CN1857675A - 一种莪术油毫微囊滴眼液制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于中药制药技术领域，具体公开了一种莪术油毫微囊滴眼液制剂及其制备方法，其特征在于它是莪术油与聚氰基丙烯酸正己酯制成毫微囊，毫微囊与增溶剂、渗透压调节剂、抗氧剂、增粘剂、防腐剂制备而成；本发明还公开了上述滴眼液制剂的制备方法。该滴眼液制剂具有很好的抗菌、抗病毒、抗炎作用，与此同时提高了药物在结膜和角膜中的吸附时间，使疗效得到显著提高，使药物具有更明显的靶向作用。药理实验表明，本发明的滴眼液能很好的治疗眼科方面的疾病。
Description
技术领域
本发明属于中药制药技术领域，具体涉及一种莪术油毫微囊滴眼液制剂及其制备方法。
背景技术
莪术为姜科植物蓬莪术Curcuma phaeocaulis Val.、广西莪术Curcumakwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang或温郁金Curcuma wengyujun Y.H.Chen et C.Ling的干燥根茎，首载于《药性论》，主要产于广西、四川、浙江等地。其性温味辛苦，具有破血行气、消积止痛的功效，是临床上较为常用的活血化瘀药物。中医理论认为莪术辛、苦、温，归肝、脾经，具行气破血，消积止痛之功效。莪术油为莪术中提取的挥发油，据药理学研究报道，莪术油具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒等作用，是一种具有发展前途的抗肿瘤、抗炎药物。
由莪术油为主要成分的滴眼液在治疗单纯疱疹病毒性角膜炎(HSK)、流行性角结膜炎(EKC)已经取得了很好的临床疗效。但是该滴眼液中药物透过角膜屏障的能力较差，易随眼液排出。半衰期很短，所以真正被眼部吸收的药物比例小，而将药物制成(聚)氰基丙烯酸正己酯毫微囊滴入眼中，它易透过角膜屏障，在结膜和角膜中粘附的药量增加，吸附时间延长，而且在发炎眼中的粘附量比在正常的量高出4倍多，表明对发炎组织有一定的靶向性，所以利用这一特征制成的滴眼液可起到延长药效，提高靶向性的作用，这也是此制剂的一个突出优点。此外(聚)氰基丙烯酸正己酯较其他丙烯酸衍生物的最大优点是聚合过程简单及所得的聚合物可生物降解。莪术油毫微囊化后可掩盖莪术油的不良气味和口味，提高药物的稳定性，减少对胃的刺激性，使液态药物固态化，因此而便于制剂及贮存。
发明内容
现代药理研究证实，莪术油具有抗菌、抗病毒、抗炎作用和增强机体自身免疫力的双向调节作用。本发明的研究人员在试验中发现，将莪术油制备成本发明的毫微囊滴眼液制剂。该滴眼液制剂具有很好的抗菌、抗病毒、抗炎作用，与此同时提高了药物在结膜和角膜中的吸附时间，使疗效得到显著提高，使药物具有更明显的靶向作用。
本发明的目的是公开一种具有抗菌、抗病毒、抗炎作用、疗效好、吸附时间长，靶向作用明显的的滴眼液制剂。
本发明的另一个目的是公开上述滴眼液制剂的制备方法。
本发明通过以下方案实现：
一、制备方法
(1)本发明的莪术油毫微囊滴眼液中：莪术油1-10重量份，氰基丙烯酸烷酯6-40重量份，增溶剂1-10重量份，抗氧剂0.5-5重量份，防腐剂0.01-0.03重量份，增粘剂0.1-100重量份，渗透压调节剂0.1-100重量份；
(2)药物载体的制备方法：
将莪术油溶解在含有右旋糖酐或非离子型表面活性剂的酸性水溶液中，调解pH值至适宜范围，在连续搅拌下，缓缓加入氰基丙烯酸烷酯，两者发生聚合反应，即得粒径为10-1000nm的毫微囊；
(3)将上述毫微囊与增溶剂混匀，再加入渗透压调节剂、抗氧剂、增粘剂、防腐剂，充分搅拌，再加磷酸盐缓冲溶液至1000ml，微孔滤膜滤过，滤液分装，即得本发明莪术油毫微囊滴眼液。
滴眼液中挥发油的增溶剂以吐温-80最为常用，但是高浓度对眼有可能产生刺激性，同时对抑菌剂的抑菌作用产生一定的影响，本发明研究人员经过大量试验，确定增溶剂吐温-80的合适浓度为0.1％-1％，优选浓度0.5％。
