CN1863507A - 含有靶向性脂质体的炎症性疾病治疗药或诊断药 - Google Patents
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Abstract
本发明提供靶向性DDS纳米颗粒，该颗粒可以聚集于炎症性疾病部位等靶组织，可用作用于将药物或基因局部送入患处的治疗或诊断用药物递送系统(DDS)。本发明还提供炎症性疾病治疗或诊断用药物组合物，该组合物含有脂质体膜结合有糖链的糖链修饰的脂质体。
Description
技术领域
本发明涉及炎症性疾病的药物递送系统。
背景技术
美国的国家纳米技术战略(NNI)中力求实现的具体目标之一就是“攻击癌细胞或靶组织的药物或基因递送系统(DDS：药物递送系统)”。日本的综合科学技术委员会的纳米技术·材料领域推进战略中，重点领域有“医疗用超微系统·材料、利用、控制生物的机理控制的纳米生物”，其5年内的研究开发目标之一是“用于延长健康寿命的机体功能材料·定点治疗等技术的基点的建立”。另一方面，随着进入老龄化社会，癌症的患病率、死亡率逐年增加，人们期望开发出新型的治疗材料——靶向DDS。没有副作用的靶向DDS纳米材料的重要性在其它疾病中也引人注目，预测在不远的将来，其市场规模会超过10兆日元。这些材料于治疗的同时也有望应用于诊断中。
药物的疗效是药物到达特定的靶部位，通过在该处作用来表达。而另一方面，药物的副作用是由于药物作用在了不必要的部位。因此，为了有效且安全地使用药物，需要进行药物递送系统的开发。其中，特别是靶向(打靶)DDS，其概念是将药物以“必要的量”，只在“必要的时间”送入“体内必要的部位”。作为其代表性的材料，微粒子性载体——脂质体受到人们的注意。为使该颗粒也具有靶向功能，人们尝试了使脂质体的脂质种类、组成比、粒径、表面电荷改变等的被动打靶方法，但该方法远不足够，需要进一步改良。
另一方面，为了可实现高性能的打靶，也尝试了主动打靶法。这也被称为“导弹药物”，是理想的打靶方法，但目前国内外还没有成熟的产品，今后有望得到较大发展。该方法是将配体结合到脂质体膜面，通过特异性识别存在于靶组织的细胞膜面上的受体，使其可以主动地打靶的方法。该主动性打靶方法中，存在于靶细胞膜面上的受体的配体可能是抗原、抗体、肽、糖脂或糖蛋白等。其中，已逐步了解到糖脂或糖蛋白的糖链在机体组织的发生或形态形成、细胞的增殖或分化、机体防御或受精机理、癌变及其转移机制等各种细胞间的联系中，作为信息分子发挥着的重要的作用。
对于存在于靶各组织的细胞膜面上的受体，如选择蛋白、DC-SIGN、DC-SGNR、胶原凝集素、甘露糖结合凝集素等C型凝集素，Siglec等I型凝集素，甘露糖-6-磷酸受体等P型凝集素，R型凝集素，L型凝集素，M型凝集素，半乳凝集素等各种凝集素(糖链识别蛋白)的研究也取得了进展，具有各种分子结构的糖链作为新型DDS配体引起人们的注意(1)Yamazaki，N.，Kojima，S.，Bovin，N.V.，Andre，S.，Gabius，S.and Gabius，H.-J.(2000)Adv.Drug Delivery Rev.43，225-244.、2)Yamazaki，N.，Jigami，Y.，Gabius，H.-J.，Kojima，S(2001)Trends in Glycoscience and Glycotechnology 13，319-329.http：//www.gak.co.jp/TIGG/71PDF/yamazaki.pdf)。
对于外膜表面结合有配体的脂质体，其作为向癌等靶部位选择性递送药物或基因等的DDS材料，已有很多研究结果。但是，它们都是在体外与靶细胞结合，在体内则几乎无法对所期望的靶细胞或组织进行打靶(1)Forssen，E.and Willis，M.(1998)Adv.Drug Delivery Rev.29，249-271、2)Takahashi，T.和M.Hashida编(1999)、Today’s DDS DrugDelivery System、159-167页、Iyaku Journal Co.Ltd.、大阪)。已知在利用糖链分子识别机能的DDS材料的研究开发中，对导入有具糖链的糖脂的脂质体也有一些研究结果.这些功能评价只是通过体外进行的，对于导入有具糖链的糖蛋白的脂质体的研究几乎没有进展(1)DeFrees，S.A.，Phillips，L.，Guo，L.and Zalipsky，S.(1996)J.Am.Chem.Soc.118，6101-6104.、2)Spevak，W.，Foxall，C.，Charych，D.H.，Dasqupta，F.and Nagy，J.O.(1996)J.Med.Chem.39，1018-1020.、3)Stahn，R.，Schafer，H.，Kernchen，F. and Schreiber，J.(1998)Glycobiology 8，311-319.、4)Yamazaki，N.，Jigami，Y.，Gabius，H.-J.，Kojima，S(2001)Trends in Glycoscience and Glycotechnology 13，319-329.http：//www.gak.co.jp/TIGG/71PDF/yamazaki.pdf)。因此，对于包括结合有糖脂或糖蛋白等各种各样糖链的脂质体的制备方法以及体内动态分析的系统性研究是目前尚未开发，期望今后获得进展的重要课题。
并且，新型DDS材料的研究中，可在最简便、成本低的口服给药中使用的DDS材料的开发也是重要的课题。例如，肽类和蛋白质类药物等通常为水溶性、高分子量，消化管的小肠粘膜透过性低，因此即使经过酶解等后再口服给药，也几乎不能被肠道吸收。因此，对将这些高分子量的药物或基因等由肠道输送到血液中的DDS材料，即结合有配体的脂质体的研究受到人们的瞩目(Lehr，C.-M.(2000)J.Controlled Release 65，19-29)。但是，对于使用糖链作为其配体的肠道吸收性脂质体的研究尚未见报告。
本发明人已经对一种糖链修饰的脂质体申请了专利，其特征在于：糖链经由接头蛋白与脂质体膜结合，糖链选自路易斯X型三糖链、唾液酸基路易斯X型四糖链、3’-唾液酸基乳糖胺三糖链、6’-唾液酸基乳糖胺三糖链，三(羟基甲基)氨基甲烷等低分子亲水化合物与脂质体膜和/或接头蛋白任意结合，形成亲水性；还对一种肠道吸收控制性脂质体申请了专利，该脂质体是糖链修饰的脂体，其中糖链选自乳糖2糖链、2’-岩藻糖基乳糖三糖链、二岩藻糖基乳糖四糖链和3-岩藻糖基乳糖三糖链，糖链可经由接头蛋白与脂质体结合。
但是，使炎症性疾病的治疗或诊断用药物进行靶向性给药的药物递送系统还没有开发。
炎症性疾病中，类风湿性关节炎(RA)是伴随有以关节炎为中心的各种早期症状的自身免疫疾病，在日本，其患者数量据称有70万人左右。该患者数量在自身免疫疾病中是最多的，可以说RA的治疗改善会带来社会性的贡献。
有人认为RA的发病与遗传性因素(特定的HLA等)或环境因素(病毒感染等)有关，但详细的发病机理尚不明确。不过，已可确认在炎症部分有存在于关节滑膜中的巨噬细胞和CD4+、CD8+、T细胞的存在，已知该T细胞识别存在于滑膜中的抗原(T.Toyosaki等人1998Arthritis Rheum 41，92-100，、P.L.van Lent等人1996 Arthritis Rheum39，1545-1555)。IL-1、肿瘤坏死因子-α(以下称为TNF-α)以及IL-6等所谓的炎症性细胞因子与起因于这些炎症的细胞显示很深的关系(S.Saijo等人.2002 Arthritis Rheum.46，533-544、D.Kontoyiannis等人.1999 Immunity 10，387-398、T.Ohtani等人.2000 Immunity 12，95-105)。
近年来，根据上述新的认识，RA的治疗开始有了很大改变，最大的进步是开发了生物学制剂。即，出现了针对TNF-α的各种抗体治疗药。这些抗体治疗药对关节炎具有高的疗效，也有抑制关节组织的破坏的效果等，是与以往的治疗药截然不同的新药。但是，关于这些新药也有包括引发以感染病在内的严重的伤害事件的报告。其副作用的原因之一起因于：为了控制关节这样的局部炎症而非特异性地对全身给予了大量的抗TNF-α抗体。
包括以往使用的药物以及创新性的新药，对于具有副作用的治疗药，理想的是特异性地分配至病灶部位，只在病灶部位发挥有效性。这样的系统可以减少药物的副作用，且可进一步提高药效，可认为这与目前作为最新型药物制剂而引人注目的生物制剂或分子靶向药物的开发同样重要。
发明内容
本发明提供靶向性DDS纳米颗粒，该靶向性DDS纳米颗粒可用作聚集在炎症性疾病部位等的靶组织、将药物或基因局部地递送至患处的治疗或诊断用药物递送系统(DDS)。具体来说，本发明提供药物递送用靶向性脂质体，该脂质体表面结合有糖链，该糖链可以与在炎症部位的血管内皮细胞中表达的E-选择蛋白、P-选择蛋白等结合。
本发明人首先开发了表面上结合有特定的糖链的DDS用靶向性脂质体。唾液酸基路易斯X糖链(sLeX)与该靶向性脂质体结合，其在向肿瘤部位、炎症部位的转移性上具有高的效率。
本发明人对于该靶向性脂质体在炎症性疾病领域的应用进行了深入地研究，制作了眼炎模型小鼠作为炎症性疾病小鼠，发现上述靶指向性脂质体被指向性地摄入眼部的炎症部位，从而完成了本发明。
这次开发的药物递送系统(以下称为DDS)可以制成向炎症部位特异性聚集、高效且副作用少的治疗系统。类固醇药是最通常的抗炎药物，实施例中用到该药，但治疗药并不限于此，可以用于分配免疫抑制剂、细胞因子、抗细胞因子剂、含有DNA和RNA的核酸等。
即，本发明如下所示。
1.炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，该药用组合物含有脂质体膜结合有糖链的糖链修饰的脂质体。
2.上述1的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，脂质体的构成脂质包含磷脂酰胆碱类(摩尔比0-70％)、磷脂酰乙醇胺类(摩尔比0-30％)、1种或以上选自磷脂酸类、长链烷基磷酸盐类和磷酸双十六烷基酯类的脂质(摩尔比0-30％)，1种或以上选自神经节苷脂类、糖脂类、磷脂酰甘油类和鞘磷脂类的脂质(摩尔比0-40％)，以及胆固醇类(摩尔比0-70％)。
3.上述2的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，至少1种选自神经节苷脂类、糖脂类、磷脂酰甘油类、鞘磷脂类和胆固醇类的脂质在脂质体表面上集合，形成脂筏。
4.上述1-3中任一项的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其结合了种类和密度受到控制的糖链。
5.上述1-4中任一项的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，脂质体的粒径为30-500nm。
6.上述5的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，脂质体的粒径为50-300nm。
7.上述1-6中任一项的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，脂质体的ζ电位为-50至10mV。
8.上述7的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，脂质体的ζ电位为-40至0mV。
9.上述8的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，脂质体的ζ电位为-30至-10mV。
10.上述1-9中任一项的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，糖链经由接头蛋白与脂质体膜结合。
11.上述10的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，接头蛋白是来自生物体的蛋白质。
12.上述11的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，接头蛋白是来自人的蛋白质。
13.上述12的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，接头蛋白是来自人的血清蛋白。
14.上述10的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，接头蛋白是人血清白蛋白或牛血清白蛋白。
15.上述1-14中任一项的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，接头蛋白与在脂质体表面上形成的含有至少1种选自神经节苷脂类、糖脂类、磷脂酰甘油类、鞘磷脂类和胆固醇类的脂质的脂筏结合。
16.上述1-15中任一项的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，亲水性化合物与脂质体膜和/或接头蛋白结合，从而脂质体形成亲水性。
17.上述16的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，亲水性化合物是低分子物质。
18.上述16或17的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，亲水性化合物不易对糖链形成位阻，不会妨碍靶细胞膜面上的凝集素对糖链分子的识别反应的进行。
19.上述16-18中任一项的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，亲水性化合物具有羟基。
20.上述16-19中任一项的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，亲水性化合物为氨基醇类。
21.上述16-20中任一项的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，亲水性化合物与脂质体膜表面直接结合。
22.炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，该药用组合物是上述16所记载的糖链修饰的脂质体，该脂质体通过亲水性化合物而形成亲水性，该亲水性化合物如通式(1)所示，
X-R1(R2OH)n 式(1)
其中R1表示C1-C40的直链或支链烃链，R2不存在或表示C1-C40的直链或支链烃链，X表示与脂质体脂质或接头蛋白直接结合、或者与交联用二价试剂结合的反应性官能团，n表示自然数。
23.炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，该药用组合物是上述16所记载的糖链修饰的脂质体，该脂质体通过亲水性化合物而形成亲水性，该亲水性化合物如通式(2)所示，
