CN1863508A - 具有糖链的靶向性和肠道吸收控制性脂质体以及含有该脂质体的癌症治疗药和诊断药 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的在于提供一种脂质体，该脂质体结合有糖链，所属糖链具有与存在于各种组织的细胞表面上的各种凝集素(糖链识别蛋白)特异性的结合活性，可以识别实际的机体内细胞、组织，有效地输送药物或基因。
Description
技术领域
本发明涉及包括药物、化妆品在内，可应用于医学、药学领域、识别癌等靶细胞、组织、可用作将药物或基因局部运送到患处的治疗用药物递送系统或诊断用的细胞、组织探针，特别涉及肠道吸收性优异的糖链修饰的脂质体、以及其中包封有药物或基因等的脂质体制剂。
背景技术
美国的国家纳米技术战略(NNI)中力求实现的具体目标之一就是“攻击癌细胞或靶组织的药物或基因递送系统(DDS：药物递送系统)”。日本的综合科学技术委员会的纳米技术·材料领域推进战略中，重点领域有“医疗用超微系统·材料、利用、控制生物的机理控制的纳米生物”，其5年内的研究开发目标之一是“用于延长健康寿命的机体功能材料·定点治疗等技术的基点的建立”。另一方面，随着进入老龄化社会，癌症的患病率、死亡率逐年增加，人们期望开发出新型的治疗材料——靶向DDS。没有副作用的靶向DDS纳米材料的重要性在其它疾病中也引人注目，预测在不远的将来，其市场规模会超过10兆日元。这些材料于治疗的同时也有望应用于诊断中。
药物的疗效是药物到达特定的靶部位，通过在该处作用来表达。而另一方面，药物的副作用是由于药物作用在了不必要的部位。因此，为了有效且安全地使用药物，需要进行药物递送系统的开发。其中，特别是靶向(打靶)DDS，其概念是将药物以“必要的量”，只在“必要的时间”送入“体内必要的部位”。作为其代表性的材料，微粒子性载体——脂质体受到人们的注意。为使该颗粒也具有靶向功能，人们尝试了使脂质体的脂质种类、组成比、粒径、表面电荷改变等的被动打靶方法，但该方法远不足够，需要进一步改良。
另一方面，为了可实现高性能的打靶，也尝试了主动打靶法。这也被称为“导弹药物”，是理想的打靶方法，但目前国内外还没有成熟的产品，今后有望得到较大发展。该方法是将配体结合到脂质体膜面，通过特异性识别存在于靶组织的细胞膜面上的受体，使其可以主动地打靶的方法。该主动性打靶方法中，存在于靶细胞膜面上的受体的配体可能是抗原、抗体、肽、糖脂或糖蛋白等。其中，已逐步了解到糖脂或糖蛋白的糖链在机体组织的发生或形态形成、细胞的增殖或分化、机体防御或受精机理、癌变及其转移机制等各种细胞间的联系中，作为信息分子发挥着的重要的作用。
对于存在于靶各组织的细胞膜面上的受体，如选择蛋白、DC-SIGN、DC-SGNR、胶原凝集素、结合有甘露糖的凝集素等C型凝集素，Siglec等I型凝集素，甘露糖-6-磷酸受体等P型凝集素，R型凝集素，L型凝集素，M型凝集素，半乳凝集素等各种凝集素(糖链识别蛋白)的研究也取得了进展，具有各种分子结构的糖链作为新型DDS配体引起人们的注意(1)Yamazaki，N.，Kojima，S.，Bovin，N.V.，Andre，S.，Gabius，S.and Gabius，H.-J.(2000)Adv.Drug Delivery Rev.43，225-244.、2)Yamazaki，N.，Jigami，Y.，Gabius，H.-J.，Kojima，S(2001)Trends in Glycoscience and Glycotechnology 13，319-329.http://www.gak.co.jp/TIGG/71PDF/yamazaki.pdf)。
对于外膜表面结合有配体的脂质体，其作为向癌等靶部位选择性递送药物或基因等的DDS材料，已有很多研究结果。但是，它们都是在体外与靶细胞结合，在体内则几乎无法对所期望的靶细胞或组织进行打靶(1)Forssen，E.and Willis，M.(1998)Adv.Drug Delivery Rev.29，249-271、2)Takahashi，T.和M.Hashida编(1999)、Today’s DDS DrugDelivery System、159-167页、Iyaku Journal Co.Ltd.、大阪)。已知在利用糖链分子识别机能的DDS材料的研究开发中，对导入有具糖链的糖脂的脂质体也有一些研究结果。这些功能评价只是通过体外进行的，对于导入有具糖链的糖蛋白的脂质体的研究几乎没有进展(1)DeFrees，S.A.，Phillips，L.，Guo，L.and Zalipsky，S.(1996)J.Am.Chem.Soc.118，6101-6104.、2)Spevak，W.，Foxall，C.，Charych，D.H.，Dasqupta，F.and Nagy，J.O.(1996)J.Med.Chem.39，1018-1020.、3)Stahn，R.，Schafer，H.，Kernchen，F.and Schreiber，J.(1998)Glycobiology 8，311-319.、4)Yamazaki，N.，Jigami，Y.，Gabius，H.-J.，Kojima，S(2001)Trends in Glycoscience and Glycotechnology 13，319-329.http://www.gak.co.jp/TIGG/71PDF/yamazaki.pdf)。因此，对于包括结合有糖脂或糖蛋白等各种各样糖链的脂质体的制备方法以及体内动态分析的系统性研究是目前尚未开发，期望今后获得进展的重要课题。
白血病是其病态的分析和治疗方法最有进步的癌症之一。其治疗方法是以化疗为主，但现状是只有在有缓解(治愈)的可能性时，才非常强力地实施化学疗法，所产生的副作用也是非常强的。
近年来，有报道指出：随着老年人的增加，老年白血病患者也在增加。急性骨髓性白血病中，60岁或以上的患者占到50％。但是，近年白血病治疗的进步对于老年白血病患者治疗效果的提高未必有大的贡献。这可认为有以下的原因。一个是老年患者中，染色体异常或出现抗药性白血病细胞等的预后不良因素高频率出现。另一个原因是，由于给予抗癌药导致并发感染、骨髓障碍，从而对抗癌药造成器官损伤的可接受能力降低。也就是说，目前的困难是对于老年患者，难以进行对年轻患者施行的强力的化学疗法。
为了解决该问题，人们进行了增强对抗癌药的感受性的开发、分子靶向药物的开发等，可以认为可以带来理想的药物分布的药物递送系统(以下称为DDS)的开发是重大的解决方案之一。DDS带来的理想的药物分布可以减轻器官伤害程度，且可提高对白血病细胞的细胞毒性，可以改善老年白血病患者的治疗效果。
并且，新型DDS材料的研究中，可在最简便、成本低的口服给药中使用的DDS材料的开发也是重要的课题。例如，肽类和蛋白质类药物等通常为水溶性、高分子量，消化管的小肠粘膜透过性低，因此即使经过酶解等后再口服给药，也几乎不能被肠道吸收。因此，对将这些高分子量的药物或基因等由肠道输送到血液中的DDS材料，即结合有配体的脂质体的研究受到人们的瞩目(Lehr，C.-M.(2000)J.Controlled Release
65，19-29)。但是，对于使用糖链作为其配体的肠道吸收控制性脂质体的研究尚未见报告。
本发明人已经对一种糖链修饰的脂质体申请了专利，其特征在于：糖链经由接头蛋白与脂质体膜结合，糖链选自路易斯X型三糖链、唾液酸基路易斯X型四糖链、3’-唾液酸基乳糖胺三糖链、6’-唾液酸基乳糖胺三糖链，三(羟基甲基)氨基甲烷等低分子亲水化合物与脂质体膜和/或接头蛋白任意结合，形成亲水性；还对一种肠道吸收控制性脂质体申请了专利，该脂质体是糖链修饰的脂体，其中糖链选自乳糖2糖链、2’-岩藻糖基乳糖三糖链、二岩藻糖基乳糖四糖链和3-岩藻糖基乳糖三糖链，糖链可经由接头蛋白与脂质体结合。
发明内容
本发明的目的在于提供一种脂质体，该脂质体结合有糖链，所述糖链对存在于各种组织的细胞表面上的各种凝集素(糖链识别蛋白)具有特异性结合活性，该脂质体可以识别实际机体内的细胞、组织，有效地输送药物或基因。本发明的另一目的还在于提供含有该脂质体的疾病治疗药。本发明的目的又在于提供稳定性高的脂质体。
为解决上述课题，本发明人对脂质体的组成进行了研究，得到了稳定性高的脂质体。还对与脂质体表面结合的糖链的种类和结合密度、接头蛋白以及使脂质体形成亲水性的化合物等进行了各种试验、探讨，发现：可通过糖链的结构实际控制对各组织的靶向性，除此之外，通过特定的亲水性化合物对脂质体表面和/或接头蛋白进行水合处理，进一步对与脂质体结合的糖链的密度进行控制，则可进一步增加脂质体向各组织的转移量，由此可将药物或基因高效地输送到靶细胞、组织。从而完成了本发明。
本发明人又对将上述得到的脂质体实际用于疾病的治疗的情况进行了深入地研究，发现根据与表面结合的糖链的种类，可以应用于各种组织和器官的各种疾病中，从而完成了本发明。
本发明人还通过将有毒性问题的抗癌药多柔比星包封入脂质体中而减轻了毒性。不过，这仅是在药物安全性上有提高，对于白血病细胞的细胞毒性也会降低。因此，完成了使糖链与脂质体表面结合，进而可主动聚集于白血病细胞的DDS。
即，本发明涉及以下1-79的内容。
1.糖链修饰的脂质体，其中糖链与脂质体膜结合。
2.上述1的糖链修饰的脂质体，其中脂质体的构成脂质包含磷脂酰胆碱类(摩尔比0-70％)、磷脂酰乙醇胺类(摩尔比0-30％)、1种或以上选自磷脂酸类、长链烷基磷酸酯类和磷酸双十六烷基酯类的脂质(摩尔比0-30％)，1种或以上选自神经节苷脂类、糖脂类、磷脂酰甘油类和鞘磷脂类的脂质(摩尔比0-40％)，以及胆固醇类(摩尔比0-70％)。
3.上述2的糖链修饰的脂质体，其中，至少1种选自神经节苷脂类、糖脂类、磷脂酰甘油类、鞘磷脂类和胆固醇类的脂质在脂质体表面上集合，形成脂筏。
4.上述1-3中任一项的糖链修饰的脂质体，其结合了种类和密度受到控制的糖链。
5.上述1-4中任一项的糖链修饰的脂质体，其中，脂质体的粒径为30-500nm。
6.上述5的糖链修饰的脂质体，其中，脂质体的粒径为50-350nm。
7.上述1-6中任一项的糖链修饰的脂质体，其中，脂质体的ζ电位为-50至10mV。
8.上述7的糖链修饰的脂质体，其中，脂质体的ζ电位为-40至0mV。
9.上述8的糖链修饰的脂质体，其中，脂质体的ζ电位为-30至-10mV。
10.上述1-9中任一项的糖链修饰的脂质体，其中，糖链经由接头蛋白与脂质体膜结合。
11.上述10的糖链修饰的脂质体，其中，接头蛋白是来自生物体的蛋白质。
12.上述11的糖链修饰的脂质体，其中，接头蛋白是来自人的蛋白质。
13.上述12的糖链修饰的脂质体，其中，接头蛋白是来自人的血清蛋白。
14.上述11的糖链修饰的脂质体，其中，接头蛋白是人血清白蛋白或牛血清白蛋白。
15.上述1-14中任一项的糖链修饰的脂质体，其中，接头蛋白与在脂质体表面上形成的含有至少1种选自神经节苷脂类、糖脂类、磷脂酰甘油类、鞘磷脂类和胆固醇类的脂质的脂筏结合。
16.上述1-15中任一项的糖链修饰的脂质体，其中，亲水性化合物与脂质体膜和/或接头蛋白结合，从而使脂质体形成亲水性。
17.上述16的糖链修饰的脂质体，其中，亲水性化合物是低分子物质。
18.上述16或17的糖链修饰的脂质体，其中，亲水性化合物不易对糖链形成位阻，不会妨碍靶细胞膜面上的凝集素对糖链分子的识别反应的进行。
19.上述16-18中任一项的糖链修饰的脂质体，其中，亲水性化合物具有羟基。
20.上述16-19中任一项的糖链修饰的脂质体，其中，亲水性化合物为氨基醇类。
21.上述16-20中任一项的糖链修饰的脂质体，其中，亲水性化合物与脂质体膜表面直接结合。
22.上述16的糖链修饰的脂质体，该脂质体通过亲水性化合物而形成亲水性，该亲水性化合物如通式(1)所示，
X-R1(R2OH)n 式(1)
其中R1表示C1-C40的直链或支链烃链，R2不存在或表示C1-C40的直链或支链烃链，X表示与脂质体脂质或接头蛋白直接结合、或者与交联用二价试剂结合的反应性官能团，n表示自然数。
23.上述16的糖链修饰的脂质体，该脂质体通过亲水性化合物而形成亲水性，该亲水性化合物如通式(2)所示，
H2N-R3(R4OH)n 式(2)
其中R3表示C1-C40的直链或支链烃链，R4不存在或表示C1-C40的直链或支链烃链，H2N表示与脂质体脂质或接头蛋白直接结合、或者与交联用二价试剂结合的反应性官能团，n表示自然数。
24.上述16的糖链修饰的脂质体，该脂质体通过亲水性化合物而形成亲水性，该亲水性化合物如通式(3)所示，
H2N-R5(OH)n 式(3)
其中R5表示C1-C40的直链或支链烃链，H2N表示与脂质体脂质或接头蛋白直接结合、或者与交联用二价试剂结合的反应性官能团，n表示自然数。
25.上述16的糖链修饰的脂质体，其中使亲水性化合物三(羟基烷基)氨基链烷与脂质体膜和/或接头蛋白通过共价键结合，由此，脂质体膜和/或接头蛋白形成亲水性。
26.上述25的糖链修饰的脂质体，其中使选自三(羟基甲基)氨基乙烷、三(羟基乙基)氨基乙烷、三(羟基丙基)氨基乙烷、三(羟基甲基)氨基甲烷、三(羟基乙基)氨基甲烷、三(羟基丙基)氨基甲烷、三(羟基甲基)氨基丙烷、三(羟基乙基)氨基丙烷、三(羟基丙基)氨基丙烷的亲水性化合物与脂质体膜和/或接头蛋白通过共价键结合，由此，脂质体膜和/或接头蛋白形成亲水性。
27.上述1-26中任一项的糖链修饰的脂质体，该糖链修饰的脂质体以存在于各组织的细胞膜面上的受体——凝集素为靶，所述凝集素选自含有选择蛋白、DC-SIGN、DC-SGNR、胶原凝集素和结合有甘露糖的凝集素的C型凝集素，含有Siglec的I型凝集素，含有甘露糖-6-磷酸受体的P型凝集素，R型凝集素，L型凝集素，M型凝集素，半乳凝集素。
28.上述27的糖链修饰的脂质体，该糖链修饰的脂质体以选自E-选择蛋白、P-选择蛋白和L-选择蛋白的选择蛋白为靶。
29.上述1-28中任一项的糖链修饰的脂质体，其中，与脂质体结合的糖链的结合密度为：使用接头蛋白时，每个脂质体颗粒上有1-30000个；不使用接头蛋白时，每个脂质体颗粒上最多有1-500000个。
30.上述1-28中任一项的糖链修饰的脂质体，其中，与脂质体结合的糖链的结合密度为：每个与脂质体结合的蛋白质分子上有1-60个。
31.上述1-30中任一项的糖链修饰的脂质体，其中，脂质体具有肠道吸收功能。
32.上述1-31中任一项的糖链修饰的脂质体，其中，对选自血液中、肝脏、脾脏、肺、脑、小肠、心脏、胸腺、肾脏、胰脏、肌肉、大肠、骨、骨髓、眼、癌组织、炎症组织和淋巴结的组织或器官的靶向性高。
33.上述1-32中任一项的糖链修饰的脂质体，其中，糖链与脂质体膜结合，糖链选自α-1，2-甘露二糖二糖链、α-1，3-甘露二糖二糖链、α-1，4-甘露二糖二糖链、α-1，6-甘露二糖二糖链、α-1，3-α-1，6-甘露三糖三糖链、低聚甘露糖-3五糖链、低聚甘露糖-4b六糖链、低聚甘露糖-5七糖链、低聚甘露糖-6八糖链、低聚甘露糖-7九糖链、低聚甘露糖-8十糖链、低聚甘露糖-9十一糖链、3’-唾液酸基乳糖三糖链和6’-唾液酸基乳糖三糖链、3’-唾液酸基乳糖胺三糖链、6’-唾液酸基乳糖胺三糖链、路易斯X型三糖链、唾液酸基路易斯X型四糖链、乳糖二糖链、2’-岩藻糖基乳糖三糖链、二岩藻糖基乳糖四糖链和3-岩藻糖基乳糖三糖链。
34.脂质体制剂，该制剂是在上述1-33中任一项的脂质体中包封药物或基因而得。
35.上述34的脂质体制剂，其中，药物选自烷基化类抗癌药、代谢拮抗剂、来自植物的抗癌药、抗癌性抗生素、BRM·细胞因子类、铂络合物系抗癌药、免疫疗法药物、激素类抗癌药、单克隆抗体等肿瘤用药物，中枢神经用药物，末梢神经系·感觉器官用药物，呼吸器官疾病治疗药物，循环器官用药物，消化器官用药物，激素系统用药物，泌尿器官·生殖器官用药物，外用药，维生素·滋补强壮药，血液·体液用药物，代谢性药物，抗生素·化疗药、检查用药物，抗炎药，眼病药物，中枢神经类药物，自身免疫类药物，循环器官类药、糖尿病、高质血症等生活习惯病药物，或者口服、经肺、经皮或经粘膜的各种药物，肾上腺皮质激素，免疫抑制剂，抗炎药，抗菌药，抗病毒药，血管新生抑制剂，细胞因子或趋化因子，抗细胞因子抗体或抗趋化因子抗体，抗细胞因子·趋化因子受体抗体，siRNA、miRNA、smRNA、反义ODN或DNA等基因治疗相关的核酸制剂，神经保护因子，抗体药物等。
36.上述34或35的脂质体制剂，该制剂是口服用制剂。
37.上述34或35的脂质体制剂，该制剂是胃肠道外给药用制剂。
38.上述35的脂质体制剂，其中糖链修饰的脂质体所含的药物是多柔比星。
39.抗癌药，该抗癌药含有上述35的脂质体制剂，其中药物是肿瘤用药物。
40.上述39的抗癌药，该抗癌药是口服用抗癌药。
41.上述39的抗癌药，该抗癌药是胃肠道外给药的抗癌药。
42.脂质体，其中脂质体膜形成亲水性，糖链与表面结合。
43.上述42的脂质体，其中脂质体的构成脂质包含磷脂酰胆碱类(摩尔比0-70％)、磷脂酰乙醇胺类(摩尔比0-30％)、1种或以上选自磷脂酸类、长链烷基磷酸酯类和磷酸双十六烷基酯类的脂质(摩尔比0-30％)，1种或以上选自神经节苷脂类、糖脂类、磷脂酰甘油类和鞘磷脂类的脂质(摩尔比0-40％)，以及胆固醇类(摩尔比0-70％)。
44.上述42或43的脂质体，该脂质体还含有蛋白质。
45.上述42-44中任一项的脂质体，其中该脂质体通过使亲水性化合物与脂质体膜结合而形成亲水性。
46.上述45的脂质体，其中亲水性化合物为低分子物质。
47.上述45或46的脂质体，亲水性化合物不易对糖链形成位阻，不会妨碍靶细胞膜面上的凝集素对糖链分子的识别反应的进行。
48.上述45-47中任一项的脂质体，其中，亲水性化合物具有羟基。
49.上述45-48中任一项的脂质体，其中，亲水性化合物为氨基醇类。
50.上述45-49中任一项的脂质体，其中，亲水性化合物与脂质体膜表面直接结合。
51.上述45的脂质体，其中低分子的亲水性化合物至少具有一个OH基。
52.上述45的脂质体，其中亲水性化合物如通式(1)所示，
X-R1(R2OH)n 式(1)
R1表示C1-C40的直链或支链烃链，R2不存在或表示C1-C40的直链或支链烃链，X表示与脂质体脂质或接头蛋白直接结合、或者与交联用二价试剂结合的反应性官能团，n表示自然数。
53.上述45的脂质体，其中亲水性化合物如通式(2)所示，
H2N-R3(R4OH)n 式(2)
R3表示C1-C40的直链或支链烃链，R4不存在或表示C1-C40的直链或支链烃链，H2N表示与脂质体脂质或接头蛋白直接结合、或者与交联用二价试剂结合的反应性官能团，n表示自然数。
54.上述45的脂质体，其中亲水性化合物如通式(3)所示，
H2N-R5(OH)n 式(3)
R5表示C1-C40的直链或支链烃链，H2N表示与脂质体脂质或接头蛋白直接结合、或者与交联用二价试剂结合的反应性官能团，n表示自然数。
55.上述45的脂质体，其中使亲水性化合物三(羟基烷基)氨基链烷与脂质体膜和/或接头蛋白通过共价键结合，由此，脂质体膜和/或接头蛋白形成亲水性。