为防止本发明滴眼液中含有的药物被氧化，避免溶液发生变色、混浊、沉淀等现象，因此需加入抗氧剂使其利于稳定存放；本发明制备方法采用NaHSO3作为抗氧剂，优选用量为0.1～0.2％。
本发明选择苯扎氯铵作为抑菌剂，其有效浓度为0.001％～0.003％，本品优选浓度为0.002％。
二、药理实施例
为了充分证明本发明莪术油毫微囊滴眼液的药理作用，本发明研究人员以临床上治疗眼科疾病效果好，并以被认可的西药为阳性对照药，进行了以下的药效学试验。
本发明莪术油毫微囊滴眼液由温州医学院药物制剂研究室提供，规格为8ml/瓶；阿昔洛韦滴眼液，安徽三超药业有限公司生产，规格为8mg/8ml/瓶；醋酸氢化可的松滴眼液，广州东康药业有限公司生产，15mg/5ml；盐酸曲马多注射液，山东鲁抗辰欣药业有限公司生产。
新西兰家兔、昆明小鼠、SD大鼠：由温州医学院实验动物中心提供；BALB/c小鼠，由第一军医大学实验动物中心提供。
单纯疱疹病毒1型(HSV-I)，腺病毒8型(Ad-8)：购自中国科学院病毒研究所，测得半数组织细胞感染量(TCID50)为10-6与10-5。Hep-2细胞株：购自中国科学院上海细胞生物所。
标准菌株：大肠埃希菌ATCC25922株，金黄色葡萄球菌ATCC25925株，甲型溶血性链球菌32209株，肺炎球菌32401株，绿脓杆菌CMCC(B)10102株，白色假丝酵母菌CMCC(F001002)，以上标准菌株冻干菌株购自中国医学科学院北京药品生物制品鉴定所中国医学细菌保藏中心，试验前传代备用。
临床分离株：金黄色葡萄球菌，甲型溶血性链球菌，乙型溶血性链球菌，肺炎球菌，肺炎克雷伯菌临床分离株由中山大学第三医院提供。
DMEM培养基：GIBCO公司产品。按说明配好后调PH值6.9-7.2，滤过消毒，分装并4℃保存。用前根据需要配成10％灭活胎牛血清完全培养基，水浴至37℃，加入2mmol/L谷氨酰胺和1％青、链霉素，NaHCO3调pH约7.2。
胎牛血清：杭州市四季青生物工程材料有限公司，特级，无支原体。用前至50℃水浴中30min灭活。
MH培养基、沙保弱氏培养基、5％小牛血清肉汤、血平板培养基：按《现代微生物培养基和试剂手册》制备。
YZ-5CS照相裂隙灯显微镜，苏州医药器械厂生产。
1、对实验小鼠单纯疱疹病毒性角膜炎的治疗作用
6周龄BALB/c小鼠72只，雌雄各半，分设正常对照组(12只)、模型对照组(12只)、阿昔洛韦滴眼液组(12只)、莪术油毫微囊滴眼液高剂量组(12只)、莪术油毫微囊滴眼液中剂量组(12只)和莪术油毫微囊滴眼液低剂量组(12只)。
角膜HSV-1感染：BALB/c小鼠腹腔内注射戊巴比妥钠(40mg/kg体重)麻醉，用无菌1号针头呈“#”形划伤每只小鼠左眼角膜，正常对照组点滴5μl生理盐水于角膜表面，其余小鼠点滴5μl HSV-1于角膜表面，同时轻轻按摩眼睑约30s。角膜感染HSV-1的小鼠在感染后24h按雌雄各半，随机分为模型组、阿昔洛韦滴眼液组、莪术油毫微囊滴眼液高剂量组(原液)、莪术油毫微囊滴眼液中剂量组(1/2原液)和莪术油毫微囊滴眼液低剂量组(1/4原液)。
治疗药物的给予：HSV-1的感染后24h，阿昔洛韦滴眼液8μl/次，莪术油毫微囊滴眼液组高、中、低三个剂量组分别给予三种浓度的滴眼液8μl/次，一天四次，间隔3h，连续给药11天。模型组不给任何药物和溶剂。
观察指标：角膜荧光染色：于感染后第3天、5天、7天、9天和12天用荧光素钠染色，在裂隙显微镜下观察病灶部位着色情况，按下述标准评分：
0分：角膜基质清晰透明，无着色；
1分：角膜基质稍浑浊，点状病灶数＜10，着色范围为角膜面积1/4以内；
2分：角膜基质中度浑浊，点状病灶数10～20或出现短树枝状病灶，着色范围为角膜面积1/4～1/2；
3分：角膜基质重度浑浊，点状病灶数10～20或出现树枝状、地图状病灶，但仍可判断瞳孔缘的位置，着色范围为角膜面积1/2～3/4；
4分：角膜基质完全浑浊，失去后部特征，出现密集树枝状或成片地图状病灶，着色范围为角膜面积3/4以上。
