机氮源，例如蛋白胨、胰蛋白胨、氨基酸、或者酵母提取物，被包括在这种矿物盐培养基中。作为替代，一种无机的氮源被使用并且这可以被选择自，例如，铵盐，氨水，和氨气。一种特定的矿物盐培养基将包含葡萄糖作为碳源。与矿物盐培养基相比，基本培养基也可以包含矿物盐和碳源，但是可以被补偿利用，例如，低水平的氨基酸，维生素，蛋白胨，或者其它的成分，虽然这些以非常低的水平添加。
一个实施方案中，使用下面表16中给出的组分来制备培养基。这种组分可以按照下面的顺序添加：首先(NH4)HPO4，KH2PO4和柠檬酸溶解到大约30升的蒸馏水，随后添加一种微量元素的溶液，进而添加防沫剂，例如Ucolub N 115。随后，在热灭菌后(例如在大约120℃)，添加灭菌的葡萄糖MgSO4和硫胺-HCL。可以利用氨水将pH调控在大约6.8。灭菌的蒸馏水随后被添加，以从最初的体积调整到371减去甘油的体积(123mL)。化学品可以是来自于不同供应商的商业可获得的产品，例如Merck。这种培养基可以允许假单胞菌种和相关细菌的高细胞密度培养(HCDC)。这种HCDC可以起始于批次过程，其跟随着两阶段(two-phase)发酵批次培养。在批次部分中非限定性生长后，生长可以被调控成一种缩小的特定生长速率经过一个3个双倍的时间段其中这种生物量浓度可以增加几倍。这种培养步骤的进一步的详细资料描述于Riesenberg，D.；Schulz，V.；Knorre，W.A.；Pohl，H.D.；Korz，D.；Sanders，E.A.；Ross，A.；Deckwer，W.D.(1991)″High cell densitycultivation of Escherichia coli at controlled specific growth rate″J Biotechnol：20(1)17-27。
按照本发明这种表达系统可以在任意的发酵模式中进行培养。例如，批次，发酵-批次，半连续，和连续发酵模式可以在这里使用。
按照本发明这种表达系统可以用于在发酵的任意水平(也就是，体积)基因表达。因此，例如，微升-水平，厘升水平，和1/10公升水平发酵体积可以被使用；和1升水平和更大的发酵体积可以被使用。一个实施方案中，发酵体积可以是或者大约1升。另一个实施方案中，发酵体积可以是或者大约5升，10升，15升，20升，25升，50升，75升，100升，200升，500升，1000升，2000升，10,000升，50,000升。
在本发明中，转化的宿主细胞的生长，培养，和/或发酵可以在允许宿主细胞存活的温度范围进行，优选一个在大约4℃到55℃大约的温度范围内，包含的。
细胞密度
与大肠杆菌或其它的细菌表达系统相比在表达重组蛋白中所需要的荧光假单胞菌的一个额外的优势包括荧光假单胞菌可以高细胞密度生长的能力。为了这个目的，本发明所述的荧光假单胞菌表达系统可以提供一种大约20g/L或更高的细胞密度。本发明所述的这种荧光假单胞菌表达系统可以同样提供至少大约70g/L的细胞密度，被描述成每升的生物量，生物量作为干细胞重量进行测量。
一个实施方案中，这种细胞密度应该为至少20g/L。另一个实施方案中，细胞密度可以为至少25g/L，30g/L，35g/L，40g/L，45g/L，50g/L，60g/L，70g/L，80g/L，90g/L，100g/L，110g/L，120g/L，130g/L，140g/L，或者至少150g/L。
另一个实施方案中，在诱导情况下细胞密度在20g/L到150g/L之间；20g/L到120g/L之间，20g/L到80g/L之间；25g/L到80g/L之间；30g/L到80g/L之间；35g/L到80g/L之间；40g/L到80g/L之间；45g/L到80g/L之间；50g/L到80g/L之间；50g/L到75g/L之间；50g/L到70g/L之间；40g/L到80g/L之间。
重组蛋白的表达水平
本发明所述的表达系统可以表达转基因多肽以一种在5％到80％细胞蛋白(％tcp)的水平。一个实施方案中，这种表达水平将是或者大约5％，8％，10％，12％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，或80％tcp。
分离和纯化
按照本发明所述生产的重组蛋白可以通过本领域中公知的标准技术来分离和纯化从而获得基本的纯度，包括，但是不限于，硫酸铵或者酒精沉淀，酸萃取，阴离子或者阳离子交换色谱，磷酸纤维素色谱，疏水的相互作用色谱，亲和力色谱，镍色谱，羟基磷灰石色谱，反相色谱，血凝素色谱，制备电泳，清洁剂溶解，选择性沉淀具有这种物质作为柱色谱，免疫纯化方法，和其他的方法。例如，具有确定的分子结合能力的蛋白可以相反地融合到一种配合体。具有适当的配合体，这种蛋白选择性地吸附到纯化柱并且随后以一种相对纯度的形式从柱上分离。这种融合蛋白随后被酶活力除去。另外，蛋白可以使用免疫亲和柱或者Ni-NTA柱进行纯化。通常的技术进一步描述在，例如，R.Scopes，Protein Purification：Principlesand Practice，Springer-Verlag：N.Y.(1982)；Deutscher，Guide to Protein Purification，Academic Press(1990)；美国专利No.4,511,503；S.Roe，Protein PurificationTechniques：A Practical Approach(Practical Approach Series)，Oxford Press(2001)；D.Bollag，etal.，Protein Methods，Wiley-Lisa，Inc.(1996)；AK Patra etal.，Protein ExprPurif，18(2)：p/182-92(2000)；和R.Mukhija，etal.，Gene 165(2)：p.303-6(1995)。也可以参考，例如，Ausubel，et al.(1987and periodic supplements)；Deutscher(1990)″Guide to Protein Purification，″Methods in Enzymology vol.182，and other volumes inthis series；Coligan，et al.(1996 and periodic Supplements)Current Protocols in ProteinScienceWiley/Greene，NY；和厂商关于蛋白纯化产品的使用，例如，Pharmacia，Piscataway，N.J.，或Bio-Rad，Richmond，Calif。结合可以将适当的片段进行融合的重组技术，例如，对于FLAG序列或者等同的其可以通过一种蛋白酶-删除序列进行融合的。也可以参考，例如，Hochuli(1989)Chemische Industrie 12：69-70；Hochuli(1990)″Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent″in Setlow(ed.)Genetic Engineering，Principle and Methods 12：87-98，Plenum Press，NY；和Crowe，et al.(1992)QIAexpress：The High Level Expression & Protein PurificationSystem QUIAGEN，Inc.，Chatsworth，Calif。
表达蛋白的监测通过本领域中已知的方法获得包括，例如，放射性免疫测定，Western印迹技术或免疫沉淀技术。
这种重组生产的和表达的酶可以利用多种方法从重组细胞培养物中回收和纯化，例如，高效液相色谱(HPLC)可以被应用到最后的纯化步骤，如果需要。
本申请中表达的几种蛋白可以形成不溶解聚集体(“包涵体”)。几种方案可以用于从包涵体中纯化蛋白。例如，包涵体的纯化典型地包括萃取，分离和/或纯化通过破碎宿主细胞得到的包涵体，例如，通过在一种50mM TRIS/HCL pH 7.5，50mM NaCl，5mM MgCl2，1mM DTT，0.1mM ATP，和1mM PMSF的缓冲液中孵化。细胞悬浮物使用French Press的2-3步的典型的细胞溶解。细胞悬浮物也可以利用Polytron(Brinknan Instruments)或者低温超声波进行均质化。可选择的溶解细菌方法对于本领域的技术人员是显而易见的(参考，例如，Sambrook等人，supra；Ausubel等人，supra)。
如果需要，包涵体可以被溶解，溶解的细胞悬浮液主要被离心后去除不溶解的物质。形成包涵体的蛋白质可以利用兼容的缓冲液稀释或者透析的方式复性。适当的溶剂包括，但是不限于尿素(从大约4M到大约8M)，甲酰胺(至少体积比为大约80％)，盐酸胍(大约4M到大约8M)。尽管盐酸胍和相似的试剂是变性剂，但是这种变性不是不可逆转的并且除去(例如通过透析)或者稀释这种变性剂可能发生复性，允许免疫学的和/或者生物学性能蛋白质的重新形成。其它适合的缓冲液对本领域的技术人员是已知的。
可选择地，从宿主外周胞质中纯化重组蛋白质或者多肽是可能的。宿主细胞溶解之后，当重组蛋白质被输出到宿主细胞的外周胞质，菌体的外周胞质片段可以通过低温渗透震动加上其它已知在该领域的技术方法分离出来。例如，为了从外周胞质中分离重组蛋白质，细菌细胞可以被离心成为小块。小块可以悬浮于一种包含20％蔗糖的缓冲液中。为了溶解细胞，细菌被离心并且小块被悬浮在冰冻的5mM MgSO4，在冰浴中保留大约10min。细胞悬浮物离心，上清夜移出并且保存。重组蛋白质存在于上清夜中可以从宿主蛋白质中通过在本领域技术人员公知的标准分离技术分出来。
最初的盐分馏法可以从许多多余的宿主细胞蛋白质(或者从细胞培养基中衍生出来的蛋白质)分离出来感兴趣的重组蛋白质。这样的例子之一是硫酸铵。硫酸铵通过有效的去除蛋白质混合物中含水量形成蛋白质沉淀。蛋白质然后在它们溶解度下沉淀。蛋白质越是疏水，在较低的硫酸铵浓度下越容易形成沉淀。一个典型的方法就是向蛋白质溶液中加入饱和硫酸铵以至于使硫酸铵的最终浓度达到20-30％。这个浓度使得最疏水的蛋白质沉淀。这种沉淀被去除(除非感兴趣的蛋白质是疏水的)并且加入硫酸铵到上清液达到一个使感兴趣蛋白质沉淀的浓度。沉淀物然后溶解在缓冲液，如果需要也可以通过透析或者过滤去除多余的盐。其它依赖于蛋白质溶解度的方法，如冷乙醇沉淀，是本领域普通技术人员所公知的并且可以用于分馏复杂蛋白质混合物。
重组蛋白的分子量可以通过使用不同孔径超滤膜(例如，Amicon or Millipore膜)用于分离从比其更大或者更小的蛋白质。第一步，蛋白质混合物通过可以将比兴趣蛋白质的分子量小的低分子量去除的孔径的膜超滤。超滤后的保留物然后可以通过膜超滤去除比感兴趣蛋白质分子量大的分子。重组蛋白质会通过膜进入滤器，滤液可以进行色谱分离，如下面所述。
重组蛋白质也可以依靠它的大小、净表面电荷、疏水性和配基的亲和力同其它蛋白质中分离。另外，蛋白质产生的抗体可以偶联成为柱矩阵(matrice)，蛋白质得到免疫纯化。所有这些方法在该领域内是公知的。本领域技术人员公知的色谱技术可以在任何规模中利用并使用许多不同制造商的仪器(例如PharmaciaBiotech)执行。
复性与再折叠
不溶解的蛋白质可以复性或者再折叠产生二级或者三级蛋白质结构构象。蛋白质的再折叠步骤可以使用，作为必需(as necessary)，完成重组产物的构象。再折叠和复性活性可以利用本领域内已知的促进蛋白质的分裂/结合的试剂来完成。例如，蛋白质可以利用二硫苏糖醇孵育，接着是与氧化型谷胱甘肽二钠盐孵育，最后利用包含折叠试剂如尿素的缓冲液孵育。
重组蛋白质也可以复性，例如通过磷酸盐缓冲液(PBS)或者50mM醋酸钠pH 6缓冲液加入200mM NaCl透析。可选择地，蛋白质可以当固定在一个柱子时再折叠，例如通过利用在500mM NaCl中的线性梯度的6M-1M尿素，20％甘油，20mMTris/HCl pH 7.4，包含蛋白酶抑制剂的Ni NTA柱。复性可以在1.5小时或者更长时期执行完成。蛋白质复性之后可以通过加入250mM咪唑(immidazole)洗涤。可以通过最后一步在PBS或者50mM醋酸钠pH 6缓冲液加入200mM NaCl中透析去除咪唑。纯化后的蛋白可以保存在4℃或者冷冻在-80℃。