H2N-R3(R4OH)n 式(2)
其中R3表示C1-C40的直链或支链烃链，R4不存在或表示C1-C40的直链或支链烃链，H2N表示与脂质体脂质或接头蛋白直接结合、或者与交联用二价试剂结合的反应性官能团，n表示自然数。
24.炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，该药用组合物是上述16所记载的糖链修饰的脂质体，该脂质体通过亲水性化合物而形成亲水性，该亲水性化合物如通式(3)所示，
H2N-R5(OH)n 式(3)
其中R5表示C1-C40的直链或支链烃链，H2N表示与脂质体脂质或接头蛋白直接结合、或者与交联用二价试剂结合的反应性官能团，n表示自然数。
25.上述16的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中使亲水性化合物三(羟基烷基)氨基链烷与脂质体膜和/或接头蛋白通过共价键结合，由此，脂质体膜和/或接头蛋白形成亲水性。
26.上述16的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中使选自三(羟基甲基)氨基乙烷、三(羟基乙基)氨基乙烷、三(羟基丙基)氨基乙烷、三(羟基甲基)氨基甲烷、三(羟基乙基)氨基甲烷、三(羟基丙基)氨基甲烷、三(羟基甲基)氨基丙烷、三(羟基乙基)氨基丙烷、三(羟基丙基)氨基丙烷的亲水性化合物与脂质体膜和/或接头蛋白通过共价键结合，由此，脂质体膜和/或接头蛋白形成亲水性。
27.上述1-26中任一项的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，糖链修饰的脂质体以存在于各组织的细胞膜面上的受体——凝集素为靶，所述凝集素选自含有选择蛋白、DC-SIGN、DC-SGNR、胶原凝集素和甘露糖结合凝集素的C型凝集素，含有Siglec的I型凝集素，含有甘露糖-6-磷酸受体的P型凝集素，R型凝集素，L型凝集素，M型凝集素，半乳凝集素。
28.上述27的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，糖链修饰的脂质体以选自E-选择蛋白、P-选择蛋白和L-选择蛋白的选择蛋白为靶。
29.上述1-28中任一项的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，与脂质体结合的糖链的结合密度为：每个使其与脂质体结合的接头蛋白分子上有1-60个。
30.上述1-28中任一项的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，与脂质体结合的糖链的结合密度为：使用接头蛋白时，每个脂质体颗粒上有1-30000个；不使用接头蛋白时，每个脂质体颗粒上最多有1-500000个。
31.上述1-30中任一项的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，糖链选自路易斯X型三糖链、唾液酸基路易斯X型四糖链、3’-唾液酸基乳糖胺三糖链、6’-唾液酸基乳糖胺三糖链、α-1，2-甘露二糖二糖链、α-1，3-甘露二糖二糖链、α-1，4-甘露二糖二糖链、α-1，6-甘露二糖二糖链、α-1，3-α-1，6-甘露三糖三糖链、低聚甘露糖-3五糖链、低聚甘露糖-4b六糖链、低聚甘露糖-5七糖链、低聚甘露糖-6八糖链、低聚甘露糖-7九糖链、低聚甘露糖-8十糖链、低聚甘露糖-9十一糖链、乳糖二糖链、2’-岩藻糖基乳糖三糖链、二岩藻糖基乳糖四糖类、3-岩藻糖基乳糖三糖链、3’-唾液酸基乳糖三糖链和6’-唾液酸基乳糖三糖链。
32.上述1-31中任一项的炎症性疾病治疗用药用组合物，其中，糖链修饰的脂质体所含的药物选自肾上腺皮质激素、抗炎药、免疫抑制剂、抗癌剂、抗菌药、抗病毒药、血管新生抑制剂、细胞因子或趋化因子、抗细胞因子抗体或抗趋化因子抗体、抗细胞因子·趋化因子受体抗体、siRNA或DNA等基因治疗相关的核酸制剂、神经保护因子以及抗体药物。
33.上述32的炎症性疾病治疗用药用组合物，其中，糖链修饰的脂质体所含的药物为肾上腺皮质激素或抗炎药。
34.上述33的炎症性疾病治疗用药用组合物，其中，糖链修饰的脂质体所含的药物为泼尼松龙。
35.上述32-34中任一项的炎症性疾病治疗用药用组合物，其中，与单独给予药物的情况相比，药物可在炎症部位聚集10倍或以上。
36.上述1-35中任一项的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，炎症性疾病选自脑炎，炎症性眼病，耳炎，咽炎，肺炎，胃炎，肠炎，肝炎，胰腺炎，肾炎，膀胱炎，尿道炎，子宫体炎，盆腔炎，关节炎，末梢神经炎，恶性肿瘤，感染性疾病，风湿病、全身性红斑狼疮、结节病(类肉瘤病)等自身免疫疾病，心肌梗塞、脑梗塞等缺血性疾病，糖尿病、通风等代谢性疾病，外伤、热灼伤、化学腐蚀，阿尔茨海默病等神经变性疾病。
37.上述36的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中炎症性疾病为炎症性眼病。
38.上述36的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中炎症性疾病为风湿病。
39.上述36的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中炎症性疾病为肠炎。
40.上述1-39中任一项的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，该组合物为口服药用组合物。
41.上述1-39中任一项的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，该组合物为胃肠道外给药的药用组合物。
42.炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中脂质体膜形成亲水性，糖链与其表面结合。
43.上述42的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中脂质体的构成脂质包含磷脂酰胆碱类(摩尔比0-70％)、磷脂酰乙醇胺类(摩尔比0-30％)、1种或以上选自磷脂酸类、长链烷基磷酸盐类和磷酸双十六烷基酯类的脂质(摩尔比0-30％)，1种或以上选自神经节苷脂类、糖脂类、磷脂酰甘油类和鞘磷脂类的脂质(摩尔比0-40％)，以及胆固醇类(摩尔比0-70％)。
44.上述43的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中脂质体还含有蛋白质。
45.上述42-44中任一项的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，该组合物通过使亲水性化合物与脂质体膜和/或接头蛋白结合而形成亲水性。
46.上述45的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中亲水性化合物为低分子物质。
47.上述45或46中任一项的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中亲水性化合物具有羟基。
48.上述45-47中任一项的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中亲水性化合物为氨基醇类。
49.上述45-48中任一项的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中亲水性化合物与脂质体膜表面直接结合。
50.上述45的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，该组合物通过亲水性化合物形成亲水性，该亲水性化合物如通式(1)所示，
X-R1(R2OH)n 式(1)
其中R1表示C1-C40的直链或支链烃链，R2不存在或表示C1-C40的直链或支链烃链，X表示与脂质体脂质或接头蛋白直接结合、或者与交联用二价试剂结合的反应性官能团，n表示自然数。
51.上述45的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，该组合物通过亲水性化合物形成亲水性，该亲水性化合物如通式(2)所示，
H2N-R3(R4OH)n 式(2)
其中R3表示C1-C40的直链或支链烃链，R4存在或表示C1-C40的直链或支链烃链，H2N表示与脂质体脂质或接头蛋白直接结合、或者与交联用二价试剂结合的反应性官能团，n表示自然数。
52.上述45的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，该组合物通过亲水性化合物形成亲水性，该亲水性化合物如通式(3)所示，
H2N-R5(OH)n 式(3)
其中R5表示C1-C40的直链或支链烃链，H2N表示与脂质体脂质或接头蛋白直接结合、或者与交联用二价试剂结合的反应性官能团，n表示自然数。
53.上述45的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中使亲水性化合物三(羟基烷基)氨基链烷与脂质体膜和/或接头蛋白通过共价键结合，由此，脂质体膜和/或接头蛋白形成亲水性。
54.上述53的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，使选自三(羟基甲基)氨基乙烷、三(羟基乙基)氨基乙烷、三(羟基丙基)氨基乙烷、三(羟基甲基)氨基甲烷、三(羟基乙基)氨基甲烷、三(羟基丙基)氨基甲烷、三(羟基甲基)氨基丙烷、三(羟基乙基)氨基丙烷、三(羟基丙基)氨基丙烷的亲水性化合物与脂质体膜和/或接头蛋白通过共价键结合，由此，脂质体膜和/或接头蛋白形成亲水性。
55.上述42-54中任一项的炎症性疾病治疗用药用组合物，其中，脂质体所含的药物选自肾上腺皮质激素、抗炎药、免疫抑制剂、抗癌剂、抗菌药、抗病毒药、血管新生抑制剂、细胞因子或趋化因子、抗细胞因子抗体或抗趋化因子抗体、抗细胞因子·趋化因子受体抗体、siRNA或DNA等基因治疗相关的核酸制剂、神经保护因子以及抗体药物。
56.上述55的炎症性疾病治疗用药用组合物，其中，脂质体所含的药物为肾上腺皮质激素或抗炎药。
57.上述56的炎症性疾病治疗用药用组合物，其中，脂质体所含的药物为泼尼松龙。
58.上述55-57中任一项的炎症性疾病治疗用药用组合物，其中，与单独给予药物的情况相比，药物可在炎症部位聚集10倍或以上。
59.上述42-58中任一项的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，炎症性疾病选自脑炎，炎症性眼病，耳炎，咽炎，肺炎，胃炎，肠炎，肝炎，胰腺炎，膀胱炎，尿道炎，子宫体炎，盆腔炎，关节炎，末梢神经炎，恶性肿瘤，感染性疾病，风湿病、全身性红斑狼疮、结节病(类肉瘤病)等自身免疫疾病，心肌梗塞、脑梗塞等缺血性疾病，糖尿病、通风等代谢性疾病，外伤、热灼伤、化学腐蚀，阿尔茨海默病等神变性疾病。
60.上述59的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中炎症性疾病为炎症性眼病。
61.上述59的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中炎症性疾病为风湿病。
62.上述59的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中炎症性疾病为肠炎。
63.上述42-62中任一项的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，该组合物为口服药用组合物。
64.上述42-62中任一项的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，该组合物为胃肠道外给予药用组合物。
本说明书包含本申请的优先权基础——日本国专利申请号2003-285422、2003-369494号说明书和/或附图的内容。
附图简述
图1是表示结合有路易斯X型三糖链的脂质体的结构例的模式图。
图2是表示结合有唾液酸基路易斯X型四糖链的脂质体的结构例的模式图。
图3是表示结合有3’-唾液酸基乳糖胺三糖链的脂质体的结构例的模式图。
图4是表示结合有6’-唾液酸基乳糖胺三糖链的脂质体的结构例的模式图。
图5是表示结合有α-1，2-甘露二糖二糖链的脂质体的结构例的模式图。
图6是表示结合有α-1，3-甘露二糖二糖链的脂质体的结构例的模式图。
图7是表示结合有α-1，4-甘露二糖二糖链的脂质体的结构例的模式图。
图8是表示结合有α-1，6-甘露二糖二糖链的脂质体的结构例的模式图。
图9是表示结合有α-1，3-α-1，6-甘露三糖三糖链的脂质体的结构例的模式图。
图10是表示结合有低聚甘露糖-3五糖链的脂质体的结构例的模式图。
图11是表示结合有低聚甘露糖-4b六糖链的脂质体的结构例的模式图。
图12是表示结合有低聚甘露糖-5七糖链的脂质体的结构例的模式图。
图13是表示结合有低聚甘露糖-6八糖链的脂质体的结构例的模式图。
图14是表示结合有低聚甘露糖-7九糖链的脂质体的结构例的模式图。
图15是表示结合有低聚甘露糖-8十糖链的脂质体的结构例的模式图。
图16是表示结合有低聚甘露糖-9十一糖链的脂质体的结构例的模式图。
图17是表示经乳糖二糖链修饰的脂质体的结构例的模式图。
图18是表示经2’-岩藻糖基乳糖三糖链修饰的脂质体的结构例的模式图。
图19是表示经二岩藻糖基乳糖四糖链修饰的脂质体的结构例的模式图。
图20是表示经3-岩藻糖基乳糖三糖链修饰的脂质体的结构例的模式图。
图21是表示结合有3’-唾液酸基乳糖三糖链的脂质体的结构例的模式图。
图22是表示结合有6’-唾液酸基乳糖三糖链的脂质体的结构例的模式图。
图23是表示作为比较样品的、结合有三(羟基甲基)氨基甲烷的脂质体的模式图。
图24是表示试验性葡萄膜炎发病的照片。
图25A是表示脂质体在各器官中分布的图。
图25B是表示脂质体在各器官中分布的图，是以与正常小鼠的相对值％表示的图。
图26是表示脂质体分布随时间变化的照片。
图27是表示正常小鼠与EAU小鼠中脂质体分布的照片。
图28是表示通过荧光抗体法检测的结果的照片。
图29是表示通过酶标记抗体法检测的结果的照片。
图30是表示结合抑制实验的结果的照片。
图31是发生炎症的RA小鼠的四肢的照片。
图32是表示对RA小鼠静脉给予包封泼尼松龙的DDS进行治疗的结果的图。
图33是表示对RA小鼠口服给予包封泼尼松龙的DDS进行治疗的结果的图。
图34是表示对RA小鼠给予适量的泼尼松龙进行治疗的结果的图。