试验结果：本实验的HSV-1能成功感染BALB/C小鼠，在角膜接种病毒后的第3天，荧光素钠染色显示角膜可出现点状、短树枝状病灶；并有随着时间的推移而加重的趋势，至第8天以后，病情趋于稳定。莪术油毫微囊滴眼液给药治疗后，荧光素钠染色表明高、中剂量组随治疗时间的延长，角膜病变有减轻的趋势，其中中剂量组减轻的程度不如阿昔洛韦滴眼液；低剂量组病变减轻的趋势不明显。详见表1。
表1 对实验性小鼠I型单纯疱疹病毒性角膜炎病变范围的影响
| 组别 | 用药后不同时间角膜病变评分( x±SD) | ||||
| 3d | 5d | 7d | 9d | 12d | |
| 空白组模型组莪术油毫微囊滴眼液低剂量莪术油毫微囊滴眼液中剂量 | 0.0±0.001.0±0.651.2±0.791.1±0.60 | 0±0.002.0±0.672.4±0.521.7±0.79 | 0±0.002.9±0.722.7±0.722.5±0.97 | 0±0.002.7±0.732.3±1.02.2±1.06 | 0±0.002.6±0.922.0±1.01.2±1.37* |
| 莪术油毫微囊滴眼液高剂量阳性组(阿昔洛韦) | 1.0±0.491.1±0.39 | 1.5±0.721.7±0.72 | 2.0±1.071.9±0.56** | 1.4±1.0*1.4±1.10* | 1.1±1.17*1.0±1.17** |
与模型组比较，*P＜0.05，*P＜0.01。
结果显示，莪术油毫微囊滴眼液对实验小鼠单纯疱疹病毒角膜炎有治疗作用，高浓度的莪术油毫微囊滴眼液的治疗作用不亚于阿昔洛韦滴眼液。
2、对实验家兔单纯疱疹病毒性角膜炎的治疗作用
HSV-I对Hep-2的TCID50的测定：将经过传代后HSV-I作10-1-10-8对数比例稀释，接种于已长成单层的Hep-2细胞上，每稀释度接种4孔，每孔0.1ml，37℃吸附90min后，弃之，用维持液洗数次后换维持液，同时增设正常细胞对照，置37℃CO2培养箱中培养5d，逐日观察记录CPE(细胞病变)出现情况，按Reed andMuench法计算TCID50。实验测得实验用HSV-I毒株对Hep-2的TCLD50为10-6。
模型制备：取健康无眼疾白色家兔50只，雌雄兼用，双眼均经点0.25％氯霉素每2小时1次，每天5次，三天后开始造模，双眼滴0.25％的卡因表面麻醉后，用5号注射针头在家兔角膜划“井”字(深度仅限上皮层)，取定量移液管在兔下眼睑内滴入105TCID50HSV-I 100μl，闭合眼睑按摩30秒。感染48小时后，动物有畏光、流泪，角膜出现点、条、片、块、树枝或地图状病变，参照文献方法并适当修改对病变进行评分，按病情轻重进行随机分组为5组，分别为溶剂对照组(10只)，阿昔洛韦滴眼液组(10只)，莪术油毫微囊滴眼液高、中、低剂量组(分别10、10、10只)。对照组给等体积溶剂，阿昔洛韦滴眼液给0.1ml/次；莪术油毫微囊滴眼液组高、中、低三个剂量组(剂量多少？)分别给予三种浓度的莪术油毫微囊滴眼液0.1ml/次，一日五次，间隔2小时，连续给药14天。
观察指标：(1)角膜荧光素染色：感染48小时后3、5、7、9、11、13、15天用荧光素钠染色一次，在裂隙灯显微镜下观察病灶部位着色情况，按下述标准进行分级评分：-无着色和混浊；+点状病灶数＜10，着色范围为角膜面积1/4以内；++点状病灶数10-20或出现短树枝状病灶，着色范围为角膜面积1/4-1/2；+++点状病灶数10-20或出现树枝状、地图状病灶，着色范围为角膜面积1/2-3/4；++++密集树枝状或在片地图状病灶，着色范围为角膜面积3/4以上。
(2)角膜粘取物分离病毒：感染48小时后3、5、7、9、11、13、15天用含倍量用抗生素(青霉素+链霉素+卡那霉素)的维持液浸湿棉拭子轻擦上下穹窿部结膜，轻轻擦过角膜表面并在内眦部停留10秒，按液体经4℃作用4小时进行病毒分离。