其他方法包括，例如它们被叙述在MH Lee等人，Protein Expr.Purif.，25(1)：p.166-73(2002)，W.K.Cho等人.，J.Biotechnology，77(2-3)：p.169-78(2000)，Ausubel，等人(1987和增刊)，Deutscher(1990)《蛋白质纯化指南》(Guide toProteinPurification)，″Methods in Enzymology vol.182，和该系列的其他期刊，Coligan，等人.(1996和增刊)Current Protocols in Protein ScienceWiley/Greene，NY，S.Roe，Protein Purification Techniques：A Practical Approach(Practical Approach Series)，Oxford Press(2001)；D.Bollag，等人，Protein Methods，Wiley-Lisa，Inc.(1996)。
                            VI.重组多肽
本发明提供在细菌表达体系中的蛋白质改良产物。重组多肽的例子可以用于本发明的包括从原核和真核生物体中衍生出来的多肽。这些生物体包括古细菌(Archea)，细菌，真菌的生物体，包括原生生物界，真菌界，植物界和动物界的生物体。
可以利用本发明的蛋白质的类型包括，非限定性的例子例如酶，它们负责催化活细胞中的上千种的化学反应；角蛋白，弹性蛋白和胶原蛋白，它们是结构，或者支持蛋白的重要类型；血红蛋白和其它气体传输蛋白质；卵清蛋白质，酪蛋白和其它营养分子；抗体，免疫系统的分子；激素蛋白质，用于调节新陈代谢；和一些执行机械工作的蛋白质，如肌动蛋白质和肌浆球蛋白，肌肉收缩蛋白质。
其它特殊的非限定性的多肽，包括分子例如，血管紧张肽原酶，一种生长激素，包括人类生长激素，牛生长激素；生长激素释放因子；副甲状腺激素；甲状腺刺激激素；脂蛋白；α-1抗胰岛素，胰岛素A-链；胰岛素B-链；胰岛素原；血小板蛋白质；滤泡刺激激素；降血钙素；黄体激素；胰高血糖素；凝结因子如VIIIC因子，IX因子，组织因子和von Willebrands因子；抗凝结因子如蛋白质C，心房利钠因子(atrial naturietic factor)，肺表面活性剂；血纤维蛋白溶酶原激活剂，例如尿激素或者人类尿或者组织形式的血纤维蛋白溶酶原激活剂(t-PA)；铃蟾肽(bombesin)；凝血酶；造血生长因子；瘤坏疽因子-α和-β；脑啡肽酶；血清白蛋白例如人血清白蛋白；缪勒式抑制物质；松弛肽A-链；松弛肽B-链；预先松弛肽(prorelaxin)；鼠促性腺激素结合蛋白；一种微生物蛋白，例如β-内酰胺酶；脱氧核糖核酸酶；抑制素；活性分子；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或者生长因子受体；整联蛋白；蛋白质A或者D；类风湿因子；神经因子例如大脑起源神经因子(BDNF)，神经营养蛋白-3，-4，-5，or-6(NT-3，NT-4，NT-5，or NT-6)，或者神经生长因子如NGF-β，心脏营养(心脏肥大因子)如心脏营养蛋白-1(CT-1)；血小板起源的生长因子(PDGF)；纤维原细胞生长因子如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转换生长因子如TGF-α与TGF-β，包括TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3，TGF-β4或者TGF-β5；类胰岛素生长因子-I和-II(IGF-I和IF-ION；des(1-3)-IGF-I(大脑IGF-I)；类胰岛素生长因子结合蛋白；CD蛋白如CD-3，CD-4，CD-8，和CD-19；促红细胞生成素；骨诱导(osteoinductive)因子；免疫毒素；骨形成蛋白(BMP)；干扰素如干扰素-α，-β和γ；集落刺激素(CSFs)，例如，M-CSF，GM-CSF，和G-CSF；白细胞介素(ILs)，如IL-1至IL-10；anti-HER-2抗体；超氧化歧化酶；T-细胞受体；表面膜蛋白；腐化加速因子(decay accelerating factor)；滤过性毒菌抗原如AIDS包膜的一部分；运输蛋白；自导引受体；地址素(addressins)；调节蛋白；抗体；和任何以上名单中多肽的片段。
根据本发明被表达的重组多肽可以从多聚核糖核酸中表达，其中目标多肽的编码序列可操作的连接在转录和翻译调控序列以形成功能性基因，该基因可以在宿主细胞中表达多肽或蛋白质。编码序列可以是一个天然的编码目标多肽序列，如果可以获得，但是更多优选在选择表达宿主细胞使用已经被筛选的、改良的或者最优化的序列。利用，通过合成基因反应假单胞菌如荧光假单胞菌的密码子使用偏好。结果获得的基因被构建到或者被插入一个或者更多载体，然后转到表达宿主细胞。核酸或者多聚核苷酸被提供“可表达形式”的表述指通过选择的细菌表达宿主细胞表达包含至少一种基因核酸或者多聚核苷酸。
分子遗传学和遗传工程技术所需要的广泛序列信息是被广泛大众化的获得。接近完成哺乳动物的核苷酸序列，和人一样，基因，cDNA序列，氨基酸序列和基因组可以从GenBank中位于URL的地址所得到。http：//www.ncbi.iiih.gov/Entrez.附加信息可以通过GeneCards得到，它是一个结合了有关基因和它们的产物以及来自于Weizmann基因组和生物信息科学院(http：//bioinformatics.weizmann.ac.il/cards/)的生物医学应用的电子百科全书，核苷酸序列信息可以从EMBL核苷酸序列数据库(http：//www.ebi.ac.uk/emb)或者DNA基因库或者日本DDBJ中获得(http：//www.ddbj.nig.ac.ip/)；其它关于氨基酸序列的网址包括乔治敦蛋白信息资源的网址(http：//www-nbrf.georgetown.edu/pir/)和瑞士-Prot(http：//au.expasv.org/sprot/sprot-top.html)。
                                    实施例
实施例1
在荧光假单胞菌宿主细胞表达体系中构建pyrF选择标记体系
除了另外说明的所需试剂均从Sigma-Aldrich(St.Louis MO)获得。LB是在明胶胶囊中含有10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物和5g/LNaCl(BIO 101)。如果需要，尿嘧啶(BIO 101，Carlsbad CA)或者L-脯氨酸加入至最终浓度为250μg/mL，四环素加至15μg/mL，LB/5-FOA培养皿中包含带有250mM尿嘧啶和0.5mg/mL 5-氟乳清酸核苷酸(5-fluoroorotic acid5-fluoroorotic acid)(5-FOA)的LB。M9培养基包含6g/L Na2HPO4，3g/L KH2PO4，1g/L NH4CI，0.5g/L NaCl，10mMMgSO4，1x HoLe微量元素溶液，pH7。加入葡萄糖至最终浓度为1％。1000x HoLe微量元素溶液是2.85g/L H3BO3，1.8g/L MnCl2·4H2O，1.77g/L酒石酸钠，1.36g/L FeSO4·7H2O，0.04g/L CoCl2·6H2O，0.027g/L CuCl2·2H2O，0.025g/L Na2MoO4·2H2O，0.02g/L ZnCl2。
                        所使用的寡核苷酸
MB214pyrFl(黑体为NotI位点)
5′-GCGGCCGCTTTGGCGCTTCGTTTACAGG-3′(SEQ ID NO：14)
MB214pyrR1(黑体为PvuI位点；下划线黑体为KpnI位点)
5′-CGATC GGGTACCTGTCGAAGGGCTGGAGACAT-3′(SEQ ID NO：15)
pyrFPstF(黑体为PstI位点)
5′-AACTGCAGGATCAGTTGCGGAGCCTTGG-3′(SEQ ID NO：16)
pyrFoverlap
5′-TGCTCACTCTAAAAATCTGGAATGGGCTCTCAGGC-3′(SEQ ID NO：17)
pyrFXbaR2(黑体为XbaI位点)
5′-GCTCTAGATGCGTGGCTGGATGAATGAA-3′(SEQ ID NO：18)
pyranaIF
5′-GGCGTCGAACAGGTAGCCTT-3′(SEQ ID NO：19)
pyranaIR
5′-CTCGCCTCCTGCCACATCAA-3′(SEQ ID NO：20)
M13F(-40)
5′-CAGGGTTTTCCCAGTCACGA-3′(SEQ ID NO：21)
                   从荧光假单胞菌中克隆pvrF基因
pyrF基因是从荧光假单胞菌中通过聚合酶链式反应(PCR)扩增方式克隆的，利用的引物分别是结合pyrF基因起始密码子上游连接297bp和终止密码子的下游212bp的MB214pyrFl和MB214pyrRl。限制性位点包含在5’末端，以促进进一步的克隆反应。pyrF读码框(ORF)扩增区域的上游被预测能够包括天然pyrF的上游启动子的足够长度。一个在pyrF读码框(ORF)下游大约14～117bp的强大的茎环状结构，其可以是转录的终止子，也可以包含在下游的侧翼区域。
为了pyrF基因的PCR扩增，高保真的PROOFSTART DNA聚合酶混合在50μL反应体系，该体系包含制造商(Qiagen，Valencia CA)提供的缓冲液，0.3mMdNTPs((Promega，Madison，WI)，1μM的每种MB214pyrFl和MB214pyrRl引物，和0.3μg的来自荧光假单胞菌MB214基因组DNA。扩增条件是95℃5min，94℃变性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸2min，共30个循环，最后是72℃10min。该反应在1％SEAKEM GTG琼脂糖(来自于Bio Whittaker Molecular Applications，Rockland ME)凝胶中分离。从凝胶中切离预期的1.2kb的带，并且通过从Millipore(Bedford MA)的ULTRAFREE-DA(超速)离心凝胶喷雾器(nebulizer)纯化；使用MICROBIOSPIN6 P-6聚丙烯酰胺旋转柱(Bio-Rad，Hercules CA)在Tris盐酸缓冲液中除盐。
克隆的基因包含编码乳清酸核苷-5’-磷酸盐脱羧酶单一的读码框(ORF)。该基因的身份可以通过其整个长度(232个残基中的209)与来自曾经被报道过(Strychetal.，1994)的铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的pyrF基因，，的高度类似性(P-value of3.3×10-78)得到进一步确认为pyrF。荧光假单胞菌菌株已经发现没有其它的pyrF基因的拷贝。
测序由Dow化学公司完成。pyrF序列参见SEQ ID NO：1。
                        pyrF(-)荧光假单胞菌的构建
为了构建pyrF(-)荧光假单胞菌，细胞基因组的pyrF基因通过删除介于和包括起始和终止密码子它们的读码框(ORF)而改变。这种删除是通过在体外将pyrF区域的侧翼上游和下游区域融合到非复制质粒上，而后利用等位基因交换实现的，即同源重组，在MB101中用删除的等位基因代替内源的pyrF基因。
为了构建侧翼区域的融合，利用了“Megaprimer”的方法(Barik 1997)，其间欲删除的上游区域和下游区域被随后利用与所需删除的序列两边的同源的重叠引物进行PCR扩增，所以侧翼区域可以连接，除去pryF的读码框(ORF)。上游区域可以从MB214基因组DNA利用上面提及的Proofstart聚合酶(Qiagen)，pyrFPstF和pyrF的重叠引物，1分钟的延伸而扩增出来。在使用连接到玻璃奶(来自BiolOl，Carlsbad，Calif.，USA的GENECLEAN Spin试剂盒)凝胶纯化以后，1kb产物可以用做Megaprimer来进行第二次扩增。