图35是表示对癌症小鼠尾静脉注射给予进行了2种亲水性处理的脂质体和未经处理的脂质体，5分钟后血液中滞留性的比较结果的图。
实施发明的最佳方式
本发明是对炎症性疾病的病灶部位具有靶向性、被特异性摄入病灶部位、在病灶部位释放被包封的药物、治疗病灶的靶向性脂质体。
已知炎症时，在血管内皮细胞表达的E-选择蛋白、P-选择蛋白与在白细胞的细胞膜上表达的糖链——唾液酸基路易斯X糖链强烈结合。可以认为：本发明的脂质体是与唾液酸基路易斯X糖链或与其类似地可与E-选择蛋白、P-选择蛋白等反应的糖链，在糖链种类和密度受到控制情况下相结合的脂质体，特异性地聚集在血管内皮细胞中表达E-选择蛋白、P-选择蛋白等的病灶部位。表达E-选择蛋白、P-选择蛋白等的部位是发生炎症或血管新生的部位，所述部位的血管中，内皮细胞的细胞间隙扩大，聚集的脂质体由该间隙向病灶部位及其周围扩散。扩散的脂质体被摄入到病灶部位及其周围的各种细胞中(吞噬)，包封的药物在细胞内释放。通过上述机理对炎症性疾病发挥效果。
如上所述，与本发明的脂质体结合的糖链有可与E-选择蛋白、P-选择蛋白等反应的糖链。这里，E-选择蛋白、P-选择蛋白等是指选择蛋白、DC-SIGN、DC-SGNR、胶原凝集素、甘露糖结合凝集素等C型凝集素，Siglec等I型凝集素，甘露糖-6-磷酸受体等P型凝集素，R型凝集素，L型凝集素，M型凝集素，半乳凝集素等各种凝集素(糖链识别蛋白)。所述糖链没有限定，例如有路易斯X型三糖链(结构式如图1所示。以下相同)、唾液酸基路易斯X型四糖链(图2)、3’-唾液酸基乳糖胺三糖链(图3)、6’-唾液酸基乳糖胺三糖链(图4)、α-1，2-甘露二糖二糖链(图5)、α-1，3-甘露二糖二糖链(图6)、α-1，4-甘露二糖二糖链(图7)、α-1，6-甘露二糖二糖链(图8)、α-1，3-α-1，6-甘露三糖三糖链(图9)、低聚甘露糖-3五糖链(图10)、低聚甘露糖-4b六糖链(图11)、低聚甘露糖-5七糖链(图12)、低聚甘露糖-6八糖链(图13)、低聚甘露糖-7九糖链(图14)、低聚甘露糖-8十糖链(图15)、低聚甘露糖-9十一糖链(图16)、乳糖二糖链(图17)、2’-岩藻糖基乳糖三糖链(图18)、二岩藻糖基乳糖四糖类(图19)、3-岩藻糖基乳糖三糖链(图20)、3’-唾液酸基乳糖三糖链(图21)和6’-唾液酸基乳糖三糖链(图22)。
(1)靶向性脂质体的制备
脂质体通常是指由集合成膜状的脂质层和内部的水层构成的封闭泡囊。如图1-22所示，本发明的脂质体其表面、即脂质层上结合有糖链。糖链可以与脂质体的脂质层直接结合，也可以经由人血清白蛋白等的接头蛋白共价键合。
构成本发明的脂质体的脂质例如有：磷脂酰胆碱类、磷脂酰乙醇胺类、磷脂酸类或长链烷基磷酸盐类、神经节苷脂类、糖脂类或磷脂酰甘油类、胆固醇类等，磷脂酰胆碱类优选二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰胆碱等，磷脂酰乙醇胺类优选二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺等，磷脂酸类或长链烷基磷酸盐类优选二肉豆蔻酰基磷脂酸、二棕榈酰基磷脂酸、二硬脂酰基磷脂酸、磷酸双十六烷基酯等，神经节苷脂类优选神经节苷脂GM1、神经节苷脂GD1a、神经节苷脂GT1b等，糖脂类优选半乳糖基神经酰胺、葡糖基神经酰胺、乳糖基神经酰胺、磷脂、红细胞糖苷脂等，磷脂酰甘油类优选二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油、二棕榈酰基磷脂酰甘油、二硬脂酰基磷脂酰甘油等。其中，磷脂酸类或长链烷基磷酸盐类、神经节苷脂类或糖脂类、胆固醇类具有提高脂质体的稳定性的效果，因此优选作为构成脂质添加。
例如，构成本发明的脂质体的脂质有：含有磷脂酰胆碱类(摩尔比0-70％)、磷脂酰乙醇胺类(摩尔比0-30％)、磷脂酸类或长链烷基磷酸盐(摩尔比0-30％)、神经节苷脂类、糖脂类或磷脂酰甘油类(摩尔比0-30％)、以及胆固醇类(摩尔比0-70％)的脂质体。
脂质体本身可按照周知的方法制备，其中可以采用薄膜法、逆相蒸发法、乙醇注入法、脱水-再水合法等。
另外，使用超声波照射法、挤压法、French Press法、均相法等，也可以调节脂质体的粒径。关于本发明的脂质体本身的制备方法，具体来说就是：例如首先制备以磷脂酰胆碱类、胆固醇类、磷脂酰乙醇胺类、磷脂酸类、神经节苷脂类、糖脂类或磷脂酰甘油类为配比成分的脂质与表面活性剂胆酸钠的混合胶束。
也就是说，作为亲水性反应部位，混合磷脂酰乙醇胺类是必须的，作为接头蛋白的结合部位，神经节苷脂类或糖脂类或磷脂酰甘油类是必须的。通过对由此得到的混合胶束进行超滤，可以制备脂质体。
本发明中使用的脂质体可以使用常规的脂质体，优选其表面形成亲水性。如上所述，制备脂质体后要使脂质体表面形成亲水性。脂质体表面的亲水性的形成通过使亲水性化合物与脂质体表面结合进行。亲水性形成中所使用的化合物为低分子亲水性化合物，优选至少具有1个OH基的低分子亲水性化合物，进一步优选至少具有2个OH基的低分子亲水性化合物。还进一步优选至少具有1个氨基的低分子亲水性化合物。也就是说，是分子中具有至少1个OH基和至少1个氨基的亲水性化合物。亲水性化合物是低分子的，因此不易对糖链形成位阻，不会妨碍靶细胞膜面上的凝集素对糖链分子的识别反应的进行。另外，亲水性化合物中不包括如本发明的糖链修饰的脂质体中用于指向凝集素等特定的靶的可以结合凝集素的糖链。所述亲水性化合物例如有：包括三(羟基甲基)氨基甲烷等的三(羟基烷基)氨基链烷等氨基醇类，更具体地有：三(羟基甲基)氨基乙烷、三(羟基乙基)氨基乙烷、三(羟基丙基)氨基乙烷、三(羟基甲基)氨基甲烷、三(羟基乙基)氨基甲烷、三(羟基丙基)氨基甲烷、三(羟基甲基)氨基丙烷、三(羟基乙基)氨基丙烷、三(羟基丙基)氨基丙烷等。具有OH基的低分子化合物中导入有氨基的化合物也可作为本发明的亲水性化合物使用。该化合物不受限定，例如有在纤维二糖等不与凝集素结合的糖链中导入氨基而成的化合物。例如，使用交联用的二价试剂和三(羟基甲基)氨基甲烷，在脂质体膜的脂质磷脂酰乙醇胺上，使脂质体膜表面形成亲水性。亲水性化合物的通式如下述式(1)、式(2)、式(3)等表示。
X-R1(R2OH)n 式(1)
H2N-R3(R4OH)n 式(2)
H2N-R5(OH)n 式(3)
这里，R1、R3和R5表示C1-C40、优选C1-C20、进一步优选C1-C10的直链或支链烃链，R2、R4不存在或表示C1-C40、优选C1-C20、进一步优选C1-C10的直链或支链烃链。X表示与脂质体脂质直接结合、或者与交联用二价试剂结合的反应性官能团，例如COOH、NH、NH2、CHO、SH、NHS-酯、马来酰亚胺、亚氨酸酯、活性卤素、EDC、二硫吡啶基、叠氮苯基、酰肼等。n表示自然数。
脂质体形成亲水性，这可通过采用以往公知的方法、例如使用通过共价键结合有聚乙二醇、聚乙烯醇、马来酸酐共聚物等的磷脂来制备脂质体的方法(日本特开2000-302685号)等方法进行。
其中特别优选使用三(羟基甲基)氨基甲烷使脂质体表面形成亲水性。
本发明的使用三(羟基甲基)氨基甲烷等低分子亲水性化合物的方法与使用聚乙二醇等的以往的亲水性形成方法相比因以下几个方面而优选。例如如本发明，在将糖链结合在脂质体上、利用其分子识别功能作为靶向性中，三(羟基甲基)氨基甲烷等低分子亲水化合物是低分子量物质，因此与以往的使用聚乙二醇等高分子量物质的方法相比，不易对糖链形成位阻，不妨碍靶细胞膜面上的凝集素(糖链识别蛋白)对糖链分子的识别反应的进行，因而特别优选。
另外，在该亲水性处理后，本发明的脂质体的粒径分布或成分组成、分散特性依然良好，长时间保存性、机体内稳定性也优异，因此优选用于脂质体的制剂化。
使用三(羟基甲基)氨基甲烷等低分子亲水性化合物使脂质体表面形成亲水性的过程可如下进行：例如使用二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺等脂质，通过常规方法得到脂质体，向该脂质体溶液中加入双磺基琥珀酰亚氨基辛二酸酯、二琥珀酰亚氨基戊二酸酯、二硫代双琥珀酰亚氨基丙酸酯、二琥珀酰亚氨基辛二酸酯、3，3’-二硫代双磺基琥珀酰亚氨基丙酸酯、双琥珀酰亚氨基琥珀酸乙二醇酯、双磺基琥珀酰亚氨基琥珀酸乙二醇酯等二价试剂，进行反应，由此使2价试剂与脂质体膜上的二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺等的脂质结合，然后使三(羟基甲基)氨基甲烷与该2价试剂的一个键合肢反应，这样，可以使三(羟基甲基)氨基甲烷与脂质体表面结合。
使亲水性化合物与脂质体表面结合时，每个脂质体颗粒可有1-500000个分子，优选1-50000个分子。
这样，对酯质体实施了亲水性处理后的脂质体在机体内极为稳定，如后所述，即使不结合具有靶向性的糖链，由于在体内的半衰期长，也可以优选用作药物递送系统中的药物载体。本发明也包含通过低分子化合物使表面形成亲水性的脂质体。
本发明还包含使用上述形成亲水性的化合物形成亲水性的、并不结合糖链的脂质体本身。这样的亲水性脂质体具有其脂质体本身的稳定性高，与糖链结合时对糖链的识别性高的优点。
本发明中，上述任何糖链都可与上述制备的脂质体直接结合，还可以经由接头蛋白结合糖链。此时，与脂质体结合的糖链的种类不限于一种，可以结合多种糖链。这种情况下，多种糖链可以是对共通存在于相同组织或器官的细胞表面上的不同的凝集素具有结合活性的多种糖链，也可以是对存在于不同的组织或器官的细胞表面上的不同的凝集素具有结合活性的糖链。通过选择前者的多种糖链，可以明确地指向特定的靶组织或器官，选择后者的多种糖链，则可以是一种脂质体指向多个靶，可得到多功能靶向性脂质体。
为使糖链与脂质体结合，可以在制备脂质体时将接头蛋白和/或糖链混合，在制备脂质体的同时使糖链与其表面结合，但优选预先分别准备好脂质体、接头蛋白和糖链，使接头蛋白和/或糖链与制备完成的脂质体结合。这是由于通过使接头蛋白和/或糖链与脂质体结合，可以控制所结合的糖链的密度。
糖链与脂质体的直接结合可按照下述的方法进行。
以糖脂的形式混合糖链，制备脂质体，或使糖链与制备好的脂质体的磷脂结合，同时控制糖链密度。
使用接头蛋白与糖链结合时，接头蛋白的例子有人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)等动物的血清白蛋白，特别是通过对小鼠的实验证实，使用人血清白蛋白时，各组织中摄入得多。
如后所述，使用本发明的靶向性脂质体作为药物时，该脂质体必须含有具有药效的化合物。该具有药效的化合物可以包封在脂质体中，或者与脂质体表面结合。
经由接头蛋白使糖链与脂质体结合，这可以按照下述的方法进行。
首先，使蛋白质与脂质体表面结合。将脂质体用NaIO4、Pb(O2CCH3)4、NaBiO3等氧化剂处理，使存在于脂质体膜面的神经节苷脂氧化，然后用NaBH3CH、NaBH4等试剂，通过还原性氨基化反应使接头蛋白与脂质体膜面上的神经节苷脂结合。该接头蛋白也优选形成亲水性，为此，可使具有羟基的化合物与接头蛋白结合，例如使用双磺基琥珀酰亚氨基辛二酸酯、二琥珀酰亚氨基戊二酸酯、二硫代双琥珀酰亚氨基丙酸酯、二琥珀酰亚氨基辛二酸酯、3，3’-二硫代双磺基琥珀酰亚氨基丙酸酯、双琥珀酰亚氨基琥珀酸乙二醇酯、双磺基琥珀酰亚氨基琥珀酸乙二醇酯等2价试剂，使三(羟基甲基)氨基甲烷与脂质体上的接头蛋白结合。
具体来说，首先将交联用2价试剂的一端与接头蛋白的全部氨基结合。然后对各种糖链的还原末端进行糖基氨基化反应，制备所得的糖链的糖基胺化合物，将该糖链的氨基与脂质体上上述结合的交联2价试剂一部分的另一未反应的末端结合。
接着，使用上述得到的结合有糖链的脂质体膜面上蛋白质的表面上未结合糖链的、因未反应而残留的大部分2价试剂未反应末端进行亲水性处理。也就是说，使与该脂质体上蛋白质结合的2价试剂的未反应末端与三(羟基甲基)氨基甲烷等形成上述亲水性所使用的化合物进行结合反应，使脂质体整个表面形成亲水性。
脂质体表面和接头蛋白形成亲水性，这可以提高向各种组织的转运性、以及血液中的滞留性和向各种组织的转移性。这是由于：脂质体表面和接头蛋白表面形成亲水性，则糖链以外的部分在各组织等中被认为是机体内的水分，因此，不被靶以外的组织等识别，而只有糖链被其靶组织的凝集素(糖链识别蛋白)识别。
接着，使糖链与脂质体上的接头蛋白结合。其过程是：用NH4HCO3、NH2COONH4等铵盐对构成糖链的糖类的还原末端进行糖基氨基化，然后使用双磺基琥珀酰亚氨基辛二酸酯、二琥珀酰亚氨基戊二酸酯、二硫代双琥珀酰亚氨基丙酸酯、二琥珀酰亚氨基辛二酸酯、3，3’-二硫代双磺基琥珀酰亚氨基丙酸酯、双琥珀酰亚氨基琥珀酸乙二醇酯、双磺基琥珀酰亚氨基琥珀酸乙二醇酯等2价试剂，使结合于脂质体膜面上的接头蛋白和上述糖基氨基化的糖类结合，得到图1-22所示的脂质体。这些糖链市面有售。
本发明的脂质体的粒径为30-500nm，优选50-300nm，进一步优选70-150nm。ζ电位为-50至10mV，优选-40至0mV，进一步优选-30至-10mV。在本发明的药用组合物所含的脂质体的制备过程中，可存在以下四种形式的脂质体：表面没有任何结合的脂质体、未形成亲水性但有糖链结合的脂质体、未结合糖链但形成亲水性的脂质体以及形成亲水性且有糖链结合的脂质体，但这四种形式的脂质体在生理盐水等等渗液中都包含在上述粒径范围和ζ电位的范围内。
关于结合糖链时糖链的结合密度，每一个结合在脂质体上的接头蛋白分子上为1-60个，优选1-40个，进一步优选1-20个。使用接头蛋白时，每个脂质体颗粒上可以有1-30000个、优选1-20000个、进一步优选1-10000个，或者有100-30000个、优选100-20000个、进一步优选100-10000个，或者有500-30000个、优选500-20000个、进一步优选500-10000个糖链。不使用接头蛋白时，每个脂质体颗粒最高可结合1-500000个，优选1-300000个，进一步优选1-100000个或以上的糖链。
(2)含有本发明的靶向性脂质体的炎症性疾病治疗用组合物
本发明包含炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，该组合物含有靶向性质体，所述脂质体是将上述唾液酸基路易斯X糖链或与其类似地可与E-选择蛋白、P-选择蛋白等反应的糖链对其种类和密度进行控制地与表面结合的脂质体。本发明还包含症性疾病治疗或诊断用药用组合物，该组合物含有使用形成亲水性的化合物形成亲水性、但没有糖链结合的脂质体。