56.上述55的脂质体，其中，使选自三(羟基甲基)氨基乙烷、三(羟基乙基)氨基乙烷、三(羟基丙基)氨基乙烷、三(羟基甲基)氨基甲烷、三(羟基乙基)氨基甲烷、三(羟基丙基)氨基甲烷、三(羟基甲基)氨基丙烷、三(羟基乙基)氨基丙烷、三(羟基丙基)氨基丙烷的亲水性化合物与脂质体膜通过共价键结合，由此，脂质体膜形成亲水性。
57.脂质体制剂，该脂质体制剂是在上述42-56中任一项的脂质体中包封药物或基因而得。
58.上述57的脂质体制剂，其中，药物选自烷基化类抗癌药、代谢拮抗剂、来自植物的抗癌药、抗癌性抗生素、BRM·细胞因子类、铂络合物系抗癌药、免疫疗法药物、激素类抗癌药、单克隆抗体等肿瘤用药物，中枢神经用药物，末梢神经系·感觉器官用药物，呼吸器官疾病治疗药，循环器官用药物，消化器官用药物，激素系统用药物，泌尿器官·生殖器官用药物，外用药，维生素·滋补强壮药，血液·体液用药物，代谢性药物，抗生素·化疗药、检查用药物，抗炎药，眼病药物，中枢神经类药物，自身免疫类药物，循环器官类药、糖尿病、高质血症等生活习惯病药物，或者口服、经肺、经皮或经粘膜的各种药物，肾上腺皮质激素，免疫抑制剂，抗炎药，抗菌药，抗病毒药，血管新生抑制剂，细胞因子或趋化因子，抗细胞因子抗体或抗趋化因子抗体，抗细胞因子·趋化因子受体抗体，siRNA、miRNA、smRNA、反义ODN或DNA等基因治疗相关的核酸制剂，神经保护因子，抗体药物等。
59.上述57或58的脂质体制剂，该制剂是口服用制剂。
60.上述57或58的脂质体制剂，该制剂是胃肠道外给药用制剂。
61.抗癌药，该抗癌药含有上述58的脂质体制剂，其中药物是肿瘤用药物。
62.上述61的脂质体制剂，其中糖链修饰的脂质体所含的药物是多柔比星。
63.上述61或62的抗癌药，该抗癌药是口服用抗癌药。
64.上述61或62的抗癌药，该抗癌药是胃肠道给予用抗癌药。
65.化妆品组合物，该组合物含有脂质体制剂，该脂质体制剂是在上述1-33中任一项的糖链修饰的脂质体中包封了化妆品。
66.上述65的化妆品组合物，该组合物是经皮给予制剂。
67.上述65或66的化妆品组合物，其中化妆品是维生素A或维生素E。
68.食品组合物，该组合物含有脂质体制剂，该脂质体制剂是在上述1-33中任一项的糖链修饰的脂质体中包封了食品。
69.上述68的食品组合物，该组合物是口服制剂。
70.上述68或69的食品组合物，其中食品是补养品。
71.上述69或70的食品组合物，其中食品是维生素A或维生素E。
72.化妆品组合物，该组合物含有脂质体制剂，该脂质体制剂是在上述42-56中任一项的脂质体中包封了化妆品。
73.上述72的化妆品组合物，该组合物是经皮给予制剂。
74.上述72或73的化妆品组合物，其中化妆品是维生素A或维生素E。
75.食品组合物，该组合物含有脂质体制剂，该脂质体制剂是在上述42-56中任一项的脂质体中包封了食品。
76.上述75的食品组合物，该组合物是口服制剂。
77.上述75或76的食品组合物，其中食品是补养品。
78.上述76或77的食品组合物，其中食品是维生素A或维生素E。
本说明书包含本申请的优先权基础——日本国专利申请号2003-285432、2004-093872号说明书和/或附图的内容。
附图简述
图1是表示结合有α-1，2-甘露二糖二糖链的脂质体的结构例的模式图。
图2是表示结合有α-1，3-甘露二糖二糖链的脂质体的结构例的模式图。
图3是表示结合有α-1，4-甘露二糖二糖链的脂质体的结构例的模式图。
图4是表示结合有α-1，6-甘露二糖二糖链的脂质体的结构例的模式图。
图5是表示结合有α-1，3-α-1，6-甘露三糖三糖链的脂质体的结构例的模式图。
图6是表示结合有低聚甘露糖-3五糖链的脂质体的结构例的模式图。
图7是表示结合有低聚甘露糖-4b六糖链的脂质体的结构例的模式图。
图8是表示结合有低聚甘露糖-5七糖链的脂质体的结构例的模式图。
图9是表示结合有低聚甘露糖-6八糖链的脂质体的结构例的模式图。
图10是表示结合有低聚甘露糖-7九糖链的脂质体的结构例的模式图。
图11是表示结合有低聚甘露糖-8十糖链的脂质体的结构例的模式图。
图12是表示结合有低聚甘露糖-9十一糖链的脂质体的结构例的模式图。
图13是表示将13种脂质体复合物静脉内给予60分钟后在血液中的分布量的图。
图14是表示将13种脂质体复合物静脉内给予60分钟后在肝脏中的分布量的图。
图15是表示将13种脂质体复合物静脉内给予60分钟后在脾脏中的分布量的图。
图16是表示将13种脂质体复合物静脉内给予60分钟后在肺中的分布量的图。
图17是表示将13种脂质体复合物静脉内给予60分钟后在脑中的分布量的图。
图18是表示将13种脂质体复合物静脉内给予60分钟后在癌组织中的分布量的图。
图19是表示将13种脂质体复合物静脉内给予60分钟后在淋巴结中的分布量的图。
图20是表示将13种脂质体复合物静脉内给予60分钟后在胸腺中的分布量的图。
图21是表示将13种脂质体复合物静脉内给予60分钟后在心脏中的分布量的图。
图22是表示将13种脂质体复合物静脉内给予60分钟后在小肠中的分布量的图。
图23是表示结合有3’-唾液酸基乳糖三糖链的脂质体的结构例的模式图。
图24是表示结合有6’-唾液酸基乳糖三糖链的脂质体的结构例的模式图。
图25是表示结合有3’-唾液酸基乳糖胺三糖链的脂质体的结构例的模式图。
图26是表示结合有6’-唾液酸基乳糖胺三糖链的脂质体的结构例的模式图。
图27是表示将4种脂质体复合物肠道内给予10分钟后向血液中的转移量的图。
图28是表示将4种脂质体复合物肠道内给予10分钟后向血液中的转移量的图。
图29是表示将4种脂质体复合物肠道内给予10分钟后向血液中的转移量的图。
图30是表示将4种脂质体复合物肠道内给予10分钟后向血液中的转移量的图。
图31是表示将4种脂质体复合物肠道内给予10分钟后向血液中的转移量的图。
图32是表示结合有作为比较试样的三(羟基甲基)氨基甲烷的脂质体的模式图。
图33是表示结合有路易斯X型三糖链的脂质体的结构例的模式图。
图34是表示结合有唾液酸基路易斯X型四糖链的脂质体的结构例的模式图。
图35是表示经乳糖二糖链修饰的脂质体的结构例的模式图。
图36是表示经2’-岩藻糖基乳糖三糖链修饰的脂质体的结构例的模式图。
图37是表示经二岩藻糖基乳糖四糖链修饰的脂质体的结构例的模式图。
图38是表示经3-岩藻糖基乳糖三糖链修饰的脂质体的结构例的模式图。
图39是表示尾静脉注射给予结合有α-1，6-甘露二糖二糖链的脂质体在癌症小鼠中的制癌效果的照片。
图40是表示尾静脉注射给予结合有α-1，6-甘露二糖二糖链的脂质体在癌症小鼠中的制癌效果的照片。
图41是表示口服给予结合有3-岩藻糖基乳糖三糖链的脂质体在癌症小鼠中的制癌效果的照片。
图42是表示口服给予结合有3-岩藻糖基乳糖三糖链的脂质体在癌症小鼠中的制癌效果的照片。
图43是表示干扰素α导致L-Dox和L-Dox-SLX细胞毒性增强的实验的结果图。
图44是表示L-选择蛋白中和抗体导致IFN附加时L-Dox-SLX细胞毒性增强的实验的结果图。
图45是表示癌症小鼠血液中的多柔比星浓度随时间变化的图。
图46是表示癌症小鼠肿瘤中的多柔比星浓度随时间变化的图。
图47是表示多柔比星在癌症小鼠的肿瘤组织和细胞中的分布的显微镜照片。
图48是表示尾静脉注射给予在癌症小鼠中的制癌效果的图。
图49是表示尾静脉注射给予在癌症小鼠中的制癌效果的照片。
图50是表示在显示尾静脉注射给予在癌症小鼠中的制癌效果中，各给予组的肿瘤重量的图。
图51是表示对癌症小鼠尾静脉注射给予进行了2种亲水性处理的脂质体和未经处理的脂质体，5分钟后血液中滞留性的比较结果的图。
图52是发生炎症的RA小鼠的四肢的照片。
图53是表示对RA小鼠静脉给予包封泼尼松龙的DDS进行治疗的结果的图。
图54是表示对RA小鼠口服给予包封泼尼松龙的DDS进行治疗的结果的图。
图55是表示对RA小鼠给予适量的泼尼松龙进行治疗的结果的图。
实施发明的最佳方式
以下，进一步详细说明本发明。
本发明是表面具有各种糖链的靶向性脂质体和肠道吸收控制性脂质体。本发明中，靶向性是指给予生物体内时，可特异性地到达特定的组织或器官或者癌等疾病部位等的靶位并被摄入的性质。肠道吸收控制性是指经由肠道深入到机体内的性质，即具有肠道吸收性并可以控制被摄入的速度、程度等的性质。
脂质体通常是指由集合成膜状的脂质层和内部的水层构成的封闭泡囊。如图1-12、23-26和32-38所示，本发明的脂质体其表面、即脂质层上结合有糖链。糖链可以与脂质体的脂质层直接结合，也可以经由接头蛋白共价键合，其中所述接头蛋白是含有人血清白蛋白等来自人的蛋白质的生物蛋白。糖链的种类和密度受到控制地结合。
可以根据本发明的肠道吸收控制性脂质体和本发明的靶向性脂质体的靶组织或器官或者癌而使用各种糖链。
已知在病变部位的血管内皮细胞中表达的E-选择蛋白、P-选择蛋白与在白细胞的细胞膜上表达的糖链——唾液酸基路易斯X糖链强烈结合。可以认为：本发明的脂质体是与唾液酸基路易斯X糖链、或与其类似地可与E-选择蛋白、P-选择蛋白等凝集素样的具有糖链结合部位的蛋白质反应的糖链在糖链的种类和密度受到控制情况下相结合的脂质体，特异性地聚集在血管内皮细胞中表达E-选择蛋白、P-选择蛋白等的癌等病灶部位。表达E-选择蛋白、P-选择蛋白等的部位是发生炎症或血管新生的部位，所述部位的血管中，内皮细胞的细胞间隙扩大，聚集的脂质体由该间隙向病灶部位及其周围扩散。扩散的脂质体被摄入到病灶部位及其周围的各种细胞中(吞噬)，包封的药物在细胞内释放。通过上述机理对炎症性疾病或癌等发挥效果。
如上所述，与本发明的脂质体结合的糖链可以举出与下述蛋白质反应的糖链，所述蛋白指E-选择蛋白、P-选择蛋白等凝集素样的具有糖链结合部位的蛋白。这里，E-选择蛋白、P-选择蛋白等是指选择蛋白、DC-SIGN、DC-SGNR、胶原凝集素、甘露糖结合蛋白等C型凝集素，Siglec等I型凝集素，甘露糖-6-磷酸受体等P型凝集素，R型凝集素，L型凝集素，M型凝集素，半乳凝集素等各种凝集素(糖链识别蛋白)。成为本发明的脂质体的靶的细胞中，由于在不同的细胞中表达的凝集素样的具有糖链结合部位的蛋白质的种类不同，因此，根据该蛋白质的种类选择糖链，可得到对特定的细胞具有特异性靶向性的脂质体。
例如，肠道吸收控制性脂质体有：3’-唾液酸基乳糖三糖链(图23中给出结构式。以下相同)、6’-唾液酸基乳糖三糖链(图24)、3’-唾液酸基乳糖胺糖链(图25)和6’-唾液酸基乳糖胺糖链(图26)，靶向性脂质体有：α-1，2-甘露二糖二糖链(图1)、α-1，3-甘露二糖二糖链(图2)、α-1，4-甘露二糖二糖链(图3)、α-1，6-甘露二糖二糖链(图4)、α-1，3-α-1，6-甘露三糖三糖链(图5)、低聚甘露糖-3五糖链(图6)、低聚甘露糖-4b六糖链(图7)、低聚甘露糖-5七糖链(图8)、低聚甘露糖-6八糖链(图9)、低聚甘露糖-7九糖链(图10)、低聚甘露糖-8十糖链(图11)、低聚甘露糖-9十一糖链(图12)、路易斯X型三糖链(图33)、唾液酸基路易斯X型四糖链(图34)、乳糖二糖链(图35)、2’-岩藻糖基乳糖三糖链(图36)、二岩藻糖基乳糖四糖链(图37)、3-岩藻糖基乳糖三糖链(图38)。
为了使本发明所使用的脂质体膜稳定性好、包封的药物或基因等不渗漏、可以对膜面进行亲水性处理、可以以各种密度结合蛋白质、可以以各种密度结合糖链等，为此进行了深入地工作，制备了以下以各种脂质和糖脂等为构成成分的脂质体。构成本发明的脂质体的脂质例如有：磷脂酰胆碱类、磷脂酰乙醇胺类、磷脂酸类、长链烷基磷酸酯类、磷酸双十六烷基酯类、神经节苷脂类、糖脂类、磷脂酰甘油类、鞘磷脂类、胆固醇类等，磷脂酰胆碱类优选二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰胆碱等，磷脂酰乙醇胺类优选二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺等，磷脂酸类或长链烷基磷酸酯类优选二肉豆蔻酰基磷脂酸、二棕榈酰基磷脂酸、二硬脂酰基磷脂酸、磷酸双十六烷基酯等，神经节苷脂类优选神经节苷脂GM1、神经节苷脂GD1a、神经节苷脂GT1b等，糖脂类优选半乳糖基神经酰胺、葡糖基神经酰胺、乳糖基神经酰胺、磷脂、红细胞糖苷脂等，磷脂酰甘油类优选二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油、二棕榈酰基磷脂酰甘油、二硬脂酰基磷脂酰甘油等。其中，磷脂酸类或长链烷基磷酸酯类、神经节苷脂类或糖脂类、胆固醇类具有提高脂质体的稳定性的效果，因此优选作为构成脂质添加。
例如，构成本发明的脂质体的脂质有：含有一种或以上选自磷脂酰胆碱类(摩尔比0-70％)、磷脂酰乙醇胺类(摩尔比0-30％)、磷脂酸类、长链烷基磷酸酯和磷酸双十六烷基酯的脂质(摩尔比0-30％)，一种或以上选自神经节苷脂类、糖脂类、磷脂酰甘油类和鞘磷脂类的脂质(摩尔比0-40％)，以及胆固醇类(摩尔比0-70％)的脂质体。脂质体本身可按照周知的方法制备，其中可以采用薄膜法、逆相蒸发法、乙醇注入法、脱水-再水合法等。
另外，使用超声波照射法、挤压法、French Press法、均相法等，也可以调节脂质体的粒径。关于本发明的脂质体本身的制备方法，具体来说就是：例如首先制备以磷脂酰胆碱类、胆固醇类、磷脂酰乙醇胺类、磷脂酸类、神经节苷脂类、糖脂类或磷脂酰甘油类为配比成分的脂质与表面活性剂胆酸钠的混合胶束。
尤其是关于磷脂酸类或磷酸双十六烷酯等长链烷基磷酸酯类的配比必须是使脂质体带有负电荷；作为亲水性反应部位，混合磷脂酰乙醇胺类是必须的，作为接头蛋白的结合部位，神经节苷脂类或糖脂类或磷脂酰甘油类是必须的。至少一种选自神经节苷脂类、糖脂类、磷脂酰甘油类、鞘磷脂类和胆固醇类的脂质在脂质体中集合，发挥与接头蛋白结合的支撑(脂筏)的功能。本发明的脂质体通过形成上述可结合蛋白质的脂筏变得进一步稳定。即，本发明的脂质体包含形成至少一种选自神经节苷脂类、糖脂类、磷脂酰甘油类、鞘磷脂类和胆固醇类的脂质的脂筏的脂质体。
通过对这样得到的混合胶束进行超滤来制备脂质体。
本发明中使用的脂体可以使用通常的脂质体，优选其表面形成亲水性。如上所述，制备脂质体后，使脂质体表面形成亲水性。脂质体表面的亲水性的形成通过使亲水性化合物与脂质体表面结合来进行。亲水性形成中所使用的化合物为低分子亲水性化合物，优选至少具有1个OH基的低分子亲水性化合物，进一步优选至少具有2个OH基的低分子亲水性化合物。还进一步优选至少具有1个氨基的低分子亲水性化合物。也就是说，是分子中具有至少1个OH基和至少1个氨基的亲水性化合物。亲水性化合物是低分子的，因此不易对糖链形成位阻，不会妨碍靶细胞膜面上的凝集素对糖链分子的识别反应的进行。另外，亲水性化合物中不包括如本发明的糖链修饰的脂质体中用于指向凝集素等特定的靶的可以结合凝集素的糖链。所述亲水性化合物例如有：包括三(羟基甲基)氨基甲烷等的三(羟基烷基)氨基链烷等氨基醇类等，更具体地有：三(羟基甲基)氨基乙烷、三(羟基乙基)氨基乙烷、三(羟基丙基)氨基乙烷、三(羟基甲基)氨基甲烷、三(羟基乙基)氨基甲烷、三(羟基丙基)氨基甲烷、三(羟基甲基)氨基丙烷、三(羟基乙基)氨基丙烷、三(羟基丙基)氨基丙烷等。具有OH基的低分子化合物中导入有氨基的化合物也可作为本发明的亲水性化合物使用。该化合物不受限定，例如有在纤维二糖等不与凝集素结合的糖链中导入氨基而成的化合物。例如，使用交联用的二价试剂和三(羟基甲基)氨基甲烷，在脂质体膜的脂质磷脂酰乙醇胺上，使脂质体膜表面形成亲水性。亲水性化合物的通式如下述式(1)、式(2)、式(3)等表示。
X-R1(R2OH)n 式(1)
H2N-R3(R4OH)n 式(2)
H2N-R5(OH)n 式(3)
这里，R1、R3和R5表示C1-C40、优选C1-C20、进一步优选C1-C10的直链或支链烃链，R2、R4不存在或表示C1-C40、优选C1-C20、进一步优选C1-C10的直链或支链烃链。X表示与脂质体脂质直接结合、或者与交联用二价试剂结合的反应性官能团，例如COOH、NH、NH2、CHO、SH、NHS-酯、马来酰亚胺、亚氨酸酯、活性卤素、EDC、二硫吡啶基、叠氮苯基、酰肼等。n表示自然数。
通过上述亲水性化合物形成亲水性的脂质体的表面被亲水性化合物薄薄覆盖。不过，由于该亲水性化合物覆盖的厚度薄，糖链与脂质体结合时糖链等的反应活性不会受到抑制。
脂质体形成亲水性，这可通过采用以往公知的方法、例如使用通过共价键结合有聚乙二醇、聚乙烯醇、马来酸酐共聚物等的磷脂来制备脂质体的方法(日本特开2000-302685号)等方法进行。
其中特别优选使用三(羟基甲基)氨基甲烷使脂质体表面形成亲水性。
本发明的使用三(羟基甲基)氨基甲烷的方法与使用聚乙二醇等的以往的亲水性形成方法相比因以下几个方面而优选。例如如本发明，在将糖链结合在脂质体上、利用其分子识别功能作为靶向性中，三(羟基甲基)氨基甲烷是低分子量物质，因此与以往的使用聚乙二醇等高分子量物质的方法相比，不易对糖链形成位阻，不妨碍靶细胞膜面上的凝集素(糖链识别蛋白)对糖链分子的识别反应的进行，因而特别优选。
另外，在该亲水性处理后，本发明的脂质体的粒径分布或成分组成、分散特性依然良好，长时间保存性、机体内稳定性也优异，因此优选用于脂质体的制剂化。
使用三(羟基甲基)氨基甲烷使脂质体表面形成亲水性的过程可如下进行：例如向使用二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺等脂质，通过常规方法得到脂质体溶液中加入双磺基琥珀酰亚氨基辛二酸酯、二琥珀酰亚氨基戊二酸酯、二硫代双琥珀酰亚氨基丙酸酯、二琥珀酰亚氨基辛二酸酯、3，3’-二硫代双磺基琥珀酰亚氨基丙酸酯、双琥珀酰亚氨基琥珀酸乙二醇酯、双磺基琥珀酰亚氨基琥珀酸乙二醇酯等二价试剂，进行反应，由此使2价试剂与脂质体膜上的二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺等的脂质结合，然后使三(羟基甲基)氨基甲烷与该2价试剂的一个键反应，这样，可以使三(羟基甲基)氨基甲烷与脂质体表面结合。
这样，对脂质体实施了亲水性处理后的脂质体在机体内极为稳定，如后所述，即使不结合具有靶向性的糖链，由于在体内的半衰期长，也可以优选用作药物递送系统中的药物载体。本发明也包含通过低分子化合物使表面形成亲水性的脂质体。
本发明还包含使用上述形成亲水性的化合物形成亲水性的、并不结合糖链的脂质体本身。这样的亲水性脂质体具有其脂质体本身的稳定性高，与糖链结合时对糖链的识别性高的优点。
本发明的脂质体是以下的脂质体：例如脂质体的构成脂质包含磷脂酰胆碱类(摩尔比0-70％)、磷脂酰乙醇胺类(摩尔比0-30％)、1种或以上选自磷脂酸类、长链烷基磷酸酯和磷酸双十六烷基酯类的脂质(摩尔比0-30％)，1种或以上选自神经节苷脂类、糖脂类、磷脂酰甘油类和鞘磷脂类的脂质(摩尔比0-40％)，以及胆固醇类(摩尔比0-70％)。