因为第二步扩增目标产物是非常困难的，利用PCR扩增准备包含基因组pyrF区域的模板，以便增加模板的数量。利用HOTSTARTAQ DNA聚合酶(来自于Qiagen，Valencia CA)，荧光假单胞菌基因组DNA，pyrFPstF和pyrFXbaR2引物。然后利用该模板，Megaprimer和pyrFXbaR2引物，和HOTSTARTAQ DNA聚合酶，通过PCR扩增该删除产物，扩增条件为95℃15min，94℃变性30秒，59℃退火30秒，72℃延伸2min，共30个循环，最后是72℃3min。预期2kb条带通过电泳与其它产物分离，然后按照上面条件凝胶纯化，按照厂商的说明书克隆到质粒pCR2.1Topo(Invitrogen，Carlsbad CA)，形成pDOW1215-7。测序显示pDOW1215-7的PCR扩增区域在扩增过程引入了3个突变。所有3个改变在pryF终止密码下游的112bp之内。测序该区域是非常困难，因为反应过程在该区域内停止。通过对该区域编码的RNA二级结构的M-折叠(GCG)的分析表明存在着一个稳定的茎环结构和一系列的尿苷残基，其为不依赖ρ转录终止子的特征结构。没有突变发生在读码框(ORF)。
质粒pDOW1215-7用于删除MB101中的染色体pyrF基因。为了达到此目的，首先，荧光假单胞菌的感受态细胞根据Artiguenave等(1997)的方法制得，与0.5μg纯化后质粒转化。转化物通过平铺到含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中进行选择。这种质粒不能在荧光假单胞菌中复制，所以对卡那霉素有抗性的克隆得自该质粒已经整合进入染色体的细胞。质粒的整合位点可以通过PCR方法分析，使用HOTSTARTAQ聚合酶，引物pryanalF和M13F(-40)，57℃退火，4分钟的延伸时间。十个分离物中一个(MB101::pDOW1215-7#2)包含了插入进入下游区域的pDOW1215-7(2.8kb分析产物)，其他九个进入上游区域(2.1kb分析产物)。
其次，为了确认菌株已经失去了通过同源区域之间的重组的整合质粒，下面的分析PCR过程可以使用：单克隆pDOW1215-7#2接种到补充了250mM尿嘧啶的LB中，生长过夜，然后涂布在含有尿嘧啶和500μg/mL的5-氟乳清酸核苷酸(5-FOA-Zymo Research，Orange CA)的LB平板上。八个克隆PCR被检测，，PCR条件是HOTSTARTAQ聚合酶，pyranalF和pyranalR引物，57℃退火，延伸4分钟。从母本MB101中扩增产物的预期大小是3.2kb，或者如果pyrF基因被删除后是2.5kb。每个克隆预期产生来自pyrF删除的2.5kb的带。前三个克隆被纯化后命名为PFG116，PFG117，和PFG118(也称为DC36)。三个单菌落表现为预料的pyrF删除的表型，即：它们对卡那霉素敏感，尿嘧啶是生长所必需的，它们对5-FOA有抵抗力。PFG118的DNA序列是与pDOW1215-7的扩增区域相同；例如在直接位于pyrF的下游的茎环结构上有三个突变，沿着pyrF删除部分插入到PFG118基因组，。
          利用pyrF基因作为荧光假单胞菌表达系统的选择标记
pyrF基因作为选择性标记物的能力可以通过将其克隆到pMYC表达质粒中来检测，这种质粒包括一个现有的四环素抵抗标记和在tac启动子调控下的目标酶编码序列。为此，质粒pMYC5088在37℃下在含有NEB缓冲液4和0.1mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)(New England Biolabs，BeverlyMA)的50μL体系中用SnaBI消化2小时。反应的混合物在70℃保持20分钟以灭活酶，然后按照上面的进行凝胶纯化。60ng的SnaBI-消化后的pMYC5088可以和50ng的MB214pyrFl-MB214pyrRlPCR产物进行连接，利用DNA连接试剂盒(Epicentre Technologies，Madison WI)。25℃反应1小时后，反应混合物在70℃保持20分钟后结束。反应结果在制造商推荐条件下转化至大肠杆菌JM109感受态细胞(Promega Corp.，Madison WI)
转化株在含有15μg/mL四环素的LB培养基筛选。质粒DNA从12个克隆中利用QiaPrep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen，Valencia CA)准备，经过Notl和EcoRI筛选，表明其中一个克隆包含预期的克隆，pDOW1249-2(图2)。质粒pDOW1249-2被转化到包含了含有lacI抑制表达盒和卡那霉素抑制标记基因的pCN质粒的pyrF(-)荧光假单胞菌中。克隆在摇瓶和20-L发酵罐中检测到。
克隆在含有卡那霉素的基本盐培养基中生长，但是培养基不含有四环素，pDOW1249-2质粒的唯一选择压力由在质粒上的pyrF基因的能力提供，以补偿染色体上pyrF删除部分。由聚丙烯酰胺凝胶分析所决定，由在摇瓶检测中新菌株产生的目标蛋白质的数量接近于对照菌株，对照菌株包含相同的两个质粒的，但是在pDOW1249-2中缺乏pyrF基因的pyrF(+)荧光假单胞菌的系统，在相同培养基但是为了维持该质粒另外加入四环素(数据没有提供)。两种菌株在20-L规模进一步分析中非常接近，基于在聚丙烯酰胺凝胶和摇瓶中OD575的值所呈现的目标蛋白质的量。两种菌株对于参照菌株都有在正常范围内可以观察的一定目标蛋白质的积累量(图1)。
实施例2
荧光假单胞菌宿主细胞内表达系统的pvrF-proC双重营养缺陷型选择性标记
                             系统的构建
在此使用的寡核苷酸表达系统
proC1
5′-ATATGAGCTCCGACCTTGAGTCGGCCATTG-3′(SEQ ID NO：22)
proC2
5′-ATATGAGCTCGGATCCAGTACGATCAGCAGGTACAG-3′(SEQ ID NO：23)
proC3
5′-AGCAACACGCGTATTGCCTT-3′(SEQ ID NO：24)
proC5
5′-GCCCTTGAGTTGGCACTTCATCG-3′(SEQ ID NO：25)
proC6
5′-GATAAACGCGAAGATCGGCGAGATA-3′(SEQ ID NO：26)
proC7
5′-CCGAGCATGTTTGATTAGACAGGTCCTTATTTCGA-3′(SEQ ID NO：27)
proC8
5’-TGCAACGTGACGCAAGCAGCATCCA-3’(SEQ ID NO：28)
proC9
5′-GGAACGATCAGCACAAGCCATGCTA-3′(SEQ ID NO：29)
genF2
5′-ATATGAGCTCTGCCGTGATCGAAATCCAGA-3′(SEQ ID NO：30)
genR2
5′-ATATGGATCCCGGCGTTGTGACAATTTACC-3′(SEQ ID NO：31)
XbaNotDraU2连接序列
5′-TCTAGAGCGGCCGCGTT-3′(SEQ ID NO：32)
XbaNotDraL连接序列
5′-GCGGCCGCTCTAGAAAC-3′(SEQ ID NO：33)
       从荧光假单胞菌中克隆proC并且形成一个
            包含proC的pCN表达质粒
在pCN511acI中用proC代替抗生素抗性基因
proC ORF和接近上游和下游序列的100bp的基因是从MB101基因组DNA利用proC1和proC2为引物扩增，56℃退火和1分钟的延伸扩增的。在凝胶纯化1kb产物后SacI熔解，该片段克隆到SacI-熔解的pDOW124(来自pCN511acl的增加了聚合连接体，并且用庆大霉素抗性基因替代卡那霉素抗性基因而得的质粒)，生成pDOW1264-2。该质粒在proC(-)突变株PFG932中检测，其调控pDOW1249-2淀粉酶的合成的能力。表达目标酶产物水平在20-L规模上接近于双重抗生素抗性标记的对照菌株DC88的产量(数据未提供)。
genR抗生素标记基因然后从pDOW1264-2(图3)中除去而形成一个没有抗生素标记的含有proC和lacI的质粒，除去genR基因是通过限制性内切酶BamHI对pDOW1264-2消化，得到6.1kB的纯化片段，连接到其本身，电转化到proC(-)荧光假单胞菌宿主PFG1016中完成。克隆通过限制性内切酶EcoRI检验的。所得到的质粒被命名为pDOW1306-6。EcoRI限制性内切的分析和通过BamHI连接测序确认了质粒和该基因正确方向。
测序工作由Dow化学公司完成。proC序列参见SEQ ID NO：4。
         含有用pyrF标记替代抗生素抗性的标记的
                目标酶表达质粒的构建
没有抗生素标记产物的质粒，pDOW1269-2，包含一个tac启动子的调控下目标酶编码基因，是由PvuI在DOW1269-2中限制性切除去tetR/terA基因而构建的。将来自MB214的pyrF基因插入pMYC5088后形成的，pDOW1249-2如实施例1所述准备。10.6kb的PvuI片段凝胶纯化后，连接其自身，电转化到PFG118/pCN5llacI，涂在包含卡那霉素的M9葡萄糖培养基(以保留质粒pCN5llacI)。提取质粒DNA并对其用限制性内切酶NcoI酶切分析的分离，被限制性内切后两个分离物与期望的条带一致。两个分离物均被PvuI连接后测序，确认质粒的相同性和其在基因内部正确的方向。
                利用pyrF和proC的基因组删除来
                   构建荧光假单胞菌菌株
PFG118，一种含有pryF删除基因的荧光假单胞菌MB101菌株，在实施例1中已经描述。
        pDOW1261-2的构建，用于基因替换和删除的载体
载体pDOW1261-2被设计来创造完全删除基因组DNA，使用通过正向交叉和反向交叉(cross-in/cross-out)方法交换标记物(Toder 1994；Davison 2002)，通过合并下列物性：
·ColEI复制原点，其仅在大肠杆菌发挥功能，而不存在荧光假单胞菌中发挥功能；
·选择性标记物(tetR/tetA)用于将质粒整合进入染色体；
·一种反向选择的标记(pyrF)其允许进行插入质粒丢失的选择(只要宿主菌株是pyrF-)；丢失pyrF基因的细胞对5-FOA有抗性；和
·钝末端克隆位点，SrfI，有一个不平常的8bp的识别位点，如果欲插入缺失该位点，插入的功效可以通过在反应体系中加入SrfI(Stratagene，La Jolla CA)以重新切开没有连接插入物的载体而被提高。
为了构建这个载体，5kb的包含tetR，tetA，和pyrF基因的PstI到EcoRI片段克隆到经过PstI和EcoRI酶切的pCRScriptCAM(Stratagene，La Jolla CA)中，产生pDOW1261-2。
               构建从染色体删除proC的载体
构建proC的删除部分，proC基因上游和下游侧翼区域的拷贝通过PCR方法连接在一起，然后克隆到pDOW1261-2基因的替换载体。proC7引物，搭建了proC的ORF，被设计删除整个从ATG起始密码子到TAG终止密码子的编码序列。另外终止密码子的下游16bp的序列也包括在删除部分。
为了使proC上游和下游区域的PCR融合，使用了PCR扩增的Megaprimer方法(Barik 1997)。为了制作megaprimer，proC开放读码框的直接上游的0.5kb区域从MB214基因组DNA中通过PCR方式扩增，以proC5和proC7作为引物。引物proC7覆盖了proC ORF的上游和下游区域。聚合酶链式反应是1uM的引物，每种200uM的四种dNTPs，和Herculase高保真聚合酶(Stratagene，La Jolla CA)在制造商推荐的缓冲液中进行。Herculase是一种高保真酶，主要包含Pfu聚合酶，得到平末端。扩增过程是95℃2分钟，30个循环为95℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸1分钟每kB，最后是72℃10分钟。扩增产物由1％琼脂糖凝胶电泳在TBE中分离并用溴化乙锭显色。包含DNA的凝胶片段从凝胶中切下并且按照上面的方法纯化。
proC基因下游的1.3kb区域利用引物proC和proC6扩增，作为下一步反应的模板。同样的扩增条件被应用，除了退火温度为60℃。反应由琼脂糖凝胶检测，然后利用StrataPrep PCR纯化试剂盒进行纯化(Stratagene，La Jolla CA)。