试验结果：模型组动物在感染病毒48小时后角膜出现点状、树枝状、或地图样病灶，甚至出现基质层水肿、浸润，在10天后有自行减轻或痊愈的趋势，病毒分离率在13天也有减少；莪术油毫微囊滴眼液组给药治疗后，隔日荧光素染色角膜，可见块状病灶随治疗天数增加而缩小和表浅；而I型单纯疱疹病毒分离率随给药天数增加而下降，莪术油毫微囊滴眼液在高、中、低三个剂量组对实验性家兔单纯疱疹角膜炎均有治疗作用，转阴率明显快于模型对照组，病变分值明显低于模型对照组，另病毒检出率于9天后用药组明显小于模型对照组。结果表明莪术油毫微囊滴眼液对实验性家兔单纯性疱疹病毒角膜炎有治疗作用。详见表2。
表2 对实验性家兔单纯性疱疹毒性角膜炎的病毒检出率的影响(
x±s)
| 组别 | 用药后病毒检出率(％) | |||||||
| 3 | 5 | 7 | 9 | 11 | 13 | 15 | ||
| 溶剂对照组阿昔洛韦组 | 100.0100.0 | 100.088.4 | 100.066.6* | 100.044.3** | 100.033.2** | 88.933.2** | 66.722.1** | |
| 莪术油毫微囊滴眼液 | 高剂量组中剂量组低剂量组 | 100.0100.0100.0 | 80.0100.0100.0 | 60.050.0*70.0 | 40.0**54.6*50.0* | 30.0**33.3**40.0* | 20.0**33.3**20.0** | 10.0**22.2*20.0** |
与模型组比较*p＜0.05，**p＜0.01。
3、体外抗病毒作用
3.1药物对细胞的最大无毒浓度(TD)的测定：将药物用细胞维持液将莪术油毫微囊滴眼液与阿昔洛韦按2倍稀释成六个浓度，分别加入细胞已长成单层的96孔培养板中，每孔加0.1ml，各浓度加4孔，同时设正常细胞对照，于37℃ 5％ CO2温箱中培养5天，每日镜下观察细胞形态。观察莪术油毫微囊滴眼液与阿昔洛韦的最大无毒浓度与TD50。
结果：莪术油毫微囊滴眼液对Hep-2细胞的TD为0.36g生药/L；阿昔洛韦对Hep-2细胞的TD为25μg/L。
3.2病毒的毒力测定：将经过传代后HSV-I或AD-8作10-1-10-8对数比例稀释，接种于已长成单层的Hep-2细胞上，每稀释度接种4孔，每孔0.1ml，37℃吸附1小时后，弃病毒液，换维持液，同时增设正常细胞对照，置37℃CO2培养箱中培养5d，逐日观察记录CPE(细胞病变)出现情况，按Reed and Muench法计算TCID50。
实验测得：实验用HSV-I毒株对Hep-2的TCLD50为10-6，AD-8对Hep-2的TCLD50为10-5。
3.3对病毒致细胞病变的抑制作用：病毒攻击量为100TCID50/0.1ml，37℃吸附1小时后，弃病毒液，加入含不同浓度药物的维持液，每孔0.1ml，各个浓度设4孔，同时设正常细胞对照和病毒对照各4孔。37℃ 5％CO2培养箱中培养4天后记录各细胞孔的细胞病变。同法重复实验。计算药物半数有效浓度(EC50)。结果见表3和表4。
表3 药物对单纯疱疹病毒I型致细胞病变作用的影响
| 组别 | 剂量(mg/ml) | 每孔CEP | CEP抑制率(％) | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 | |||
| 莪术油毫微囊滴眼液 | 0.720.36 | 01 | 00 | 01 | 01 | 10090.0 |
| 无环鸟苷细胞对照病毒对照 | 0.180.090.0450.0160.0080.0040.0020.001-- | 2440122304 | 1330112404 | 2240013304 | 2340012404 | 58.318.52.610094.373.133.33.20100 |
*与病毒对照组比较，经fisner精确概率法检验：P＜0.01。
采用Reed-Muench法计算，莪术油毫微囊滴眼液、阿昔洛韦抗单纯疱疹病毒1型的EC50分别为0.162g/L、2.5μg/L。