本发明还包含使上述形成亲水性的化合物与脂质体结合，使脂质体形成亲水性的方法。也包含未结合糖链但形成亲水性的脂质体。可以通过使糖链与未结合糖链的脂质体结合来制备本发明的靶向性脂质体或肠道吸收性脂质体。
本发明中，可以使上述任意的糖链与如上制备的脂质体直接结合，还可以使糖链经由接头蛋白结合。此时，与脂质体结合的糖链的种类不限于一种，可以结合多种糖链。这种情况下，多种糖链可以是对共通存在于相同组织或器官的细胞表面上的不同的凝集素具有结合活性的多种糖链，也可以是对存在于不同的组织或器官的细胞表面上的不同的凝集素具有结合活性的糖链。通过选择前者的多种糖链，可以明确地指向特定的靶组织或器官，选择后者的多种糖链，则可以是一种脂质体指向多个靶，可得到多功能靶向性脂质体。
为使糖链与脂质体结合，可以在制备脂质体时将接头蛋白和/或糖链混合，在制备脂质体的同时使糖链与其表面结合，但优选预先分别准备好脂质体、接头蛋白和糖链，使接头蛋白和/或糖链与制备完成的脂质体结合。这是由于通过使接头蛋白和/或糖链与脂质体结合，可以控制所结合的糖链的密度。
糖链与脂质体的直接结合可按照下述的方法进行。
以糖脂的形式混合糖链，制备脂质体，或使糖链与制备好的脂质体的磷脂结合，同时控制糖链密度。
使用接头蛋白与糖链结合时，接头蛋白可使用来自生物体的蛋白质、特别优选使用来自人的蛋白质。来自生物体的蛋白质没有限定，有白蛋白等存在于血液中的蛋白质、其它存在于生物体中的生理活性物质等。例如有人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)等动物的血清白蛋白，特别是通过对小鼠的实验证实，使用人血清白蛋白时，各组织中摄入得多。
本发明的脂质体非常稳定，可以进行以下的后处理：形成脂质体后连接蛋白质，或连接接头蛋白，或连接糖链。因此，在大量制备脂质体后，可以根据目的，连接各种不同的蛋白质，或者连接接头蛋白或糖链，由此制备与目的相适应的各种脂质体。
糖链经由接头蛋白与本发明的脂质体连接，或与构成脂质体的脂质直接结合。本发明的脂质体是具有糖脂或糖蛋白等复合糖配体、用低分子化合物进行亲水性处理的脂质体。
如后所述，将本发明的靶向性脂质体用作药物时，该脂质体必须含有具有药效的化合物。该具有药效的化合物可以包封在脂质体中，或者与脂质体表面结合，接头蛋白可以使用具有药效的蛋白质。这种情况下，蛋白质可以兼用作使脂质体与糖链结合的接头蛋白以及具有药效的蛋白质。具有药效的蛋白质有生理活性蛋白质。
经由接头蛋白使糖链与脂质体结合，这可以按照下述的方法进行。
首先，使蛋白质与脂质体表面结合。将脂质体用NaIO4、Pb(O2CCH3)4、NaBiO3等氧化剂处理，使存在于脂质体膜面的神经节苷脂氧化，然后用NaBH3CH、NaBH4等试剂，通过还原性氨基化反应使接头蛋白与脂质体膜面上的神经节苷脂结合。该接头蛋白也优选形成亲水性，为此，可使具有羟基的化合物与接头蛋白结合，例如使用双磺基琥珀酰亚氨基辛二酸酯、二琥珀酰亚氨基戊二酸酯、二硫代双琥珀酰亚氨基丙酸酯、二琥珀酰亚氨基辛二酸酯、3，3’-二硫代双磺基琥珀酰亚氨基丙酸酯、双琥珀酰亚氨基琥珀酸乙二醇酯、双磺基琥珀酰亚氨基琥珀酸乙二醇酯等2价试剂，使三(羟基甲基)氨基甲烷等上述用于形成亲水性的化合物与脂质体上的接头蛋白结合。
具体来说，首先将交联用2价试剂的一端与接头蛋白的全部氨基结合。然后对各种糖链的还原末端进行糖基氨基化反应，制备所得的糖链的糖基胺化合物，将该糖链的氨基与脂质体上上述结合的交联2价试剂一部分的另一未反应的末端结合。
糖链和/或亲水性化合物与脂质体的共价键、或者糖链和/或亲水性化合物与接头蛋白的共价键可以在脂质体被摄入到细胞内时切断。例如，如果接头蛋白与糖链是经由二硫键共价键合，则在细胞内被还原，糖链被切断。糖链被切断后，脂质体表面形成疏水性，与机体膜结合，膜稳定性被打乱，脂质体中所含的药物被释放出来。
接着，使用上述得到的结合有糖链的脂质体膜面上蛋白质的表面上未结合糖链的、因未反应而残留的大部分2价试剂未反应末端进行亲水性处理。也就是说，使与该脂质体上蛋白质结合的2价试剂的未反应末端与三(羟基甲基)氨基甲烷等进行形成上述亲水性所使用的化合物进行结合反应，使脂质体整个表面形成亲水性。
脂质体表面和接头蛋白形成亲水性，这可以提高向各种组织的转移性、以及血液中的滞留性和向各种组织的转移性。这是由于：脂质体表面和接头蛋白表面形成亲水性，则糖链以外的部分在各组织等中被认为是机体内的水分，因此，不被靶以外的组织等识别，而只有糖链被其靶组织的凝集素(糖链识别蛋白)识别。
接着，使糖链与脂质体上的接头蛋白结合。其过程是：用NH4HCO3、NH2COONH4等铵盐对构成糖链的糖类的还原末端进行糖基氨基化，然后使用双磺基琥珀酰亚氨基辛二酸酯、二琥珀酰亚氨基戊二酸酯、二硫代双琥珀酰亚氨基丙酸酯、二琥珀酰亚氨基辛二酸酯、3，3’-二硫代双磺基琥珀酰亚氨基丙酸酯、双琥珀酰亚氨基琥珀酸乙二醇酯、双磺基琥珀酰亚氨基琥珀酸乙二醇酯等2价试剂，使结合于脂质体膜面上的接头蛋白和上述糖基氨基化的糖类结合，得到图1-12、23-26和33-38所示的脂质体。这些糖链市面有售。
本发明的脂质体、结合有糖链等的脂质体的粒径为30-500nm，优选50-350nm。本发明的脂质体优选带有负电荷。通过带有负电荷，可以防止与机体中带有负电荷的细胞相互作用。在生理盐水中，37℃下，本发明的脂质体表面的ζ电位为-50至10mV，优选-40至0mV，进一步优选-30至-10mV。
关于结合糖链时糖链的结合密度，每一个结合在脂质体上的接头蛋白分子上为1-60个，优选1-40个，进一步优选1-20个。使用接头蛋白时，每个脂质体颗粒上可以有1-30000个、优选1-20000个、进一步优选1-10000个，或者有100-30000个、优选100-20000个、进一步优选100-10000个，或者有500-30000个、优选500-20000个、进一步优选500-10000个糖链。不使用接头蛋白时，每个脂质体颗粒最高可结合1-500000个，优选1-300000个，进一步优选1-100000个或以上的糖链。
本发明中，可以通过对所使用的糖链的结构和糖链结合量进行各种选择，来控制对各种靶细胞、组织的靶向性。
还可以通过糖链的种类和糖链结合量来提高在肠道中的吸收性。通过将可提高肠道吸收控制性的糖链和对特定的组织或器官具有靶向性的糖链两者与脂质体结合，可以制备兼具对特定的组织或器官具有靶向性以及肠道吸收控制性两者特性的脂质体。
如上所述，本发明的靶向性脂质体通过糖链的种类和糖链结合量来确定要特异性结合的凝集素，特异性到达特定的组织或器官。通过选择糖链结构和糖链结合量，还可以使其到达癌组织等的疾病部位。
本发明中，通过对所使用的糖链的结构和糖链结合量进行各种选择，可以控制对各靶细胞、组织的靶向性。本发明的脂质体可通过糖链对血液中、肝脏、脾脏、肺、脑、小肠、心脏、胸腺、肾脏、胰脏、肌肉、大肠、骨、骨髓、癌组织、炎症组织和淋巴结等的组织或器官打靶。例如，如实施例中的图13、16、17、18、21和22所示，结合有α-1，2-甘露二糖二糖链、α-1，3-甘露二糖二糖链、α-1，4-甘露二糖二糖链、α-1，6-甘露二糖二糖链、α-1，3-α-1，6-甘露三糖三糖链、低聚甘露糖-3五糖链、低聚甘露糖-4b六糖链、低聚甘露糖-5七糖链、低聚甘露糖-6八糖链、低聚甘露糖-7九糖链、低聚甘露糖-8十糖链、低聚甘露糖-9十一糖链的脂质体全部对血液中、肺、脑、癌组织、心脏和小肠的靶向性高。如图14所示，结合有α-1，2-甘露二糖二糖链、低聚甘露糖-3五糖链、低聚甘露糖-4b六糖链的脂质体对肝脏的靶向性高。如图15所示，结合有α-1，2-甘露二糖二糖链、α-1，3-甘露二糖二糖链、α-1，3-α-1，6-甘露三糖三糖链的脂质体对脾脏的靶向性高。如图19所示，结合有α-1，2-甘露二糖二糖链、α-1，4-甘露二糖二糖链、α-1，6-甘露二糖二糖链的脂质体对淋巴结的靶向性高。还有结合有低聚甘露糖-6八糖链对胸腺的靶向性高。
本发明图23-26所示的脂质体都是肠道吸收性极高，并且通过调节脂质体上的糖链的密度，可以控制肠道吸收性，使药物更有效地转移到靶位，还可减轻副作用。例如，实施例的图27-30表示了将上述四种糖链修饰的脂质体中的糖链结合量变化为三种程度时脂质体由肠道向血液中的转移性(即肠道吸收性)。
该糖链结合量的变化通过将糖链以三种程度的浓度(1)50μg、2)200μg、3)1mg)与连接有接头蛋白的脂质体结合来进行。这样，当糖链为6’-唾液酸基乳糖三糖链和6’-唾液酸基乳糖胺糖链时，随着糖链密度的提高，肠道吸收性依次降低，但当为3’-唾液酸基乳糖三糖链、3’-唾液酸基乳糖胺糖链时，肠道吸收性反而上升。这显示：肠道吸收性随脂质体上的糖链的结合量、糖链的种类而不同。因此，根据糖链的种类，通过适当设定脂质体上的糖链结合量，可以控制肠道吸收性。
通过使本发明的脂质体中含有具有药效的化合物，脂质体到达特定的组织或器官，脂质体被摄入到该组织或器官的细胞中，释放具有药效的化合物，发挥药效。当为结合有糖链的脂质体时，通过糖链所具有的靶向性，脂质体到达特定的组织或器官。另外，即使未结合糖链，由于脂质体在体内非常稳定，所以半衰期变长，也可到达特定的组织或器官。
具有药效的化合物并没有限定，可以广泛使用公知的蛋白质、公知的药用化合物。通过含有抗癌药等针对特定的疾病的药用化合物，本发明的脂质体可以作为特定疾病的治疗药使用。本发明的脂质体中所含的具有药效的化合物有基因治疗用DNA、RNA、siRNA等。
本发明的脂质体中所含的药用化合物选自烷基化类抗癌药、代谢拮抗剂、来自植物的抗癌药、抗癌性抗生素、BRM·细胞因子类、铂络合物系抗癌药、免疫疗法药物、激素类抗癌药、单克隆抗体等肿瘤用药物，中枢神经用药物，末梢神经系·感觉器官用药物，呼吸器官疾病治疗药物，循环器官用药物，消化器官用药物，激素系统用药物，泌尿器官·生殖器官用药物，外用药，维生素·滋补强壮药，血液·体液用药物，代谢性药物，抗生素·化疗药、检查用药物，抗炎药，眼病药物，中枢神经类药物，自身免疫类药物，循环器官类药、糖尿病.高质血症等生活习惯病药物，或者口服、经肺、经皮或经粘膜的各种药物，肾上腺皮质激素，免疫抑制剂，抗炎药，抗菌药，抗病毒药，血管新生抑制剂，细胞因子或趋化因子，抗细胞因子抗体或抗趋化因子抗体，抗细胞因子·趋化因子受体抗体，siRNA、miRNA、smRNA、反义ODN或DNA等基因治疗相关的核酸制剂，神经保护因子，各种抗体药物等。
例如，肿瘤用药物有盐酸N-氧氮芥、环磷酰胺(cyclofosfamine)、异环磷酰胺、brusfan、盐酸尼莫司汀、二溴甘露醇、美法仑、达卡巴嗪、雷莫司汀、雌莫司汀磷酸酯钠等烷基化剂，巯嘌呤、巯嘌呤苷(巯嘌呤核苷)、甲氨喋呤、依诺他滨、阿糖胞苷、盐酸安西他滨(盐酸环胞苷)、氟尿嘧啶、5-FU、替加氟、去氧氟尿苷、卡莫氟等的代谢拮抗剂，包括依托泊苷、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、硫酸长春地辛、紫杉醇、泰素、盐酸伊立替康、盐酸nogitecan等生物碱等的来自植物的抗癌药，放线菌素D、丝裂霉素C、色霉素A3、盐酸博来霉素、硫酸博来霉素、硫酸培洛霉素、盐酸柔红霉素、盐酸多柔比星、盐酸阿柔比星(acrasinomycin A)、盐酸吡柔比星、盐酸表柔比星、新制癌菌素等抗癌性抗生素，除此之外还有盐酸米托蒽醌、卡铂、顺铂、L-天冬酰胺酶、醋葡醛内酯、盐酸丙卡巴肼、枸橼酸他莫昔芬、乌苯美司、lenthinan、西佐喃、醋酸甲羟孕酮、磷雌酚、美雄烷、环硫雄醇等。本发明中，上述药物中也包含其衍生物。
通过含有上述药物，可以将本发明的脂质体用于癌症、炎症等疾病的治疗。这里，癌症包括肿瘤或白血病等所有的新生物导致的疾病。本发明的糖链修饰的脂质体中含有这些药物给予时，与单独给予药物的情况相比，药物聚集于癌症、炎症部位。与单独给予的情况相比，可聚集2倍或以上，优选5倍或以上，进一步优选10倍或以上，特别优选50倍或以上。
具有药效的化合物可以包封在脂质体中，也可以与脂质体的表面结合。例如，蛋白质可以以与上述接头蛋白的结合方法相同的方法结合，其它化合物也可以利用其它化合物所具有的官能团，按照公知的方法结合。向脂质体内部的包封通过以下方法进行。药物等向脂质体内包封时，可以采用周知的方法，例如使用含有药物等的溶液和含有磷脂酰胆碱类、磷脂酰乙醇胺类、磷脂酸类或长链烷基磷酸酯类、神经节苷脂类、糖脂类或磷脂酰甘油类和胆固醇类的脂质，通过形成脂质体，药物等被包封入脂质体内。
因此，通过在本发明的脂质体中包封可用于治疗或诊断的药物或基因而得到的脂质体制剂是可选择性地控制向癌组织、炎症组织、各种组织的转移性的脂质体，通过治疗药或诊断药向靶细胞、组织的集中，可以使药效增强或使药物被其它细胞、组织的摄入减少，从而实现副作用的减轻。
本发明的脂质体或糖链修饰的脂质体作为药用组合物，可以以各种形式给予。所述给予形式可以是滴眼剂等经眼给药，片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、糖浆剂等口服给药，或者注射剂、输液剂、栓剂等的胃肠道外给药。所述组合物可通过公知的方法制备，包含制剂领域中常用的载体、稀释剂、赋型剂。例如，片剂用的载体、赋型剂可以使用凝胶化剂、乳糖、硬脂酸镁等。注射剂可通过将本发明的结合糖链的脂质体溶解、悬浮或乳化于通常注射剂所使用的无菌水性或油性液体中来制备。注射用的水性液体可以使用生理盐水、葡萄糖或含有其它辅助药物的等渗液等，也可以与适当的助溶剂例如乙醇、丙二醇等多元醇、非离子表面活性剂等结合使用。油性液体可以使用芝麻油、大豆油等，助溶剂可以结合使用苯甲酸苄酯、苄醇等。
本发明的药用组合物的给药途径没有限定，有滴眼、口服、静脉注射、肌肉注射等。给药量可根据疾病的严重程度等适当决定，但要给予患者本发明的组合物的药物有效量。这里，“给予药物有效量”是指给予患者治疗各种疾病的适当水平的药物。本发明的药用组合物的给予次数可根据患者的症状适当选择。
表面具有糖链的脂质体适合胃肠道外给药(静脉注射给予)和口服给药，给药两可以是以往不具有靶向性的脂质体的几分之一至数千分之一。例如，相对于每1kg体重，脂质体中所含的药物为0.0001-1000mg，优选0.0001-10mg，进一步优选0.0001-0.1mg。本发明的脂质体也包括不含有具靶向性的糖链但结合有亲水性化合物的脂质体，该脂质体也由于进行了亲水性处理而在机体内的稳定性高，半衰期也长，因此低用量即可具有足够的效果。
将本发明的药用组合物用于诊断用时，可以将荧光染料、放射性化合物等标记化合物与脂质体结合。该结合有标记化合物的脂质体与患处结合，标记化合物被摄入患处细胞，可以以该标记化合物的存在为指标检测·诊断疾病。
还可以在本发明的脂质体中包封或结合化妆品或香精，将其作为化妆用组合物使用。这里，化妆品通常是指“为清洁、美化人的身体，使人增加魅力、改变容貌，或者是皮肤或毛发保持柔和，而在身体上通过涂擦、散布以及其它类似的方法而使用的物质，对人体的作用是和缓的”。本发明中，称为“化妆品”时，除上述通常的化妆品之外，还包含定义为“作用和缓，不用于疾病的治疗或预防，同时不具有对身体结构、机能有影响的使用目的的物质”的“准药物”。化妆品例如包含作用于皮肤等细胞、使细胞活化的物质等。
化妆品包含皮肤用、毛发·头发·头皮用化妆品。
具体来说，磷酸-抗坏血酸镁、曲酸、胎盘提取物、熊果苷、鞣花酸等皮肤漂白剂(美白剂)，维生素A、维生素B、维生素C、维生素E等维生素类，雌激素、雌二醇、雌酮、乙炔雌二醇、可的松、氢化可的松、泼尼松等激素类，柠檬酸、酒石酸、乳酸、氯化铝、硫酸铝钾、明矾、二羟基尿囊素铝、氯羟基尿囊素铝(aluminium dihydroxyallantoin)、对苯酚硫酸锌、硫酸锌等皮肤收敛剂，斑蝥酊、辣椒酊、生姜酊、青叶胆提取物、蒜提取物、扁柏酚、卡普氯铵、十五烷酸甘油酯等毛发生长促进剂，弹性蛋白、胶原、黄春菊提取物、甘草提取物、β-甘草次酸、甘草酸、γ-阿魏酸酯(γ-orizanol)、泛酸钙、泛酰乙醚、氨基酸等可作为化妆品使用。其它，干扰素、白介素、溶解酶、乳铁蛋白、运铁蛋白等生理活性蛋白等可使细胞活化的化合物也可用作化妆品。
其它还可以使用例如新化妆品化学第2版光井武夫编南山堂2002年1月18日刊行、香妆品科学-理论和实际-第4版田村健夫广田博著Fragrance Science公司2001年6月30日刊行等中记载的化妆品。
本发明的脂质体中包封或结合化妆品而得的组合物可以滞留在皮肤表面，脂质体中所含的化妆品被释放出来，在皮肤表面发挥效果。每个脂质体都是经皮吸收，到达角质层或角质层下的组织，脂质体被该组织的细胞摄取，释放化妆品，发挥药效。
用于化妆用组合物的脂质体中，可以不连接糖链，这种情况下，脂体制留在皮肤或皮肤下部的组织中，在该处释放化妆品。也可以连接糖链，以皮肤的炎症部位为靶，特异性地聚集于炎症部位。
本发明的化妆组合物除上述脂质体外，还可以含有通常化妆品混合的水性成分、油性成分等。水性成分例如有保湿剂、增稠剂、醇等，保湿剂可以是甘油、丙二醇、多元醇等，增稠剂，例如有黄耆树胶、果胶、藻酸盐，醇有乙醇、异丙醇等。油性成分有橄榄油、山茶油、蓖麻子油、涂蜡、油酸、固体石蜡、地蜡、蜡、凡士林、液体石蜡、有机硅油、合成酯油、合成聚醚等。
还可以在本发明的脂质体中包封或连接功能性食品、营养辅助食品或健康辅助食品，以此作为食品组合物使用。本发明中可使用的功能性食品、营养辅助食品或健康辅助食品没有限定，只要是设计成被摄取并有效地表达食品功能、可加工转换的食品即可，可包含任何的食品。
例如有银杏叶、紫锥菊、锯叶棕、圣约翰草、缬草、黑升麻、水飞蓟、月见草、葡萄籽提取物、蓝莓、小白菊、当归、大豆、法国海岸松、蒜、高丽人参、茶、生姜、姬松茸、桑黄、Merto purple、AHCC、酵母β-葡聚糖、舞茸、蜂胶、啤酒酵母、谷类、李、绿藻、大麦嫩叶、绿汁、维生素类、胶原、葡糖胺、桑叶、rooibos茶、氨基酸、蜂王浆、香菇菌丝体提取物、螺旋藻、田七、水芥、植物发酵食品、DHA、EPA、ARA、海带、卷心菜、芦荟、紫叶五尖槭、酒花、牡蛎肉提取物、法国海岸松提取物(Pycnogenol)、芝麻等作为可在本发明中使用的功能性食品、营养辅助食品或健康辅助食品。他们可以直接含在脂质体中，也可以是含有提取物等处理物。含有脂质体的食品组合物可口服摄取。所使用的脂质体可以连接糖链也可以不连接，还可以连接用于提高肠道吸收的糖链或以特定的组织或器官为靶的糖链。以食品组合物的形式给予本发明的脂质体时，可以加工成液体饮料、凝胶状食品、固体食品等的食品。还可以加工成片剂、颗粒等。本发明的食品组合物根据脂质体所含的食品的种类，可以用作功能性食品、营养辅助食品或健康辅助食品。例如含有DHA的脂质体可以用作对轻度老年性痴呆或改善记忆有效果的功能性食品、营养辅助食品或健康辅助食品。
可通过以下的实施例进一步具体说明本发明，但本发明并不受这些实施例的限定。
实施例1脂质体的制备
脂质体根据已报道的方法(Yamazaki，N.，Kodama，M.and Gabius，H.-J.(1994)Methods Enzymol.