为了制造删除融合部分的第二个步骤，megaprimer和proC6用做PCR反应中引物，以proC-proC6PCR反应产物作为模板。退火温度是61℃，延伸时间2分钟。1kb的PCR产物被纯化，平末端连接到经由SrfI酶切过的自毁载体pDOW1261-2上。SrfI已经包括在连接物中，为了降低不必要的载体的再次连接，如制造商说明书上所示(pCRScriptCam Cloning Kit-Stratagene，La Jolla CA)。连接物通过电转化(2mM gap cuvette，25，uF，2.25kV，200 Ohms)(Artiguenave et al.1997)至DH10β(GibcoBRL Life Technologies，now Invitrogen，Carlsbad CA)，分离物通过限制酶DraIII筛选。每个分离物的PCR扩增区域均由Dow化学公司测序；pDOW1305-6经验证包含正确的基因组DNA序列。
               荧光假单胞菌pyrF-proC双删除的形成
为了制作双删除的菌株，如上面所述利用pDOW1305-6电转化PFG118。克隆体的分析PCR以proC8和M13/pUC反向序列引物(-48)(只与质粒杂交)(NewEngland Biolabs，Beverly MA)，利用HotStar Taq酶(Qiagen，Valencia CA)，退火温度为59℃，延伸时间为4分钟，显示22个分离物中有9个具有整合进入proC的上游区域的质粒，22个中有7个具有整合进入下游区域的质粒(数据未提供)。每个方向的3个被纯化成为单克隆。三个分离物PFG118::1305-6.1，-6.8，-6.10已经插入到上游区域；PFG118::1305-6.2，-6.3，-6.9这三个单体插入到下游区域。
为了给已经携带质粒和离开一个删除部分的染色体基因之间同源重组的细胞(To select for cells that have carried out a homologous recombination between the plasmidand the chromosome genes thereby leaving a deletion)，PFG118::1305-6.1和-6.2在含有尿嘧啶和脯氨酸补充物的50mL的LB中生长为稳定期，然后接种在含有尿嘧啶和脯氨酸添加物的LB-5-FOA。通过重组丢失了整合质粒的细胞也丢失了pyrF基因，所以预期能够抵制以其它方式转变成毒性物质的5-FOA。利用proC8和proC9分析的PCR执行着区分细胞丢失质粒和更新的原始序列，它们已经丢失了删除部分。两个带有预期的1.3kb带的分离物分别从两个选择物中挑选出来，命名为PFG1013，PFG1014，PFG1015和PFG1016(也称为DC164)。所有这四个分离物都不能在M9葡萄糖中生长除非加入脯氨酸和尿嘧啶，而且都对四环素敏感。PFG118(野生型proC)和PFG1016(删除了proC)的基因组区域通过PCR(引物是proC8和proC9，HotStar Taq聚合酶，63℃退火，3分钟延伸)扩增和测序。菌株PFG1016的proC5和proC6之间的区域与母本相同，除了预期删除的835bp。
 双重营养缺陷选择标记物表达体系PFG1016/pDOW1306-6pDOW1269-2的构
                                建
质粒从菌株PFG118 pCN511acI pDOW1269-2通过HISPEED质粒Midi试剂盒(Qiagen，Valencia CA)分离出来。pDOW 1269-2从pCN511acl通过琼脂糖凝胶电泳部分纯化，电转化至PFG1016 pDOW1306-6。转化株在没有添加剂的M9/葡萄糖培养基上筛选。因为存在一些包含pCN5llacI污染pDOW1269-2制备品的转换进入细胞的可能，每个转化株中的三个分离物被检测对卡那霉素的敏感性，携带pCN5llacI的抗生素标记物；所有六个发现成敏感性。这六个菌株发现在目标酶活性检测中表达目标酶。PCR分析表明所有六个都包含染色体的proC删除。
从转化株分离出来的质粒限制性内切与预期的模式相同。
           双重营养缺陷标记表达系统在摇瓶中的性能测试
如实施例1中所述，六个菌株在摇瓶中测试。通过在26小时之后加入IPTG对目标酶表达进行诱导。六个菌株的OD575值与双抗生素抗性标记表达系统对照组DC88一致。通过SDS-PAGE测试所有六个的目标酶产物水平也与对照相当。最高OD575的两个菌株1046和1048被选做进一步特征研究。
        双重营养缺陷标记表达系统在20-L发酵罐中性能测试
菌株1046和1048被选做在20-L生物发生器中进一步测试。通过在26小时之后加入IPTG对目标酶表达进行诱导。两个菌株都到达对照菌株DC88的OD575和目标酶活性的正常范围的性能水平。这两个菌株的性能的平均水平如表1所示。在接种状态和在26小时后刚开始诱导前的样品中制备的质粒的限制酶切表明与预期的模式相一致。同一样品所携带的基因组DNA的分析PCR证明proC删除和pyrF删除部分的保持力。25小时的样品的一部分涂平板在四环素，庆大霉素，或者卡那霉素添加的培养基上；没有发现细胞生长，证明缺乏抗生素抑制基因活性。
菌株1046(也称为DC167)在20-L生物发生器中的分析重复两次，出现相近的结果。接种时和发酵25小时后(感应现象出现之前)的质粒稳定性通过从稀释和涂在完全培养基的复制法(replica)而测试。两个质粒出现高于97％的克隆检测，表明在没有质粒的缺乏交叉传递回复突变型(cross feeding revertants)能够存活并且在荧光假单胞菌中维持表达载体。
                              结果
两种pyrF表达系统都具有与只使用抗生素抑制标记物的对照体系相同的性能(图1)。对于对照菌株，没有交叉传递(cross-feeding)的副反应，因为任何从破裂细胞而来的外源代谢物的都不能降低或者除去由培养基中抗生素提供的选择压力。预期在两个pyrF表达体系的由于交叉传递导致的性能的预期降低非常惊讶的没有发现。
实施例3
           在荧光假单胞菌中的lacI，lacIQ和lacIQI染色体整合
三个荧光假单胞菌菌株已经构建，每个与三个不同的大肠杆菌lacI等位基因，lacI(SEQ ID NO：9)，lacIQ(SEQ ID NO：11)，和lacIQI(SEQ ID NO：12)，整合到染色体。三个菌株展示不同的LacI抑制积累量。每个菌株都在荧光假单胞菌DC36果聚糖蔗糖转移酶位点(SEQ ID NO：13)携带一个lacI基因的单拷贝，它是MB101的衍生物(参见TD Landry等人，″Safety evaluation of an a-amylase enzymepreparation derived from the archaeal order Thermococcales as expressed inPseudonaonas fluorescens biovar I，″Regulator Toxicology andPharraacology 37(1)：149-168(2003))通过从其中删除pyrF基因而形成，如上面所述。
没有载体或者其它外来DNA序列保留在菌株中。菌株不含抗生素抗性基因并且还包含pyrF删除，允许维持一个携带pyrF+基因的表达质粒在不含尿嘧啶添加剂的培养基中生长。蛋白质产物完全不含抗生素抗性基因和抗生素。
MB214包含lacI-lacZYA染色体的插入在美国专利5,169,760中有描述。MB214也包含在LacI蛋白的C末端点的一个复制，加入大约10kDa的分子量至LacI抑制剂的分子量。
       用于插入基因至果聚糖蔗糖酶位点的载体pDOW 1266-1的构建
质粒pDOW 1266-1通过荧光假单胞菌的果聚糖蔗糖酶(SEQ ID NO：13)的上游和其中区域的PCR扩增而构建的，利用XbaI位点替代起始密码子，利用Megaprimer方法，参见ABarik，″Mutagenesis and Gene Fusion by Megaprimer PCR，″in BA White，PCR Cloning Protocols 173-182(1997)(Humana)。PCR是利用HERCULASE聚合酶(Stratagene，Madison WI，USA)，引物LEV1(SEQ ID NO：34)和LEV2(SEQ ID NO：35)，荧光假单胞菌MB214基因组DNA(参见下面的寡聚核苷酸序列)为模板而执行的。引物LEV2(SEQ ID NO：35)包含插入XbaI位点的序列。反应条件为95℃2分钟，95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环，最后是72℃10分钟。1kb的产物凝胶纯化后作为下一个反应的引物之一，同LEV3(SEQ ID NO：36)，利用MB214基因组DNA作为模板，相同的条件，除了延伸时间为2分钟。2kb的产物凝胶纯化，再次与LEV2(SEQ IDNO：35)和LEV3(SEQ ID NO：36)再扩增以提高数量。
所用的寡核苷酸
LEV1(SEQ ID NO：34)
5′-TTCGAAGGGGTGCTTTTTCTAGAAGTAAGTCTCGTCCATGA
LEV2(SEQ ID NO：35)
5′-CGCAAGGTCAGGTACAACAC
LEV3(SEQ ID NO：36)
5′-TACCAGACCAGAGCCGTTCA
LEV7(SEQ ID NO：37)
5′-CTACCCAGAACGAAGATCAG
LEV8(SEQ ID NO：38)
5′-GACTCAACTCAATGGTGCAGG
BglXbaLacF(SEQ ID NO：39)
5′-AGATCTCTAGAGAAGGCGAAGCGGCATGCATTTACG
lacIR4(SEQ ID NO：40)
5′-ATATTCTAGAGACAACTCGCGCTAACTTACATTAATTGC
Lacpro9(SEQ ID NO：41)
5′-ATATTCTAGAATGGTGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGA
LacIQF(SEQ ID NO：42)
5′-GCTCTAGAAGCGGCATGCATTTACGTTGACACC
LacINXR(SEQ ID NO：43)
5′-AGCTAGCTCTAGAAAGTTGGGTAACGCCAGGGT
lacIQI(SEQ ID NO：44)
5′-AGTAAGCGGCCGCAGCGGCATGCATTTACGTTGACACCACCTTTCGCGGTATGGCATG
下面的仅用于分析测序
lacIF1(SEQ ID NO：45)
5′-ACAATCTTCTCGCGCAACGC
lacIF2(SEQ ID NO：46)
5′-ATGTTATATCCCGCCGTTAA
lacIR1(SEQ ID NO：47)
5′-CCGCTATCGGCTGAATTTGA
lacIR2(SEQ ID NO：48)
5′-TGTAATTCAGCTCCGCCATC
SeqLev5AS(SEQ ID NO：49)
5′-TATCGAGATGCTGCAGCCTC
SeqLev3S(SEQ ID NO：50)
5′-ACACCTTCACCTACGCCGAC
LEV10(SEQ ID NO：51)
5′-TCTACTTCGCCTTGCTCGTT
LEV2-LEV3的扩增产物被克隆至pDOW1261-2的SrfI位点，包含荧光假单胞菌pyrF+基因作为一个选择性标记物以促进删除的选择的自杀性载体。新质粒命名为pDOW 1266-1。扩增区域被测序。
                LacI基因克隆至插入载体pDOW1266-1
大肠杆菌lacI基因从pCN511acI中以引物BglXbaLacF(SEQ ID NO：39)和lacIR4(SEQ ID NO：40)，利用HERCULASE聚合酶(退火温度62℃，延伸时间2分钟)扩增出来。凝胶纯化之后，利用XbaI酶切，lacI基因克隆至pDOW1266-1的XbaI位点，形成pDOW1310。lacIQ基因通过利用pCN511acI为模板，使用15个引物lacpro9(SEQ ID NO：41)和lacIR4(SEQ ID NO：40)，HERCULASE聚合酶(退火温度62℃，2分钟延伸时间)PCR扩增出来。凝胶纯化后XbaI酶切，它被克隆至pDOW1266-1的XbaI位点，形成pDOW 1311。