作为本发明的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物对象的炎症性疾病没有限定，有脑炎、炎症性眼病、耳炎、咽炎、肺炎、胃炎、肠炎、肝炎、胰腺炎、膀胱炎、尿道炎、子宫体炎、盆腔炎、关节炎、末梢神经炎等通常的炎症性疾病，还有恶性肿瘤、感染性疾病、变应性疾病、自身免疫疾病(风湿病、全身性红斑狼疮、结节病(类肉瘤病)等)，缺血性疾病(心肌梗塞、脑梗塞等)，代谢性疾病(糖尿病、痛风等)，外伤·热灼伤·化学腐蚀，神经变性疾病(阿尔茨海默病等)等继发性引起炎症的炎症性疾病。炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物可适用的对象器官、组织不受限定，可以以动物的所有器官和组织为对象。另外，炎症性眼病没有限定，有包括葡萄膜炎的内眼炎、糖尿病性视网膜病、血管新生黄斑病、变应性结膜炎、眼眶和眼内肿瘤、视神经炎、巩膜炎(包含后巩膜炎)等。
本发明的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物所含的靶向性脂质体含有具有炎症性疾病治疗用药效的化合物，这些化合物不受限定，有肾上腺皮质激素、抗炎药、免疫抑制剂、抗癌剂、抗菌药、抗病毒药、血管新生抑制剂、细胞因子或趋化因子、抗细胞因子抗体或抗趋化因子抗体、抗细胞因子·趋化因子受体抗体、siRNA或DNA等基因治疗相关的核酸制剂、神经保护因子等。
肾上腺皮质激素有：皮质醇、可的松等天然肾上腺皮质激素(糖皮质类固醇)，泼尼松龙、磷酸泼尼松龙、地塞米松、磷酸地塞米松、倍他米松、氟轻松、曲安西龙等合成肾上腺皮质激素。其它抗炎药有阿司匹林等水杨酸类、吲哚美辛等吲哚乙酸衍生物、双氯芬酸等苯乙酸衍生物、甲芬那酸等非那乙酸衍生物。还有依托度酸、美洛昔康、塞来考昔、罗非考昔、MK-0966等选择性COX-2抑制剂。
本发明中，上述药物中也包含其衍生物。
使本发明的糖链修饰的脂质体中含有上述药物并给予时，与单独给药的情况相比，药物聚集于炎症部位。与单独给药的情形相比，可聚集2倍或以上，优选5倍或以上，进一步优选10倍或以上，特别优选50倍或以上。
这些化合物可以包封在脂质体中，也可以与脂质体表面结合，优选包封在脂质体中。这些化合物可以利用该化合物所具有的官能团，用公知的方法结合。
包封入脂质体内部的方法可以按以下的方法进行。将药物等包封入脂质体中时，可以采用周知的方法，例如使用含有药物等的溶液和含有磷脂酰胆碱类、磷脂酰乙醇胺类、磷脂酸类或长链烷基磷酸盐类、神经节苷脂类、糖脂类或磷脂酰甘油类以及胆固醇类的脂质，通过形成脂质体，药物等被包封入脂质体内。
本发明的药用组合物可以除靶向性脂质体和使用形成亲水性的化合物形成亲水性但没有糖链结合的脂质体外，还可以含有药理学上可接受的载体、稀释剂或赋型剂等，其中所述靶向性脂质体是将唾液酸基路易斯X糖链或与其同样地可与E-选择蛋白、P-选择蛋白等反应的糖链对其种类和密度进行控制地与表面结合的脂质体。本发明的药用组合物可以以各种形式给予。所述给予形式可以是滴眼剂等经眼给药，片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、糖浆剂等口服给药，或者注射剂、输液剂、栓剂等的胃肠道外给药。所述组合物可通过公知的方法制备，包含制剂领域中常用的载体、稀释剂、赋型剂。例如，片剂用的载体、赋型剂可以使用凝胶化剂、乳糖、硬脂酸镁等。注射剂可通过将本发明的结合糖链的脂质体溶解、悬浮或乳化于通常注射剂所使用的无菌水性或油性液体中来制备。注射用的水性液体可以使用生理盐水、葡萄糖或含有其它辅助药物的等渗液等，也可以与适当的助溶剂例如乙醇、丙二醇等多元醇、非离子表面活性剂等结合使用。油性液体可以使用芝麻油、大豆油等，助溶剂可以结合使用苯甲酸苄酯、苄醇等。
本发明的药用组合物的给药途径没有限定，有滴眼、口服、静脉注射、肌肉注射等。给药量可根据炎症性疾病的严重程度等适当决定，但要给予患者本发明的组合物的药物有效量。这里，“给予药物有效量”是指给予患者治疗炎症性疾病的适当水平的药物。本发明的药用组合物的给予次数可根据患者的症状适当选择。
将本发明的药用组合物用于诊断用时，可以将荧光染料、放射性化合物等标记化合物与脂质体结合。该结合有标记化合物的脂质体与患处结合，标记化合物被摄入患处细胞，可以以该标记化合物的存在为指标检测·诊断疾病。
可通过以下的实施例进一步具体说明本发明，但本发明并不受这些实施例的限定。
实施例1脂质体的制备
脂质体根据已报道的方法(Yamazaki，N.，Kodama，M. and Gabius，H.-J.(1994)Methods Enzymol.242，56-65)，使用改良型胆酸透析法制备。即，向摩尔比为35∶40∶5∶15∶5的比例、脂质总量为45.6mg的二棕榈酰基磷脂酰胆碱、胆固醇、磷酸双十六烷基酯、神经节苷酯和二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺中加入46.9mg胆酸钠，溶解于3ml氯仿/甲醇溶液。蒸发该溶液，将沉淀物在真空中干燥，得到脂质膜。将所得脂质膜悬浮于3ml TAPS缓冲液(pH8.4)，进行超声波处理，得到透明的胶束悬浮液。再使用PM10膜(AmiconCo.，USA)和PBS缓冲液(pH7.2)对胶束悬浮液进行超滤，制备10ml均匀的脂质体(平均粒径100nm)。
实施例2脂质体脂质膜面上的亲水性处理
使用XM300膜(AmiconCo.，USA)和CBS缓冲液(pH8.5)，对10ml实施例1中制备的脂质体溶液进行超滤，使溶液的pH为8.5。接着，加入10ml交联试剂双(磺基琥珀酰亚氨基)辛二酸酯(BS3；PierceCo.，USA)，在25℃搅拌2小时。然后，再在7℃搅拌过夜，使脂质体膜上的脂质二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺与BS3的化学键合反应终止。将该脂质体液用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)超滤。接着，将40mg溶解于1ml CBS缓冲液(pH8.5)的三(羟基甲基)氨基甲烷加入到10ml脂质体液中，在25℃搅拌2小时，然后，再在7℃搅拌过夜，使与脂质体膜上的脂质结合的BS3和三(羟基甲基)氨基甲烷的化学键合反应终止。由此，三(羟基甲基)氨基甲烷的羟基与脂质体膜的脂质二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺配位，形成亲水性。
实施例3人血清白蛋白(HSA)与脂质体膜面上的结合
按照已报道的方法(Yamazaki，N.，Kodama，M.and Gabius，H.-J.(1994)Methods Enzymol.242，56-65)使用偶联反应法进行。即，该反应以2步化学反应进行，首先，将43mg溶解于1ml TAPS缓冲液(pH8.4)中的偏过碘酸钠加入到实施例2得到的10ml脂质体中，在室温下搅拌2小时，使存在于膜面上的神经节苷脂进行过碘酸氧化，然后通过XM300膜和PBS缓冲液(pH8.0)进行超滤，得到10ml被氧化的脂质体。向该脂质体液中加入20mg人血清白蛋白(HSA)，在25℃搅拌2小时，然后，向PBS(pH8.0)中加入100μl 2M NaBH3CN，在10℃搅拌过夜，通过脂质体上的神经节苷脂与HSA的偶联反应结合HSA。用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，得到10ml结合有HSA的脂质体液。
实施例4
路易斯X型三糖链、唾液酸基路易斯X型四糖链、3’-唾液酸基乳糖胺三糖链、6’-唾液酸基乳糖胺三糖链、α-1，2-甘露二糖二糖链、α-1，3-甘露二糖二糖链、α-1，4-甘露二糖二糖链、α-1，6-甘露二糖二糖链、α-1，3-α-1，6-甘露三糖三糖链、低聚甘露糖-3五糖链、低聚甘露糖-4b六糖链、低聚甘露糖-5七糖链、低聚甘露糖-6八糖链、低聚甘露糖-7九糖链、低聚甘露糖-8十糖链、低聚甘露糖-9十一糖链与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白(HSA)的结合。
将50μg路易斯X型三糖链(Calbiochem Co.，USA)加入到溶解有0.25g NH4HCO3的0.5ml水溶液中，在37℃搅拌3天，然后用0.45μm的滤器过滤，使糖链还原末端的氨基化反应终止，得到50μg路易斯X型三糖链的糖基胺化合物。接着，向1ml实施例3得到的脂质体液的一部分中加入1mg交联试剂3，3’-二硫代双(磺基琥珀酰亚氨基)丙酸酯(DTSSP；Pierce Co.，USA)，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，得到1ml DTSSP与脂质体上的HAS结合的脂质体。接着，向该脂质体液中加入50μg上述路易斯X型三糖链的糖基胺化合物，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和PBS缓冲液(pH7.2)进行超滤，进行路易斯X型三糖链与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白上的DTSSP的结合。结果，得到2ml图1所示的路易斯X型三糖链、人血清白蛋白、脂质体结合的脂质体(脂质总量2mg、蛋白总量200μg、平均粒径100nm)。其它结合有糖链的脂质体也是通过改变所使用的糖链、用同样的方法制备。这些结合糖链的脂质体如图2-16所示。
实施例5
乳糖二糖链、2’-岩藻糖基乳糖三糖链、二岩藻糖基乳糖四糖类、3-岩藻糖基乳糖三糖链、3’-唾液酸基乳糖三糖链和6’-唾液酸基乳糖三糖链、3’-唾液酸基乳糖胺三糖链或6’-唾液酸基乳糖胺三糖链与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白(HSA)的结合(糖链结合量不同的三种)。
将乳糖二糖链(Wako Pure Chemical Co.，Japan)(1)50μg或2)200μg或3)1mg加入到溶解有0.25g NH4HCO3的0.5ml水溶液中，在37℃搅拌3天，然后用0.45μm的滤器过滤，使糖链还原末端的氨基化反应终止，得到50μg乳糖二糖链的糖基胺化合物。接着，向1ml实施例3得到的脂质体液的一部分中加入1mg交联试剂3，3’-二硫代双(磺基琥珀酰亚氨基)丙酸酯(DTSSP；Pierce Co.，USA)，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，得到1ml DTSSP与脂质体上的HAS结合的脂质体。接着，向该脂质体液中加入50μg上述乳糖二糖链的糖基胺化合物，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和PBS缓冲液(pH7.2)进行超滤，进行乳糖二糖链与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白上的DTSSP的结合。结果，得到各2ml糖链结合量不同的3种图17所示的乳糖二糖链、人血清白蛋白、脂质体结合的脂质体(脂质总量2mg、蛋白总量200μg、平均粒径100nm)。其它结合有糖链的脂质体也是通过改变所使用的糖链、用同样的方法制备。其它结合有糖链的脂质体的结构如图3、4和18-22所示。
实施例6三(羟基甲基)氨基甲烷与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白(HSA)的结合
为了制备作为比较样品的脂质体，向1ml实施例3得到的脂质体液的一部分中加入1mg交联试剂3，3’-二硫代双(磺基琥珀酰亚氨基)丙酸酯(DTSSP；Pierce Co.，USA)，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，得到1ml脂质体上的HSA结合有DTSSP的脂质体。接着，向该脂质体液中加入13mg三(羟基甲基)氨基甲烷(Wako Co.，Japan)，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和PBS缓冲液(pH7.2)进行超滤，使三(羟基甲基)氨基甲烷与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白上的DTSSP结合。结果，得到2ml作为比较样品的脂质体(脂质总量2mg、蛋白总量200μg、平均粒径100nm)，该脂质体是图25所示的三(羟基甲基)氨基甲烷与人血清白蛋白、脂质体结合得到的。
实施例7结合于脂质体膜面的人血清白蛋白(HSA)上的亲水性处理
按照以下的顺序，对由实施例4或实施例5的方法制备的脂质体进行脂质体上的HAS蛋白表面的亲水性处理。向2ml结合有糖链的脂质体中加入13mg三(羟基甲基)氨基甲烷，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和PBS缓冲液(pH7.2)进行超滤，除去未反应物，得到各2ml最终产物——经亲水性处理的结合糖链的脂质体复合物(脂质总量2mg、蛋白总量200μg、平均粒径100nm)。
实施例8结合有各种糖链的脂质体复合物对凝集素结合活性的抑制效果的测定
按照常规方法(Yamazaki，N.(1999)Drug Delivery System，14，498-505)，采用固定有凝集素的微量板，通过抑制试验测定由实施例5或实施例6的方法制备的12种结合有糖链的脂质体复合物与凝集素的体外结合活性。即，将凝集素(E-选择蛋白；R&D Systems Co.，USA)固定在96孔微量板上。将浓度各异的各种结合有糖链的脂质体复合物(蛋白质量为0.01μg、0.04μg、0.11μg、0.33μg、1μg)与0.1μg比较配体——生物素化的岩藻糖基化胎球蛋白一起加入到该固定有凝集素的孔板中，在4℃温育2小时。用PBS(pH7.2)洗涤3次，添加结合有辣根过氧化物酶(HRPO)的链霉抗生物素，再在4℃温育1小时，用PBS(pH7.2)洗涤三次，添加过氧化物酶底物，在室温下静置，通过读板仪(MolecularDevices Corp.，USA)测定405nm下的吸光度。岩藻糖基化胎球蛋白的生物素化是在经sulfo-NHS-biotin reagent(Pierce Co.，USA)处理后，通过Centricon-30(Amicon Co.，USA)纯化。结合有HRPO的链霉抗生物素通过以下两步骤制备：HRPO的氧化和通过使用NaBH3CN的还原氨基化法与链霉抗生物素的结合。该测定结果如表1-4所示。
表中的脂质体复合物的符号表示脂质体与以下的糖链结合。
LX：路易斯X型三糖链
SLX：唾液酸基路易斯X型四糖链
3SLN：3’-唾液酸基乳糖胺三糖链
6SLN：6’-唾液酸基乳糖胺三糖链
A2：α-1，2甘露二糖二糖链
A3：α-1，3甘露二糖二糖链
A4：α-1，4甘露二糖二糖链
A6：α-1，6甘露二糖二糖链
A36：α-1，3-α-1，6甘露三糖三糖链
Man3：低聚甘露糖-3五糖链
Man46：低聚甘露糖-4b六糖链
Man5：低聚甘露糖-5七糖链
Man6：低聚甘露糖-6八糖链
Man7：低聚甘露糖-7九糖链
Man8：低聚甘露糖-8十糖链