242，56-65)，使用改良型胆酸透析法制备。即，向摩尔比为35∶40∶5∶15∶5的比例、脂质总量为45.6mg的二棕榈酰基磷脂酰胆碱、胆固醇、磷酸双十六烷基酯、神经节苷酯和二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺中加入46.9mg胆酸钠，溶解于3ml氯仿/甲醇溶液。蒸发该溶液，将沉淀物在真空中干燥，得到脂质膜。将所得脂质膜悬浮于3ml TAPS缓冲液(pH8.4)，进行超声波处理，得到透明的胶束悬浮液。再使用PM10膜(AmiconCo.，USA)和PBS缓冲液(pH7.2)对胶束悬浮液进行超滤，制备10ml均匀的脂质体(平均粒径100nm)。实施例2脂质体脂质膜面上的亲水性处理
使用XM300膜(AmiconCo.，USA)和CBS缓冲液(pH8.5)，对10ml实施例1中制备的脂质体溶液进行超滤，使溶液的pH为8.5。接着，加入10ml交联试剂双(磺基琥珀酰亚氨基)辛二酸酯(BS3；PierceCo.，USA)，在25℃搅拌2小时。然后，再在7℃搅拌过夜，使脂质体膜上的脂质二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺与BS3的化学键合反应终止。将该脂质体液用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)超滤。接着，将40mg溶解于1ml CBS缓冲液(pH8.5)的三(羟基甲基)氨基甲烷加入到10ml脂质体液中，在25℃搅拌2小时，然后，再在7℃搅拌过夜，使与脂质体膜上的脂质结合的BS3和三(羟基甲基)氨基甲烷的化学键合反应终止。由此，三(羟基甲基)氨基甲烷的羟基与脂质体膜的脂质二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺配位，形成亲水性。
实施例3人血清白蛋白(HSA)与脂质体膜面上的结合
按照已报道的方法(Yamazaki，N.，Kodama，M.and Gabius，H.-J.(1994)Methods Enzymol.242，56-65)使用偶联反应法进行。即，该反应以2步化学反应进行，首先，将43mg溶解于1ml TAPS缓冲液(pH8.4)中的偏过碘酸钠加入到实施例2得到的10ml脂质体中，在室温下搅拌2小时，使存在于膜面上的神经节苷脂进行过碘酸氧化，然后通过XM300膜和PBS缓冲液(pH8.0)进行超滤，得到10ml被氧化的脂质体。向该脂质体液中加入20mg人血清白蛋白(HSA)，在25℃搅拌2小时，然后，向PBS(pH8.0)中加入100μl 2M NaBH3CN，在10℃搅拌过夜，通过脂质体上的神经节苷脂与HSA的偶联反应结合HSA。用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，得到10ml结合有HSA的脂质体液。
实施例4 α-1，2-甘露二糖二糖链与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白(HSA)结合
将50μgα-1，2-甘露二糖二糖链(Calbiochem Co.，USA)加入到溶解有0.25g NH4HCO3的0.5ml水溶液中，在37℃搅拌3天，然后用0.45μm的滤器过滤，使糖链还原末端的氨基化反应终止，得到50μgα-1，2-甘露二糖二糖链的糖基胺化合物。接着，向1ml实施例3得到的脂质体液的一部分中加入1mg交联试剂3，3’-二硫代双(磺基琥珀酰亚氨基)丙酸酯(DTSSP；Pierce Co.，USA)，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，得到1ml脂质体上的HSA结合有DTSSP的脂质体。接着，向该脂质体液中加入50μg上述α-1，2-甘露二糖二糖链的糖基胺化合物，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和PBS缓冲液(pH7.2)进行超滤，进行α-1，2-甘露二糖二糖链与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白上的DTSSP的结合。结果，得到2ml图1所示的α-1，2-甘露二糖二糖链、人血清白蛋白、脂质体结合的脂质体(简称A2)(脂质总量2mg、蛋白总量200μg、平均粒径100nm)。
实施例5α-1，3-甘露二糖二糖链与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白(HSA)结合
将50μgα-1，3-甘露二糖二糖链(Calbiochem Co.，USA)加入到溶解有0.25g NH4HCO3的0.5ml水溶液中，在37℃搅拌3天，然后用0.45μm的滤器过滤，使糖链还原末端的氨基化反应终止，得到50μgα-1，3-甘露二糖二糖链的糖基胺化合物。接着，向1ml实施例3得到的脂质体液的一部分中加入1mg交联试剂3，3’-二硫代双(磺基琥珀酰亚氨基)丙酸酯(DTSSP；Pierce Co.，USA)，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，得到1ml脂质体上的HSA结合有DTSSP的脂质体。接着，向该脂质体液中加入50μg上述α-1，3-甘露二糖二糖链的糖基胺化合物，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和PBS缓冲液(pH7.2)进行超滤，进行α-1，3-甘露二糖二糖链与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白上的DTSSP的结合。结果，得到2ml图2所示的α-1，3-甘露二糖二糖链、人血清白蛋白、脂质体结合的脂质体(简称A3)(脂质总量2mg、蛋白总量200μg、平均粒径100nm)。
实施例6α-1，4-甘露二糖二糖链与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白(HSA)结合
将50μgα-1，4-甘露二糖二糖链(Calbiochem Co.，USA)加入到溶解有0.25g NH4HCO3的0.5ml水溶液中，在37℃搅拌3天，然后用0.45μm的滤器过滤，使糖链还原末端的氨基化反应终止，得到50μgα-1，4-甘露二糖二糖链的糖基胺化合物。接着，向1ml实施例3得到的脂质体液的一部分中加入1mg交联试剂3，3’-二硫代双(磺基琥珀酰亚氨基)丙酸酯(DTSSP；Pierce Co.，USA)，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，得到1ml脂质体上的HSA结合有DTSSP的脂质体。接着，向该脂质体液中加入50μg上述α-1，4-甘露二糖二糖链的糖基胺化合物，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和PBS缓冲液(pH7.2)进行超滤，进行α-1，4-甘露二糖二糖链与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白上的DTSSP的结合。结果，得到2ml图3所示的α-1，4-甘露二糖二糖链、人血清白蛋白、脂质体结合的脂质体(简称A4)(脂质总量2mg、蛋白总量200μg、平均粒径100nm)。
实施例7α-1，6-甘露二糖二糖链与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白(HSA)结合
将50μgα-1，6-甘露二糖二糖链(Calbiochem Co.，USA)加入到溶解有0.25g NH4HCO3的0.5ml水溶液中，在37℃搅拌3天，然后用0.45μm的滤器过滤，使糖链还原末端的氨基化反应终止，得到50μgα-1，6-甘露二糖二糖链的糖基胺化合物。接着，向1ml实施例3得到的脂质体液的一部分中加入1mg交联试剂3，3’-二硫代双(磺基琥珀酰亚氨基)丙酸酯(DTSSP；Pierce Co.，USA)，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，得到1ml脂质体上的HSA结合有DTSSP的脂质体。接着，向该脂质体液中加入50μg上述α-1，6-甘露二糖二糖链的糖基胺化合物，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和PBS缓冲液(pH7.2)进行超滤，进行α-1，6-甘露二糖二糖链与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白上的DTSSP的结合。结果，得到2ml图4所示的α-1，6-甘露二糖二糖链、人血清白蛋白、脂质体结合的脂质体(简称A6)(脂质总量2mg、蛋白总量200μg、平均粒径100nm)。
实施例8α-1，3-α-1，6-甘露三糖三糖链与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白(HSA)结合
将50μgα-1，3-α-1，6-甘露三糖三糖链(Calbiochem Co.，USA)加入到溶解有0.25g NH4HCO3的0.5ml水溶液中，在37℃搅拌3天，然后用0.45μm的滤器过滤，使糖链还原末端的氨基化反应终止，得到50μgα-1，3-α-1，6-甘露三糖三糖链的糖基胺化合物。接着，向1ml实施例3得到的脂质体液的一部分中加入1mg交联试剂3，3’-二硫代双(磺基琥珀酰亚氨基)丙酸酯(DTSSP；Pierce Co.，USA)，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，得到1ml脂质体上的HSA结合有DTSSP的脂质体。接着，向该脂质体液中加入50μg上述α-1，3-α-1，6-甘露三糖三糖链的糖基胺化合物，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和PBS缓冲液(pH7.2)进行超滤，进行α-1，3-α-1，6-甘露三糖三糖链与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白上的DTSSP的结合。结果，得到2ml图5所示的α-1，3-α-1，6-甘露三糖三糖链、人血清白蛋白、脂质体结合的脂质体(简称A36)(脂质总量2mg、蛋白总量200μg、平均粒径100nm)。
实施例9低聚甘露糖-3五糖链与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白(HSA)结合
将50μg低聚甘露糖-3五糖链(Calbiochem Co.，USA)加入到溶解有0.25g NH4HCO3的0.5ml水溶液中，在37℃搅拌3天，然后用0.45μm的滤器过滤，使糖链还原末端的氨基化反应终止，得到50μg低聚甘露糖-3五糖链的糖基胺化合物。接着，向1ml实施例3得到的脂质体液的一部分中加入1mg交联试剂3，3’-二硫代双(磺基琥珀酰亚氨基)丙酸酯(DTSSP；Pierce Co.，USA)，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，得到1ml脂质体上的HSA结合有DTSSP的脂质体。接着，向该脂质体液中加入50μg上述低聚甘露糖-3五糖链的糖基胺化合物，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和PBS缓冲液(pH7.2)进行超滤，进行低聚甘露糖-3五糖链与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白上的DTSSP的结合。结果，得到2ml图6所示的低聚甘露糖-3五糖链、人血清白蛋白、脂质体结合的脂质体(简称Man3)(脂质总量2mg、蛋白总量200μg、平均粒径100nm)。
实施例10低聚甘露糖-4b六糖链与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白(HSA)结合
将50μg低聚甘露糖-4b六糖链(Calbiochem Co.，USA)加入到溶解有0.25g NH4HCO3的0.5ml水溶液中，在37℃搅拌3天，然后用0.45μm的滤器过滤，使糖链还原末端的氨基化反应终止，得到50μg低聚甘露糖-4b六糖链的糖基胺化合物。接着，向1ml实施例3得到的脂质体液的一部分中加入1mg交联试剂3，3’-二硫代双(磺基琥珀酰亚氨基)丙酸酯(DTSSP；Pierce Co.，USA)，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，得到1ml脂质体上的HSA结合有DTSSP的脂质体。接着，向该脂质体液中加入50μg上述低聚甘露糖-4b六糖链的糖基胺化合物，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和PBS缓冲液(pH7.2)进行超滤，进行低聚甘露糖-4b六糖链与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白上的DTSSP的结合。结果，得到2ml图7所示的低聚甘露糖-4b六糖链、人血清白蛋白、脂质体结合的脂质体(简称Man4b)(脂质总量2mg、蛋白总量200μg、平均粒径100nm)。
实施例11低聚甘露糖-5七糖链与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白(HSA)结合
将50μg低聚甘露糖-5七糖链(Calbiochem Co.，USA)加入到溶解有0.25g NH4HCO3的0.5ml水溶液中，在37℃搅拌3天，然后用0.45μm的滤器过滤，使糖链还原末端的氨基化反应终止，得到50μg低聚甘露糖-5七糖链的糖基胺化合物。接着，向1ml实施例3得到的脂质体液的一部分中加入1mg交联试剂3，3’-二硫代双(磺基琥珀酰亚氨基)丙酸酯(DTSSP；Pierce Co.，USA)，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，得到1ml脂质体上的HSA结合有DTSSP的脂质体。接着，向该脂质体液中加入50μg上述低聚甘露糖-5七糖链的糖基胺化合物，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和PBS缓冲液(pH7.2)进行超滤，进行低聚甘露糖-5七糖链与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白上的DTSSP的结合。结果，得到2ml图8所示的低聚甘露糖-5七糖链、人血清白蛋白、脂质体结合的脂质体(简称Man5)(脂质总量2mg、蛋白总量200μg、平均粒径100nm)。
实施例12低聚甘露糖-6八糖链与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白(HSA)结合
将50μg低聚甘露糖-6八糖链(Calbiochem Co.，USA)加入到溶解有0.25g NH4HCO3的0.5ml水溶液中，在37℃搅拌3天，然后用0.45μm的滤器过滤，使糖链还原末端的氨基化反应终止，得到50μg低聚甘露糖-6八糖链的糖基胺化合物。接着，向1ml实施例3得到的脂质体液的一部分中加入1mg交联试剂3，3’-二硫代双(磺基琥珀酰亚氨基)丙酸酯(DTSSP；Pierce Co.，USA)，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，得到1ml脂质体上的HSA结合有DTSSP的脂质体。接着，向该脂质体液中加入50μg上述低聚甘露糖-6八糖链的糖基胺化合物，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和PBS缓冲液(pH7.2)进行超滤，进行低聚甘露糖-6八糖链与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白上的DTSSP的结合。结果，得到2ml图9所示的低聚甘露糖-6八糖链、人血清白蛋白、脂质体结合的脂质体(简称Man6)(脂质总量2mg、蛋白总量200μg、平均粒径100nm)。
实施例13低聚甘露糖-7九糖链与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白(HSA)结合
将50μg低聚甘露糖-7九糖链(Calbiochem Co.，USA)加入到溶解有0.25g NH4HCO3的0.5ml水溶液中，在37℃搅拌3天，然后用0.45μm的滤器过滤，使糖链还原末端的氨基化反应终止，得到50μg低聚甘露糖-7九糖链的糖基胺化合物。接着，向1ml实施例3得到的脂质体液的一部分中加入1mg交联试剂3，3’-二硫代双(磺基琥珀酰亚氨基)丙酸酯(DTSSP；Pierce Co.，USA)，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，得到1ml脂质体上的HSA结合有DTSSP的脂质体。接着，向该脂质体液中加入50μg上述低聚甘露糖-7九糖链的糖基胺化合物，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和PBS缓冲液(pH7.2)进行超滤，进行低聚甘露糖-7九糖链与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白上的DTSSP的结合。结果，得到2ml图10所示的低聚甘露糖-7九糖链、人血清白蛋白、脂质体结合的脂质体(简称Man7)(脂质总量2mg、蛋白总量200μg、平均粒径100nm)。
实施例14低聚甘露糖-8十糖链与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白(HSA)结合
将50μg低聚甘露糖-8十糖链(Calbiochem Co.，USA)加入到溶解有0.25g NH4HCO3的0.5ml水溶液中，在37℃搅拌3天，然后用0.45μm的滤器过滤，使糖链还原末端的氨基化反应终止，得到50μg低聚甘露糖-8十糖链的糖基胺化合物。接着，向1ml实施例3得到的脂质体液的一部分中加入1mg交联试剂3，3’-二硫代双(磺基琥珀酰亚氨基)丙酸酯(DTSSP；Pierce Co.，USA)，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，得到1ml脂质体上的HSA结合有DTSSP的脂质体。接着，向该脂质体液中加入50μg上述低聚甘露糖-8十糖链的糖基胺化合物，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和PBS缓冲液(pH7.2)进行超滤，进行低聚甘露糖-8十糖链与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白上的DTSSP的结合。结果，得到2ml图11所示的低聚甘露糖-8十糖链、人血清白蛋白、脂质体结合的脂质体(简称Man8)(脂质总量2mg、蛋白总量200μg、平均粒径100nm)。
实施例15低聚甘露糖-9十一糖链与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白(HSA)结合
将50μg低聚甘露糖-9十一糖链(Calbiochem Co.，USA)加入到溶解有0.25g NH4HCO3的0.5ml水溶液中，在37℃搅拌3天，然后用0.45μm的滤器过滤，使糖链还原末端的氨基化反应终止，得到50μg低聚甘露糖-9十一糖链的糖基胺化合物。接着，向1ml实施例3得到的脂质体液的一部分中加入1mg交联试剂3，3’-二硫代双(磺基琥珀酰亚氨基)丙酸酯(DTSSP；Pierce Co.，USA)，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，得到1ml脂质体上的HSA结合有DTSSP的脂质体。接着，向该脂质体液中加入50μg上述低聚甘露糖-9十一糖链的糖基胺化合物，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和PBS缓冲液(pH7.2)进行超滤，进行低聚甘露糖-9十一糖链与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白上的DTSSP的结合。结果，得到2ml图12所示的低聚甘露糖-8十糖链、人血清白蛋白、脂质体结合的脂质体(简称Man9)(脂质总量2mg、蛋白总量200μg、平均粒径100nm)。
实施例16三(羟基甲基)氨基甲烷与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白(HSA)结合
为了制备作为比较样品的脂质体，向1ml实施例3得到的脂质体液的一部分中加入1mg交联试剂3，3’-二硫代双(磺基琥珀酰亚氨基)丙酸酯(DTSSP；Pierce Co.，USA)，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，得到1ml脂质体上的HSA结合有DTSSP的脂质体。接着，向该脂质体液中加入13mg三(羟基甲基)氨基甲烷(Wako Co.，Japan)，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和PBS缓冲液(pH7.2)进行超滤，使三(羟基甲基)氨基甲烷与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白上的DTSSP结合。结果，得到2ml作为比较样品的脂质体(脂质总量2mg、蛋白总量200μg、平均粒径100nm)，该脂质体是图31所示的三(羟基甲基)氨基甲烷与人血清白蛋白、脂质体结合得到的(简称TRIS)。
实施例17脂质体膜面结合的人血清白蛋白(HSA)上的亲水性处理
按照以下的顺序，分别对实施例4-15中制备12种结合有糖链的脂质体进行脂质体上的HSA蛋白表面的水合性处理。向各2ml 12种结合有糖链的脂质体中分别加入13mg三(羟基甲基)氨基甲烷，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和PBS缓冲液(pH7.2)进行超滤，除去未反应物，得到各2ml最终产物——经水合性处理的12种结合糖链的脂质体复合物(简称A2、A3、A4、A6、A36、Man3、Man4、Man5、Man6、Man7、Man8、Man9)。
实施例18结合有各种糖链的脂质体复合物对凝集素结合活性的抑制效果的测定