lacIQI基因是通过从大肠杆菌K12(ATCC47076)中的lacI基因利用引物lacIQI(SEQ ID NO：44)和lacINXR(SEQ ID NO：43)扩增而创造，然后克隆至pCR2.1Topo(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，形成pCR2-lacIQI。lacIQI基因从pCR2-lacIQI再次扩增利用引物lacIQF(SEQ ID NO：42)和lacINXR(SEQ ID NO：43)，Herculase聚合酶(61℃退火，3分钟延伸时间，35个循环)。凝胶纯化之后，利用XbaI酶切，PCR产物被克隆至pDOW1266-1的XbaI位点，形成pDOW1309。
PCR扩增产物插入pCR2-lacIQl，pDOW1310，pDOW1311，和pDOW1309进行测序(利用引物lacIF1(SEQ ID NO：45)，lacIF2(SEQ ID NO：46)，lacIR1(SEQ IDNO：47)，lacIR2(SEQ ID NO：48)，SeqLev5AS(SEQ ID NO：49)，SeqLev3S(SEQ IDNO：50)，和LEV10(SEQ ID NO：51))证实PCR反应没有产生的突变。在每一种情况下，选择方向其使得lacI转录同果聚糖蔗糖酶基因方向相同。尽管果聚糖蔗糖酶启动子潜在的能够调控lacI的转录，启动子只能在蔗糖存在下起作用，它不存在于发酵条件下。
             在果聚糖蔗糖酶位点携带整合lacI基因的
                  荧光假单胞菌菌株的构建
载体pDOW1309，pDOW1310，和pDOW1311通过电转化介入DC36，载体整合进入基因组的第一选择就是利用四环素的抗性。克隆经过筛选，以测定载体已经整合在果聚糖蔗糖酶位点，通过PCR方式利用引物LEV7(SEQ ID NO：37)和M13R (New England Biolabs，Gloucester MA，USA)。为了第二次交换选择，该交换能够让lacI基因留在基因组，分离物在存在5-氟乳清酸核苷酸而缺乏四环素的条件下生长。基因组中复制区域之间的重组或者保存母本的基因型，或者留下了lacI基因。获得的分离物，生长在缺乏尿嘧啶条件下，通过以LEV7(SEQ ID NO：37)和LEV8(SEQ ID NO：38)为引物的PCR筛选对四环素的敏感性。新菌株的命名参见表17。为了得到基因组区域的序列信息，PCR产物直接测序，参见E Werle，″Directsequencing of polymerase chain reaction products，″Laboratory Methods for theDetection of Mutations and Polymorphisms in DNA 163-174(1997)。对与每个菌株，测序证实了启动子的同一性，相对于侧面区域的lacI变体的方向，以及相对于母本序列是否存在点突变。DC202和DC206的序列正如所预料的。DC204序列表明在果聚糖蔗糖酶读码框，lacIQ的下游，的一个点突变，它并没有改变任何编码序列，所以是无关紧要的。
表17.携带LACI等位基因整合到基因组中的荧光假单胞菌菌株
  菌株定义   用于实现lacI插入的质粒   基因型
  DC202   pDOW1310-1   PyrF lev::lacI
  DC204   pDOW1311-4   PyrF lev::lacIQ
  DC206   pDOW1309oriA   PyrF lev::lacIQI
与pCN511acI相比较LacI在lacI整合(integrants)中的相对浓度的分析，
UnBlot是一种类似于Western分析的方法，蛋白质在凝胶中检测而不需要转移到滤纸(filter)。该技术根据制造商Pierce Biotechnology(Rockford，IL，USA)的指示完成。利用UnBlot分析表明在每个新整合菌株的LacI的量均高于MB214中的量。MB214包含lacI-lacZYA插入部分在美国专利5,169,760有描述。LacI在lacIQ和lacIQI整合体中相对浓度大约同携带pCN511acI的菌株中的浓度相当，包含lacI多拷贝质粒。参见图5。
进行一系列稀释，为了更精确的评估LacI浓度在MB214，DC202(lacI整合)和DC206(lacIQI整合)的相对差别。MB101pCN511acI，DC204和DC206中的LacI比MB214中高出大约100倍，而DC202大约高出5倍多。
实施例4
                      腈水解酶的表达和转录
菌株DC140通过导入荧光假单胞菌MB214广泛宿主范围的四环素抗性质粒，pMYC1803(WO 2003/068926)而获得，其中腈水解酶基因(G DeSanthis etal.，J.Amer.Chem.Soc.125：11476-77(2003))，在启动子Ptac的调控下已经被插入该质粒。为了比较DC202和DC206中靶基因没有诱导表达的调节与MB214之间的关系，同样的腈水解酶基因被克隆至pMYC1803衍生物，其中的四环素抗性基因已经被pyrF选择性标记所代替。新质粒pDOW2415电转化至DC202和DC204，分别得到DC239和DC240。DC140，DC239和DC240在20L发酵罐内生长，通过在矿物盐的培养基中提供葡萄糖或者甘油，最终细胞浓度位于在大约20g/L至超过70g/L干细胞重量的生物量(参见WO2003/068926)。Ptac启动子的安慰诱导物，IPTG，被加入以诱导表达。
DC140与DC239与DC240腈水解酶活性诱导前的比例是6∶2∶1。相同样品的Northern印迹法的RNA分析显示相同程度的阻遏水平。基于光密度测量，DC140∶DC239∶DC240未诱导的转录本水平比例是2.4∶1.4∶1.0。使用0.3mM IPTG诱导之后马上(30分钟)，所有菌株的转录本水平相同。腈水解酶诱导后产物比例也相当。这暗示所用的诱导物的浓度能够足够充分的诱导这三个菌株的Ptac启动子，尽管它们不同的LacI蛋白水平。但是，阻遏最多的菌株DC140的发酵在大约诱导后24小时后伴随着腈水解酶活性的消失承受着较大的细胞裂解。改良的诱导，更严格调节的菌株DC239和DC240能够延伸到超过诱导后48小时，而且维持高的腈水解酶的产率，最终结果是腈水解酶的产量加倍，参加图6。
                           结果
本实施例显示在假单胞菌中使用不同于整体中的一部分或者截断的Plac-lacI-lacZYA操纵子的LacI编码基因导致诱导前重组蛋白表达充分改良的抑制，在商业大规模发酵中更高的细胞密度，与先前lacI-lacZYA假单胞菌染色体的插入(美国专利5,169,760)相比，预期产物产量也增加了。结果也显示lacI插入体在荧光假单胞菌中LacI产生抑制蛋白非常有效，所以排除在细胞中维持一个独立编码LacI受体蛋白质粒的需要，并且减少由于这种维护而产生的无效的潜在产物。
另外不含有抗生素，在DC239和DC240中生长阶段的阻遏达到比MB214菌株少10倍。DC239和DC240的诱导前腈水解酶在多于13个单独发酵中活性水平平均为0.4U/ml，在DC239和DC240中细胞密度和腈水解酶表达在延伸诱导阶段没有衰减，和DC140一样，考虑到较高的阻遏作用，DC239和DC240发酵运行，降低生长阶段的时间超过30％，减少发酵成本。
实施例5
      tac启动子与单个理想的lac操作子和与两个lac操纵基因的构建
天然的tac启动子只有一个天然的lac操纵基因，AATTGTGAGCGGATAACAATT，在O1位置(图4)。在第一个构建体中，pDOW1418，天然的操纵基因由更对称的lacOid操纵基因序列5′-AATTGTGAGCGCTCACAATT-3′(SEQ ID NO：14)(JR.Sadler，H.Sasmor and JL.Betz.PNAS.1983Nov；80(22)：6785-9)代替。一个包含tac启动子和天然lacO序列的289bp Hindlll/Spel片段被从pMYC1803衍生物pDOW2118中删除，由从SOE中PCR扩增出来的产物，其包含了对称的lacOid序列分离出来的HindIII/Spel片段代替。SOEPCR引物(RC-3和RC-9)含有4个核苷变化，其产生最优化/对称lacO序列(三个碱基对取代和一个碱基对删除)。获得质粒pDOW2201的HindIII/SpeI启动子片段被克隆至基于pMYC1803的腈水解酶表达质粒，代替天然的tac启动子，形成pDOW1414。这种表达盒然后转移至pyrF(+)质粒pDOW1269，通过交换DraI/XhoI片段形成pDOW1418。质粒pDOW1418然后转至宿主菌株DC206，形成菌株DC281(参见图4)。
所用的寡核苷酸
RC-3(SEQ ID NO：52)
5′-GTGAGCGCTCACAATTCCACACAGGAAAACAG
RC-4(SEQ ID NO：53)
5′-TTCGGGTGGAAGTCCAGGTAGTTGGCGGTGTA
RC-9(SEQ ID NO：54)
5′-GAATTGTGAGCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGC
RC-10(SEQ ID NO：55)
5′-ATTCAGCGCATGTTCAACGG
在第二次构建体中，pDOW1416，lacOid操纵基因，5′-AATTGTGAGCGCTCACAATT-3′(SEQ ID NO：14)，通过PCR插入核苷在天然lacO1存在的上游(5’)52个核苷酸的位置。启动子区域使用Megaprimer方法进行PCR扩增利用pMYC1803的衍生物，pMYC5088执行，然后第一步引物是AKB-1和AKB-2。所得的PCR产物在利用相同模板的第二轮的PCR扩增中与引物AKB-3相结合。在利用HindIII和Spel纯化和酶切之后，包括双重操纵基因的启动子片段被克隆到质粒pMYC5088的HindIII和SpeI位点，得到pDOW1411。第二个操纵基因的介入引进了一个唯一紧跟着最优化操纵基因的上游的MfeI位点。携带pDOW1411的启动子区域的Xhol/Spel载体片段然后连接携带到腈水解酶基因的pMYC1803衍生物的兼容片段，形成pDOW1413。pDOW1413的MfeI/XhoI表达盒片段的下一步与pDOW1269的兼容载体片段连接，得到pDOW1416；它转录到DC206，形成菌株DC262。
所用的寡聚核苷酸
AKB-1(SEQ ID NO：56)
5′-ACGGTTCTGGCAAACAATTGTGAGCGCTCACAATTTATTCTGAAATGAGC
AKB-2(SEQ ID NO：57)
5′-GCGTGGGCGGTGTTTATCATGTTC
AKB-3(SEQ ID NO：58)
5′-TACTGCACGCACAAGCCTGAACA
腈水解酶阻遏
Northern印迹分析在MB214，DC202，和DC206诱导前后分别进行。MB214，DC202，和DC206利用在tac启动子3’端的O1位置含有野生型的lacO序列的腈水解酶表达载体进行转化，创造了MB214 wt O1，DC202wtO1(DC239)，和DC206wtO1(DC240)，如上面所述。DC206也利用在tac启动子3’端的O1位置含有取代野生型lacO序列的含有lacOid序列的腈水解酶表达载体进行转化，如上面所述，创建了DC2060id(DC281)。DC206也利用在tac启动子3’端的O1位置含有野生型的有lacO序列和在tac启动子5’端的O3位置含有lacOid序列的腈水解酶表达载体进行转化，创建了包含DC206wtO1O3id(DC263)的双重lacO。
Northern印迹分析显示了包含双重lacO序列盒(DC206wtO1O3id(DC263))的菌株在诱导前表现出了更大的抑制。当产生毒素蛋白质时诱导前表达的更大的抑制尤其有用，因为诱导前毒素蛋白质的基础水平导致细胞进入生长阶段的延迟，并且潜在地，产物更低的收率。