Man9：低聚甘露糖-9十一糖链
LAC：乳糖二糖链
FL：2’-岩藻糖基乳糖三糖链
DFL：二岩藻糖基乳糖四糖链
FL：3-岩藻糖基乳糖三糖链
3SL：3’-唾液酸基乳糖三糖链
6SL：6’-唾液酸基乳糖三糖链
3SLN：3’-唾液酸基乳糖胺三糖链
6SLN：6’-唾液酸基乳糖胺三糖链
如表所示，各脂质体具有与凝集素的结合活性，这显示有糖链结合。
表1
| 脂质体复合物 | 脂质体复合物各浓度(μg蛋白质)下的抑制效果(吸光度) | ||||
| 0.01μg | 0.04μg | 0.11μg | 0.33μg | 1μg | |
| LX | 0.199 | 0.195 | 0.195 | 0.195 | 0.129 |
| SLX | 0.105 | 0.100 | 0.100 | 0.084 | 0.073 |
| 3SLN | 0.175 | 0.158 | 0.144 | 0.131 | 0.095 |
| 6SLN | 0.256 | 0.245 | 0.233 | 0.200 | 0.151 |
表2
| 脂质体复合物 | 脂质体复合物各浓度(μg蛋白质)下的抑制效果(吸光度) | ||||
| 0.006μg | 0.02μg | 0.06μg | 0.17μg | 0.5μg | |
| A2 | 0.192 | 0.196 | 0.192 | 0.169 | 0.155 |
| A3 | 0.178 | 0.178 | 0.178 | 0.170 | 0.142 |
| A4 | 0.192 | 0.196 | 0.192 | 0.175 | 0.153 |
| A6 | 0.182 | 0.196 | 0.182 | 0.169 | 0.151 |
| A36 | 0.205 | 0.215 | 0.205 | 0.192 | 0.150 |
| Man3 | 0.201 | 0.211 | 0.201 | 0.177 | 0.144 |
| Man4 | 0.171 | 0.203 | 0.171 | 0.157 | 0.148 |
| Man5 | 0.215 | 0.221 | 0.215 | 0.196 | 0.164 |
| Man6 | 0.210 | 0.222 | 0.210 | 0.207 | 0.126 |
| Man7 | 0.213 | 0.214 | 0.213 | 0.183 | 0.137 |
| Man8 | 0.211 | 0.216 | 0.211 | 0.188 | 0.132 |
| Man9 | 0.208 | 0.211 | 0.208 | 0.186 | 0.135 |
表3
| 脂质体复合物 | 脂质体复合物各浓度(μg蛋白质)下的抑制效果(吸光度) | ||||
| 0.01μg | 0.04μg | 0.11μg | 0.33μg | 1μg | |
| LAC-1 | 0.115 | 0.114 | 0.112 | 0.112 | 0.105 |
| LAC-2 | 0.112 | 0.109 | 0.104 | 0.104 | 0.097 |
| LAC-3 | 0.119 | 0.118 | 0.112 | 0.109 | 0.108 |
| 2FL-1 | 0.121 | 0.115 | 0.106 | 0.097 | 0.067 |
| 2FL-2 | 0.131 | 0.119 | 0.116 | 0.111 | 0.079 |
| 2FL-3 | 0.149 | 0.133 | 0.122 | 0.104 | 0.073 |
| DFL-1 | 0.167 | 0.158 | 0.146 | 0.131 | 0.108 |
| DFL-2 | 0.136 | 0.134 | 0.133 | 0.120 | 0.106 |
| DFL-3 | 0.163 | 0.150 | 0.134 | 0.118 | 0.097 |
| 3FL-1 | 0.138 | 0.131 | 0.121 | 0.113 | 0.085 |
| 3FL-2 | 0.148 | 0.134 | 0.128 | 0.123 | 0.092 |
| 3FL-3 | 0.149 | 0.134 | 0.129 | 0.128 | 0.110 |
表4
| 脂质体复合物 | 脂质体复合物各浓度(μg蛋白质)下的抑制效果(吸光度) | ||||
| 0.01μg | 0.04μg | 0.11μg | 0.33μg | 1μg | |
| 3SL-1 | 0.154 | 0.147 | 0.135 | 0.120 | 0.097 |
| 3SL-2 | 0.149 | 0.142 | 0.124 | 0.118 | 0.098 |
| 3SL-3 | 0.214 | 0.214 | 0.210 | 0.183 | 0.167 |
| 6SL-1 | 0.177 | 0.171 | 0.167 | 0.160 | 0.114 |
| 6SL-2 | 0.196 | 0.184 | 0.169 | 0.160 | 0.159 |
| 6SL-3 | 0.214 | 0.207 | 0.196 | 0.192 | 0.183 |
| 3SLN-1 | 0.219 | 0.198 | 0.180 | 0.164 | 0.119 |
| 3SLN-2 | 0.155 | 0.155 | 0.151 | 0.119 | 0.096 |
| 3SLN-3 | 0.216 | 0.198 | 0.187 | 0.146 | 0.132 |
| 6SLN-1 | 0.257 | 0.246 | 0.233 | 0.200 | 0.151 |
| 6SLN-2 | 0.250 | 0.250 | 0.230 | 0.199 | 0.158 |
| 6SLN-3 | 0.248 | 0.231 | 0.227 | 0.201 | 0.144 |
实施例9
葡萄膜炎模型小鼠的制备
实验性葡萄膜炎(自身免疫性葡萄膜视网膜炎：以下称为EAU)模型小鼠的制备使用以下的材料。
实验动物：C57BL/6小鼠(雌性、8周龄)
接种抗原：人视网膜特异性蛋白IRBP(光感受器间视网膜样结合蛋白)
合成肽：序列GPTHLFQPSLVLDMAKVLLD(1-20)
佐剂：含有6mg/ml结核(H37RA)死菌的完全氟氏佐剂(CFA)
增效剂：百日咳毒素(纯化百日咳毒素(PTX))
将肽水溶液和佐剂以1∶1容积比混合，制备成乳浊液的形式。对8周龄C57BL/6雌性小鼠每只足背皮下接种50μg，鼠蹊皮下接种50μg，共接种200μg。每只腹腔内给予100ng百日咳毒素作为追加佐剂。通过0.5％托吡卡胺·0.5％盐酸去氧肾上腺素使瞳孔放大，通过观察眼底来评价EAU发病程度。
结果如图24。在给药第16天，EAU发病达到峰值。
给予肽后第16天，可观察到炎症细胞浸润脉络膜、视网膜、玻璃体腔。
本方法中确认了制成了人内眼炎模型——EAU。
实施例10
脂质体在体内的动态分析
给予的脂质体是上述实施例中制备的结合糖链的脂质体中结合有唾液酸基路易斯X糖链的脂质体(以下称为糖链+脂质体)和未结合糖链的脂质体(以下称为糖链-脂质体)。
对EAU小鼠和正常小鼠分别给予糖链+脂质体、糖链-脂质体，目的在于评价脂质体在小鼠各器官中的聚集。
给予肽第16天，准备确认有EAU发病的EAU小鼠和正常小鼠。将预先制备成50μg/ml的脂质体溶液从小鼠尾静脉进行静脉注射，静脉注射后通过肝素生理盐水溶液进行除血循环，然后摘除各器官。使用1％TritonX溶液和HG30匀浆器(日立工机制造)，将各器官制成组织匀浆，然后使用100％甲醇和氯仿提取组织匀浆中所含的脂质体。使用荧光读板仪Biolumin960(Molecular Dynamics公司制造)测定与脂质体结合的FITC的荧光强度，以490nm的激发能和520nm的发射能测定脂质体量。
给予脂质体后，研究眼中的聚集随时间的变化。结果可知：30分钟聚集达到峰值。因此，对于在各器官中的聚集研究，设定在给予脂质体30分钟后进行。结果见图25A和图25B。图25A以聚集量表示，图25B以与正常小鼠的相对值表示。首先，在正常小鼠的各器官中未见糖链+脂质体和糖链-脂质体的聚集差别。而在EAU小鼠的眼部，可见糖链+脂质体的聚集是正常小鼠的眼的6倍。但是，糖链-脂质体在EAU小鼠眼中的聚集与正常小鼠比较最高为1.5倍。在EAU小鼠的眼以外的器官中，糖链+脂质体和糖链-脂质体的聚集未见显著差别，其值与正常小鼠相比大致为同等程度。
只在发炎的眼中见到脂质体摄入的增加。糖链-脂质体在EAU小鼠的眼中摄入了正常小鼠眼中的1.5倍，这可能是由于血管内皮细胞间隙扩大而导致(被动转运)。另一方面，糖链+脂质体在EAU小鼠眼中聚集正常小鼠眼中的6倍(即与糖链-脂质体比较，聚集约4倍)，这是由于是以在炎症部位表达的E-选择蛋白、P-选择蛋白为靶(主动转运)。
实施例11
1)脂质体向炎症部位的聚集
目的在于评价脂质体在炎症器官(眼)的哪些部位发生聚集。
从肽免疫后第16天的EAU发病小鼠的尾静脉给予脂质体。30分钟后摘除小鼠眼球，直接包埋在OCT化合物中并冷冻。使用冷冻切片机制备6-8μm的冷冻切片，使用AxioVision(Carl Zeiss公司制造)进行观察。
结果如图26所示。对EAU小鼠给予糖链+脂质体，给予后5分钟，可见聚集于巩膜，7分钟时，脉络膜中相当于脉络膜毛细血管层的部位可见一条细长的聚集。给予后10分钟，可观察到其聚集线扩大。30分钟时，聚集线变薄，可观察到荧光物质向周围的组织扩散(图26)。另一方面，给予糖链-脂质体的未见聚集线的形成，30分钟时也未观察到明显的荧光物质的滞留，未能观察到扩散(图26-F)，另外，正常小鼠中的任何脂质体都未见荧光物质(图27)。
已明确脂质体在眼症部位的动态为：糖链+脂质体的聚集由血管最丰富的脉络膜毛细血管层开始，随时间推移而向周围的组织扩散。这可以认为糖链+脂质体以在炎症部位的血管中表达的E-选择蛋白、P-选择蛋白为靶进行聚集，然后通过因炎症而扩大的血管内皮细胞间隙向周围组织扩散。另一方面，糖链-脂质体中未能观察到明确的荧光染料，这是由于该脂质体向炎症部位的聚集是被动转运，没有象糖链+脂质体那样的因靶而聚集的部位，分别分散地扩散到组织中。
实施例12
E-选择蛋白、P-选择蛋白的表达
其目的在于确认E-选择蛋白、P-选择蛋白在EAU小鼠眼部是否确实地表达、其表达部位是否与糖链+脂质体最初聚集的聚集线一致。
准备EAU发病小鼠、正常小鼠。摘除眼球后将其用4％戊醛固定，用30％蔗糖PBS进行脱水，将所得眼球包埋在OCT化合物中并冷冻。
(1)通过荧光抗体法进行检测：使用14-16μm的冷冻切片，进行封闭后使其与抗小鼠E-选择蛋白一次抗体(多克隆抗体：山羊)反应。通过结合有FITC的抗山羊IgG二次抗体检测信号。
(2)通过酶标记抗体法进行检测：通过抗小鼠E-选择蛋白和P-选择蛋白一次抗体(多克隆抗体：山羊)进行的反应与荧光抗体法同样地进行，二次抗体反应使用VECTASTAIN(注册商标)ABC-AP试剂盒和Vector(注册商标)Red Alkaline Phosphatase Substrate试剂盒I进行。
为了确认免疫染色的特异性，任何检测方法都从购入抗体的公司购入用于制备各抗体的肽，作为封闭肽使用，确认染色是否消失。
结果如图28和29所示。可观察到：E-选择蛋白、P-选择蛋白都是在与糖链+脂质体的聚集线一致的部位强烈表达。另外，通过所使用的抗体的中和肽，染色消失，这可能显示了该免疫染色的特异性。另一方面，正常小鼠中，E-选择肽、P-选择肽均未见表达。
EAU小鼠中的E-选择蛋白、P-选择蛋白的表达部位与糖链+脂质体的聚集部位一致，这支持了该脂质体的靶为E-选择蛋白、P-选择蛋白的理论。
实施例13
通过给予E-选择蛋白和P-选择蛋白的抗体来抑制糖链+脂质体的聚集
本实施例的目的在于显示糖链+脂质体的靶分子确实为E-选择蛋白和P-选择蛋白。
由EAU发病小鼠的尾静脉同时给予200μg抗小鼠E-选择蛋白抗体、200μg抗小鼠P-选择蛋白抗体，等待4小时，中和受体。作为对照，准备从EAU发病小鼠的尾静脉给予400μg同型IgG的小鼠。给予4小时后，由尾静脉给予糖链+脂质体，10分钟后摘除眼球，制成冷冻标本。制备6-8μm的冷冻切片，使用AxioVision分析配体-受体特异性结合是否受到抑制。
结果如图30所示。将E-选择蛋白和P-选择蛋白的抗体同时给予EAU小鼠，可以抑制糖链+脂质体的聚集。给予同型IgG并不能抑制聚集。另外，单独给予E-选择蛋白和P-选择蛋白的各抗体，也不能完全抑制聚集。
将该结果与实施例11所示的结果一并考虑，可以得出以下结论：糖链+脂质体的靶为E-选择蛋白和P-选择蛋白。
以上的实验结果显示：结合有唾液酸基路易斯X糖链的脂质体可以将药物特异性递送到较多表达E-选择蛋白和P-选择蛋白的病灶部位。
实施例14包封磷酸泼尼松龙的脂质体的制备
(1)包封磷酸泼尼松龙的脂质体的制备和包封药物的定量以及保存稳定性
使用胆酸透析法制备脂质体。即，将二棕榈酰基磷脂酰胆碱、胆固醇、磷酸双十六烷基酯、神经节苷脂和二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺以摩尔比35∶40∶5∶15∶5的比例混合，脂质总量为45.6mg，添加46.9mg胆酸钠，溶解于3ml氯仿/甲醇溶液。蒸发该溶液，在真空中干燥沉淀物，得到脂质膜。将所的脂质膜悬浮于3ml TAPS缓冲液(pH8.4)，进行超声波处理，得到3ml透明的胶束悬浮液。向该胶束悬浮液中加入PBS缓冲液(pH7.2)，制成5ml，然后在TAPS缓冲液(pH8.4)中一边搅拌一边以2250mg/6ml缓慢滴加完全溶解的磷酸泼尼松龙，均匀混合，然后将该含磷酸泼尼松龙的胶束悬浮液进行使用PM10膜(AmiconCo.，USA)和TAPS缓冲液(pH8.4)的超滤，制备10ml均匀的、包封有磷酸泼尼松龙的脂质体。用ζ电位、粒径、分子量测定装置(Model Nano ZS，Malvern Instruments Ltd.，UK)测定所得的生理盐水悬浮液(37℃)中的包封磷酸泼尼松龙的脂质体颗粒的粒径和ζ电位，结果，粒径为50-350nm、ζ电位为-30至-10mV。以260nm吸光度测定该脂质体包封的药物量，可知以280μg/ml的浓度包封磷酸泼尼松龙。该包封有磷酸泼尼松龙的脂质体在冰箱中保存1年后也不会发生凝聚，很稳定。
(2)包封有磷酸泼尼松龙的脂质体脂质膜面的亲水性处理