按照常规方法(Yamazaki，N.(1999)Drug Delivery System，14，498-505)，采用固定有凝集素的微量板，通过抑制试验测定由实施例4-15和实施例17的方法制备的12种结合有糖链的脂质体复合物与凝集素的体外结合活性。即，将凝集素(Con A；R&D Systems Co.，USA)固定在96孔微量板上。将不同浓度的各种结合有糖链的脂质体复合物(蛋白质量为0.01μg、0.04μg、0.11μg、0.33μg、1μg)与0.1μg比较配体——生物素化的岩藻糖基化胎球蛋白一起加入到该固定有凝集素的孔板中，在4℃温育2小时。用PBS(pH7.2)洗涤3次，添加结合有辣根过氧化物酶(HRPO)的链霉抗生物素，再在4℃温育1小时，用PBS(pH7.2)洗涤三次，添加过氧化物酶底物，在室温下静置，通过读板仪(MolecularDevices Corp.，USA)测定405nm下的吸光度。岩藻糖基化胎球蛋白的生物素化是在经sulfo-NHS-biotin reagent(Pierce Co.，USA)处理后，通过Centricon-30(Amicon Co.，USA)纯化。结合有HRPO的链霉抗生物素通过以下两步骤制备：HRPO的氧化和通过使用NaBH3CN的还原氨基化法与链霉抗生物素的结合。该测定结果如表1所示。
表1
靶向性脂质体
表1：表示各种结合糖链的脂质体复合物与凝集素的结合活性抑制效果的实验
| 脂质体复合物 | 脂质体复合物各浓度(μg蛋白质)下的抑制效果(吸光度) | ||||
| 0.006μg | 0.02μg | 0.06μg | 0.17μg | 0.5μg | |
| A2 | 0.192 | 0.196 | 0.192 | 0.169 | 0.155 |
| A3 | 0.178 | 0.178 | 0.178 | 0.170 | 0.142 |
| A4 | 0.192 | 0.196 | 0.192 | 0.175 | 0.153 |
| A6 | 0.182 | 0.196 | 0.182 | 0.169 | 0.151 |
| A36 | 0.205 | 0.215 | 0.205 | 0.192 | 0.150 |
| Man3 | 0.201 | 0.211 | 0.201 | 0.177 | 0.144 |
| Man4 | 0.171 | 0.203 | 0.171 | 0.157 | 0.148 |
| Man5 | 0.215 | 0.221 | 0.215 | 0.196 | 0.164 |
| Man6 | 0.210 | 0.222 | 0.210 | 0.207 | 0.125 |
| Man7 | 0.213 | 0.214 | 0.213 | 0.183 | 0.137 |
| Man8 | 0.211 | 0.216 | 0.211 | 0.188 | 0.132 |
| Man9 | 0.208 | 0.211 | 0.208 | 0.186 | 0135 |
实施例19通过氯胺T法进行脂质体的125I标记
将氯胺T(Wako Pure Chemical Co.，Japan)溶液和二亚硫酸钠溶液在用时分别制备成3mg/ml和5mg/ml。将各50μl在实施例4-16中制备的12种结合有糖链的脂质体和结合有三(羟基甲基)氨基甲烷的脂质体分别装入Eppendorf管中，接着加入15μl125I-NaI(NEN Life ScienceProduct，nc.USA)、10μl氯胺T溶液。每隔5分钟加入10μl氯胺T溶液，将该操作重复2次，15分钟后加入100μl二亚硫酸钠作为还原剂，终止反应。接着，进行Sephadex G-50(Phramacia Biotech.Sweden)柱层析，用PBS洗脱，纯化标记物。最后添加未标记脂质体复合物，调节比活性(4×106Bq/mg蛋白质)，得到13种125I标记脂质体液。
实施例20各种结合糖链的脂质体复合物在癌症小鼠各组织中分布量的测定
将Ehrlich ascites tumor(EAT)细胞(约2×107个)移植到雄性ddY小鼠(7周龄)大腿部皮下，将癌组织发育至0.3-0.6g(6-8天后)的小鼠用于本试验。对该癌症小鼠尾静脉注射0.2ml实施例19中125I标记的12种结合有糖链和三(羟基甲基)氨基甲烷的脂质体复合物，使蛋白质量的比例为3μg/只，60分钟后摘除组织(血液、肝脏、脾脏、肺、脑、癌组织、癌周围炎症组织、淋巴结)，用γ射线计数仪(Aloka ARC 300)测定各组织的放射能。放射能在各组织中的分布量以每1g各组织的放射能占给予全部放射能的比例(％给予量/g组织)表示。结果如图13-图22所示。
实施例21 3’-唾液酸基乳糖三糖链与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白(HSA)结合(糖链结合量不同的3种)
将(1)50μg、或2)200μg、2)1mg)3’-唾液酸基乳糖三糖链(WakoPure Chemical Co.，Japan)加入到溶解有0.25g NH4HCO3的0.5ml水溶液中，在37℃搅拌3天，然后用0.45μm的滤器过滤，使糖链还原末端的氨基化反应终止，得到50μg 3’-唾液酸基乳糖三糖链的糖基胺化合物。接着，向1ml实施例3得到的脂质体液的一部分中加入1mg交联试剂3，3’-二硫代双(磺基琥珀酰亚氨基)丙酸酯(DTSSP；PierceCo.，USA)，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，得到1ml脂质体上的HSA结合有DTSSP的脂质体。接着，向该脂质体液中加入50μg上述3’-唾液酸基乳糖三糖链的糖基胺化合物，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和PBS缓冲液(pH7.2)进行超滤，进行3’-唾液酸基乳糖三糖链与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白上的DTSSP的结合。结果，得到各2ml图22所示的3’-唾液酸基乳糖三糖链、人血清白蛋白、脂质体结合的脂质体(简称1)3SL-1、2)3SL-2、1)3SL-3)(脂质总量2mg、蛋白总量200μg、平均粒径100nm)。
实施例22 6’-唾液酸基乳糖三糖链与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白(HSA)结合(糖链结合量不同的3种)
将(1)50μg、或2)200μg、2)1mg)6’-唾液酸基乳糖三糖链(WakoPure Chemical Co.，Japan)加入到溶解有0.25g NH4HCO3的0.5ml水溶液中，在37℃搅拌3天，然后用0.45μm的滤器过滤，使糖链还原末端的氨基化反应终止，得到50μg 6’-唾液酸基乳糖三糖链的糖基胺化合物。接着，向1ml实施例3得到的脂质体液的一部分中加入1mg交联试剂3，3’-二硫代双(磺基琥珀酰亚氨基)丙酸酯(DTSSP；PierceCo.，USA)，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，得到1ml脂质体上的HSA结合有DTSSP的脂质体。接着，向该脂质体液中加入50μg上述6’-唾液酸基乳糖三糖链的糖基胺化合物，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和PBS缓冲液(pH7.2)进行超滤，进行6’-唾液酸基乳糖三糖链与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白上的DTSSP的结合。结果，得到各2ml图23所示的6’-唾液酸基乳糖三糖链、人血清白蛋白、脂质体结合的脂质体(简称1)6SL-1、2)6SL-2、1)6SL-3)(脂质总量2mg、蛋白总量200μg、平均粒径100nm)。
实施例23 3’-唾液酸基乳糖胺三糖链与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白(HSA)结合(糖链结合量不同的3种)
将(1)50μg、或2)200μg、2)1mg)3’-唾液酸基乳糖胺三糖链(WakoPure Chemical Co.，Japan)加入到溶解有0.25g NH4HCO3的0.5ml水溶液中，在37℃搅拌3天，然后用0.45μm的滤器过滤，使糖链还原末端的氨基化反应终止，得到50μg 3’-唾液酸基乳糖胺三糖链的糖基胺化合物。接着，向1ml实施例3得到的脂质体液的一部分中加入1mg交联试剂3，3’-二硫代双(磺基琥珀酰亚氨基)丙酸酯(DTSSP；PierceCo.，USA)，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，得到1ml脂质体上的HSA结合有DTSSP的脂质体。接着，向该脂质体液中加入50μg上述3’-唾液酸基乳糖胺三糖链的糖基胺化合物，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和PBS缓冲液(pH7.2)进行超滤，进行3’-唾液酸基乳糖胺三糖链与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白上的DTSSP的结合。结果，得到各2ml图24所示的3’-唾液酸基乳糖胺三糖链、人血清白蛋白、脂质体结合的脂质体(简称1)3SLN-1、2)3SLN-2、1)3SLN-3)(脂质总量2mg、蛋白总量200μg、平均粒径100nm)。
实施例24 6’-唾液酸基乳糖胺三糖链与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白(HSA)结合(糖链结合量不同的3种)
将(1)50μg、或2)200μg、2)1mg)6’-唾液酸基乳糖胺三糖链(WakoPure Chemical Co.，Japan)加入到溶解有0.25g NH4HCO3的0.5ml水溶液中，在37℃搅拌3天，然后用0.45μm的滤器过滤，使糖链还原末端的氨基化反应终止，得到50μg 6’-唾液酸基乳糖胺三糖链的糖基胺化合物。接着，向1ml实施例3得到的脂质体液的一部分中加入1mg交联试剂3，3’-二硫代双(磺基琥珀酰亚氨基)丙酸酯(DTSSP；PierceCo.，USA)，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，得到1ml脂质体上的HSA结合有DTSSP的脂质体。接着，向该脂质体液中加入50μg上述6’-唾液酸基乳糖胺三糖链的糖基胺化合物，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和PBS缓冲液(pH7.2)进行超滤，进行6’-唾液酸基乳糖胺三糖链与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白上的DTSSP的结合。结果，得到各2ml图25所示的6’-唾液酸基乳糖胺三糖链、人血清白蛋白、脂质体结合的脂质体(简称1)6SLN-1、2)6SLN-2、1)6SLN-3)(脂质总量2mg、蛋白总量200μg、平均粒径100nm)。
实施例25脂质体膜面结合的人血清白蛋白(HSA)上的亲水性处理
按照以下的顺序，分别对通过实施例21-24的方法制备的各12种结合有糖链的脂质体进行进行脂质体上的HSA蛋白表面的亲水性处理。向2ml 12种结合有糖链的脂质体中分别加入13mg三(羟基甲基)氨基甲烷，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和PBS缓冲液(pH7.2)进行超滤，除去未反应物，得到各2ml最终产物——经亲水性处理的12种结合糖链的脂质体复合物(简称3SL-2、3SL-2、3SL-3、6SL-1、6SL-2、6SL-3、3SLN-1、3SLN-3、6SLN-1、6SLN-2、6SLN-3)(脂质总量2mg、蛋白总量200μg、平均粒径100nm)。
实施例26结合有各种糖链的脂质体复合物对凝集素结合活性的抑制效果的测定
按照常规方法(Yamazaki，N.(1999)Drug Delivery System，14，498-505)，采用固定有凝集素的微量板，通过抑制试验测定由实施例21-24和实施例16的方法制备的12种结合有糖链的脂质体复合物与凝集素的体外结合活性。即，将凝集素(E-选择蛋白；R&D Systems Co.，USA)固定在96孔微量板上。将浓度各异的各种结合有糖链的脂质体复合物(蛋白质量为0.01μg、0.04μg、0.11μg、0.33μg、1μg)与0.1μg比较配体——生物素化的岩藻糖基化胎球蛋白一起加入到该固定有凝集素的孔板中，在4℃温育2小时。用PBS(pH7.2)洗涤3次，添加结合有辣根过氧化物酶(HRPO)的链霉抗生物素，再在4℃温育1小时，用PBS(pH7.2)洗涤三次，添加过氧化物酶底物，在室温下静置，通过读板仪(Molecular Deviees Corp.，USA)测定405nm下的吸光度。岩藻糖基化胎球蛋白的生物素化是在经sulfo-NHS-biotin reagent(Pierce Co.，USA)处理后，通过Centricon-30(Amicon Co.，USA)纯化。结合有HRPO的链霉抗生物素通过以下两步骤制备：HRPO的氧化和通过使用NaBH3CN的还原氨基化法与链霉抗生物素的结合。该测定结果如表2所示。
表2
肠道吸收控制性脂质体
表2
| 脂质体复合物 | 脂质体复合物各浓度(μg蛋白质)下的抑制效果(吸光度) | ||||
| 0.01μg | 0.04μg | 0.11μg | 0.33μg | 1μg | |
| 3SL·1 | 0.154 | 0.147 | 0.135 | 0.120 | 0.097 |
| 3SL·2 | 0.149 | 0.142 | 0.124 | 0.118 | 0.098 |
| 3SL·3 | 0.214 | 0.214 | 0.210 | 0.183 | 0.167 |
| 6SL·1 | 0.177 | 0.171 | 0.167 | 0.160 | 0.114 |
| 6SL·2 | 0.196 | 0.184 | 0.169 | 0.160 | 0.159 |
| 6SL·3 | 0.214 | 0.207 | 0.196 | 0.192 | 0.183 |
| 3SLN·1 | 0.219 | 0.198 | 0.180 | 0.164 | 0.119 |
| 3SLN·2 | 0.155 | 0.155 | 0.151 | 0.119 | 0.096 |
| 3SLN·3 | 0.216 | 0.198 | 0.187 | 0.146 | 0.132 |
| 6SLN·1 | 0.257 | 0.246 | 0.233 | 0.200 | 0.151 |
| 6SLN·2 | 0.250 | 0.250 | 0.230 | 0.199 | 0.158 |
| 6SLN·3 | 0.248 | 0.231 | 0.227 | 0.201 | 0.144 |
实施例27通过氯胺T法进行各种结合糖链的脂质体的125I标记
将氯胺T(Wako Pure Chemical Co.，Japan)溶液和二亚硫酸钠溶液在用时分别制备成3mg/ml和5mg/ml。将各50μl在实施例21-24和实施例16中制备的13种结合有糖链的脂质体和结合有三(羟基甲基)氨基甲烷的脂质体分别装入Eppendorf管中，接着加入15μl125I-NaI(NENLife Science Product，Inc.USA)、10μl氯胺T溶液。每隔5分钟加入10μl氯胺T溶液，终止反应。接着，进行Sephadex G-50(PhramaciaBiotech.Sweden)柱层析，用PBS洗脱，纯化标记物。最后添加未标记脂质体复合物，调节比活性(4×106Bq/mg蛋白质)，得到13种125I标记脂质体液。
实施例28各种糖链结合的脂质体复合物在小鼠中由肠道向血液中转移量的测定
对除水以外绝食一昼夜的雄性ddY小鼠(7周龄)以小鼠用经口喂饲针肠道内强制给予0.2ml实施例27中125I标记的13种结合有糖链和三(羟基甲基)氨基甲烷的脂质体复合物，使蛋白质量的比例为3μg/只，10分钟后，在戊巴比妥麻醉下从降主动脉采集1ml血液。然后用γ射线计数仪(Alola ARC 300)测定血液中的放射能。为了研究各种脂质体复合物在机体内的稳定性，用Sephadex G-50再次进行层析，大半放射能都是在高分子量的空隙组分中可见，各种脂质体复合物在机体内也具有稳定性。由肠道向血液中的放射能转移量以每1ml血液肿的放射能占给予全部放射能的比例(％给予量/ml血液)表示。结果如图27-图31所示。
实施例29包封抗癌药多柔比星的脂质体的制备
使用胆酸透析法制备脂质体。即，将二棕榈酰基磷脂酰胆碱、胆固醇、磷酸双十六烷基酯、神经节苷脂和二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺分别以摩尔比35∶40∶5∶15∶5的比例混合，脂质总量为45.6mg，添加46.9mg胆酸钠，溶解于3ml氯仿/甲醇溶液。蒸发该溶液，在真空中干燥沉淀物，得到脂质膜。将所得脂质膜悬浮于10ml TAPS缓冲生理盐水(pH8.4)，进行超声波处理，得到10ml透明的胶束悬浮液。一边搅拌一边将在TAPS缓冲液(pH8.4)中以3mg/1ml完全溶解的抗癌药多柔比星缓慢滴加到该胶束悬浮液中，均匀混合，然后将该含多柔比星的胶束悬浮液通过PM10膜(AmiconCo.，USA)和TAPS缓冲液(pH8.4)进行超滤，制备10ml均匀的、包封有抗癌药多柔比星的脂质体颗粒悬浮液。用ζ电位、粒径、分子量测定装置(Model Nano ZS，Malvern InstrumentsLtd.，UK)测定所得的生理盐水悬浮液(37℃)中的包封抗癌药多柔比星的脂质体颗粒的粒径和ζ电位，结果，粒径为50-350nm、ζ电位为-30至-10mV。
实施例30包封有抗癌药多柔比星的脂质体脂质膜面的亲水性处理
将10ml实施例29中制备的包封有抗癌药多柔比星的脂质体溶液通过XM300膜(AmiconCo.，USA)和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，使溶液的pH为8.5。接着，加入10ml交联试剂双(磺基琥珀酰亚氨基)辛二酸酯(BS3；Pierce Co.，USA)，在25℃搅拌2小时。然后再在7℃搅拌过夜，使脂质体膜上的脂质二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺与BS3的化学键合反应终止。将该脂质体液用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤。接着，将40mg溶解于1ml CBS缓冲液(pH8.5)的三(羟基甲基)氨基甲烷加入到10ml脂质体液中，在25℃搅拌2小时。然后再在7℃搅拌过夜，使与脂质体膜上的脂质键合的BS3与三(羟基甲基)氨基甲烷的化学键合反应终止。由此，三(羟基甲基)氨基甲烷的羟基与包封有抗癌剂多柔比星的脂质体膜的脂质二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺配位，形成水合亲水性。
实施例31人血清白蛋白(HSA)与包封有抗癌药多柔比星的脂体膜面的结合
根据已报道的方法(Yamazaki，N.，Kodama，M.and Gabius，H.-J.(1994)Methods Enzymol.242，56-65)，使用偶联反应法进行。即，该反应通过2步化学反应进行，首先，将43mg溶解于1ml TAPS缓冲液(pH8.4)中的偏过碘酸钠加入到实施例2中得到的10ml脂质体中，在室温下搅拌2小时，使存在于膜面上的神经节苷脂进行过碘酸氧化，然后用XM300膜和PBS缓冲液(pH8.0)进行超滤，得到10ml被氧化的脂质体。向该脂质体液中加入20mg人血清白蛋白(HSA)，在25℃搅拌2小时，然后，向PBS(pH8.0)中加入100μl 2M NaBH3CN，在10℃搅拌过夜，通过脂质体上的神经节苷脂与HSA的偶联反应结合HSA。用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，得到10ml结合有HSA的、包封有抗癌药多柔比星的脂质体液。
实施例32α-1，6-甘露二糖二糖链与包封有抗癌药多柔比星的脂质体膜面结合的人血清白蛋白(HSA)的结合以及接头蛋白(HSA)的亲水性处理
将50μgα-1，6-甘露二糖二糖链(Calbiochem Co.，USA)加入到溶解有0.25g NH4HCO3的0.5ml水溶液中，在37℃搅拌3天，然后用0.45μm的滤器过滤，使糖链还原末端的氨基化反应终止，得到50μgα-1，6-甘露二糖二糖链的糖基胺化合物。接着，向1ml实施例31中得到的包封有抗癌药多柔比星的脂质体液的一部分中加入1mg交联试剂3，3’-二硫代双(磺基琥珀酰亚氨基)丙酸酯(DTSSP；Pierce Co.，USA)，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，得到1ml脂质体上的HSA结合有DTSSP的脂质体。接着，向该脂质体液中加入50μg上述α-1，6-甘露二糖二糖链的糖基胺化合物，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和PBS缓冲液(pH7.2)进行超滤，进行α-1，6-甘露二糖二糖链与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白上的DTSSP的结合。接着，向该脂质体液中加入13mg三(羟基甲基)氨基甲烷(Wako Co.，Japan)，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和PBS缓冲液(pH7.2)进行超滤，使三(羟基甲基)氨基甲烷与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白上的DTSSP结合。结果得到图32所示的三(羟基甲基)氨基甲烷与人血清白蛋白、脂质体结合并且对接头蛋白(HSA)进行了亲水性处理的脂质体。结果可得到2ml图4所示的α-1，6-甘露二糖二糖链与人血清白蛋白、脂质体结合并且对接头蛋白(HSA)进行了亲水性处理的、包封有抗癌药多柔比星的脂质体(简称：DX-A6)(脂质总量2mg、蛋白总量200μg)。用ζ电位、粒径、分子量测定装置(Model Nano ZS，Malvern InstrumentsLtd.，UK)测定所得的生理盐水悬浮液(37℃)中的包封抗癌药多柔比星的脂质体颗粒的粒径和ζ电位，结果，粒径为50-350nm、ζ电位为-30至-10mV。