表4 药物对腺病毒3型致细胞病变作用的影响
| 组别 | 剂量(mg/ml) | 每孔CEP | CEP抑制率(％) | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 | |||
| 莪术油毫微囊滴眼液无环鸟苷细胞对照病毒对照 | 0.720.360.180.090.0450.0160.0080.0040.0020.001-- | 012440122304 | 122340113404 | 012340023404 | 011340122404 | 97.479.348.010.3010090.661.529.23.00100 |
*与病毒对照组比较，经fisner精确概率法检验：P＜0.01。
采用Reed-Muench法计算，莪术油毫微囊滴眼液、阿昔洛韦抗单纯疱疹病毒1型的EC50分别为0.22g/L、3.2μg/L。
4、体外抗菌试验
4.1试验菌液配制：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、绿脓假单孢菌、肺炎克雷伯菌接种于MH肉汤，置普通培养箱37℃、24小时培养；甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌、肺炎球菌接种于5％小牛血清肉汤，5％ CO2培养箱37℃、48小时培养；白色假丝酵母菌接种于沙保弱氏肉汤，置普通培养箱37℃、48小时培养；比浊法进行细菌计数，转种于平板测定菌液中活菌数即菌落形成单位(CFU)/ml。用稀释液调配成106CFU/ml菌液备用。
4.2最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定
大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌的MIC、MBC测定：将莪术油毫微囊滴眼液用MH肉汤由50％(W/V)为起点进行2ml/2ml连续二倍梯度稀释，依次加入浓度为106CFU/ml的试验菌液0.05ml。同时设立细菌以及培养基对照。置4℃作用12小时，于普通培养箱37℃、48小时培养，观察结果。无细菌生长试管中所含最小药物浓度为最小抑菌浓度(MIC)。再依次将未见细菌生长各管的培养物分别吸取0.1ml涂于MH平板，置普通培养箱37℃、48小时培养，平板上菌落数小于5个的平板中所含最小药物浓度为最小杀菌浓度(MBC)。
4.3甲型溶血性链球菌，肺炎球菌的MIC、MBC的测定：将莪术油毫微囊滴眼液用含5％小牛血清的MH肉汤由50％为起点进行连续二倍梯度稀释，加入106CFU/ml的菌液0.05ml，设立细菌及培养基对照，4℃作用12小时，置5％CO2培养箱37℃、48小时培养，观察结果。无细菌生长试管中所含药物最小浓度为MIC。将无细菌生长试管中培养物0.1ml依次转染到营养平板(甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌接种于血平板，卡他球菌接种于巧克力色平板)，置5％CO2培养箱37℃、48小时培养，平板上菌落数小于5个的平板所含药物最小浓度为MBC。4.3试验结果：见表5和表6。
表5 莪术油毫微囊滴眼液对标准菌株的MIC和MBC
| 菌株 | MIC(生药g/ml) | MBC(生药g/ml) |
| 大肠埃希菌 ATCC25922株金黄色葡萄球菌ATCC25925株甲型溶血性链球菌 32209株肺炎球菌 31001株绿脓杆菌 46104株 | 0.1800.3600.0450.0900.720 | 0.7200.3600.0900.360- |
“一”表示未见明显抑菌或杀菌现象
从表5可见，莪术油毫微囊滴眼液提取液对试验所选用的5株标准菌株均有较明显的抑制和灭活作用，其MBC为MIC的1-4倍。
表6 莪术油毫微囊滴眼液对临床分离菌株的MIC、MIC50、MIC90及MBC