将10ml(1)中制备的包封有磷酸泼尼松龙的脂质体溶液进行使用XM300膜(AmiconCo.，USA)和CBS缓冲液(pH8.5)的超滤，使溶液的pH为8.5。接着，加入10ml交联试剂双(磺基琥珀酰亚氨基)辛二酸酯(BS3；Pierce Co.，USA)，在25℃搅拌2小时。然后再在7℃搅拌过夜，使脂质体膜上的脂质二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺与BS3的化学键合反应终止。将该脂质体液用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤。接着，将40mg溶解于1ml CBS缓冲液(pH8.5)的三(羟基甲基)氨基甲烷加入到10ml脂质体液中，在25℃搅拌2小时。然后再在7℃搅拌过夜，使与脂质体膜上的脂质键合的BS3与三(羟基甲基)氨基甲烷的化学键合反应终止。由此，三(羟基甲基)氨基甲烷的羟基与包封有抗癌剂多柔比星的脂质体膜的脂质二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺配位，形成水合亲水性。
(3)人血清白蛋白(HSA)与包封有磷酸泼尼松龙的脂体膜面的结合
根据已报道的方法(Yamazaki，N.，Kodama，M.and Gabius，H.-J.(1994)Methods Enzymol.242，56-65)，使用偶联反应法进行。即，该反应通过2步化学反应进行，首先，将43mg溶解于1ml TAPS缓冲液(pH8.4)中的偏过碘酸钠加入到(2)中得到的10ml脂质体中，在室温下搅拌2小时，使存在于膜面上的神经节苷脂进行过碘酸氧化，然后用XM300膜和PBS缓冲液(pH8.0)进行超滤，得到10ml被氧化的脂质体。向该脂质体液中加入20mg人血清白蛋白(HSA)，在25℃搅拌2小时，然后，向PBS(pH 8.0)中加入100μl 2M NaBH3CN，在10℃搅拌过夜，通过脂质体上的神经节苷脂与HAS的偶联反应结合HAS。用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，得到10ml结合有HAS的、包封有磷酸泼尼松龙的脂质体。
(4)唾液酸基路易斯X型四糖链与包封有磷酸泼尼松龙的结合于脂质体膜面的人血清白蛋白(HSA)的结合以及接头蛋白(HSA)的亲水性处理
将50μg唾液酸基路易斯X型四糖链(Calbiochem Co.，USA)加入到溶解有0.25g NH4HCO3的0.5ml水溶液中，在37℃搅拌3天，然后用0.45μm的滤器过滤，使糖链还原末端的氨基化反应终止，得到50μg唾液酸基路易斯X型四糖链的糖基胺化合物。接着，向1ml(3)中得到的包封有磷酸泼尼松龙的脂质体液的一部分中加入1mg交联试剂3，3’-二硫代双(磺基琥珀酰亚氨基)丙酸酯(DTSSP；Pierce Co.，USA)，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，得到1ml DTSSP与脂质体上的HAS结合的脂质体。接着，向该脂质体液中加入50μg上述路易斯X型四糖链的糖基胺化合物，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和PBS缓冲液(pH7.2)进行超滤，进行唾液酸基路易斯X型四糖链与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白上的DTSSP的结合。接着，向该脂质体液中加入13mg三(羟基甲基)氨基甲烷(Wako Co.，Japan)，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和PBS缓冲液(pH7.2)进行超滤，进行三(羟基甲基)氨基甲烷与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白上的DTSSP的结合。结果得到三(羟基甲基)氨基甲烷与人血清白蛋白、脂质体结合并且对接头蛋白(HSA)进行了亲水性处理的脂质体。结果可得到2ml唾液酸基路易斯X型四糖链与人血清白蛋白、脂质体结合并且对接头蛋白(HSA)进行了亲水性处理的、包封有磷酸泼尼松龙的脂质体(脂质总量2mg、蛋白总量200μg)。用ζ电位、粒径、分子量测定装置(Model Nano ZS，Malvern Instruments Ltd.，UK)测定所得的生理盐水悬浮液(37℃)中的包封磷酸泼尼松龙的脂质体颗粒的粒径和ζ电位，结果，粒径为50-350nm、ζ电位为-30至-10mV。
(5)通过三(羟基甲基)氨基甲烷与包封有磷酸泼尼松龙的结合于脂质体膜面的人血清白蛋白(HSA)的结合对接头蛋白(HSA)实施亲水性处理
为了制备作为比较样品的包封有磷酸泼尼松龙的脂质体(不具糖链)，向1ml(3)中得到的包封有磷酸泼尼松龙的脂质体液的一部分中加入1mg交联试剂3，3’-二硫代双(磺基琥珀酰亚氨基)丙酸酯(DTSSP；Pierce Co.，USA)，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，得到1ml DTSSP与脂质体上的HAS结合并且对接头蛋白(HSA)实施了亲水性处理的脂质体。接着，向该脂质体液中加入13mg三(羟基甲基)氨基甲烷(Wako Co.，Japan)，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和PBS缓冲液(pH7.2)进行超滤，进行三(羟基甲基)氨基甲烷与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白上的DTSSP的结合。结果得到2ml三(羟基甲基)氨基甲烷与人血清白蛋白、脂质体结合并且对接头蛋白(HSA)进行了亲水性处理的作为比较样品的包封有磷酸泼尼松龙的脂质体(不具有糖链)(脂质总量2mg、蛋白总量200μg)。用ζ电位、粒径、分子量测定装置(ModelNano ZS，Malvern Instruments Ltd.，UK)测定所得的生理盐水悬浮液(37℃)中的包封磷酸泼尼松龙的脂质体颗粒(不具有糖链)的粒径和ζ电位，结果，粒径为50-350nm、ζ电位为-30至-10mV。
将本实施例中制备的脂质体用于以下的实施例15和16的研究。
实施例15药物向炎症部位聚集的效果
目的在于研究E-选择蛋白在EAU发病小鼠各器官中的表达。
将1mg磷酸泼尼松龙由小鼠尾静脉给予，在确认有E-选择蛋白表达的器官中，用HPLC测定1小时后单位重量各器官中的泼尼松龙浓度。接着将本说明书开发的E-选择蛋白靶指向性、具有唾液酸基路易斯X糖链的脂质体(以下称为具糖链脂质体)包封磷酸泼尼松龙，将其给予小鼠(磷酸泼尼松龙合计5μg)，用HPLC测定1小时后单位重量各器官中的泼尼松龙浓度。
得到以下结果。
1.EAU发病小鼠中，除眼部以外，在肠中也可见E-选择蛋白的表达。除此之外的器官中未见表达。
2.单独给予1mg磷酸泼尼松龙时，眼部聚集100ng，肠中聚集500ng。而给予具糖链脂质体(包封合计5μg磷酸泼尼松龙)时，眼部聚集25ng，肠中聚集2000ng。
本实施例的结果显示：为了在炎症部位得到与单独给予1mg磷酸泼尼松龙同等的效果，使用具糖链脂质体，则对于眼部的炎症可以给予20μg磷酸泼尼松龙，对于肠，给予1.25μg即可。也就是说，使用该具糖链脂质体作为药物递送系统，则在眼中可得到50倍、在肠中可得到800倍的聚集效果。
本实施例中，给予磷酸泼尼松龙，却是测定泼尼松龙。磷酸泼尼松龙被摄入到细胞内，磷酸根脱离，成为泼尼松龙，因此本次的结果也同时显示：以具糖链脂质体给予的磷酸泼尼松龙被摄入到细胞内并进行了代谢。
总结EAU发病小鼠的实验，该具糖链脂质体是选择性地以E，P-选择蛋白为靶，可发挥最大800倍的聚集效果，这表明具有以往未见过的高精度靶向性。还可证实：包封在该具糖链脂质体内的药物进行了代谢。以上可得到如下结论：要获得目前临床医学中使用的药效，如果采用使用了该具糖链脂质体的药物递送系统，则可以将给药量减少至数百分之一，可以获得最大限度的药效和最小限度的副作用。
实施例16通过靶向性脂质体研究类风湿性关节炎的治疗
(1)RA模型小鼠的制备
制备II型胶原诱导关节炎(以下称为CIA)模型作为RA小鼠模型。所使用的小鼠、试剂类如下。
实验动物：DBA/1J小鼠(8周龄、雄性)
接种抗原：牛胶原II型
佐剂：含有结核死菌(H37RA、2mg/ml)的完全氟氏佐剂(CFA)、不含结核死菌的不完全氟氏佐剂(IFA)
将胶原水溶液和CFA以2∶1容积比混合，调节为100μL中含有200μg胶原的乳浊液，将其注射到小鼠尾底部皮下(第0天)。处置21天后(第21天)，将胶原水溶液和IFA以2∶1容积比混合，调节为100μL中含有200μg胶原的乳浊液，再次将其注射到小鼠尾底部皮下。
处置后，以3次/周的频率观察小鼠的四肢，按照以下基准评分，进行炎症量化。各个四肢中，正常：0分，轻度炎症或发红：1分，重度发红、肿胀或应用障碍：2分，前掌、足跖部和关节部变形：3分(最低为0分，最高为12分)。将该分由下式处理，求出炎症活动度(Inflammatory Activity：以下称为IA)。
炎症活动度(％)＝四肢的总分数/12×100
得到以下结果。
从第21天后经过数日，可见后肢足趾发红的小鼠增加。第28天，小鼠的IV为16.7％，第39天达到50％。图31表示发炎小鼠的四肢的照片。CIA小鼠关节炎情况如下。A：后肢足趾间关节肿胀(第二趾、箭头)、B：后肢足趾间关节肿胀(第四趾、箭头)、C：后肢足趾间关节发红(箭头)、D：正常后肢、E：前肢指关节肿胀(箭头)、F：正常前肢
这样，可以由上述方法制备CIA小鼠作为RA模型小鼠。
(2)通过静脉内给予DDS治疗RA小鼠的实验
从尾静脉向引发关节炎的小鼠注射治疗药，实施治疗。静脉注射在第28天至第46天以每周2次的频率进行。
第28天，选择有炎症表现的小鼠，分成4组，使每组的炎症分数平均值相同。各组为：1)对照：无治疗组、2)free Pred：将磷酸泼尼松龙溶解于生理盐水，使用该水溶液，磷酸泼尼松龙的量为每次100μg，每周静脉注射200μg、3)L-Pred：将磷酸泼尼松龙包封入脂质体中，不具有糖链，使用该脂质体，磷酸泼尼松龙的量为每次10μg，每周静脉注射20μg、4)L-Pred-SLX：将磷酸泼尼松龙包封入脂质体中，结合有唾液酸基路易斯X糖链，使用该脂质体，磷酸泼尼松龙的量为每次10μg，每周静脉注射20μg。
该4组小鼠的数量为：对照：6只、free Pred：7只、L-Pred：8只、L-Pred-SLX：8只。
得到以下的结果。对照中，LA随时间而上升，第46天时突破了60％。free Pred中，IA在第37天时达到约50％，随后以平衡状态推移。L-Pred中，IA从第32天开始上升，在第46天约为40％。L-Pred-SLX中，未观察到IA的大幅度上升，整个过程中都为20％或以下(图32)。
该结果表明以下内容。
free Pred组中，静脉注射的磷酸泼尼松龙的量为100μg/次，对于炎症的控制来讲是不够的，与对照组相比，IA未见明显的差别。L-Pred组中，静脉注射的磷酸泼尼松龙量为free Pred组的十分之一，为10μg/次，IA与free Pred组同等或以下。这可能是磷酸泼尼松龙的脂质体化使药物在血液中的滞留性提高，药效得到提高。L-Pred-SLX组中，磷酸泼尼松龙量同样为free Pred组的十分之一，为10μg/次，但IA完全没有上升，炎症的进展得到显著抑制。这可以认为是由于L-Pred和L-Pred-SLX的差别、即有无唾液酸基X糖链带来的效果。即，这显示了唾液酸基X糖链使得脂质体有效地聚集在炎症部位的可能性。
证明该DDS具有可以将治疗药极有效地分配到炎症部位的能力。这显示：在炎症疾病治疗中，通过将治疗药集中在病灶部位，可以抑制治疗药所具有的副作用，或者增大治疗药的药效。
(3)通过DDS的口服给予来治疗RA小鼠的实验
将治疗药口服给予引发关节炎的小鼠，实施治疗。给予是在第28天至第39天以每周3次的频率进行。
第28天，选择有炎症表现的小鼠，分成4组，使每组的炎症分数平均值相同。各组为：1)对照：无治疗组、2)free Pred：将磷酸泼尼松龙溶解于生理盐水，使用该水溶液，磷酸泼尼松龙的量为每次100μg，每周口服给予300μg、3)L-Pred：将磷酸泼尼松龙包封入脂质体中，不具有糖链，使用该脂质体，磷酸泼尼松龙的量为每次10μg，每周口服给予30μg、4)L-Pred-SLX：将磷酸泼尼松龙包封入脂质体中，结合有唾液酸基路易斯X糖链，使用该脂质体，磷酸泼尼松龙的量为每次10μg，每周口服给予30μg。
该4组小鼠的数量为：对照：2只、free Pred：3只、L-Pred：3只、L-Pred-SLX：4只。
得到以下的结果。
free Pred组中，由于喂饲针导致胃穿孔死亡，在第32天中止实验。对照组、free Pred组(至第32天)、L-Pred组中，IA未观察到显著差异。L-Pred-SLX组不能抑制炎症的进展，但在第39天时，与L-Pred组相比，IA显著低(图33)。
该结果表明以下内容。
对照、free Pred以及L-Pred三组中未见显著差异。这可能是由于free Pred组中，口服给予的300μg/周的磷酸泼尼松龙的量对于抑制炎症的进展来讲是不够的。L-Pred组中，脂质体不能通过肠道吸收，或者即使吸收，考虑到口服给予的磷酸泼尼松龙的量为30μg/周，量不够的可能性很高。而L-Pred-SLX组中，LA受到抑制。如果考虑到脂质体在肠道中被吸收，并且口服给予磷酸泼尼松龙的量为30μg/周，这显示磷酸泼尼松龙以具有糖链的脂质体的形式被运送到炎症部位的可能性。
结果显示：该DDS不仅可以静脉内给予，口服给予也可以有效发挥功能。并且显示：包封在脂质体中，以往不可能口服吸收的药物也可以制成可口服给予的制剂。
(4)寻求RA小鼠治疗中磷酸泼尼松龙适当量的实验
从尾静脉向引发关节炎的小鼠注射治疗药，实施治疗。静脉注射是在第28天至第46天期间以每周2次的频率进行。
第28天，选择有炎症表现的小鼠，分成3组，使每组的炎症分数平均值相同。各组为：1)对照：无治疗组、2)250μg：将磷酸泼尼松龙溶解于生理盐水，使用该水溶液，磷酸泼尼松龙的量为每次250μg，每周静脉注射500μg、3)500μg：将磷酸泼尼松龙溶解于生理盐水，使用该水溶液，磷酸泼尼松龙的量为每次500μg，每周静脉注射1000μg。
该3组小鼠的数量为：对照：2只、250μg：2只、500μg：2只。
得到以下的结果。
对照组和250μg组中未见显著差异。500μg组中未见IA的上升，炎症的进展得到抑制(图34)。
由该结果表明以下内容。在该RA模型小鼠中，抑制炎症的进展要求最低量比500μg/周多、最高为1000μg/周的磷酸泼尼松龙的量。静脉注射的治疗试验中，L-Pred-SLX组以每次10μg、每周20μg的磷酸泼尼松龙的量抑制炎症的进展，由此可以认为：该DDS中，以最多为50分之1的药量即可得到与以往的治疗效果同样的效果。
这显示：保持病灶部位的药物浓度，同时可以减少全身的给药量，可以减少药物的副作用，还可以将药物的全身给予量提高至低于药物表现副作用的浓度，从而提高病灶部位的药物浓度，可以具有更高的药效。
实施例17实施2种亲水性处理的脂质体在血液中的滞留性的研究
(1)脂质体的制备