实施例333-岩藻糖基乳糖三糖链与包封有抗癌药多柔比星的脂质体膜面结合的人血清白蛋白(HSA)的结合以及接头蛋白(HSA)的亲水性处理
将50μg 3-岩藻糖基乳糖三糖链(Calbiochem Co.，USA)加入到溶解有0.25g NH4HCO3的0.5ml水溶液中，在37℃搅拌3天，然后用0.45μm的滤器过滤，使糖链还原末端的氨基化反应终止，得到50μg 3-岩藻糖基乳糖三糖链的糖基胺化合物。接着，向1ml实施例31中得到的包封有抗癌药多柔比星的脂质体液的一部分中加入1mg交联试剂3，3’-二硫代双(磺基琥珀酰亚氨基)丙酸酯(DTSSP；Pierce Co.，USA)，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，得到1ml脂质体上的HSA结合有DTSSP的脂质体。接着，向该脂质体液中加入50μg上述3-岩藻糖基乳糖三糖链的糖基胺化合物，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和PBS缓冲液(pH7.2)进行超滤，进行3-岩藻糖基乳糖三糖链与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白上的DTSSP的结合。接着，向该脂质体液中加入13mg三(羟基甲基)氨基甲烷(Wako Co.，Japan)，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和PBS缓冲液(pH7.2)进行超滤，使三(羟基甲基)氨基甲烷与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白上的DTSSP结合。结果得到图32所示的三(羟基甲基)氨基甲烷与人血清白蛋白、脂质体结合并且对接头蛋白(HSA)进行了亲水性处理的脂质体。结果可得到2ml图38所示的3-岩藻糖基乳糖三糖链与人血清白蛋白、脂质体结合并且对接头蛋白(HSA)进行了亲水性处理的、包封有抗癌药多柔比星的脂质体(简称：DX-3FL)(脂质总量2mg、蛋白总量200μg)。用ζ电位、粒径、分子量测定装置(Model Nano ZS，Malvern InstrumentsLtd.，UK)测定所得的生理盐水悬浮液(37℃)中的包封抗癌药多柔比星的脂质体颗粒的粒径和ζ电位，结果，粒径为50-350nm、ζ电位为-30至-10mV。
实施例34通过三(羟基甲基)氨基甲烷与包封有抗癌药多柔比星的脂质体膜面结合的人血清白蛋白(HSA)的结合对接头蛋白(HSA)实施亲水性处理
为了制备作为比较样品的包封有抗癌药多柔比星的脂质体，向1ml实施例31中得到的包封有抗癌药多柔比星的脂质体液的一部分中加入1mg交联试剂3，3’-二硫代双(磺基琥珀酰亚氨基)丙酸酯(DTSSP；Pierce Co.，USA)，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，得到1ml DTSSP与脂质体上的HAS结合并且对接头蛋白(HSA)实施了亲水性处理的脂质体。接着，向该脂质体液中加入13mg三(羟基甲基)氨基甲烷(Wako Co.，Japan)，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和PBS缓冲液(pH7.2)进行超滤，使三(羟基甲基)氨基甲烷与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白上的DTSSP结合。结果得到2ml图32所示的三(羟基甲基)氨基甲烷与人血清白蛋白、脂质体结合并且对接头蛋白(HSA)进行了亲水性处理的作为比较样品的包封有抗癌药多柔比星的脂质体(简称：DX-TRIS)(脂质总量2mg、蛋白总量200μg)。用ζ电位、粒径、分子量测定装置(Model Nano ZS，Malvern Instruments Ltd.，UK)测定所得的生理盐水悬浮液(37℃)中的包封抗癌药多柔比星的脂质体颗粒的粒径和ζ电位，结果，粒径为50-350nm、ζ电位为-30至-10mV。
实施例35尾静脉注射给予各种结合糖链的脂质体复合物对癌症小鼠的制癌效果的测定
将Ehrlich ascites tumor(EAT)细胞(约2×107个)移植到雄性ddY小鼠(7周龄)右大腿部皮下，将约40只癌组织发育至50-100mm3(6-8天后)的小鼠用于本试验。将各10只该癌症小鼠分成4组，每隔3-4天对各组尾静脉注射0.2ml实施例32和实施例34中制备的结合有糖链、包封抗癌药多柔比星的脂质体液或者没有糖链、包封抗癌药多柔比星的脂质体液或者生理盐水或者单独的多柔比星液，共注射4次(癌细胞移植后的第7天、11天、14天、18天)。肿瘤体积是用游标卡尺测定移植肿瘤的长径(L)和短径(S)，通过下式计算。肿瘤体积(mm3)＝1/2×L×S×S。结果如图39或图40所示。如图所示，使用本发明的脂质体中包封多柔比星的脂质体，则肿瘤体积的上升得到抑制，可见肿瘤抑制效果。
实施例36口服给予各种结合糖链的脂质体复合物对癌症小鼠的制癌效果的测定
将Ehrlich ascites tumor(EAT)细胞(约2×107个)移植到雄性ddY小鼠(7周龄)右大腿部皮下，将约30只癌组织发育至50-100mm3(6-8天后)的小鼠用于本试验。将各10只该癌症小鼠分成3组，每隔3-4天对各组口服给予0.6ml实施例33和实施例34中制备的结合有糖链、包封抗癌药多柔比星的脂质体液或者没有糖链、包封抗癌药多柔比星的脂质体液或者生理盐水，共给予4次(癌细胞移植后的第7天、11天、14天、18天)。肿瘤体积是用游标卡尺测定移植肿瘤的长径(L)和短径(S)，通过下式计算。肿瘤体积(mm3)＝1/2×L×S×S。结果如图41或图42所示。如图所示，使用本发明的脂质体中包封多柔比星的脂质体，则肿瘤体积的上升得到抑制，可见肿瘤抑制效果。
实施例37白血病治疗用靶向性脂质体的制备
(1)包封多柔比星的脂质体的制备和包封药物的定量以及保存稳定性
使用胆酸透析法制备脂质体。即，将二棕榈酰基磷脂酰胆碱、胆固醇、磷酸双十六烷基酯、神经节苷脂和二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺分别以摩尔比35∶40∶5∶15∶5的比例混合，脂质总量为45.6mg，添加46.9mg胆酸钠，溶解于3ml氯仿/甲醇溶液。蒸发该溶液，在真空中干燥沉淀物，得到脂质膜。将所得脂质膜悬浮于3ml TAPS缓冲液(pH8.4)，进行超声波处理，得到3ml透明的胶束悬浮液。向该胶束悬浮液中加入PBS缓冲液(pH7.2)，制成10ml，然后再一边搅拌一边缓慢滴加在TAPS缓冲液(pH8.4)中以3mg/1ml完全溶解的多柔比星，均匀混合，然后将该含多柔比星的胶束悬浮液通过PM10膜(AmiconCo.，USA)和TAPS缓冲液(pH8.4)进行超滤，制备10ml均匀的、包封有多柔比星的脂质体。用ζ电位、粒径、分子量测定装置(Model Nano ZS，MalvernInstruments Ltd.，UK)测定所得的生理盐水悬浮液(37℃)中的包封抗癌药多柔比星的脂质体颗粒的粒径和ζ电位，结果，粒径为50-350nm、ζ电位为-30至-10mV。以485nm吸光度测定该脂质体包封的药物量，可知以110μg/ml的浓度包封多柔比星。该包封有多柔比星的脂质体在冰箱中保存1年后也不会发生沉淀或凝聚，很稳定。
(2)包封有抗癌药多柔比星的脂质体脂质膜面的亲水性处理
将10ml(1)中制备的包封有抗癌药多柔比星的脂质体溶液通过XM300膜(AmiconCo.，USA)和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，使溶液的pH为8.5。接着，加入10ml交联试剂双(磺基琥珀酰亚氨基)辛二酸酯(BS3；Pierce Co.，USA)，在25℃搅拌2小时。然后再在7℃搅拌过夜，使脂质体膜上的脂质二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺与BS3的化学键合反应终止。将该脂质体液用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤。接着，将40mg溶解于1ml CBS缓冲液(pH8.5)的三(羟基甲基)氨基甲烷加入到10ml脂质体液中，在25℃搅拌2小时。然后再在7℃搅拌过夜，使与脂质体膜上的脂质键合的BS3与三(羟基甲基)氨基甲烷的化学键合反应终止。由此，三(羟基甲基)氨基甲烷的羟基与包封有抗癌药多柔比星的脂质体膜的脂质二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺配位，形成水合亲水性。
(3)人血清白蛋白(HSA)与包封有抗癌药多柔比星的脂质体膜面的结合
根据已报道的方法(Yamazaki，N.，Kodama，M.and Gabius，H.-J.(1994)Methods Enzymol.242，56-65)，使用偶联反应法进行。即，该反应通过2步化学反应进行，首先，将43mg溶解于1ml TAPS缓冲液(pH8.4)中的偏过碘酸钠加入到实施例2中得到的10ml脂质体中，在室温下搅拌2小时，使存在于膜面上的神经节苷脂进行过碘酸氧化，然后用XM300膜和PBS缓冲液(pH8.0)进行超滤，得到10ml被氧化的脂质体。向该脂质体液中加入20mg人血清白蛋白(HSA)，在25℃搅拌2小时，然后，向PBS(pH8.0)中加入100μl 2M NaBH3CN，在10℃搅拌过夜，通过脂质体上的神经节苷脂与HAS的偶联反应结合HAS。用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，得到10ml结合有HAS的、包封有抗癌药多柔比星的脂质体液。
(4)唾液酸基路易斯X型四糖链与包封有抗癌药多柔比星的脂质体膜面结合的人血清白蛋白(HSA)的结合以及接头蛋白(HSA)的亲水性处理
将50μg唾液酸基路易斯X型四糖链(Calbiochem Co.，USA)加入到溶解有0.25g NH4HCO3的0.5ml水溶液中，在37℃搅拌3天，然后用0.45μm的滤器过滤，使糖链还原末端的氨基化反应终止，得到50μg唾液酸基路易斯X型四糖链的糖基胺化合物。接着，向1ml(3)中得到的包封有抗癌药多柔比星的脂质体液的一部分中加入1mg交联试剂3，3’-二硫代双(磺基琥珀酰亚氨基)丙酸酯(DTSSP；Pierce Co.，USA)，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，得到1ml DTSSP与脂质体上的HAS结合的脂质体。接着，向该脂质体液中加入50μg上述路易斯X型四糖链的糖基胺化合物，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和PBS缓冲液(pH7.2)进行超滤，进行唾液酸基路易斯X型四糖链与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白上的DTSSP的结合。接着，向该脂质体液中加入13mg三(羟基甲基)氨基甲烷(Wako Co.，Japan)，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和PBS缓冲液(pH7.2)进行超滤，使三(羟基甲基)氨基甲烷与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白上的DTSSP结合。结果得到三(羟基甲基)氨基甲烷与人血清白蛋白、脂质体结合并且对接头蛋白(HSA)进行了亲水性处理的脂质体。结果可得到2ml唾液酸基路易斯X型四糖链与人血清白蛋白、脂质体结合并且对接头蛋白(HSA)进行了亲水性处理的、具有唾液酸基路易斯X型四糖链、包封有抗癌药多柔比星的脂质体(脂质总量2mg、蛋白总量200μg)。用ζ电位、粒径、分子量测定装置(Model Nano ZS，MalvernInstruments Ltd.，UK)测定所得的生理盐水悬浮液(37℃)中的具有唾液酸基路易斯X型四糖链、包封抗癌药多柔比星的脂质体颗粒的粒径和ζ电位，结果，粒径为50-350nm、ζ电位为-30至-10mV。
(5)通过三(羟基甲基)氨基甲烷与包封有抗癌药多柔比星的脂质体膜面结合的人血清白蛋白(HSA)的结合对接头蛋白(HSA)实施亲水性处理
为了制备作为比较样品的包封有抗癌药多柔比星的脂质体(未结合糖链)，向1ml(3)中得到的包封有抗癌药多柔比星的脂质体液的一部分中加入1mg交联试剂3，3’-二硫代双(磺基琥珀酰亚氨基)丙酸酯(DTSSP；Pierce Co.，USA)，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，得到1ml DTSSP与脂质体上的HAS结合并且对接头蛋白(HSA)实施了亲水性处理的脂质体。接着，向该脂质体液中加入13mg三(羟基甲基)氨基甲烷(Wako Co.，Japan)，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和PBS缓冲液(pH7.2)进行超滤，使三(羟基甲基)氨基甲烷与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白上的DTSSP结合。结果得到2ml如图32所示的三(羟基甲基)氨基甲烷与人血清白蛋白、脂质体结合并且对接头蛋白(HSA)进行了亲水性处理的作为比较样品的包封有抗癌药多柔比星的脂质体(未结合糖链)(脂质总量2mg、蛋白总量200μg)。用ζ电位、粒径、分子量测定装置(Model Nano ZS，Malvern Instruments Ltd.，UK)测定所得的生理盐水悬浮液(37℃)中的包封抗癌剂多柔比星的脂质体颗粒(不具有糖链)的粒径和ζ电位，结果，粒径为50-350nm、ζ电位为-30至-10mV。
将本实施例中制备的脂质体用于实施例38。
实施例38对通过靶向性脂质体治疗白血病的研究
(1)脂质体化盐酸多柔比星的细胞毒性试验
使用由急性骨髓性白血病患者的白血病细胞构建的KG-1a细胞作为人白血病细胞，用含有10％胎牛血清(以下称为FBS)的RPMI 1640培养基培养该细胞。使用由正常成纤维细胞构建的MRC5细胞作为人正常细胞，用含有10％FBS的MEM培养基培养该细胞。由这些细胞制备105个/ml的细胞悬浮液，在96孔培养板上接种104个/孔，进行培养。24小时后，分别以适当的浓度向各孔分别给予未脂质体化的游离的盐酸多柔比星(以下称为free Dox)、脂质体化的盐酸多柔比星但未结合糖链(以下称为L-Dox)、脂质体化的盐酸多柔比星且结合有唾液酸基路易斯X糖链(以下称为L-Dox-SLX)。此时，调节为FBS等的浓度在各孔中相同的条件。给予抗癌药后培养72小时，对生存的细胞进行定量，计算致死活性，求出50％药物抑制浓度(以下称为IC50)。细胞的定量如下进行：除去含有抗癌药的培养基后，置换为100μl含有10％WST-8、10％FBS的RPMI 1640培养基或MEM培养基，培养3小时后测定485nm的吸光度(以550nm的吸光度作为参考值)。致死活性(％)＝100-(所检查孔的在485nm下的吸光度-未处置孔在550nm下的吸光度)×100，由上式求出致死活性(％)(以下称为KA)。
得到以下结果。
Free Dox对于KG-1a细胞的IC50为0.18μM，L-Dox为21.9μM，L-Dox-SLX为5.9μM。Free Dox对于MRC5细胞的IC50为8.4μM，L-Dox为520μM，L-Dox-SLX为802μM(表3)。
表3
| MRC5 | KG-1a | |
| Free Dox | 8.4 | 0.18±0.081 |
| L-Dox | 520 | 21.9±4.83 |
| L-Dox-SLX | 802 | 5.9±1.85 |
细胞毒性以50％药物抑制浓度(IC50)(μM)表示。
人正常细胞采用MRC5细胞，人白血病细胞采用KG-1a细胞。
该结果表明以下内容。
通过对盐酸多柔比星进行脂质体化，关于其对正常细胞的毒性，如果采用L-Dox则降至约62分之1，如果采用L-Dox-SLX则降至约95分之1。这显示：通过脂质体化，抗癌药的毒性非常低。考虑到目前临床的治疗方案是：采用的盐酸多柔比星的给药量为每天0.4-0.6mg/kg(0.67-1μM)，给药数天，可以认为对正常细胞的IC50值为500μM，其安全性是非常高的。
但是，经过脂质体化，对白血病细胞的细胞毒性也降低了，L-Dox对于KG-1a细胞的IC50为21.9μM，Free Dox的IC50为0.18μM，降低至约120分之1。实际的机体内给药中，脂质体化制剂在血液中的滞留性与Free Dox在血液中的滞留性相比提高，因此对于KG-1a细胞，Free Dox和L-Dox在机体内的药效差异并不大，但对于机体内的药效，L-Dox与Free Dox相比可能降低。
这里，我们对糖链带给靶向性脂质体的功能进行了研究。L-Dox-SLX对于KG-1a细胞的IC50是5.9μM，与L-Dox相比，细胞毒性降低得并不太大，最高为约30分之1左右。这可能是由于近年来已经证实L-选择蛋白在包含KG-1a细胞的白血病细胞中表达，有可能是与脂质体结合的唾液酸基路易斯X糖链作为配体与白血病细胞结合。而对于MRC5细胞，L-Dox和L-Dox-SLX的IC50没有差异。这可能显示：对于没有L-选择蛋白表达的MRC5细胞，L-Dox-SLX没有主动聚集，只是与L-Dox相同程度地聚集。可以认为：该唾液酸基路易斯X糖链的效果给脂质体带来了靶向性，也有望可以恢复因脂质体化而降低的细胞毒性。
L-Dox-SLX可以因脂质体化而带来高的血液中滞留性和对正常细胞的低细胞毒性，并且是因为所结合的糖链而对白血病细胞主动聚集的理想的靶向性DDS。
(2)关于脂质体化盐酸多柔比星对细胞毒性的增强和抑制的实验
使用人白血病细胞KG-1a，培养条件与实验1)相同。首先求出干扰素α(以下称为IFN)对KG-1a细胞的细胞毒性。KA的求法与(1)相同。接着求出培养基中添加IFN的状态或未添加状态下的L-Dox和L-Dox-SLX的KA，观察IFN导致的KA的增强。再通过与L-选择蛋白结合的糖链的中和抗体(克隆：DREG56)观察添加IFN时L-Dox-SLX的KA是否受到抑制。也测定中和抗体本身的KA。
得到以下结果。
在向培养基中添加100U/ml的状态下，IFN本身对KG-1a细胞的KA为9.4％±7.34。
在向培养基中添加100U/ml的状态下，对L-Dox和L-Dox-SLX的KA进行比较(图43)。L-Dox和L-Dox-SLX中的盐酸多柔比星的浓度为17.8μM。在没有IFN的状态下，L-Dox的KA为10％±10.5，在添加IFN的状态下仅增强至19.2％±7.99。考虑到IFN本身的KA，只是L-Dox与因添加IFN而得到的增强的单纯的相加。而在没有IFN的状态下，L-Dox-SLX的KA为6.3％±11.6，在添加IFN的状态下增强至44.1％±3.76。这显示该增强效果非常大，是协同性的。
以0.3μg/ml的浓度向培养基中添加L-选择蛋白的中和抗体，测定抗体单独的KA。在0.3μg/ml浓度下，抗体具有16.3％±25.8的浓度。
在添加IFN的状态下，L-Dox-SLX(盐酸多柔比星的浓度为17.8μM)的KA为47.2％±3.71，但在该状态下加入中和抗体，则KA被抑制为23.2％±12.7(图44)。考虑到中和抗体本身的KA，可以认为添加IFN时，L-Dox-SLX的KA几乎都受到了抑制。
该结果表明以下内容。
已有报告称：IFN以及干扰素γ等可以使白细胞上的选择蛋白的表达亢进。如果在我们所使用的人白血病细胞KG-1a中发生选择蛋白的表达亢进，则可以预测L-Dox-SLX在KG-1a细胞的聚集性提高，细胞毒性提高。实验结果中，无糖链的L-Dox的KA是L-Dox的KA和IFN单独的KA的单纯相加值，而L-Dox-SLX中，因IFN而使其KA倍数性地增强。这说明上述预测是正确的。
另外，在L-选择蛋白中和抗体的抑制实验中，因为抗体而使得为约47％的KA降低至23％。中和抗体本身所具有的KA为约16％，L-Dox-SLX的KA被抑制至个位数水平的可能性高。这说明L-Dox-SLX的细胞毒性的表达与L-选择蛋白有关。即，与脂质体结合的唾液酸即路易斯X糖链与白血病上的L-选择蛋白结合，L-Dox-SLX的细胞毒性得以表达。
以上结果显示：我们所制备的DDS具有可识别人白血病细胞上的选择蛋白并聚集的靶向性，可以认为与脂质体结合的糖链发挥了其功能。并且，IFN等的添加导致L-Dox-SLX的细胞毒性增强，考虑到临床应用，这是很有意味的现象，可以说这进一步提高了该DDS的临床地位。
实施例39关于癌症小鼠的药动学和制癌效果的研究
(1)具有糖脂型糖链、包封多柔比星的脂质体的制备和包封药物的定量以及保存稳定性
使用胆酸透析法制备脂质体。即，将二棕榈酰基磷脂酰胆碱、胆固醇、磷酸双十六烷基酯、神经节苷脂(作为糖脂糖链，含有GM1：13％、GD1a：38％、GD1b：9％、GT1b：16％)分别以摩尔比35∶45∶5∶15的比例混合，脂质总量为45.6mg，添加46.9mg胆酸钠，溶解于3ml氯仿/甲醇溶液。蒸发该溶液，在真空中干燥沉淀物，得到脂质膜。将所得脂质膜悬浮于3ml TAPS缓冲液(pH8.4)，进行超声波处理，得到3ml透明的胶束悬浮液。向该胶束悬浮液中加入PBS缓冲液(pH7.2)，制成10ml，然后再一边搅拌一边缓慢滴加在TAPS缓冲液(pH8.4)中以3mg/lml完全溶解多柔比星，均匀混合，然后将该含多柔比星的胶束悬浮液通过PM10膜(AmiconCo.，USA)和TAPS缓冲液(pH8.4)进行超滤，制备10ml均匀的、具有糖脂型糖链、包封有多柔比星的脂质体颗粒悬浮液。用ζ电位、粒径、分子量测定装置(Model Nano ZS，MalvernInstruments Ltd.，UK)测定所得的生理盐水悬浮液(37℃)中的具有糖脂型糖链、包封抗癌药多柔比星的脂质体颗粒的粒径和ζ电位，结果，粒径为50-350nm、ζ电位为-30至-10mV。以485nm吸光度测定该脂质体包封的药物量，可知以71μg/ml的浓度包封多柔比星。该包封有多柔比星的脂质体在冰箱中保存1年后也不会发生沉淀或凝聚，很稳定。
(2)通过尾静脉注射具有糖脂型糖链、包封多柔比星的脂质体进行在癌症小鼠中的药动学测定
将Ehrlich ascites tumor(EAT)细胞(约2×107个)移植到雄性ddY小鼠(7周龄)右大腿部皮下，将约50只癌组织发育至50-100mm3(6-8天后)的小鼠用于本试验。将各25只该癌症小鼠分成2组，在癌细胞移植后，分别对各组尾静脉注射0.2ml具有糖脂型糖链并包封多柔比星的脂质体液或者游离的多柔比星液。然后用荧光法(470nm)随时测定每组5只的血液中或肿瘤组织中的多柔比星浓度。用荧光显微镜观察血药浓度的时间曲线下面积(AUC)、多柔比星在肿瘤组织和细胞中的分布。如表4和图45-50的图表和照片所示，与以往的游离多柔比星相比，使用本发明的脂质体中包封多柔比星的脂质体时，多柔比星在血液中的滞留性提高约数百倍，多柔比星向肿瘤组织和癌细胞的聚集效果也高约数十倍。