Claims (214)

1.一种用于包括核酸构建体的细菌表达系统中的营养缺陷型假单胞菌细胞，该构建体包括：
a.编码重组多肽的核酸；
b.编码至少一种将营养缺陷型宿主细胞回复为原养型的多肽的核酸。
2.根据权利要求1所述的细胞，其中该假单胞菌是荧光假单胞菌。
3.根据权利要求1所述的细胞，其中该细胞是尿嘧啶是营养缺陷的。
4.根据权利要求1所述的细胞，其中该细胞是脯氨酸是营养缺陷的。
5.根据权利要求1所述的细胞，其中该营养缺陷细胞对多于一种代谢物是营养缺陷的。
6.根据权利要求5所述的细胞，其中该这种细胞对尿嘧啶和脯氨酸是营养缺陷的。
7.根据权利要求1所述的细胞，其中原养型回复多肽是细胞存活必需的代谢物生物合成中活性的酶。
8.根据权利要求7所述的细胞，其中该酶是乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶。
9.根据权利要求8所述的细胞，其中该酶通过选自SEQ ID.1和3的核酸序列编码。
10.根据权利要求7所述的细胞，其中该酶包含SEQ ID No.2的氨基酸序列。
11.根据权利要求7所述的细胞，其中该酶是Δ1-吡咯啉-5-羧化物还原酶。
12.根据权利要求11所述的细胞，其中该酶通过选自SEQ ID.6和8的核酸序列编码。
13.根据权利要求11所述的细胞，其中该酶包含SEQ ID.No.7的氨基酸序列。
14.根据权利要求1所述的细胞，其中通过使pyrF基因失效来产生该营养缺陷细胞。
15.根据权利要求14所述的细胞，其中该失效的pyrF基因包含选自SEQ.ID.No.1或SEQ.ID.No.3的核酸。
16.根据权利要求1所述的细胞，其中通过使proC基因失效来产生该营养缺陷细胞。
17.根据权利要求16所述的细胞，其中该失效的proC基因包含选自SEQ.ID.No.6和SEQ.ID.No.8的核酸序列。
18.根据权利要求1所述的细胞，其中通过使pyrF基因和proC基因失效来产生该营养缺陷型细胞。
19.根据权利要求18所述的细胞，其中该失效的pyrF基因含有选自SEQ.ID.No.1或SEQ.ID.No.3的核酸，以及该失效的proC基因含有选自SEQ.ID.No.6或SEQID.No.9的核酸。
20.根据权利要求1所述的细胞，其中该细胞还包含不是作为PlacI-lacI-lacZYA操纵子一部分的染色体lacI插入片段。
21.根据权利要求20所述的细胞，其中该lacI基因选自lacI，lacIQ和lacIQI。
22.根据权利要求1所述的细胞，其中该核酸构建体进一步包含至少一种lacOid序列。
23.根据权利要求22所述的细胞，其中该lacOid序列选自SEQ.ID.NO.14或SEQ.ID.NO.59。
24.根据权利要求1所述的细胞，其中该核酸构建体进一步包含多于一种的lac操纵基因序列。
25.根据权利要求24所述的细胞，其中至少一种lac操纵基因序列位于启动子的5’端，并且至少一种lac操纵基因序列位于启动子的3’端。
26.根据权利要求25所述的细胞，其中至少一种lac操纵基因序列是lacOid序列。
27.根据权利要求26所述的细胞，其中该lacOid序列选自SEQ.ID.NO.14或SEQ.ID.NO.59。
28.一种用于细菌表达系统的遗传修饰假单胞菌细胞，其中该修饰包括至少一种lacI基因的染色体插入，其中该lacI基因不同于PlacI-lacI-lacZYA操纵子整体的一部分或截断的PlacI-lacI-lacZYA操纵子。
29.根据权利要求28所述的细胞，其中该假单胞菌是荧光假单胞菌。
30.根据权利要求28所述的细胞，其中该lacI基因选自lacI，lacIQ或lacIQI。
31.根据权利要求28所述的细胞，其中该lacI基因被插入果聚糖蔗糖酶位点。
32.根据权利要求28所述的细胞，其中该细胞被进一步修饰以在该细胞中形成对至少一种代谢物的营养缺陷型。
33.根据权利要求32所述的细胞，其中通过修饰选自pyrF和proC的基因来形成该营养缺陷型。
34.根据权利要求32所述的细胞，其中通过修饰pyrF和proC两种基因来形成该营养缺陷型。
35.根据权利要求28所述的细胞，进一步包括含有至少一种lacOid序列的核酸。
36.根据权利要求35所述的细胞，其中该lacOid序列选自SEQ.ID.NO.14或SEQ.ID.NO.59。
37.根据权利要求28所述的细胞，进一步包括含有多于一种lac操纵基因序列的核酸。
38.根据权利要求37所述的细胞，其中至少一种lac操纵基因序列是lacOid序列。
39.根据权利要求38所述的细胞，其中该lacOid序列选自SEQ.ID.NO.14或SEQ.ID.NO.59。
40.用于细菌表达系统中的假单胞菌细胞，包括核酸构建体，该构建体包含至少一种lacOid操纵基因序列。
41.根据权利要求40所述的细胞，其中该假单胞菌是荧光假单胞菌。
42.根据权利要求40所述的细胞，其中该lacOid序列位于启动子的3’端。
43.根据权利要求40所述的细胞，其中该lacOid序列位于启动子的5’端。
44.根据权利要求40所述的细胞，其中lacOid序列位于启动子的3’端和5’端。
45.根据权利要求40所述的细胞，其中细胞被进一步修饰以在该细胞中形成对至少一种代谢物的营养缺陷型。
46.根据权利要求45所述的细胞，其中通过修饰选自pyrF和proC的基因来形成该营养缺陷型。
47.根据权利要求45所述的细胞，其中通过修饰pyrF和proC两种基因来形成该营养缺陷型。
48.根据权利要求40所述的细胞，其中该细胞包含lacI基因的染色体插入，其中该lacI基因不同于Plac-lacI-lacZYA操纵子整体的一部分或截断的Plac-lacI-lacZYA操纵子。
49.根据权利要求40所述的细胞，其中该lacOid序列选自SEQ ID NO.14或SEQ.ID.NO.59。
50.一种用于包含核酸构建体的细胞表达系统中的假单胞菌细胞，，该构建体包含多于一种的lac操纵基因序列。
51.根据权利要求50所述的细胞，其中至少一种lac操纵基因是lacOid序列。
52.根据权利要求51所述的细胞，其中该lacOid序列选自SEQ.ID.NO.14或SEQ.ID.NO.59。
53.根据权利要求51所述的细胞，其中该lacOid序列是启动子的5’端或3’端。
54.根据权利要求51所述的细胞，其中该lacOid序列是启动子的5’端和3’端。
55.根据权利要求50所述的细胞，其中进一步修饰该细胞以在该细胞中形成对至少一种代谢物的营养缺陷型。
56.根据权利要求55所述的细胞，其中通过修饰选自pyrF或proC的基因来形成该营养缺陷型。
57.根据权利要求55所述的细胞，其中通过修饰pyrF和proC两种基因来形成该营养缺陷型。
58.根据权利要求50所述的细胞，其中该细胞包含lacI基因的染色体插入，其中该lacI基因不同于Plac-lacl-lacZYA操纵子整体的一部分或者截断的Plac-lacI-lacZYA操纵子。
59.根据权利要求50所述的细胞，其中该假单胞菌是荧光假单胞菌。
60.一种生产重组多肽的方法，包括：
a.在假单胞菌细胞中表达编码重组多肽的核酸，该假单胞菌细胞已经被遗传修饰以形成对至少一种代谢物的营养缺陷型；
b.表达编码多肽的核酸，该多肽将营养缺陷型细胞回复成原养型；c.使细胞在缺乏营养缺陷型代谢物的培养基上生长。
61.根据权利要求60所述的方法，其中该假单胞菌是荧光假单胞菌。
62.根据权利要求60所述的方法，其中该细胞是尿嘧啶营养缺陷。
63.根据权利要求60所述的方法，其中该细胞是脯氨酸营养缺陷。
64.根据权利要求60所述的方法，其中该营养缺陷型细胞对多于一种的代谢物营养缺陷。
65.根据权利要求64所述的方法，其中该细胞是尿嘧啶和脯氨酸营养缺陷。
66.根据权利要求60所述的方法，其中该原养型回复多肽是细胞存活所需代谢物生物合成中活性的酶。
67.根据权利要求66所述的方法，其中该酶是乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶。
68.根据权利要求67所述的方法，其中该酶通过选自SEQ.ID.1或3的核酸序列编码。
69.根据权利要求68所述的方法，其中该酶包含SEQ ID No.2的氨基酸序列。
70.根据权利要求66所述的方法，其中该酶是Δ1-吡咯啉-5-羧化物还原酶。
71.根据权利要求70所述的方法，其中该酶通过选自ID.NO.6或8的核酸序列编码。
72.根据权利要求70所述的方法，其中该酶包含SEQ.ID.No.7的氨基酸序列。
73.根据权利要求60所述的方法，其中通过使pyrF基因失效来产生该营养缺陷型细胞。
74.根据权利要求73所述的方法，其中该失效的pyrF基因包含选自SEQ.ID.No.1或SEQ.ID.No.3的核酸序列。
75.根据权利要求60所述的方法，其中通过使proC基因失效来产生该营养缺陷型细胞。
76.根据权利要求75所述的方法，其中该失效的proC基因包含选自SEQ.ID.No.6或SEQ.ID.No.8的核酸序列。
77.根据权利要求60所述的方法，其中通过使pyrF基因和proC基因失效产生该营养缺陷型细胞。
78.根据权利要求77所述的方法，其中该失效的pyrF基因包含选自SEQ.ID.No.1或SEQ.ID.No.3的核酸序列，以及该失效的proC基因包含选自SEQ.ID.No.6或SEQ.ID.NO.9的核酸。
79.根据权利要求60所述的方法，其中该细胞还包含不同于PlacI-lacI-lacZYA操纵子一部分的染色体lacI插入片段。
80.根据权利要求79所述的方法，其中该lacI基因选自lacI，lacIQ或lacIQI。
81.根据权利要求60所述的方法，其中编码重组多肽的该核酸进一步包含至少一种lacOid序列。
82.根据权利要求81所述的方法，其中该lacOid序列选自SEQ.ID.NO.14或SEQ.ID.NO.59。
83.根据权利要求60所述的方法，其中编码重组多肽的该核酸进一步包含多于一种的lac操纵基因序列。
84.根据权利要求83所述的方法，其中至少一种lac操纵基因序列位于启动子的5’端，以及至少一种lac操纵基因序列位于启动子的3’端。
85.根据权利要求84所述的方法，其中至少一种lac操纵基因序列是lacOid序列。
86.根据权利要求85所述的方法，其中该lacOid序列选自SEQ.ID.NO.14或SEQ.ID.NO.59。
87.一种生产重组多肽的方法，包括在假单胞菌中表达编码重组多肽的核酸，该假单胞菌细胞包含至少一种lacI基因的染色体插入，其中该lacI基因不同于PlacI-lacI-lacZYA操纵子整体的部分或者截断的PlacI-lacI-lacZYA操纵子。
88.根据权利要求87所述的方法，其中该假单胞菌是荧光假单胞菌。
89.根据权利要求87所述的方法，其中该lacI基因选自lacI，lacIQ或lacIQI。
90.根据权利要求87所述的方法，其中将该lacI基因插入果聚糖蔗糖酶位点。
91.根据权利要求87所述的方法，其中进一步修饰该细胞以在该细胞中形成对至少一种代谢物的营养缺陷型。
92.根据权利要求91所述的方法，其中通过修饰选自pyrF或proC的基因来形成该营养缺陷型。
93.根据权利要求91所述的方法，其中通过修饰pyrF和proC两种基因来形成该营养缺陷型。
94.根据权利要求87所述的方法，其中编码重组多肽的该核酸包含至少一种lacOid序列。
95.根据权利要求94所述的方法，其中该lacOid序列选自SEQ.ID.NO.14或SEQ.ID.NO.59。
96.根据权利要求87所述的方法，其中编码重组多肽的该核酸包含多于一种lac操纵基因序列。
97.根据权利要求96所述的方法，其中至少一种lac操纵基因序列是lacOid序列。
98.根据权利要求97所述的方法，其中该lacOid序列选自SEQ.ID.NO.14或SEQ.ID.NO.59。
99.一种生产重组多肽的方法，包括在假单胞菌细胞中表达编码该重组多肽的核酸，其中该核酸进一步包含至少一种lac操纵基因序列，其中该lac操纵基因序列是lacOid序列。
100.根据权利要求99所述的方法，其中该假单胞菌是荧光假单胞菌。
101.根据权利要求99所述的方法，其中该lacOid序列选自SEQ.ID.NO.14或SEQ.ID.NO.59。
102.根据权利要求99所述的方法，其中至少一种lacOid序列位于启动子的3’端。
103.根据权利要求99所述的方法，其中至少一种lacOid序列位于启动子的5’端。
104.根据权利要求99所述的方法，其中至少一种lacOid序列位于启动子的3’端和5’端。
105.根据权利要求99所述的方法，其中进一步修饰该细胞以在细胞中形成对至少一种代谢物的营养缺陷型。
106.根据权利要求105所述的方法，其中通过修饰选自pyrF和proC的基因来形成该营养缺陷型。
107.根据权利要求105所述的方法，其中通过修饰pyrF和proC两种基因来形成该营养缺陷型。
108.根据权利要求99所述的方法，其中该细胞包含lacI基因的染色体插入，其中该lacI基因不同于Plac-lacI-lacZYA操纵子整体的一部分或截断的Plac-lacI-lacZYA操纵子。
109.一种生产重组多肽的方法，包括在假单胞菌中表达编码重组多肽的核酸，其中该核酸进一步包含多于一种lac操纵基因序列。
110.根据权利要求109所述的方法，其中至少一种lac操纵基因是lacOid序列。111.根据权利要求110所述的方法，其中该lacOid序列选自SEQ.ID.NO.14或SEQ.ID.NO.59。
112.根据权利要求110所述的方法，其中该lacOid序列是启动子的5’端或3’端。
113.根据权利要求110所述的方法，其中该lacOid序列是启动子的5’端和3’端。
114.根据权利要求109所述的方法，其中进一步修饰该细胞以在细胞中形成对至少一种代谢物的营养缺陷型。