使用胆酸透析法制备脂质体。即，将二棕榈酰基磷脂酰胆碱、胆固醇、磷酸双十六烷基酯、神经节苷脂和二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺以摩尔比35∶40∶5∶15∶5的比例混合，脂质总量为45.6mg，添加46.9mg胆酸钠，溶解于3ml氯仿/甲醇溶液。蒸发该溶液，在真空中干燥沉淀物，得到脂质膜。将所的脂质膜悬浮于3ml TAPS缓冲液(pH8.4)，进行超声波处理，得到3ml透明的胶束悬浮液。向该胶束悬浮液中加入PBS缓冲液(pH7.2)，制成5ml，再在TAPS缓冲液(pH8.4)中一边搅拌一边以2250mg/6ml缓慢滴加完全溶解的磷酸泼尼松龙，均匀混合，然后将该含磷酸泼尼松龙的胶束悬浮液进行使用PM10膜(AmiconCo.，USA)和TAPS缓冲液(pH8.4)的超滤，制备10ml均匀的脂质体。用ζ电位、粒径、分子量测定装置(Model Nano ZS，MalvernInstruments Ltd.，UK)测定所得的生理盐水悬浮液(37℃)中的脂质体颗粒的粒径和ζ电位，结果，粒径为50-350nm、ζ电位为-30至-10mV。
(2)通过脂质体膜面上的三(羟基甲基)氨基甲烷实施亲水性处理
将10ml(1)中制备的脂质体溶液进行使用XM300膜(AmiconCo.，USA)和CBS缓冲液(pH8.5)的超滤，使溶液的pH为8.5。接着，加入10ml交联试剂双(磺基琥珀酰亚氨基)辛二酸酯(BS3；PierceCo.，USA)，在25℃搅拌2小时。然后再在7℃搅拌过夜，使脂质体膜上的脂质二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺与BS3的化学键合反应终止。将该脂质体液用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤。接着，将40mg溶解于1ml CBS缓冲液(pH8.5)的三(羟基甲基)氨基甲烷加入到10ml脂质体液中，在25℃搅拌2小时。然后再在7℃搅拌过夜，使与脂质体膜上的脂质结合的BS3与三(羟基甲基)氨基甲烷的化学键合反应终止。由此，三(羟基甲基)氨基甲烷的羟基与脂质体膜的脂质二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺配位，形成水合亲水性。
(3)通过脂质体脂质膜面上的纤维二糖实施亲水性处理
将10ml(1)中制备的脂质体溶液进行使用XM300膜(AmiconCo.，USA)和CBS缓冲液(pH8.5)的超滤，使溶液的pH为8.5。接着，加入10ml交联试剂双(磺基琥珀酰亚氨基)辛二酸酯(BS3；PierceCo.，USA)，在25℃搅拌2小时。然后再在7℃搅拌过夜，使脂质体膜上的脂质二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺与BS3的化学键合反应终止。将该脂质体液用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤。接着，将50mg溶解于1ml CBS缓冲液(pH8.5)的纤维二糖加入到10ml脂质体液中，在25℃搅拌2小时。然后再在7℃搅拌过夜，使与脂质体膜上的脂质结合的BS3与纤维二糖的化学键合反应终止。由此，纤维二糖的羟基与脂质体膜的脂质二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺配位，形成水合亲水性。
(4)人血清白蛋白(HSA)与结合有三(羟基甲基)氨基甲烷的脂质体膜面的结合
根据已报道的方法(Yamazaki，N.，Kodama，M.and Gabius，H.-J.(1994)Methods Enzymol.242，56-65)，使用偶联反应法进行。即，该反应通过2步化学反应进行，首先，将43mg溶解于1ml TAPS缓冲液(pH8.4)中的偏过碘酸钠加入到(2)中得到的10ml脂质体中，在室温下搅拌2小时，使存在于膜面上的神经节苷脂进行过碘酸氧化，然后采用XM300膜和PBS缓冲液(pH8.0)进行超滤，得到10ml被氧化的脂质体。向该脂质体液中加入20mg人血清白蛋白(HSA)，在25℃搅拌2小时，然后，向PBS(pH8.0)中加入100μl 2M NaBH3CN，在10℃搅拌过夜，通过脂质体上的神经节苷脂与HAS的偶联反应结合HAS。用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，得到10ml结合有HAS的脂质体液。
(5)人血清白蛋白(HSA)与结合有纤维二糖的脂质体膜面上的结合
根据已报道的方法(Yamazaki，N.，Kodama，M.and Gabius，H.-J.(1994)Methods Enzymol.242，56-65)，使用偶联反应法进行。即，该反应通过2步化学反应进行，首先，将43mg溶解于1ml TAPS缓冲液(pH8.4)中的偏过碘酸钠加入到实施例3中得到的10ml脂质体中，在室温下搅拌2小时，使存在于膜面上的神经节苷脂进行过碘酸氧化，然后采用XM300膜和PBS缓冲液(pH8.0)进行超滤，得到10ml被氧化的脂质体。向该脂质体液中加入20mg人血清白蛋白(HSA)，在25℃搅拌2小时，然后，向PBS(pH8.0)中加入100μl 2M NaBH3CN，在10℃搅拌过夜，通过脂质体上的神经节苷脂与HAS的偶联反应结合HAS。用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，得到10ml结合有HAS的脂质体液。
(6)通过三(羟基甲基)氨基甲烷与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白(HSA)的结合对接头蛋白(HSA)实施亲水性处理
为了制备作为亲水性样品之一的脂质体，向1ml(4)中得到的脂质体液的一部分中加入1mg交联试剂3，3’-二硫代双(磺基琥珀酰亚氨基)丙酸酯(DTSSP；Pierce Co.，USA)，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，得到1ml DTSSP与脂质体上的HSA结合的对接头蛋白(HSA)实施亲水性处理的脂质体。接着，向该脂质体液中加入13mg三(羟基甲基)氨基甲烷(WakoCo.，Japan)，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和PBS缓冲液(pH7.2)进行超滤，进行三(羟基甲基)氨基甲烷与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白上的DTSSP的结合。结果得到2ml三(羟基甲基)氨基甲烷与人血清白蛋、脂质体结合并且对接头蛋白(HSA)进行了亲水性处理的作为比较样品的脂质体(脂质总量2mg、蛋白总量200μg)。用ζ电位、粒径、分子量测定装置(Model Nano ZS，MalvernInstruments Ltd.，UK)测定所得的生理盐水悬浮液(37℃)中的脂质体颗粒的粒径和ζ电位，结果，粒径为50-350nm、ζ电位为-30至-10mV。
(7)通过纤维二糖与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白(HSA)的结合对接头蛋白(HSA)实施亲水性处理
为了制备作为亲水性样品之一的脂质体，向1ml(5)中得到的脂质体液的一部分中加入1mg交联试剂3，3’-二硫代双(磺基琥珀酰亚氨基)丙酸酯(DTSSP；Pierce Co.，USA)，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和CBS缓冲液(pH8.5)进行超滤，得到1ml DTSSP与脂质体上的HAS结合的对接头蛋白(HSA)实施亲水性处理的脂质体。接着，向该脂质体液中加入30mg纤维二糖，在25℃搅拌2小时，接着在7℃搅拌过夜，用XM300膜和PBS缓冲液(pH7.2)进行超滤，进行纤维二糖与结合于脂质体膜面的人血清白蛋白上的DTSSP的结合。结果得到2ml三(羟基甲基)氨基甲烷与人血清白蛋、脂质体结合并且对接头蛋白(HSA)进行了亲水性处理的作为比较样品的脂质体(脂质总量2mg、蛋白总量200μg)。用ζ电位、粒径、分子量测定装置(ModelNano ZS，Malvern Instruments Ltd.，UK)测定所得的生理盐水悬浮液(37℃)中的脂质体颗粒的粒径和ζ电位，结果，粒径为50-350nm、ζ电位为-30至-10mV。
(8)未经亲水性处理的脂质体的制备
使用胆酸透析法制备脂质体。即，将二棕榈酰基磷脂酰胆碱、胆固醇、磷酸双十六烷基酯、神经节苷脂(糖脂糖链为含有100％GTlb的糖链)以摩尔比35∶40∶5∶15的比例混合，脂质总量为45.6mg，添加46.9mg胆酸钠，溶解于3ml氯仿/甲醇溶液。蒸发该溶液，在真空中干燥沉淀物，得到脂质膜。将所的脂质膜悬浮于3ml TAPS缓冲液(pH8.4)，进行超声波处理，得到3ml透明的胶束悬浮液。向该胶束悬浮液中加入PBS缓冲液(pH7.2)，制成10ml，再在TAPS缓冲液(pH8.4)中一边搅拌一边以3mg/1ml缓慢滴加完全溶解的多柔比星，均匀混合，然后将该含多柔比星的胶束悬浮液进行使用PM10膜(AmiconCo.，USA)和TAPS缓冲液(pH8.4)的超滤，制备10ml均匀的未实施亲水性处理的脂质体颗粒悬浮液。用ζ电位、粒径、分子量测定装置(Model Nano ZS，Malvern Instruments Ltd.，UK)测定所得的生理盐水悬浮液(37℃)中的未经亲水性处理的脂质体颗粒的粒径和ζ电位，结果，粒径为50-350nm、ζ电位为-30至-10mV。
(9)通过氯胺T法进行脂质体的125I标记
将氯胺T(Wako Pure Chemical Co.，Japan)溶液和二亚硫酸钠溶液在用时分别制备成3mg/ml和5mg/ml。将各50μl在实施例6-8中制备的3种脂质体分别装入Eppendorf管中，接着加入15μl 125I-NaI(NENLife Science Product，Inc.USA)、10μl氯胺T溶液。每隔5分钟加入10μl氯胺T溶液，将该操作重复2次，15分钟后加入100μl二亚硫酸钠作为还原剂，终止反应。接着，进行Sephadex G-50(PhramaciaBiotech.Sweden)柱层析，用PBS洗脱，纯化标记物。最后添加未标记脂质体复合物，调节比活性(4×106Bq/mg蛋白质)，得到3种125I标记脂质体液。
(10)各种脂质体在癌症小鼠的血液中浓度的测定
将Ehrlich ascites tumor(EAT)细胞(约2×107个)移植到雄性ddY小鼠(7周龄)大腿部皮下，将癌组织发育至0.3-0.6g(6-8天后)的小鼠用于本试验。对该癌症小鼠尾静脉注射0.2ml(9)中125I标记的3种脂质体复合物，脂质量的比例为30μg/只。5分钟后采血，用γ射线计数仪(Aloka ARC 300)测定其放射能。放射能在血液中的分布量以每1ml血液中放射能占给予全部放射能的比例(％给予量/ml血液)表示。如图35所示，2种亲水性处理使得在血液中的滞留性都提高，特别是通过三(羟基甲基)氨基甲烷实施的亲水性处理的脂质体在血液中滞留性的提高显著。
本说明书中引用的所有刊行物、专利和专利申请都直接作为参考引入本说明书中。
产业实用性
本发明的炎症性疾病治疗用靶向性脂质体被特异性摄入炎症性疾病部位，并释放包封在脂质体中的炎症性疾病治疗药物。本发明的脂质体具有治疗或诊断用药物的效果，可作为炎症性疾病患者的药物递送系统。
本发明的结合有唾液酸基路易斯X糖链等糖链的脂质体特异性到达表达E，P-选择蛋白的病变部位，在该部位释放具有药效的药物，因此可用作炎症性疾病治疗或诊断用制剂。
如实施例所示，本发明的炎症性疾病治疗用靶向性脂质体中包封抗炎药并给予，与单独给予抗炎药的情况相比，数十倍至数百倍的药物聚集于炎症部位，可发挥显著的效果。
Claims (64)
1.炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，该药用组合物含有脂质体膜结合有糖链的糖链修饰的脂质体。
2.权利要求1的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，脂质体的构成脂质包含磷脂酰胆碱类(摩尔比0-70％)、磷脂酰乙醇胺类(摩尔比0-30％)、1种或以上选自磷脂酸类、长链烷基磷酸盐类和磷酸双十六烷基酯类的脂质(摩尔比0-30％)，1种或以上选自神经节苷脂类、糖脂类、磷脂酰甘油类和鞘磷脂类的脂质(摩尔比0-40％)，以及胆固醇类(摩尔比0-70％)。
3.权利要求2的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，至少1种选自神经节苷脂类、糖脂类、磷脂酰甘油类、鞘磷脂类和胆固醇类的脂质在脂质体表面上集合，形成脂筏。
4.权利要求1-3中任一项的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其结合了种类和密度受到控制的糖链。
5.权利要求1-4中任一项的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，脂质体的粒径为30-500nm。
6.权利要求5的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，脂质体的粒径为50-300nm。
7.权利要求1-6中任一项的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，脂质体的ζ电位为-50至10mV。
8.权利要求7的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，脂质体的ζ电位为-40至0mV。
9.权利要求8的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，脂质体的ζ电位为-30至-10mV。
10.权利要求1-9中任一项的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，糖链经由接头蛋白与脂质体膜结合。
11.权利要求10的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，接头蛋白是来自生物体的蛋白质。
12.权利要求11的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，接头蛋白是来自人的蛋白质。
13.权利要求12的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，接头蛋白是来自人的血清蛋白。