(3)通过尾静脉注射具有糖脂型糖链、包封多柔比星的脂质体进行在癌症小鼠中的制癌效果的测定
将Ehrlich ascites tumor(EAT)细胞(约2×107个)移植到雄性ddY小鼠(7周龄)右大腿部皮下，将约30只癌组织发育至50-100mm3(6-8天后)的小鼠用于本试验。将各10只该癌症小鼠分成3组，在癌细胞移植后，每隔3-4天对各组尾静脉注射0.2ml具有糖脂型糖链并包封多柔比星的脂质体液或者游离的多柔比星液，共注射6次。肿瘤体积是用游标卡尺测定移植肿瘤的长径(L)和短径(S)，通过下式计算。肿瘤体积(mm3)＝1/2×L×S×S。如图45-50的图表和照片所示，与以往的游离多柔比星相比，使用本发明的脂质体中包封多柔比星的脂质体时，即使给予低浓度，也会抑制肿瘤体积的上升，可见显著的制癌效果。
表4
| AUC0→∞(mg×h/ml) | |
| 包封多柔比星的脂质体(给药量0.42mg/kg) | 5.72±0.31 |
| 游离多柔比星(给药量1.4mg/kg) | 0.13±0.01 |
实施例40实施2种亲水性处理的脂质体在血液中的滞留性的研究
(1)脂质体的制备
使用胆酸透析法制备脂质体。即，将二棕榈酰基磷脂酰胆碱、胆固醇、磷酸双十六烷基酯、神经节苷脂和二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺分别以摩尔比35∶40∶5∶15∶5的比例混合，脂质总量为45.6mg，添加46.9mg胆酸钠，溶解于3ml氯仿/甲醇溶液。蒸发该溶液，在真空中干燥沉淀物，得到脂质膜。将所得脂质膜悬浮于3ml TAPS缓冲液(pH8.4)，进行超声波处理，得到3ml透明的胶束悬浮液。向该胶束悬浮液中加入PBS缓冲液(pH7.2)，制成5ml，再一边搅拌一边缓慢滴加在TAPS缓冲液(pH8.4)中以2250mg/6ml完全溶解的磷酸泼尼松龙，均匀混合，然后将该含磷酸泼尼松龙的胶束悬浮液通过PM10膜(AmiconCo.，USA)和TAPS缓冲液(pH8.4)进行超滤，制备10ml均匀的脂质体。用ζ电位、粒径、分子量测定装置(Model Nano ZS，Malvern Instruments Ltd.，UK)测定所得的生理盐水悬浮液(37℃)中的脂质体颗粒的粒径和ζ电位，结果，粒径为50-350nm、ζ电位为-30至-10mV。
(2)通过脂质体膜面上的三(羟基甲基)氨基甲烷实施亲水性处理
将10ml(1)中制备的脂质体溶液通过XM300膜(AmiconCo.，USA)和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，使溶液的pH为8.5。接着，加入10ml交联试剂双(磺基琥珀酰亚氨基)辛二酸酯(BS3；Pierce Co.，USA)，在25℃搅拌2小时。然后再在7℃搅拌过夜，使脂质体膜上的脂质二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺与BS3的化学键合反应终止。将该脂质体液用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤。接着，将40mg溶解于1ml CBS缓冲液(pH8.5)的三(羟基甲基)氨基甲烷加入到10ml脂质体液中，在25℃搅拌2小时。然后再在7℃搅拌过夜，使与脂质体膜上的脂质结合的BS3与三(羟基甲基)氨基甲烷的化学键合反应终止。由此，三(羟基甲基)氨基甲烷的羟基与脂质体膜的脂质二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺配位，形成水合亲水性。
(3)通过脂质体脂质膜面上的纤维二糖实施亲水性处理
将10ml(1)中制备的脂质体溶液通过XM300膜(AmiconCo.，USA)和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，使溶液的pH为8.5。接着，加入10ml交联试剂双(磺基琥珀酰亚氨基)辛二酸酯(BS3；Pierce Co.，USA)，在25℃搅拌2小时。然后再在7℃搅拌过夜，使脂质体膜上的脂质二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺与BS3的化学键合反应终止。将该脂质体液用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤。接着，将50mg溶解于1ml CBS缓冲液(pH8.5)的纤维二糖加入到10ml脂质体液中，在25℃搅拌2小时。然后再在7℃搅拌过夜，使与脂质体膜上的脂质结合的BS3与纤维二糖的化学键合反应终止。由此，纤维二糖的羟基与脂质体膜的脂质二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺配位，形成水合亲水性。
(4)人血清白蛋白(HSA)与结合有三(羟基甲基)氨基甲烷的脂质体膜面的结合
根据已报道的方法(Yamazaki，N.，Kodama，M.and Gabius，H.-J.(1994)Methods Enzymol.242，56-65)，使用偶联反应法进行。即，该反应通过2步化学反应进行，首先，将43mg溶解于1ml TAPS缓冲液(pH8.4)中的偏过碘酸钠加入到(2)中得到的10ml脂质体中，在室温下搅拌2小时，使存在于膜面上的神经节苷脂进行过碘酸氧化，然后采用XM300膜和PBS缓冲液(pH8.0)进行超滤，得到10ml被氧化的脂质体。向该脂质体液中加入20mg人血清白蛋白(HSA)，在25℃搅拌2小时，然后，向PBS(pH8.0)中加入100μl 2M NaBH3CN，在10℃搅拌过夜，通过脂质体上的神经节苷脂与HAS的偶联反应结合HAS。用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，得到10ml结合有HAS的脂质体液。
(5)人血清白蛋白(HSA)与结合有纤维二糖的脂质体膜面上的结合
根据已报道的方法(Yamazaki，N.，Kodama，M.and Gabius，H.-J.(1994)Methods Enzymol.242，56-65)，使用偶联反应法进行。即，该反应通过2步化学反应进行，首先，将43mg溶解于1ml TAPS缓冲液(pH8.4)中的偏过碘酸钠加入到实施例3中得到的10ml脂质体中，在室温下搅拌2小时，使存在于膜面上的神经节苷脂进行过碘酸氧化，然后采用XM300膜和PBS缓冲液(pH8.0)进行超滤，得到10ml被氧化的脂质体。向该脂质体液中加入20mg人血清白蛋白(HSA)，在25℃搅拌2小时，然后，向PBS(pH8.0)中加入100μl 2M NaBH3CN，在10℃搅拌过夜，通过脂质体上的神经节苷脂与HAS的偶联反应结合HAS。用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，得到10ml结合有HAS的脂质体液。
(6)通过三(羟基甲基)氨基甲烷与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白(HSA)结合对接头蛋白(HSA)实施亲水性处理
为了制备作为亲水性样品之一的脂质体，向1ml(4)中得到的脂质体液的一部分中加入1mg交联试剂3，3’-二硫代双(磺基琥珀酰亚氨基)丙酸酯(DTSSP；Pierce Co.，USA)，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，得到1ml DTSSP与脂质体上的HSA结合的对接头蛋白(HSA)实施亲水性处理的脂质体。接着，向该脂质体液中加入13mg三(羟基甲基)氨基甲烷(WakoCo.，Japan)，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和PBS缓冲液(pH7.2)进行超滤，使三(羟基甲基)氨基甲烷与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白上的DTSSP结合。结果得到2ml三(羟基甲基)氨基甲烷与人血清白蛋、脂质体结合并且对接头蛋白(HSA)进行了亲水性处理的作为比较样品的脂质体(脂质总量2mg、蛋白总量200μg)。用ζ电位、粒径、分子量测定装置(Model Nano ZS，MalvernInstruments Ltd.，UK)测定所得的生理盐水悬浮液(37℃)中的脂质体颗粒的粒径和ζ电位，结果，粒径为50-350nm、ζ电位为-30至-10mV。
(7)通过纤维二糖与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白(HSA)结合对接头蛋白(HSA)实施亲水性处理
为了制备作为亲水性样品之一的脂质体，向1ml(5)中得到的脂质体液的一部分中加入1mg交联试剂3，3’-二硫代双(磺基琥珀酰亚氨基)丙酸酯(DTSSP；Pierce Co.，USA)，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，得到1ml DTSSP与脂质体上的HAS结合的对接头蛋白(HSA)实施亲水性处理的脂质体。接着，向该脂质体液中加入30mg纤维二糖，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和PBS缓冲液(pH7.2)进行超滤，进行纤维二糖与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白上的DTSSP的结合。结果得到2ml三(羟基甲基)氨基甲烷与人血清白蛋、脂质体结合并且对接头蛋白(HSA)进行了亲水性处理的作为比较样品的脂质体(脂质总量2mg、蛋白总量200μg)。用ζ电位、粒径、分子量测定装置(ModelNano ZS，Malvern Instruments Ltd.，UK)测定所得的生理盐水悬浮液(37℃)中的脂质体颗粒的粒径和ζ电位，结果，粒径为50-350nm、ζ电位为-30至-10mV。
(8)未经亲水性处理的脂质体的制备
使用胆酸透析法制备脂质体。即，将二棕榈酰基磷脂酰胆碱、胆固醇、磷酸双十六烷基酯、神经节苷脂(作为糖脂糖链，含有100％GTlb)分别以摩尔比35∶40∶5∶15的比例混合，脂质总量为45.6mg，添加46.9mg胆酸钠，溶解于3ml氯仿/甲醇溶液。蒸发该溶液，在真空中干燥沉淀物，得到脂质膜。将所的脂质膜悬浮于3ml TAPS缓冲液(pH8.4)，进行超声波处理，得到3ml透明的胶束悬浮液。向该胶束悬浮液中加入PBS缓冲液(pH7.2)，制成10ml，再一边搅拌一边缓慢滴加在TAPS缓冲液(pH8.4)中以3mg/1 ml完全溶解的多柔比星，均匀混合，然后将该含多柔比星的胶束悬浮液通过PM10膜(AmiconCo.，USA)和TAPS缓冲液(pH8.4)进行超滤，制备10ml均匀的未实施亲水性处理的脂质体颗粒悬浮液。用ζ电位、粒径、分子量测定装置(Model Nano ZS，Malvern Instruments Ltd.，UK)测定所得的生理盐水悬浮液(37℃)中的未经亲水性处理的脂质体颗粒的粒径和ζ电位，结果，粒径为50-350nm、ζ电位为-30至-10mV。
(9)通过氯胺T法进行脂质体的125I标记
将氯胺T(Wako Pure Chemical Co.，Japan)溶液和二亚硫酸钠溶液在用时分别制备成3mg/ml和5mg/ml。将各50μl在实施例6-8中制备的3种脂质体分别装入Eppendorf管中，接着加入15μl125I-NaI(NENLife Science Product，Inc.USA)、10μl氯胺T溶液。每隔5分钟加入10μl氯胺T溶液，将该操作重复2次，15分钟后加入100μl二亚硫酸钠作为还原剂，终止反应。接着，进行Sephadex G-50(PhramaciaBiotech.Sweden)柱层析，用PBS洗脱，纯化标记物。最后添加未标记脂质体复合物，调节比活性(4×106Bq/mg蛋白质)，得到3种125I标记脂质体液。
(10)各种脂质体在癌症小鼠的血液中浓度的测定
将Ehrlich ascites tumor(EAT)细胞(约2×107个)移植到雄性ddY小鼠(7周龄)大腿部皮下，将癌组织发育至0.3-0.6g(6-8天后)的小鼠用于本试验。对该癌症小鼠尾静脉注射0.2ml(9)中125I标记的3种脂质体复合物，脂质量的比例为30μg/只。5分钟后采血，用γ射线计数仪(Aloka ARC 300)测定其放射能。放射能在血液中的分布量以每1ml血液中放射能占给予全部放射能的比例(％给予量/ml血液)表示。如图51所示，2种亲水性处理使得在血液中的滞留性都提高，特别是通过三(羟基甲基)氨基甲烷实施的亲水性处理的脂质体在血液中滞留性的提高显著。
实施例41包封维生素A的脂质体的制备和保存稳定性
使用胆酸透析法制备脂质体。即，将二棕榈酰基磷脂酰胆碱、胆固醇、磷酸双十六烷基酯、神经节苷脂和二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺分别以摩尔比35∶40∶5∶15∶5的比例混合，脂质总量为45.6mg，添加46.9mg胆酸钠，溶解于3ml氯仿/甲醇溶液。蒸发该溶液，在真空中干燥沉淀物，得到脂质膜。将所得脂质膜悬浮于3ml PBS缓冲液(pH7.2)，进行超声波处理，得到3ml透明的胶束悬浮液。向该胶束悬浮液中加入PBS缓冲液(pH7.2)，制成10ml，然后再加入0.3ml乙醇和0.7ml PBS缓冲液(pH7.2)，一边搅拌一边缓慢滴加6mg完全溶解的维生素A，均匀混合，然后将该含维生素A的胶束悬浮液通过PM10膜(AmiconCo.，USA)和PBS缓冲液(pH7.2)进行超滤，制备10ml均匀的、包封有维生素A的脂质体(平均粒径100nm)。该包封有维生素A的脂质体在冰箱中保存1年后也不会发生沉淀或凝聚，很稳定。
实施例42包封维生素E的脂质体的制备和保存稳定性
使用胆酸透析法制备脂质体。即，将二棕榈酰基磷脂酰胆碱、胆固醇、磷酸双十六烷基酯、神经节苷脂和二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺分别以摩尔比35∶40∶5∶15∶5的比例混合，脂质总量为45.6mg，添加46.9mg胆酸钠，再添加6mg维生素E，溶解于3ml氯仿/甲醇溶液。蒸发该溶液，在真空中干燥沉淀物，得到脂质膜。将所得脂质膜悬浮于3mlPBS缓冲也(pH7.2)，进行超声波处理，得到3ml透明的胶束悬浮液。向该胶束悬浮液中加入PBS缓冲液(pH7.2)，制成10ml，然后将该含维生素A的胶束悬浮液通过PM10膜(AmiconCo.，USA)和PBS缓冲液(pH7.2)进行超滤，制备10ml均匀的、包封有维生素A的脂质体(平均粒径100nm)。该包封有维生素E的脂质体在冰箱中保存1年后也不会发生沉淀或凝聚，很稳定。
实施例42包封磷酸泼尼松龙的脂质体的制备
(1)包封磷酸泼尼松龙的脂质体的制备和包封药物的定量以及保存稳定性
使用胆酸透析法制备脂质体。即，将二棕榈酰基磷脂酰胆碱、胆固醇、磷酸双十六烷基酯、神经节苷脂和二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺以摩尔比35∶40∶5∶15∶5的比例混合，脂质总量为45.6mg，添加46.9mg胆酸钠，溶解于3ml氯仿/甲醇溶液。蒸发该溶液，在真空中干燥沉淀物，得到脂质膜。将所得脂质膜悬浮于3ml TAPS缓冲液(pH8.4)，进行超声波处理，得到3ml透明的胶束悬浮液。向该胶束悬浮液中加入PBS缓冲液(pH7.2)，制成5ml，然后一边搅拌一边缓慢滴加在TAPS缓冲液(pH8.4)中以2250mg/6ml完全溶解的磷酸泼尼松龙，均匀混合，然后将该含磷酸泼尼松龙的胶束悬浮液通过PM10膜(AmiconCo.，USA)和TAPS缓冲液(pH8.4)进行超滤，制备10ml均匀的、包封有磷酸泼尼松龙的脂质体。用ζ电位、粒径、分子量测定装置(Model Nano ZS，Malvern Instruments Ltd.，UK)测定所得的生理盐水悬浮液(37℃)中的包封磷酸泼尼松龙的脂质体颗粒的粒径和ζ电位，结果，粒径为50-350nm、ζ电位为-30至-10mV。以260nm吸光度测定该脂质体包封的药物量，可知以280μg/ml的浓度包封磷酸泼尼松龙。该包封有磷酸泼尼松龙的脂质体在冰箱中保存1年后也不会发生沉淀或凝聚，很稳定。
(2)包封有磷酸泼尼松龙的脂质体脂质膜面的亲水性处理
将10ml(1)中制备的包封有磷酸泼尼松龙的脂质体溶液通过XM300膜(AmiconCo.，USA)和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，使溶液的pH为8.5。接着，加入10ml交联试剂双(磺基琥珀酰亚氨基)辛二酸酯(BS3；Pierce Co.，USA)，在25℃搅拌2小时。然后再在7℃搅拌过夜，使脂质体膜上的脂质二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺与BS3的化学键合反应终止。将该脂质体液用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤。接着，将40mg溶解于1ml CBS缓冲液(pH8.5)的三(羟基甲基)氨基甲烷加入到10ml脂质体液中，在25℃搅拌2小时。然后再在7℃搅拌过夜，使与脂质体膜上的脂质键合的BS3与三(羟基甲基)氨基甲烷的化学键合反应终止。由此，三(羟基甲基)氨基甲烷的羟基与包封有抗癌剂多柔比星的脂质体膜的脂质二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺配位，形成水合亲水性。
(3)人血清白蛋白(HSA)与包封有磷酸泼尼松龙的脂体膜面的结合
根据已报道的方法(Yamazaki，N.，Kodama，M.and Gabius，H.-J.(1994)Methods Enzymol.242，56-65)，使用偶联反应法进行。即，该反应通过2步化学反应进行，首先，将43mg溶解于1ml TAPS缓冲液(pH8.4)中的偏过碘酸钠加入到(2)中得到的10ml脂质体中，在室温下搅拌2小时，使存在于膜面上的神经节苷脂进行过碘酸氧化，然后用XM300膜和PBS缓冲液(pH8.0)进行超滤，得到10ml被氧化的脂质体。向该脂质体液中加入20mg人血清白蛋白(HSA)，在25℃搅拌2小时，然后，向PBS(pH8.0)中加入100μl 2M NaBH3CN，在10℃搅拌过夜，通过脂质体上的神经节苷脂与HAS的偶联反应结合HAS。用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，得到10ml结合有HAS的、包封有磷酸泼尼松龙的脂质体。
(4)唾液酸基路易斯X型四糖链与包封有磷酸泼尼松龙的脂质体膜面结合的人血清白蛋白(HSA)的结合以及接头蛋白(HSA)的亲水性处理
将50μg唾液酸基路易斯X型四糖链(Calbiochem Co.，USA)加入到溶解有0.25g NH4HCO3的0.5ml水溶液中，在37℃搅拌3天，然后用0.45μm的滤器过滤，使糖链还原末端的氨基化反应终止，得到50μg唾液酸基路易斯X型四糖链的糖基胺化合物。接着，向1ml(3)中得到的包封有磷酸泼尼松龙的脂质体液的一部分中加入1mg交联试剂3，3’-二硫代双(磺基琥珀酰亚氨基)丙酸酯(DTSSP；Pierce Co.，USA)，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，得到1ml DTSSP与脂质体上的HAS结合的脂质体。接着，向该脂质体液中加入50μg上述路易斯X型四糖链的糖基胺化合物，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和PBS缓冲液(pH7.2)进行超滤，进行唾液酸基路易斯X型四糖链与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白上的DTSSP的结合。接着，向该脂质体液中加入13mg三(羟基甲基)氨基甲烷(Wako Co.，Japan)，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和PBS缓冲液(pH7.2)进行超滤，使三(羟基甲基)氨基甲烷与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白上的DTSSP结合。结果得到三(羟基甲基)氨基甲烷与人血清白蛋白、脂质体结合并且对接头蛋白(HSA)进行了亲水性处理的脂质体。结果可得到2ml唾液酸基路易斯X型四糖链与人血清白蛋白、脂质体结合并且对接头蛋白(HSA)进行了亲水性处理的、包封有磷酸泼尼松龙的脂质体(脂质总量2mg、蛋白总量200μg)。用ζ电位、粒径、分子量测定装置(Model Nano ZS，Malvern Instruments Ltd.，UK)测定所得的生理盐水悬浮液(37℃)中的包封磷酸泼尼松龙的脂质体颗粒的粒径和ζ电位，结果，粒径为50-350nm、ζ电位为-30至-10mV。
(5)通过三(羟基甲基)氨基甲烷与包封有磷酸泼尼松龙的脂质体膜面结合的人血清白蛋白(HSA)的结合对接头蛋白(HSA)实施亲水性处理
为了制备作为比较样品的包封有磷酸泼尼松龙的脂质体(不具糖链)，向1ml(3)中得到的包封有磷酸泼尼松龙的脂质体液的一部分中加入1mg交联试剂3，3’-二硫代双(磺基琥珀酰亚氨基)丙酸酯(DTSSP；Pierce Co.，USA)，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，得到1ml DTSSP与脂质体上的HAS结合并且对接头蛋白(HSA)实施了亲水性处理的脂质体。接着，向该脂质体液中加入13mg三(羟基甲基)氨基甲烷(Wako Co.，Japan)，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和PBS缓冲液(pH7.2)进行超滤，使三(羟基甲基)氨基甲烷与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白上的DTSSP结合。结果得到2ml三(羟基甲基)氨基甲烷与人血清白蛋白、脂质体结合并且对接头蛋白(HSA)进行了亲水性处理的作为比较样品的包封有磷酸泼尼松龙的脂质体(不具有糖链)(脂质总量2mg、蛋白总量200μg)。用ζ电位、粒径、分子量测定装置(Model NanoZS，Malvern Instruments Ltd.，UK)测定所得的生理盐水悬浮液(37℃)中的包封磷酸泼尼松龙的脂质体颗粒(不具有糖链)的粒径和ζ电位，结果，粒径为50-350nm、ζ电位为-30至-10mV。