115.根据权利要求114所述的方法，其中通过修饰选自pyrF或proC的基因来形成该营养缺陷型。
116.根据权利要求114所述的方法，其中通过修饰pyrF和proC两种基因来形成该营养缺陷型。
117.根据权利要求109所述的方法，其中该细胞包含lacI基因的染色体插入，其中该lacI基因不同于Plac-lacI-lacZYA操纵子整体的一部分或者截断的Plac-lacI-lacZYA操纵子。
118.根据权利要求109所述的方法，其中该假单胞菌是荧光假单胞菌。
119.一种在宿主细胞中调控重组蛋白表达的方法，包括：
a.选择假单胞菌细胞，其中通过将lacI基因染色体插入该细胞中对该细胞进行了遗传修饰，其中lacI基因不同于PlacI-lacI-lacZYA操纵子整体的一部分或者截断的PlacI-lacI-lacZYA操纵子；和
b.核酸构建体引入该细胞中，该构建体包括可操作连接编码该重组多肽的核酸的LacI蛋白启动子。
120.根据权利要求119所述的方法，其中假单胞菌是荧光假单胞菌。
121.根据权利要求119所述的方法，其中该lacI基因选自由lacI，lacIQ或lacIQI。
122.根据权利要求119所述的方法，其中将该lacI基因插入果聚糖蔗糖酶位点。
123.根据权利要求119所述的方法，其中进一步修饰该细胞以在该细胞中形成对至少一种代谢物的营养缺陷型。
124.根据权利要求123所述的方法，其中通过修饰选自pyrF或proC的基因来形成该营养缺陷型。
125.根据权利要求123所述的方法，其中通过修饰pyrF和proC两种基因来形成该营养缺陷型。
126.根据权利要求119所述的方法，其中编码该重组蛋白的该核酸包含至少一种lacOid序列。
127.根据权利要求126所述的方法，其中该lacOid序列选自SEQ.ID.NO.14或SEQ.ID.NO.59。
128.根据权利要求126所述的方法，其中至少一种lacOid序列位于启动子的3’端。
129.根据权利要求126所述的方法，其中至少一种lacOid序列位于启动子的5’端。
130.根据权利要求126所述的方法，其中lacOid序列位于启动子的5’端和3’端。
13l、根据权利要求119所述的方法，其中编码该重组蛋白的该核酸包含多于一种的lac操纵基因序列。
132.根据权利要求131所述的方法，其中至少一种lac操纵基因序列是lacOid序列。
133.根据权利要求132所述的方法，其中该lacOid序列选自SEQ.ID.NO.14或SEQ.ID.NO.59。
134.一种调控宿主细胞中重组蛋白表达的方法，包括：
a.选择假单胞菌细胞；和
b.引入核酸构建体，该构建体包括：
i.编码重组多肽的核酸，
ii.至少一种lacOid操纵基因序列。
135.根据权利要求134所述的方法，其中假单胞菌是荧光假单胞菌。
136.根据权利要求134所述的方法，其中该lacOid位于启动子的3’端。
137.根据权利要求134所述的方法，其中该lacOid位于启动子的5’端。
138.根据权利要求134所述的方法，其中lacOid位于启动子的3’端和5’端。
139.根据权利要求134所述的方法，其中进一步修饰该细胞以在该细胞中形成对至少一种代谢物的营养缺陷型。
140.根据权利要求139所述的方法，其中通过修饰选自pyrF和proC的基因来形成该营养缺陷型。
141.根据权利要求139所述的方法，其中通过修饰pyrF和proC两种基因来形成该营养缺陷型。
142.根据权利要求134所述的方法，其中该细胞包含lacI基因的染色体插入，其中该lacI基因不同于Plac-lacI-lacZYA操纵子整体的一部分或者截断的Plac-lacI-lacZYA操纵子。
143.根据权利要求134所述的方法，其中该lacOid序列选自SEQ.ID.NO.14或SEQ.ID.NO.59。
144.一种调控宿主细胞中重组蛋白表达的方法，包括：
a.选择假单胞菌细胞；和
b.引入核酸构建体，该构建体包括：
i.编码重组多肽的核酸，和
ii.多于一种lac操纵基因序列。
145.根据权利要求144所述的方法，其中至少一种lac操纵基因是lacOid序列。
146.根据权利要求145所述的方法，其中该lacOid序列选自SEQ.ID.NO.14或SEQ.ID.NO.59。
147.根据权利要求145所述的方法，其中该lacOid序列是启动子的5’端或3’端。
148.根据权利要求145所述的方法，其中该lacOid序列是启动子的5’端和3’端。
149.根据权利要求144所述的方法，其中进一步修饰该细胞以在该细胞中形成对至少一种代谢物的营养缺陷型。
150.根据权利要求149所述的方法，其中通过修饰选自pyrF和proC的基因来形成该营养缺陷型。
151.根据权利要求149所述的方法，其中通过修饰pyrF和proC两种基因来形成该营养缺陷型。
152.根据权利要求144所述的方法，其中该细胞包含lacI基因的染色体插入，其中该lacI基因不同于Plac-lacI-lacZYA操纵子整体的一部分或者截断的Plac-lacI-lacZYA操纵子。
153.根据权利要求144所述的方法，其中该假单胞菌是荧光假单胞菌。
154.一种在缺少抗生素的情况下生产重组蛋白的方法，包括：
a.选择假单胞菌细胞，其中对该细胞进行遗传修饰来引起对至少一种代谢物的营养缺陷型，因此产生营养缺陷型细胞；
b.将核酸构建体引入细胞中，该构建体包括：
i.编码重组多肽的核酸；
ii.编码将营养缺陷型宿主细胞回复成原养型的多肽的核酸；
c.在该细胞中表达重组多肽和原养型回复多肽；和
d.使该细胞在缺乏该营养缺陷型代谢物的培养基上生长。
155.根据权利要求154所述的方法，其中该假单胞菌是荧光假单胞菌。
156.根据权利要求154所述的方法，其中该细胞是尿嘧啶营养缺陷。
157.根据权利要求154所述的方法，其中该细胞是脯氨酸营养缺陷。
158.根据权利要求154所述的方法，其中该营养缺陷细胞是对多于一种的代谢物营养缺陷。
159.根据权利要求158所述的方法，其中该细胞是尿嘧啶和脯氨酸营养缺陷。
160.根据权利要求154所述的方法，其中该原养型回复多肽是细胞存活所需代谢物生物合成中活性的酶。
161.根据权利要求160所述的方法，其中该酶是乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶。
162.根据权利要求161所述的方法，其中该酶通过选自SEQ.ID.1或3的核酸来编码。
163.根据权利要求160所述的方法，其中该酶含SEQ ID No.2的氨基酸序列。
164.根据权利要求160所述的方法，其中该酶是Δ1-吡咯啉-5-羧化物还原酶。
165.根据权利要求164所述的方法，其中该酶通过选自SEQ.ID.NO.6或8的核酸序列来编码。
166.根据权利要求164所述的方法，其中该酶包含SEQ.ID.No.7的氨基酸序列。
167.根据权利要求154所述的方法，其中通过使pyrF基因失效来产生该营养缺陷型细胞。
168.根据权利要求167所述的方法，其中该失效的pyrF基因包含选自SEQ.ID.No.1或SEQ.ID.No.3的核酸。
169.根据权利要求154所述的方法，其中通过失效proC基因来产生该营养缺陷型细胞。
170.根据权利要求169所述的方法，其中该失效的proC基因包含选自的SEQ.ID.No.6或SEQ.ID.No.8的核酸序列。
171.根据权利要求154所述的方法，其中通过使pyrF和proC基因失效来产生该营养缺陷型细胞。
172.根据权利要求171所述的方法，其中该失效的pyrF基因包含选自SEQ.ID.No.1或SEQ.ID.No.3的核酸，以及该失效的proC基因包含选自SEQ.ID.No.6或SEQ.ID.NO.9的核酸。
173.根据权利要求154所述的方法，其中该细胞还包含不同于PlacI-lacI-lacZYA操纵子一部分的染色体lacI插入片段。
174.根据权利要求173所述的方法，其中该lac基因选自lacI，lacIQ或lacIQI。
175.根据权利要求154所述的方法，其中该核酸构建体进一步包含至少一种lacOid序列。
176.根据权利要求154所述的方法，其中该核酸构建体进一步包含多于一种的lac操纵基因序列。
177.根据权利要求176所述的方法，其中至少一种lac操纵基因序列位于启动子的5’端，以及至少一种lac操纵基因序列位于启动子的3’端。
178.根据权利要求177所述的方法，其中至少一种lac操纵基因序列是lacOid序列。
179.缺少抗生素条件下生产重组多肽的方法，其中交叉传递抑制在选择过程中被最小化，包括
a.选择假单胞菌细胞，其中对该细胞进行遗传修饰来引起对至少一种代谢物的营养缺陷型，因此产生营养缺陷型细胞；
b.将核酸构建体引入该细胞中，该构建体包括：
i.编码重组多肽的核酸；和
ii.编码可以将该营养缺陷型宿主细胞回复成原养型的多肽的核酸；
c.在该细胞中表达重组多肽和原养型回复多肽；和
d.使该细胞在缺乏营养缺陷型代谢物的培养基上生长。
180.根据权利要求179所述的方法，其中该假单胞菌是荧光假单胞菌。
181.根据权利要求179所述的方法，其中该细胞对尿嘧啶营养缺陷。
182.根据权利要求179所述的方法，其中该细胞对脯氨酸营养缺陷。
183.根据权利要求179所述的方法，其中该细胞对多于一种的代谢物营养缺陷。
184.根据权利要求183所述的方法，其中该细胞对尿嘧啶和脯氨酸营养缺陷。
185.根据权利要求179所述的方法，其中该原养型回复蛋白是细胞存活所需代谢物生物合成中活性的酶。
186.根据权利要求185所述的方法，其中该酶是乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶。
187.根据权利要求186所述的方法，其中该酶通过选自SEQ.ID.1或3的核酸来编码。
188.根据权利要求185所述的方法，其中该酶包含SEQ ID No.2的氨基酸序列。
189.根据权利要求185所述的方法，其中该酶是Δ1-吡咯啉-5-羧化物还原酶。
190.根据权利要求189所述的方法，其中该酶通过选自SEQ.ID.NO.6或8的核酸序列来编码。
191.根据权利要求189所述的方法，其中该酶包含SEQ.ID.No.7的氨基酸序列。
192.根据权利要求179所述的方法，其中通过使pyrF基因失效来产生该营养缺陷细胞型。
193.根据权利要求192所述的方法，其中该失效的pyrF基因包含选自SEQ.ID.No.1或SEQ.ID.No.3的核酸。
194.根据权利要求179所述的方法，其中通过使proC基因失效来产生该营养缺陷细胞型。
195.根据权利要求194所述的方法，其中该失效的proC基因包含选自SEQ.ID.No.6或SEQ.ID.No.8的核酸。
196.根据权利要求179所述的方法，其中通过使pyrF基因和proC基因失效来产生该营养缺陷型细胞。
197.根据权利要求196所述的方法，其中该失效的pyrF基因包含选自SEQ.ID.No.1或SEQ.ID.No.3的核酸，和该失效的proC基因包含选自SEQ.ID.No.6或SEQ.ID.NO.9的核酸。
198.根据权利要求179所述的方法，其中该细胞还包含不同于PlacI-lacI-lacZYA操纵子一部分的染色体lacI插入片段。
199.根据权利要求198所述的方法，其中该lacI基因选自lacI，lacIQ或lacIQI。
200.根据权利要求199所述的方法，其中该核酸构建体进一步包含至少一种lacOid序列。
201.根据权利要求179所述的方法，其中该核酸构建体进一步包含多于一种的lac操纵基因序列。
202.根据权利要求201所述的方法，其中至少一种lac操纵基因序列位于启动子的5’端，以及至少一种lac操纵基因序列位于启动子的3’端。
203.根据权利要求202所述的方法，其中至少一种lac操纵基因序列是lacOid序列。
204.荧光假单胞菌pyrF基因，或与pyrF基因杂交的核酸，包含选自SEQ.ID.No.1或3的核酸序列。
205.根据权利要求204所述的基因，其中该核酸包括SEQ.ID.No.1的序列。
206.根据权利要求204所述的基因，其中该核酸包含SEQ.ID.No.3的序列。
207.荧光假单胞菌proC基因，或与proC基因杂交的核酸，包括选自SEQ.ID.No.6或8的核酸序列。
208.根据权利要求207所述的基因，其中该核酸包含SEQ ID No.6的序列。
209.根据权利要求207所述的基因，其中该核酸包含SEQ ID No.8的序列。
210.核酸构建体，包括：
a.编码重组多肽的核酸；和
b.编码从荧光假单胞菌分离的pyrF基因的核酸。
211.根据权利要求210所述的构建体，其中该pyrF基因包含SEQ.ID No.1的核酸序列。
212.根据权利要求210所述的构建体，其中该pyrF基因包含SEQ.ID No.3的核酸序列。
213.核酸构建体，包括：
a.编码重组多肽的核酸；和
b.编码从荧光假单胞菌分离的proC基因的核酸。
214.根据权利要求213所述的构建体，其中该proC基因包含SEQ.ID No.6的核酸序列。
215.根据权利要求213所述的构建体，其中该proC基因包含SEQ.ID No.8的核酸序列。
CN2004800407027A 2003-11-19 2004-11-19 改良的蛋白表达系统 Active CN1906294B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US52342003P 2003-11-19 2003-11-19
US60/523,420 2003-11-19
US53714704P 2004-01-16 2004-01-16
US60/537,147 2004-01-16
PCT/US2004/038884 WO2005052151A1 (en) 2003-11-19 2004-11-19 Improved protein expression systems