14.权利要求10的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，接头蛋白是人血清白蛋白或牛血清白蛋白。
15.权利要求1-14中任一项的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，接头蛋白与在脂质体表面上形成的含有至少1种选自神经节苷脂类、糖脂类、磷脂酰甘油类、鞘磷脂类和胆固醇类的脂质的脂筏结合。
16.权利要求1-15中任一项的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，亲水性化合物与脂质体膜和/或接头蛋白结合，从而脂质体形成亲水性。
17.权利要求16的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，亲水性化合物是低分子物质。
18.权利要求16或17的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，亲水性化合物不易对糖链形成位阻，不会妨碍靶细胞膜面上的凝集素对糖链分子的识别反应的进行。
19.权利要求16-18中任一项的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，亲水性化合物具有羟基。
20.权利要求16-19中任一项的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，亲水性化合物为氨基醇类。
21.权利要求16-20中任一项的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，亲水性化合物与脂质体膜表面直接结合。
22.炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，该药用组合物是权利要求16所记载的糖链修饰的脂质体，该脂质体通过亲水性化合物而形成亲水性，该亲水性化合物如通式(1)所示，
X-R1(R2OH)n 式(1)
其中R1表示C1-C40的直链或支链烃链，R2不存在或表示C1-C40的直链或支链烃链，X表示与脂质体脂质或接头蛋白直接结合、或者与交联用二价试剂结合的反应性官能团，n表示自然数。
23.炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，该药用组合物是权利要求16所记载的糖链修饰的脂质体，该脂质体通过亲水性化合物而形成亲水性，该亲水性化合物如通式(2)所示，
H2N-R3(R4OH)n 式(2)
其中R3表C1-C40的直链或支链烃链，R4不存在或表C1-C40的直链或支链烃链，H2N表示与脂质体脂质或接头蛋白直接结合、或者与交联用二价试剂结合的反应性官能团，n表示自然数。
24.炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，该药用组合物是权利要求16所记载的糖链修饰的脂质体，该脂质体通过亲水性化合物而形成亲水性，该亲水性化合物如通式(3)所示，
H2N-R5(OH)n 式(3)
其中R5表示C1-C40的直链或支链烃链，H2N表示与脂质体脂质或接头蛋白直接结合、或者与交联用二价试剂结合的反应性官能团，n表示自然数。
25.权利要求16的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中使亲水性化合物三(羟基烷基)氨基链烷与脂质体膜和/或接头蛋白通过共价键结合，由此，脂质体膜和/或接头蛋白形成亲水性。
26.权利要求16的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中使选自三(羟基甲基)氨基乙烷、三(羟基乙基)氨基乙烷、三(羟基丙基)氨基乙烷、三(羟基甲基)氨基甲烷、三(羟基乙基)氨基甲烷、三(羟基丙基)氨基甲烷、三(羟基甲基)氨基丙烷、三(羟基乙基)氨基丙烷、三(羟基丙基)氨基丙烷的亲水性化合物与脂质体膜和/或接头蛋白通过共价键结合，由此，脂质体膜和/或接头蛋白形成亲水性。
27.权利要求1-26中任一项的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，糖链修饰的脂质体以存在于备组织的细胞膜面上的受体——凝集素为靶，所述凝集素选自含有选择蛋白、DC-SIGN、DC-SGNR、胶原凝集素和甘露糖结合凝集素的C型凝集素，含有Siglec的I型凝集素，含有甘露糖-6-磷酸受体的P型凝集素，R型凝集素，L型凝集素，M型凝集素，半乳凝集素。
28.权利要求27的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，糖链修饰的脂质体以选自E-选择蛋白、P-选择蛋白和L-选择蛋白的选择蛋白为靶。
29.权利要求1-28中任一项的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，与脂质体结合的糖链的结合密度为：每个使其与脂质体结合的接头蛋白分子上有1-60个。
30.权利要求1-28中任一项的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，与脂质体结合的糖链的结合密度为：使用接头蛋白时，每个脂质体颗粒上有1-30000个；不使用接头蛋白时，每个脂质体颗粒上最多有1-500000个。
31.权利要求1-30中任一项的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，糖链选自路易斯X型三糖链、唾液酸基路易斯X型四糖链、3’-唾液酸基乳糖胺三糖链、6’-唾液酸基乳糖胺三糖链、α-1，2-甘露二糖二糖链、α-1，3-甘露二糖二糖链、α-1，4-甘露二糖二糖链、α-1，6-甘露二糖二糖链、α-1，3-α-1，6-甘露三糖三糖链、低聚甘露糖-3五糖链、低聚甘露糖-4b六糖链、低聚甘露糖-5七糖链、低聚甘露糖-6八糖链、低聚甘露糖-7九糖链、低聚甘露糖-8十糖链、低聚甘露糖-9十一糖链、乳糖二糖链、2’-岩藻糖基乳糖三糖链、二岩藻糖基乳糖四糖类、3-岩藻糖基乳糖三糖链、3’-唾液酸基乳糖三糖链和6’-唾液酸基乳糖三糖链。
32.权利要求1-31中任一项的炎症性疾病治疗用药用组合物，其中，糖链修饰的脂质体所含的药物选自肾上腺皮质激素、抗炎药、免疫抑制剂、抗癌剂、抗菌药、抗病毒药、血管新生抑制剂、细胞因子或趋化因子、抗细胞因子抗体或抗趋化因子抗体、抗细胞因子·趋化因子受体抗体、siRNA或DNA等基因治疗相关的核酸制剂、神经保护因子以及抗体药物。
33.权利要求32的炎症性疾病治疗用药用组合物，其中，糖链修饰的脂质体所含的药物为肾上腺皮质激素或抗炎药。
34.权利要求33的炎症性疾病治疗用药用组合物，其中，糖链修饰的脂质体所含的药物为泼尼松龙。
35.权利要求32-34中任一项的炎症性疾病治疗用药用组合物，其中，与单独给予药物的情况相比，药物可在炎症部位聚集10倍或以上。
36.权利要求1-35中任一项的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，炎症性疾病选自脑炎，炎症性眼病，耳炎，咽炎，肺炎，胃炎，肠炎，肝炎，胰腺炎，肾炎，膀胱炎，尿道炎，子宫体炎，盆腔炎，关节炎，末梢神经炎，恶性肿瘤，感染性疾病，风湿病、全身性红斑狼疮、结节病(类肉瘤病)等自身免疫疾病，心肌梗塞、脑梗塞等缺血性疾病，糖尿病、通风等代谢性疾病，外伤、热灼伤、化学腐蚀，阿尔茨海默病等神经变性疾病。
37.权利要求36的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中炎症性疾病为炎症性眼病。
38.权利要求36的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中炎症性疾病为风湿病。
39.权利要求36的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中炎症性疾病为肠炎。
40.权利要求1-39中任一项的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，该组合物为口服药用组合物。
41.权利要求1-39中任一项的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，该组合物为胃肠道外给药的药用组合物。
42.炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中脂质体膜形成亲水性，糖链与其表面结合。
43.权利要求42的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中脂质体的构成脂质包含磷脂酰胆碱类(摩尔比0-70％)、磷脂酰乙醇胺类(摩尔比0-30％)、1种或以上选自磷脂酸类、长链烷基磷酸盐类和磷酸双十六烷基酯类的脂质(摩尔比0-30％)，1种或以上选自神经节苷脂类、糖脂类、磷脂酰甘油类和鞘磷脂类的脂质(摩尔比0-40％)，以及胆固醇类(摩尔比0-70％)。
44.权利要求43的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中脂质体还含有蛋白质。
45.权利要求42-44中任一项的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，该组合物通过使亲水性化合物与脂质体膜和/或接头蛋白结合而形成亲水性。
46.权利要求45的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中亲水性化合物为低分子物质。
47.权利要求45或46中任一项的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中亲水性化合物具有羟基。
48.权利要求45-47中任一项的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中亲水性化合物为氨基醇类。
49.权利要求45-48中任一项的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中亲水性化合物与脂质体膜表面直接结合。
50.权利要求45的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，该组合物通过亲水性化合物形成亲水性，该亲水性化合物如通式(1)所示，
X-R1(R2OH)n 式(1)
其中R1表示C1-C40的直链或支链烃链，R2不存在或表C1-C40的直链或支链烃链，X表示与脂质体脂质或接头蛋白直接结合、或者与交联用二价试剂结合的反应性官能团，n表示自然数。
51.权利要求45的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，该组合物通过亲水性化合物形成亲水性，该亲水性化合物如通式(2)所示，
H2N-R3(R4OH)n 式(2)
其中R3表示C1-C40的直链或支链烃链，R4不存在或表示C1-C40的直链或支链烃链，H2N表示与脂质体脂质或接头蛋白直接结合、或者与交联用二价试剂结合的反应性官能团，n表示自然数。
52.权利要求45的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，该组合物通过亲水性化合物形成亲水性，该亲水性化合物如通式(3)所示，
H2N-R5(OH)n 式(3)
其中R5表示C1-C40的直链或支链烃链，H2N表示与脂质体脂质或接头蛋白直接结合、或者与交联用二价试剂结合的反应性官能团，n表示自然数。
53.权利要求45的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中使亲水性化合物三(羟基烷基)氨基链烷与脂质体膜和/或接头蛋白通过共价键结合，由此，脂质体膜和/或接头蛋白形成亲水性。
54.权利要求53的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，使选自三(羟基甲基)氨基乙烷、三(羟基乙基)氨基乙烷、三(羟基丙基)氨基乙烷、三(羟基甲基)氨基甲烷、三(羟基乙基)氨基甲烷、三(羟基丙基)氨基甲烷、三(羟基甲基)氨基丙烷、三(羟基乙基)氨基丙烷、三(羟基丙基)氨基丙烷的亲水性化合物与脂质体膜和/或接头蛋白通过共价键结合，由此，脂质体膜和/或接头蛋白形成亲水性。
55.权利要求42-54中任一项的炎症性疾病治疗用药用组合物，其中，脂质体所含的药物选自肾上腺皮质激素、抗炎药、免疫抑制剂、抗癌剂、抗菌药、抗病毒药、血管新生抑制剂、细胞因子或趋化因子、抗细胞因子抗体或抗趋化因子抗体、抗细胞因子·趋化因子受体抗体、siRNA或DNA等基因治疗相关的核酸制剂、神经保护因子以及抗体药物。
56.权利要求55的炎症性疾病治疗用药用组合物，其中，脂质体所含的药物为肾上腺皮质激素或抗炎药。
57.权利要求56的炎症性疾病治疗用药用组合物，其中，脂质体所含的药物为泼尼松龙。
58.权利要求55-57中任一项的炎症性疾病治疗用药用组合物，其中，与单独给予药物的情况相比，药物可在炎症部位聚集10倍或以上。
59.权利要求42-58中任一项的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中，炎症性疾病选自脑炎，炎症性眼病，耳炎，咽炎，肺炎，胃炎，肠炎，肝炎，胰腺炎，膀胱炎，尿道炎，子宫体炎，盆腔炎，关节炎，末梢神经炎，恶性肿瘤，感染性疾病，风湿病、全身性红斑狼疮、结节病(类肉瘤病)等自身免疫疾病，心肌梗塞、脑梗塞等缺血性疾病，糖尿病、通风等代谢性疾病，外伤、热灼伤、化学腐蚀，阿尔茨海默病等神变性疾病。
60.权利要求59的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中炎症性疾病为炎症性眼病。
61.权利要求59的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中炎症性疾病为风湿病。
62.权利要求59的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，其中炎症性疾病为肠炎。
63.权利要求42-62中任一项的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，该组合物为口服药用组合物。
64.权利要求42-62中任一项的炎症性疾病治疗或诊断用药用组合物，该组合物为胃肠道外给予药用组合物。
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