| 菌株 | 株数 | MIC范围 | MIC50 | MIC90 | MBC范围 |
| 金黄葡菌甲型链菌乙型链菌肺炎球菌克雷伯菌 | 7560703525 | 0.022-0.1800.045-0.3600.180-0.7200.090-0.1800.045-0.180 | 0.0810.1700.3670.1200.108 | 0.1560.3240.6900.1650.167 | 0.180-0.0360.360-0.720无0.180-0.7200.180-0.360 |
从表6中可见，莪术油毫微囊滴眼液对试验所选用的临床分离菌株均有一定的抑制和灭活作用，其MBC为MIC的2-4倍。
5、莪术油毫微囊滴眼液的抗炎作用
5.1对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响
取昆明种小鼠50只，18-22g剪去右耳周围的毛，随机分为五组，即溶剂组，醋酸氢化可的松滴眼液，莪术油毫微囊滴眼液高、中、低三个剂量组。用微量移液器吸取25μl受试药液涂于右耳耳廓两侧，一日三次，连续给药五日，于末次给予30min后，以25μl二甲苯涂于右耳耳廓两侧，15min后脱臼处死，用6mm的打孔器将小鼠双耳相同部位打孔取材，分别精密称重，以两耳重量差值作为肿胀度指标，比较药物组与溶剂组的差异，并求出抑制率。
结果表明，莪术油毫微囊滴眼液的三个剂量对小鼠耳廓肿胀有明显的抑制作用，醋酸氢化可的松滴眼液也表现出明显的抑制作用，详见表7。
表7 对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响(n＝10，x±s)
| 组别 | 耳片重(mg) | 抑制率(％) | ||
| 左 | 右 | |||
| 溶剂对照组氢化可的松 | 10.45±1.0410.23±1.12 | 25.17±2.4817.15±1.42* | -31.86 | |
| 莪术油毫微囊滴眼液 | 高中低 | 11.05±1.6810.74±1.2311.04±1.43 | 18.32±0.34*20.17±0.44*20.05±3.32* | 27.2119.8620.34 |
与溶剂组比较：*p＜0.05，与致炎前自身比较均P＜0.05。
5.2对鸡蛋清所致大鼠足跖肿胀的影响
采用大鼠足跖肿胀试验来观察莪术油毫微囊滴眼液的抗炎消肿作用。170-190g SD大鼠50只，随机分成五组，分别为溶剂组，氢化可的松组，眼滴莪术油毫微囊滴眼液高、中和低三个剂量组。各组按相应剂量涂于足跖，于致炎前每日涂3次，连续五日，末次给药后30分钟，在大鼠足跖部皮下注射新鲜配制的1％鸡蛋清0.05ml致炎，用足跖容积测定仪测量致炎前后大白鼠足跖关节以下的容积变化，计算并比较致炎后0.5h、1h、2h、4h各组大鼠致炎前后足体积的差值为肿胀度，比较各组肿胀度的差异。
结果表明，莪术油毫微囊滴眼液的高、中、低剂量在给药后1h-4h均抑制大鼠足跖肿胀的作用，与对照组比较2h后皆有显著性差异。结果见表8。
表8 对琼脂致大鼠足跖肿胀的影响(n＝10，x±s)
| 组别 | 致炎前足跖体积(ml) | 0.5h | 致炎后不同时间足跖肿胀度(ml) | |||
| 1h | 2h | 4h | ||||
| 浴剂对照氢化可的松 | 1.14±0.111.08±0.13 | 0.265±0.0520.207±0.054** | 0.232±0.0480.175±0.052** | 0.196±0.0450.126±0.046** | 0.128±0.0360.077±0.047* | |
| 莪术油毫微囊滴眼液 | 大中小 | 1.15±0.121.12±0.121.10±0.14 | 0.235±0.0740.228±0.0650.256±0.088 | 0.168±0.052**0.189±0.0600.184±0.070 | 0.130±0.042**0.136±0.050**0.158±0.062 | 0.082±0.032**0.086±0.042**0.097±0.050 |