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1906294A true CN1906294A (zh) 2007-01-31
CN1906294B CN1906294B (zh) 2013-09-11

Family

ID=34636466

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2004800407027A Active CN1906294B (zh) 2003-11-19 2004-11-19 改良的蛋白表达系统

Country Status (10)

Country Link
US (2) US20050186666A1 (zh)
EP (1) EP1692282B1 (zh)
JP (2) JP5087741B2 (zh)
KR (1) KR101237651B1 (zh)
CN (1) CN1906294B (zh)
AU (1) AU2004293810B2 (zh)
BR (1) BRPI0416744A (zh)
CA (1) CA2545610C (zh)
MX (1) MXPA06005634A (zh)
WO (1) WO2005052151A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113025601A (zh) * 2019-12-25 2021-06-25 上海奥博生物医药技术有限公司 腈水解酶启动子优化表达及应用

Families Citing this family (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9453251B2 (en) 2002-10-08 2016-09-27 Pfenex Inc. Expression of mammalian proteins in Pseudomonas fluorescens
CA2545610C (en) 2003-11-19 2014-03-25 Dow Global Technolgies Inc. Auxotrophic pseudomonas fluorescens bacteria for recombinant protein expression
EP1774017B1 (en) 2004-07-26 2013-05-15 Pfenex Inc. Process for improved protein expression by strain engineering
EP1945772B1 (en) * 2005-10-06 2015-11-18 Advanced Accelerator Applications S.A. Novel selection system
US8043833B2 (en) * 2005-10-31 2011-10-25 Novo Nordisk A/S Expression of soluble therapeutic proteins
GB0602173D0 (en) 2006-02-03 2006-03-15 Avecia Ltd Expression system
EP2013357A4 (en) 2006-04-19 2012-02-22 Biogenerix Ag EXPRESSION OF O-GLYCOSYLATED THERAPEUTIC PROTEINS IN PROKARYOTIC MICROORGANISMS
KR20090018799A (ko) * 2006-05-30 2009-02-23 다우 글로벌 테크놀로지스 인크. 코돈 최적화 방법
KR100824541B1 (ko) * 2007-02-26 2008-04-24 고려대학교 산학협력단 항산화 효소의 과발현을 통해 환경오염물질 분해능이향상된 균주
WO2008134461A2 (en) 2007-04-27 2008-11-06 Dow Global Technologies, Inc. Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins
US9580719B2 (en) 2007-04-27 2017-02-28 Pfenex, Inc. Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins
CA2706639A1 (en) * 2007-11-29 2009-06-04 Novozymes A/S Synthase inhibitor screening method
US20110053274A1 (en) * 2007-11-30 2011-03-03 Scarab Genomics Llc Lac expression system
WO2010008764A1 (en) * 2008-06-23 2010-01-21 Dow Global Technologies Inc. Pseudomonas fluorescens strains for production of extracellular recombinant protein
JP2010017131A (ja) * 2008-07-10 2010-01-28 Mitsui Eng & Shipbuild Co Ltd モーレラ属細菌及びプライマー
US8198062B2 (en) 2008-08-29 2012-06-12 Dsm Ip Assets B.V. Hydrolases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
US8357503B2 (en) 2008-08-29 2013-01-22 Bunge Oils, Inc. Hydrolases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
US8153391B2 (en) 2008-08-29 2012-04-10 Bunge Oils, Inc. Hydrolases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
US8623652B2 (en) * 2009-04-06 2014-01-07 Lucigen Corporation Host-vector system for cloning and expressing genes
WO2010132341A2 (en) 2009-05-11 2010-11-18 Pfenex, Inc. Production of recombinant proteins utilizing non-antibiotic selection methods and the incorporation of non-natural amino acids therein
UA111708C2 (uk) 2009-10-16 2016-06-10 Бандж Ойлз, Інк. Спосіб рафінування олії
UA109884C2 (uk) 2009-10-16 2015-10-26 Поліпептид, що має активність ферменту фосфатидилінозитол-специфічної фосфоліпази с, нуклеїнова кислота, що його кодує, та спосіб його виробництва і застосування
MX2012010148A (es) 2010-03-04 2013-01-22 Pfenex Inc Metodo para producir proteinas de interferon recombinantes solubles sin desnaturalizacion.
AU2011238711B2 (en) 2010-03-30 2015-06-18 Pelican Technology Holdings, Inc. High level expression of recombinant toxin proteins
WO2011123570A2 (en) 2010-04-01 2011-10-06 Pfenex Inc. Methods for g-csf production in a pseudomonas host cell
CN113736721A (zh) * 2010-07-12 2021-12-03 因比奥斯公司 用于生产附加值生物产品的代谢改造的生物
EP3366697B1 (en) 2010-08-10 2020-12-30 Sachdev Sidhu Specific active site inhibitors of enzymes or substrate binding partners and methods of producing same
PL222067B1 (pl) * 2011-08-11 2016-06-30 Inst Biotechnologii I Antybiotyków Kaseta ekspresyjna, zastosowanie kasety ekspresyjnej, wektor ekspresyjny, komórka prokariotycznego gospodarza zawierająca wektor ekspresyjny, szczep bakteryjny oraz sposób wytwarzania polipeptydu
EA028648B1 (ru) 2012-03-30 2017-12-29 Басф Энзаймс Ллк Ген, кодирующий целлюлазу (варианты)
US9169304B2 (en) 2012-05-01 2015-10-27 Pfenex Inc. Process for purifying recombinant Plasmodium falciparum circumsporozoite protein
WO2014047625A1 (en) 2012-09-24 2014-03-27 Montana State University Recombinant lactococcus lactis expressing escherichia coli colonization factor antigen i (cfa/i) fimbriae and their methods of use
JP6448909B2 (ja) * 2013-03-01 2019-01-09 学校法人関西学院 目的遺伝子を欠損した酢酸菌の製造方法及びその利用
GB201308853D0 (en) 2013-03-12 2013-07-03 Verenium Corp Genes encoding xylanase
GB201308828D0 (en) 2013-03-12 2013-07-03 Verenium Corp Phytase
GB201308843D0 (en) 2013-03-14 2013-07-03 Verenium Corp Phytase formulation
AR095173A1 (es) 2013-07-25 2015-09-30 Basf Enzymes Llc Fitasa
AU2015271666B2 (en) 2014-06-06 2021-07-08 The Hospital For Sick Children Soluble bacterial and fungal proteins and methods and uses thereof in inhibiting and dispersing biofilm
CN104004760B (zh) * 2014-06-12 2017-11-28 华东理工大学 一种用于在米曲霉细胞分泌表达外源蛋白的表达设备及其米曲霉基因工程菌
IL249749B2 (en) 2014-06-27 2023-03-01 Nat Res Council Canada Cannabichromic acid synthase from Cannabis sativa
WO2016004024A1 (en) 2014-07-02 2016-01-07 Sutro Biopharma, Inc. High growth capacity auxotrophic escherichia coli and methods of use
DK3227455T3 (da) 2014-12-01 2023-08-21 Pfenex Inc Fusionspartnere til peptidfremstilling
PT3253406T (pt) 2015-02-05 2024-02-05 Canem Holdings Llc Composições para tratar granulomatose com poliangiite
KR20170068304A (ko) * 2015-12-09 2017-06-19 삼성전자주식회사 대장균 및 코마가타에이박터 속 세포에서 복제가능한 벡터, 그를 포함한 세포, 및 그를 이용하는 방법
US11447714B2 (en) 2017-09-26 2022-09-20 Bunge Global Innovation, Llc Enzymatic removal of chlorophyll substrates from triacylglycerol-based oils
WO2019083793A1 (en) 2017-10-27 2019-05-02 Pfenex Inc. PROCESS FOR THE PRODUCTION OF RECOMBINANT ERWINIA ASPARAGINASE
WO2019083795A1 (en) 2017-10-27 2019-05-02 Pfenex Inc. GUIDED BACTERIAL SEQUENCES FOR EXPRESSION OF PERIPLASMIC PROTEINS
CN108504677B (zh) * 2018-03-06 2020-05-12 上海晶诺生物科技有限公司 一个用于构建谷氨酸基因家族缺失结核分枝杆菌的重组tm4噬菌体文库及其应用
WO2020198212A1 (en) 2019-03-27 2020-10-01 Bunge Global Innovation, Llc Silica adsorbent treatment for removal of chlorophyll derivatives from triacylglycerol-based oils
EP3976799A4 (en) * 2019-05-31 2023-07-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York AUXOTROPHIC PROPAGATION CELL LINE FOR THE PRODUCTION OF RECOMBINANT PROTEINS AND RELATED METHODS
CN111041029B (zh) * 2019-12-23 2022-05-10 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种强启动子及其在产维生素b12菌株中的应用
US11746352B2 (en) 2019-12-30 2023-09-05 Eligo Bioscience Microbiome modulation of a host by delivery of DNA payloads with minimized spread
CN112080451A (zh) * 2020-07-13 2020-12-15 宁波大学 一种嗜酸乳杆菌的食品级基因表达体系及其制备方法和应用
WO2022144381A1 (en) 2020-12-30 2022-07-07 Eligo Bioscience Microbiome modulation of a host by delivery of dna payloads with minimized spread
WO2022211829A1 (en) 2021-03-30 2022-10-06 Jazz Pharmaceuticals Ireland Ltd. Dosing of recombinant l-asparaginase
KR20240021768A (ko) 2021-05-12 2024-02-19 엘리고 바이오사이언스 용해성 파지의 제조

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4511503A (en) 1982-12-22 1985-04-16 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
US4755465A (en) 1983-04-25 1988-07-05 Genentech, Inc. Secretion of correctly processed human growth hormone in E. coli and Pseudomonas
US4680264A (en) 1983-07-01 1987-07-14 Lubrizol Genetics, Inc. Class II mobilizable gram-negative plasmid
US5281532A (en) 1983-07-27 1994-01-25 Mycogen Corporation Pseudomas hosts transformed with bacillus endotoxin genes
DK594084A (da) * 1984-12-12 1986-06-13 Novo Industri As Fremgangsmaade til stabilisering af extra-chromosomale elementer i bakterier under dyrkning
US4695455A (en) 1985-01-22 1987-09-22 Mycogen Corporation Cellular encapsulation of pesticides produced by expression of heterologous genes
US4695462A (en) 1985-06-28 1987-09-22 Mycogen Corporation Cellular encapsulation of biological pesticides
GB8517071D0 (en) 1985-07-05 1985-08-14 Hoffmann La Roche Gram-positive expression control sequence
US5232840A (en) * 1986-03-27 1993-08-03 Monsanto Company Enhanced protein production in bacteria by employing a novel ribosome binding site
US5128130A (en) 1988-01-22 1992-07-07 Mycogen Corporation Hybrid Bacillus thuringiensis gene, plasmid and transformed Pseudomonas fluorescens
US5055294A (en) 1988-03-03 1991-10-08 Mycogen Corporation Chimeric bacillus thuringiensis crystal protein gene comprising hd-73 and berliner 1715 toxin genes, transformed and expressed in pseudomonas fluorescens
US5169760A (en) * 1989-07-27 1992-12-08 Mycogen Corporation Method, vectors, and host cells for the control of expression of heterologous genes from lac operated promoters
JP2600090B2 (ja) 1991-04-19 1997-04-16 農林水産省農業環境技術研究所長 宿主ベクター系
US6566121B1 (en) * 1991-06-13 2003-05-20 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Insertional mutations in mycobacteria
US5691185A (en) * 1993-10-08 1997-11-25 Chr. Hansen A/S Lactic acid bacterial suppressor mutants and their use as selective markers and as means of containment in lactic acid bacteria
US5527883A (en) 1994-05-06 1996-06-18 Mycogen Corporation Delta-endotoxin expression in pseudomonas fluorescens
AU6489996A (en) 1995-07-14 1997-02-18 Somatogen, Inc. Methods for increasing protein expression
AU1467399A (en) 1997-11-20 1999-06-15 William Marsh Rice University Lactose repressor proteins with altered ligand responsivity
US7390645B2 (en) * 1997-11-20 2008-06-24 William Marsh Rice University Lactose repressor proteins with increased operator DNA binding affinity
DE19801120A1 (de) * 1998-01-15 1999-07-22 Basf Ag Orotidin-5'-Phosphatdecarboxylase-Gen, Genkonstrukt enthaltend dieses Gen und seine Verwendung
JP4320689B2 (ja) 1998-06-16 2009-08-26 株式会社力王 履物用先芯
US6291245B1 (en) * 1998-07-15 2001-09-18 Roche Diagnostics Gmbh Host-vector system
EP0972838B1 (en) * 1998-07-15 2004-09-15 Roche Diagnostics GmbH Escherichia coli host/vector system based on antibiotic-free selection by complementation of an auxotrophy
US6413768B1 (en) * 1998-12-02 2002-07-02 University Of Maryland Expression plasmids
WO2002086098A2 (en) * 2001-03-05 2002-10-31 University Of Virginia Patent Foundation A lac operator-repressor system
AU2003216100A1 (en) * 2002-01-23 2003-09-02 Diversa Corporation Biocatalytic reduction of nitro groups
WO2003068948A1 (en) * 2002-02-13 2003-08-21 Dow Global Technologies Inc. Over-expression of extremozyme genes in pseudomonads and closely related bacteria
DE10214406A1 (de) * 2002-03-30 2003-10-09 Nutrinova Gmbh Verfahren und Marker zur einfachen Transformation und Selektion von rekombinanten Protisten
CA2482995C (en) * 2002-04-22 2013-01-29 Dow Global Technologies Inc. Low-cost production of peptides
CA2545610C (en) 2003-11-19 2014-03-25 Dow Global Technolgies Inc. Auxotrophic pseudomonas fluorescens bacteria for recombinant protein expression

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113025601A (zh) * 2019-12-25 2021-06-25 上海奥博生物医药技术有限公司 腈水解酶启动子优化表达及应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP1692282A4 (en) 2008-04-02
BRPI0416744A (pt) 2007-01-16
EP1692282A1 (en) 2006-08-23
AU2004293810B2 (en) 2010-07-01
CA2545610C (en) 2014-03-25
WO2005052151A1 (en) 2005-06-09
JP2012100669A (ja) 2012-05-31
KR20060132587A (ko) 2006-12-21
CN1906294B (zh) 2013-09-11
US20090325230A1 (en) 2009-12-31
JP2007511238A (ja) 2007-05-10
CA2545610A1 (en) 2005-06-09
EP1692282B1 (en) 2012-08-08
KR101237651B1 (ko) 2013-02-27
MXPA06005634A (es) 2006-08-23
AU2004293810A1 (en) 2005-06-09
JP5087741B2 (ja) 2012-12-05
US8288127B2 (en) 2012-10-16
US20050186666A1 (en) 2005-08-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1906294A (zh) 改良的蛋白表达系统
TWI247808B (en) Method of preparing amino acids by fermentation with the constructed amino acid producing bacteria
AU2016203224B2 (en) Production of recombinant proteins utilizing non-antibiotic selection methods and the incorporation of non-natural amino acids therein
US20110165626A1 (en) High yield production of sialic acid (neu5ac) by fermentation
CN1298855C (zh) 在宿主细胞中生成产物的方法
JP2002538832A (ja) 外因性アミノ酸および新規ａｔｐ再生システムを用いたインビトロ高分子生合成の方法
Marienhagen et al. Metabolic function of Corynebacterium glutamicum aminotransferases AlaT and AvtA and impact on L-valine production
CN114774343B (zh) 一种生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株及应用
Mindt et al. Fermentative production of N-methylglutamate from glycerol by recombinant Pseudomonas putida
CN1993377A (zh) 丙氨酸2,3氨基变位酶
CN1678624A (zh) 苯甲酸盐－和邻氨基苯甲酸盐－诱导的启动子
CN1809631A (zh) 用不能形成芽孢的微生物来生产泛酸盐/酯的方法
CN1620511A (zh) 透明质素合成酶基因及其表达
US10995350B2 (en) Purine alkaloid-producing microorganisms and methods of making and using the same
CN109790557B (zh) 控制生物膜分散以产生氨基酸或氨基酸衍生产物
CN1178245A (zh) 反式－4－羟基－l－脯氨酸的制造方法
CN1054799A (zh) 生物合成钴胺素和/或钴胺酰胺有关的多肽、编码这些多肽的dna序列、其制备方法及应用
Sycheva et al. Overproduction of noncanonical amino acids by Escherichia coli cells
CN1247786C (zh) 在芽孢杆菌细胞的枯草菌脂肽突变体中生产多肽的方法
JP7331278B1 (ja) ３’ｓｌのインビボ合成のための新規なシアリルトランスフェラーゼ
WO2023282315A1 (ja) 非天然アミノ酸含有タンパク質の分泌生産法
Bubnov et al. Glutamyl-and Glutaminyl-tRNA synthetases are a promising target for the design of an L-Threonine–producing strain
CN1714146A (zh) 丙氨酸2,3－氨基变位酶
AU757594B2 (en) Process for constructing amino acid-producing bacterium and process for producing amino acid by fermentation method with the use of the thus constructed amino acid-producing bacterium
CN1545556A (zh) 制备维生素b12的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: PHONEX CORP.

Free format text: FORMER OWNER: DOW GLOBAL TECHNOLOGIES INC.

Effective date: 20131010

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
C56 Change in the name or address of the patentee
CP01 Change in the name or title of a patent holder

Address after: michigan

Patentee after: Dow Global Technologies Llc

Address before: michigan

Patentee before: Dow Global Technologies Inc.

TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20131010

Address after: California, USA

Patentee after: PHONEX Corp.

Address before: michigan

Patentee before: Dow Global Technologies Llc

TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20240329

Address after: California, USA

Patentee after: Peliken Technology Holdings Ltd.

Country or region after: U.S.A.

Address before: California, USA

Patentee before: PHONEX Corp.

Country or region before: U.S.A.

TR01 Transfer of patent right