将本实施例中制备的脂质体用于以下的实施例15和16的研究。
实施例43通过靶向性脂质体研究风湿性关节炎的治疗
(1)RA模型小鼠的制备
制备II型胶原诱导关节炎(以下称为CIA)模型作为RA小鼠模型。所使用的小鼠、试剂类如下。
实验动物：DBA/1J小鼠(8周龄、雄性)
接种抗原：牛胶原II型
佐剂：含有结核死菌(H37RA、2mg/ml)的完全氟氏佐剂(CFA)、不含结核死菌的不完全氟氏佐剂(IFA)
将胶原水溶液和CFA以2∶1容积比混合，调节为100μL中含有200μg胶原的乳浊液，将其注射到小鼠尾底部皮下(第0天)。处置21天后(第21天)，将胶原水溶液和IFA以2∶1容积比混合，调节为100μL中含有200μg胶原的乳浊液，再次将其注射到小鼠尾底部皮下。
处置后，以3次/周的频率观察小鼠的四肢，按照以下基准评分，进行炎症量化。各个四肢中，正常：0分，轻度炎症或发红：1分，重度发红、肿胀或应用障碍：2分，前掌、足跖部和关节部变形：3分(最低为0分，最高为12分)。将该分由下式处理，求出炎症活动度(Inflammatory Activity：以下称为IA)。
炎症活动度(％)＝四肢的总分数/12×100
得到以下结果。
从第21天后经过数日，可见后肢足趾发红的小鼠增加。第28天，小鼠的IV为16.7％，第39天达到50％。图31表示发炎小鼠的四肢的照片。CIA小鼠关节炎情况如下。A：后肢足趾间关节肿胀(第二趾、箭头)、B：后肢足趾间关节肿胀(第四趾、箭头)、C：后肢足趾间关节发红(箭头)、D：正常后肢、E：前肢指关节肿胀(箭头)、F：正常前肢
这样，可以由上述方法制备CIA小鼠作为RA模型小鼠。
(2)通过静脉内给予DDS治疗RA小鼠的实验
从尾静脉向引发关节炎的小鼠注射治疗药，实施治疗。静脉注射在第28天至第46天以每周2次的频率进行。
第28天，选择有炎症表现的小鼠，分成4组，使每组的炎症分数平均值相同。各组为：1)对照：无治疗组、2)free Pred：将磷酸泼尼松龙溶解于生理盐水，使用该水溶液，磷酸泼尼松龙的量为每次100μg，每周静脉注射200μg、3)L-Pred：将磷酸泼尼松龙包封入脂质体中，不具有糖链，使用该脂质体，磷酸泼尼松龙的量为每次10μg，每周静脉注射20μg、4)L-Pred-SLX：将磷酸泼尼松龙包封入脂质体中，结合有唾液酸基路易斯X糖链，使用该脂质体，磷酸泼尼松龙的量为每次10μg，每周静脉注射20μg。
该4组小鼠的数量为：对照：6只、free Pred：7只、L-Pred：8只、L-Pred-SLX：8只。
得到以下的结果。对照中，IA随时间而上升，第46天时突破了60％。free Pred中，IA在第37天时达到约50％，随后以平衡状态推移。L-Pred中，IA从第32天开始上升，在第46天约为40％。L-Pred-SLX中，未观察到IA的大幅度上升，整个过程中都为20％或以下(图53)。
该结果表明以下内容。
free Pred组中，静脉注射的磷酸泼尼松龙的量为100μg/次，对于炎症的控制来讲是不够的，与对照组相比，IA未见明显的差别。L-Pred组中，静脉注射的磷酸泼尼松龙量为free Pred组的十分之一，为10μg/次，IA与free Pred组同等或以下。这可能是磷酸泼尼松龙的脂质体化使药物在血液中的滞留性提高，药效得到提高。L-Pred-SLX组中，磷酸泼尼松龙量同样为free Pred组的十分之一，为10μg/次，但IA完全没有上升，炎症的进展得到显著抑制。这可以认为是由于L-Pred和L-Pred-SLX的差别、即有无唾液酸基X糖链带来的效果。即，这显示了唾液酸基X糖链使得脂质体有效地聚集在炎症部位的可能性。
证明该DDS具有可以将治疗药极有效地分配到炎症部位的能力。这显示：在炎症疾病治疗中，通过将治疗药集中在病灶部位，可以抑制治疗药所具有的副作用，或者增大治疗药的药效。
(3)通过DDS的口服给予来治疗RA小鼠的实验
将治疗药口服给予引发关节炎的小鼠，实施治疗。给予是在第28天至第39天以每周3次的频率进行。
第28天，选择有炎症表现的小鼠，分成4组，使每组的炎症分数平均值相同。各组为：1)对照：无治疗组、2)free Pred：将磷酸泼尼松龙溶解于生理盐水，使用该水溶液，磷酸泼尼松龙的量为每次100μg，每周口服给予300μg、3)L-Pred：将磷酸泼尼松龙包封入脂质体中，不具有糖链，使用该脂质体，磷酸泼尼松龙的量为每次10μg，每周口服给予30μg、4)L-Pred-SLX：将磷酸泼尼松龙包封入脂质体中，结合有唾液酸基路易斯X糖链，使用该脂质体，磷酸泼尼松龙的量为每次10μg，每周口服给予30μg。
该4组小鼠的数量为：对照：2只、free Pred：3只、L-Pred：3只、L-Pred-SLX：4只。
得到以下的结果。
free Pred组中，由于喂饲针导致胃穿孔死亡，在第32天中止实验。对照组、free Pred组(至第32天)、L-Pred组中，IA未观察到显著差异。L-Pred-SLX组不能抑制炎症的进展，但在第39天时，与L-Pred组相比，IA显著低(图54)。
该结果表明以下内容。
对照、free Pred以及L-Pred三组中未见显著差异。这可能是由于free Pred组中，口服给予的300μg/周的磷酸泼尼松龙的量对于抑制炎症的进展来讲是不够的。L-Pred组中，脂质体不能通过肠道吸收，或者即使吸收，考虑到口服给予的磷酸泼尼松龙的量为30μg/周，量不够的可能性很高。而L-Pred-SLX组中，IA受到抑制。如果考虑到脂质体在肠道中被吸收，并且口服给予磷酸泼尼松龙的量为30μg/周，这显示磷酸泼尼松龙以具有糖链的脂质体的形式被运送到炎症部位的可能性。
结果显示：该DDS不仅可以静脉内给予，口服给予也可以有效发挥功能。并且显示：包封在脂质体中，以往不可能口服吸收的药物也可以制成可口服给予的制剂。
(4)寻求RA小鼠治疗中磷酸泼尼松龙适当量的实验
从尾静脉向引发关节炎的小鼠注射治疗药，实施治疗。静脉注射是在第28天至第46天期间以每周2次的频率进行。
第28天，选择有炎症表现的小鼠，分成3组，使每组的炎症分数平均值相同。各组为：1)对照：无治疗组、2)250μg：将磷酸泼尼松龙溶解于生理盐水，使用该水溶液，磷酸泼尼松龙的量为每次250μg，每周静脉注射500μg、3)500μg：将磷酸泼尼松龙溶解于生理盐水，使用该水溶液，磷酸泼尼松龙的量为每次500μg，每周静脉注射1000μg。
该3组小鼠的数量为：对照：2只、250μg：2只、500μg：2只。
得到以下的结果。
对照组和250μg组中未见显著差异。500μg组中未见IA的上升，炎症的进展得到抑制(图55)。
由该结果表明以下内容。在该RA模型小鼠中，抑制炎症的进展要求最低量比500μg/周多、最高为1000μg/周的磷酸泼尼松龙的量。静脉注射的治疗试验中，L-Pred-SLX组以每次10μg、每周20μg的磷酸泼尼松龙的量抑制炎症的进展，由此可以认为：该DDS中，以最多为50分之1的药量即可得到与以往的治疗效果同样的效果。
这显示：保持病灶部位的药物浓度，同时可以减少全身的给药量，可以减少药物的副作用，还可以将药物的全身给予量提高至低于药物表现副作用的浓度，从而提高病灶部位的药物浓度，可以具有更高的药效。
本说明书中引用的所有刊行物、专利和专利申请都直接作为参考引入本说明书中。
产业实用性
通过调节构成脂质体的组成的种类和量，可得到稳定性高的脂质体。并且，通过特定的亲水性化合物使脂质体形成亲水性，可得到具有比以往的脂质体的稳定性优异等特性的脂质体。
如本发明的实施例所示，制备由各种糖链、包含人血清白蛋白等来自人的蛋白质的来自生物体蛋白质(接头)、脂质体结合而成的脂质体，使用Ehrlich’s实体癌小鼠对上述脂质体对小鼠各种组织的药动学、特别是关于被癌组织的摄取进行分析，结果，通过利用糖链分子结构的差异，可以在实际的机体内促进或抑制脂质体对各种组织的药动学，并对此进行控制，基于此，可以使DDS材料具有有效地对以癌组织为首的目标组织(血液中、肝脏、脾脏、肺、脑、小肠、心脏、胸腺、肾脏、胰脏、肌肉、大肠、骨、骨髓、眼、癌组织、炎症组织、淋巴结)进行打靶的功能。这样，本发明可提供在医学、药学领域极为有用的、可控制靶向性的脂质体。此时，通过控制与脂质体表面结合的糖链的密度，更可以得到靶向性高的结合有糖链的脂质体。
本发明的上述糖链修饰脂质体的肠道吸收性优异，可以经由肠道这种以往的应用脂质体的制剂中未见的新型给药形式给药，这是具有划时代意义的。并且，肠道吸收性以及在各种组织(血液中、肝脏、脾脏、肺、脑、小肠、心脏、胸腺、肾脏、胰脏、肌肉、大肠、骨、骨髓、眼、癌组织、炎症组织、淋巴结)中的药动学可以通过设定脂质体与糖链的结合量、和选择糖链来控制，由此，可以将药物或基因等经由肠道进而经由血液高效且无副作用、安全地转移到机体组织，在医学、药学领域特别有用。
本发明的糖链修饰亲水性脂质体和无糖链修饰的亲水性脂质体中包封抗癌药，经口或胃肠道外给予有癌症的受体，则药物靶向性地聚集于癌组织，可抑制癌的生长。
本发明的靶向性脂质体通过适当包封具有药效的化合物，可以在体内到达有脂质体表面结合的糖链可识别、结合的凝集素表达的组织、器官，被细胞摄取，具有药效的化合物发挥其效果，可以用作治疗药和诊断药。特别是包封抗癌药，用作癌症治疗药。另外，本发明的肠道吸收控制性脂质体容易由肠道吸收，之后与靶向性脂质体同样，因此被包封的具有药效的物质可在体内迅速地发挥效果。
Claims (78)
1.糖链修饰的脂质体，其中糖链与脂质体膜结合。
2.权利要求1的糖链修饰的脂质体，其中脂质体的构成脂质包含磷脂酰胆碱类(摩尔比0-70％)、磷脂酰乙醇胺类(摩尔比0-30％)、1种或以上选自磷脂酸类、长链烷基磷酸酯类和磷酸双十六烷基酯类的脂质(摩尔比0-30％)，1种或以上选自神经节苷脂类、糖脂类、磷脂酰甘油类和鞘磷脂类的脂质(摩尔比0-40％)，以及胆固醇类(摩尔比0-70％)。
3.权利要求2的糖链修饰的脂质体，其中，至少1种选自神经节苷脂类、糖脂类、磷脂酰甘油类、鞘磷脂类和胆固醇类的脂质在脂质体表面上集合，形成脂筏。
4.权利要求1-3中任一项的糖链修饰的脂质体，其结合了种类和密度受到控制的糖链。
5.权利要求1-4中任一项的糖链修饰的脂质体，其中，脂质体的粒径为30-500nm。
6.权利要求5的糖链修饰的脂质体，其中，脂质体的粒径为50-350nm。
7.权利要求1-6中任一项的糖链修饰的脂质体，其中，脂质体的ζ电位为-50至10mV。
8.权利要求7的糖链修饰的脂质体，其中，脂质体的ζ电位为-40至0mV。
9.权利要求8的糖链修饰的脂质体，其中，脂质体的ζ电位为-30至-10mV。
10.权利要求1-9中任一项的糖链修饰的脂质体，其中，糖链经由接头蛋白与脂质体膜结合。
11.权利要求10的糖链修饰的脂质体，其中，接头蛋白是来自生物体的蛋白质。
12.权利要求11的糖链修饰的脂质体，其中，接头蛋白是来自人的蛋白质。
13.权利要求12的糖链修饰的脂质体，其中，接头蛋白是来自人的血清蛋白。
14.权利要求11的糖链修饰的脂质体，其中，接头蛋白是人血清白蛋白或牛血清白蛋白。
15.权利要求1-14中任一项的糖链修饰的脂质体，其中，接头蛋白与在脂质体表面上形成的含有至少1种选自神经节苷脂类、糖脂类、磷脂酰甘油类、鞘磷脂类和胆固醇类的脂质的脂筏结合。
16.权利要求1-15中任一项的糖链修饰的脂质体，其中，亲水性化合物与脂质体膜和/或接头蛋白结合，从而使脂质体形成亲水性。
17.权利要求16的糖链修饰的脂质体，其中，亲水性化合物是低分子物质。
18.权利要求16或17的糖链修饰的脂质体，其中，亲水性化合物不易对糖链形成位阻，不会妨碍靶细胞膜面上的凝集素对糖链分子的识别反应的进行。
19.权利要求16-18中任一项的糖链修饰的脂质体，其中，亲水性化合物具有羟基。
20.权利要求16-19中任一项的糖链修饰的脂质体，其中，亲水性化合物为氨基醇类。
21.权利要求16-20中任一项的糖链修饰的脂质体，其中，亲水性化合物与脂质体膜表面直接结合。
22.权利要求16的糖链修饰的脂质体，该脂质体通过亲水性化合物而形成亲水性，该亲水性化合物如通式(1)所示，
X-R1(R2OH)n 式(1)
其中R1表示C1-C40的直链或支链烃链，R2不存在或表示C1-C40的直链或支链烃链，X表示与脂质体脂质或接头蛋白直接结合、或者与交联用二价试剂结合的反应性官能团，n表示自然数。
23.权利要求16的糖链修饰的脂质体，该脂质体通过亲水性化合物而形成亲水性，该亲水性化合物如通式(2)所示，
H2N-R3(R4OH)n 式(2)
其中R3表示C1-C40的直链或支链烃链，R4不存在或表示C1-C40的直链或支链烃链，H2N表示与脂质体脂质或接头蛋白直接结合、或者与交联用二价试剂结合的反应性官能团，n表示自然数。
24.权利要求16的糖链修饰的脂质体，该脂质体通过亲水性化合物而形成亲水性，该亲水性化合物如通式(3)所示，
H2N-R5(OH)n 式(3)
其中R5表示C1-C40的直链或支链烃链，H2N表示与脂质体脂质或接头蛋白直接结合、或者与交联用二价试剂结合的反应性官能团，n表示自然数。
25.权利要求16的糖链修饰的脂质体，其中使亲水性化合物三(羟基烷基)氨基链烷与脂质体膜和/或接头蛋白通过共价键结合，由此，脂质体膜和/或接头蛋白形成亲水性。
26.权利要求25的糖链修饰的脂质体，其中使选自三(羟基甲基)氨基乙烷、三(羟基乙基)氨基乙烷、三(羟基丙基)氨基乙烷、三(羟基甲基)氨基甲烷、三(羟基乙基)氨基甲烷、三(羟基丙基)氨基甲烷、三(羟基甲基)氨基丙烷、三(羟基乙基)氨基丙烷、三(羟基丙基)氨基丙烷的亲水性化合物与脂质体膜和/或接头蛋白通过共价键结合，由此，脂质体膜和/或接头蛋白形成亲水性。
27.权利要求1-26中任一项的糖链修饰的脂质体，该糖链修饰的脂质体以存在于各组织的细胞膜面上的受体——凝集素为靶，所述凝集素选自含有选择蛋白、DC-SIGN、DC-SGNR、胶原凝集素和结合有甘露糖的凝集素的C型凝集素，含有Siglec的I型凝集素，含有甘露糖-6-磷酸受体的P型凝集素，R型凝集素，L型凝集素，M型凝集素，半乳凝集素。
28.权利要求27的糖链修饰的脂质体，该糖链修饰的脂质体以选自E-选择蛋白、P-选择蛋白和L-选择蛋白的选择蛋白为靶。
29.权利要求1-28中任一项的糖链修饰的脂质体，其中，与脂质体结合的糖链的结合密度为：使用接头蛋白时，每个脂质体颗粒上有1-30000个；不使用接头蛋白时，每个脂质体颗粒上最多有1-500000个。
30.权利要求1-28中任一项的糖链修饰的脂质体，其中，与脂质体结合的糖链的结合密度为：每个与脂质体结合的蛋白质分子上有1-60个。
31.权利要求1-30中任一项的糖链修饰的脂质体，其中，脂质体具有肠道吸收功能。
32.权利要求1-31中任一项的糖链修饰的脂质体，其中，对选自血液中、肝脏、脾脏、肺、脑、小肠、心脏、胸腺、肾脏、胰脏、肌肉、大肠、骨、骨髓、眼、癌组织、炎症组织和淋巴结的组织或器官的靶向性高。
33.权利要求1-32中任一项的糖链修饰的脂质体，其中，糖链与脂质体膜结合，糖链选自α-1，2-甘露二糖二糖链、α-1，3-甘露二糖二糖链、α-1，4-甘露二糖二糖链、α-1，6-甘露二糖二糖链、α-1，3-α-1，6-甘露三糖三糖链、低聚甘露糖-3五糖链、低聚甘露糖-4b六糖链、低聚甘露糖-5七糖链、低聚甘露糖-6八糖链、低聚甘露糖-7九糖链、低聚甘露糖-8十糖链、低聚甘露糖-9十一糖链、3’-唾液酸基乳糖三糖链和6’-唾液酸基乳糖三糖链、3’-唾液酸基乳糖胺三糖链、6’-唾液酸基乳糖胺三糖链、路易斯X型三糖链、唾液酸基路易斯X型四糖链、乳糖二糖链、2’-岩藻糖基乳糖三糖链、二岩藻糖基乳糖四糖链和3-岩藻糖基乳糖三糖链。
34.脂质体制剂，该制剂是在权利要求1-33中任一项的脂质体中包封药物或基因而得。
35.权利要求34的脂质体制剂，其中，药物选自烷基化类抗癌药、代谢拮抗剂、来自植物的抗癌药、抗癌性抗生素、BRM·细胞因子类、铂络合物系抗癌药、免疫疗法药物、激素类抗癌药、单克隆抗体等肿瘤用药物，中枢神经用药物，末梢神经系·感觉器官用药物，呼吸器官疾病治疗药物，循环器官用药物，消化器官用药物，激素系统用药物，泌尿器官·生殖器官用药物，外用药，维生素·滋补强壮药，血液·体液用药物，代谢性药物，抗生素·化疗药、检查用药物，抗炎药，眼病药物，中枢神经类药物，自身免疫类药物，循环器官类药、糖尿病、高质血症等生活习惯病药物，或者口服、经肺、经皮或经粘膜的各种药物，肾上腺皮质激素，免疫抑制剂，抗炎药，抗菌药，抗病毒药，血管新生抑制剂，细胞因子或趋化因子，抗细胞因子抗体或抗趋化因子抗体，抗细胞因子·趋化因子受体抗体，siRNA、miRNA、smRNA、反义ODN或DNA等基因治疗相关的核酸制剂，神经保护因子，抗体药物等。
36.权利要求34或35的脂质体制剂，该制剂是口服用制剂。
37.权利要求34或35的脂质体制剂，该制剂是胃肠道外给药用制剂。
38.权利要求35的脂质体制剂，其中糖链修饰的脂质体所含的药物是多柔比星。
39.抗癌药，该抗癌药含有权利要求35的脂质体制剂，其中药物是肿瘤用药物。
40.权利要求39的抗癌药，该抗癌药是口服用抗癌药。
41.权利要求39的抗癌药，该抗癌药是胃肠道外给药的抗癌药。
42.脂质体，其中脂质体膜形成亲水性，糖链与表面结合。
43.权利要求42的脂质体，其中脂质体的构成脂质包含磷脂酰胆碱类(摩尔比0-70％)、磷脂酰乙醇胺类(摩尔比0-30％)、1种或以上选自磷脂酸类、长链烷基磷酸酯类和磷酸双十六烷基酯类的脂质(摩尔比0-30％)，1种或以上选自神经节苷脂类、糖脂类、磷脂酰甘油类和鞘磷脂类的脂质(摩尔比0-40％)，以及胆固醇类(摩尔比0-70％)。
44.权利要求42或43的脂质体，该脂质体还含有蛋白质。
45.权利要求42-44中任一项的脂质体，其中该脂质体通过使亲水性化合物与脂质体膜结合而形成亲水性。
46.权利要求45的脂质体，其中亲水性化合物为低分子物质。
47.权利要求45或46的脂质体，亲水性化合物不易对糖链形成位阻，不会妨碍靶细胞膜面上的凝集素对糖链分子的识别反应的进行。
48.权利要求45-47中任一项的脂质体，其中，亲水性化合物具有羟基。
49.权利要求45-48中任一项的脂质体，其中，亲水性化合物为氨基醇类。
50.权利要求45-49中任一项的脂质体，其中，亲水性化合物与脂质体膜表面直接结合。
51.权利要求45的脂质体，其中低分子的亲水性化合物至少具有一个OH基。
52.权利要求45的脂质体，其中亲水性化合物如通式(1)所示，
X-R1(R2OH)n 式(1)
R1表示C1-C40的直链或支链烃链，R2不存在或表示C1-C40的直链或支链烃链，X表示与脂质体脂质或接头蛋白直接结合、或者与交联用二价试剂结合的反应性官能团，n表示自然数。
53.权利要求45的脂质体，其中亲水性化合物如通式(2)所示，
H2N-R3(R4OH)n 式(2)
R3表示C1-C40的直链或支链烃链，R4不存在或表示C1-C40的直链或支链烃链，H2N表示与脂质体脂质或接头蛋白直接结合、或者与交联用二价试剂结合的反应性官能团，n表示自然数。
54.权利要求45的脂质体，其中亲水性化合物如通式(3)所示，
H2N-R5(OH)n 式(3)
R5表示C1-C40的直链或支链烃链，H2N表示与脂质体脂质或接头蛋白直接结合、或者与交联用二价试剂结合的反应性官能团，n表示自然数。
55.权利要求45的脂质体，其中使亲水性化合物三(羟基烷基)氨基链烷与脂质体膜和/或接头蛋白通过共价键结合，由此，脂质体膜和/或接头蛋白形成亲水性。
56.权利要求55的脂质体，其中，使选自三(羟基甲基)氨基乙烷、三(羟基乙基)氨基乙烷、三(羟基丙基)氨基乙烷、三(羟基甲基)氨基甲烷、三(羟基乙基)氨基甲烷、三(羟基丙基)氨基甲烷、三(羟基甲基)氨基丙烷、三(羟基乙基)氨基丙烷、三(羟基丙基)氨基丙烷的亲水性化合物与脂质体膜通过共价键结合，由此，脂质体膜形成亲水性。
57.脂质体制剂，该脂质体制剂是在权利要求42-56中任一项的脂质体中包封药物或基因而得。
58.权利要求57的脂质体制剂，其中，药物选自烷基化类抗癌药、代谢拮抗剂、来自植物的抗癌药、抗癌性抗生素、BRM·细胞因子类、铂络合物系抗癌药、免疫疗法药物、激素类抗癌药、单克隆抗体等肿瘤用药物，中枢神经用药物，末梢神经系·感觉器官用药物，呼吸器官疾病治疗药，循环器官用药物，消化器官用药物，激素系统用药物，泌尿器官·生殖器官用药物，外用药，维生素·滋补强壮药，血液·体液用药物，代谢性药物，抗生素·化疗药、检查用药物，抗炎药，眼病药物，中枢神经类药物，自身免疫类药物，循环器官类药、糖尿病、高质血症等生活习惯病药物，或者口服、经肺、经皮或经粘膜的各种药物，肾上腺皮质激素，免疫抑制剂，抗炎药，抗菌药，抗病毒药，血管新生抑制剂，细胞因子或趋化因子，抗细胞因子抗体或抗趋化因子抗体，抗细胞因子·趋化因子受体抗体，siRNA、miRNA、smRNA、反义ODN或DNA等基因治疗相关的核酸制剂，神经保护因子，抗体药物等。
59.权利要求57或58的脂质体制剂，该制剂是口服用制剂。
60.权利要求57或58的脂质体制剂，该制剂是胃肠道外给药用制剂。
61.抗癌药，该抗癌药含有权利要求58的脂质体制剂，其中药物是肿瘤用药物。
62.权利要求61的脂质体制剂，其中糖链修饰的脂质体所含的药物是多柔比星。
63.权利要求61或62的抗癌药，该抗癌药是口服用抗癌药。
64.权利要求61或62的抗癌药，该抗癌药是胃肠道给予用抗癌药。
65.化妆品组合物，该组合物含有脂质体制剂，该脂质体制剂是在权利要求1-33中任一项的糖链修饰的脂质体中包封了化妆品。
66.权利要求65的化妆品组合物，该组合物是经皮给予制剂。
67.权利要求65或66的化妆品组合物，其中化妆品是维生素A或维生素E。
68.食品组合物，该组合物含有脂质体制剂，该脂质体制剂是在权利要求1-33中任一项的糖链修饰的脂质体中包封了食品。
69.权利要求68的食品组合物，该组合物是口服制剂。
70.权利要求68或69的食品组合物，其中食品是补养品。
71.权利要求69或70的食品组合物，其中食品是维生素A或维生素E。
72.化妆品组合物，该组合物含有脂质体制剂，该脂质体制剂是在权利要求42-56中任一项的脂质体中包封了化妆品。
73.权利要求72的化妆品组合物，该组合物是经皮给予制剂。
74.权利要求72或73的化妆品组合物，其中化妆品是维生素A或维生素E。
75.食品组合物，该组合物含有脂质体制剂，该脂质体制剂是在权利要求42-56中任一项的脂质体中包封了食品。
76.权利要求75的食品组合物，该组合物是口服制剂。
77.权利要求75或76的食品组合物，其中食品是补养品。
78.权利要求76或77的食品组合物，其中食品是维生素A或维生素E。
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