与溶剂组比较：*p＜0.05，**p＜0.01；与致炎前自身比较均P＜0.01。
6、热板法镇痛试验
取昆明种小鼠60只，均雌性，18～22g。给药前1日先经筛选，用热板测痛仪55±5℃刺激，测定每只鼠出现舔后足反应的时间(秒)即致痛潜伏期，选取痛阈值在5～30秒的合格小鼠，按痛阈值随机分为5组，实验时同上法测定每鼠给药前痛阈值(T0)，随即尾静脉给药：空白对照组ip溶剂0.2ml/10g，阳性对照组ip盐酸曲马多注射液50mg/kg，给药组分别ip三种浓度的莪术油毫微囊滴眼液0.2ml/10g体重。给药后30min同上法测定每鼠给药后痛阈值(T1)，与给药前比较，计算痛阈提高百分率％＝(T1-T0)/T0×100。结果见表9。
表9 莪术油毫微囊滴眼液对小鼠热板致痛的影响(
X±SD)
| 药物 | n | T0(s) | T1(s) | 提高率(％) | |
| 溶剂对照盐酸曲马多莪术油毫微囊滴眼液 | 高中低 | 1010101010 | 15.61±0.5816.57±0.1717.14±0.7814.25±0.1914.14±0.35 | 16.14±0.9029.25±0.87**25.12±0.70*18.16±0.3316.29±0.21 | 3.5176.5246.5627.4415.21 |
与空白对照组比，*P＞0.05，**P＜0.05。
由表9可见，莪术油毫微囊滴眼液能提高小鼠热板致痛的痛阈值，高剂量给药组作用显著，中低剂量组没明显作用，阳性药物盐酸曲马多注射液有明显的镇痛作用。
以上药理试验结果说明：莪术油毫微囊滴眼液对实验性小鼠、家兔单纯疱疹性角膜炎试验有良好的作用，表现为可明显减轻角膜的病理改变和减少病毒分离率，加快痊愈时间。体外抗菌、抗病毒试验结果显示莪术油有较强的清热解毒，对HSV-1与AD-8均有较强抑制作用，对金黄色葡萄球菌、大肠埃氏菌、肺炎球菌等五侏标准菌株及120株临床菌株均表现出一定的抗菌作用，小鼠耳廓肿长试验和大鼠足跖肿胀试验均表明莪术油毫微囊滴眼液的较好的抗炎作用，镇痛试验表明莪术油没有明显的镇痛作用。综上所述莪术油毫微囊滴眼液有抗菌、抗病毒、抗炎等作用，对病毒性角、结膜炎有良好的治疗作用基础。
三、刺激性试验
单次用药眼刺激性试验：取健康无眼疾白色家兔8只，将0.1ml莪术油毫微囊滴眼液滴入于家兔右侧眼结膜囊内，另一侧以0.1ml作溶媒对照。给受试物后，用手将动物眼睑被动闭合10秒。记录给莪术油毫微囊滴眼液后6、24、48、72小时至7天的局部反应情况。按表10的要求，将每只家兔与莪术油毫微囊滴眼液接触后角膜、虹膜和结膜的平均分值及眼刺激反应的综合平均分值(即三种平均分值的总和)。而后以表11的评价标准，判断给莪术油毫微囊滴眼液后6、24、48、72小时至第七天时的刺激分值，并以最高分值为准，判定莪术油毫微囊滴眼液对眼刺激性的反应程度。
结果：滴入莪术油毫微囊滴眼液的右眼在用药6小时后有一只家兔结膜有一点轻度充血，其余动物未见明显改变。结果表明实验平均分均小于3，由此可判定莪术油毫微囊滴眼液一次滴眼没有刺激性。
多次给药眼刺激性试验：取健康无眼疾白色家兔8只，将家兔右眼下眼睑拉成杯状，把0.1ml莪术油毫微囊滴眼液滴入于右侧眼结膜囊内，用手将动物眼睑被动闭合10秒。另一侧作溶媒对照，记录每天末次给莪术油毫微囊滴眼液后1小时局部反应情况。同时观察全身反应。每小时滴眼1次，每天6次，连续滴7天。停药后再观察七天。按表10的要求，将每只家兔与莪术油毫微囊滴眼液接触后角膜、虹膜和结膜的平均分值及眼刺激反应的综合平均分值(即三种平均分值的总和)。而后以表11的评价标准，观察每天给莪术油毫微囊滴眼液后的刺激分值，判定莪术油毫微囊滴眼液的眼刺激性程度。
结果：在给药的七日及停药七日的过程中对家兔的饮食、活动、大小便及精神状态等一般体征没有明显影响，除个别家免体重略有下降外，整体对家兔体重没有明显影响。莪术油毫微囊滴眼液与空白溶剂连续滴七日及停药后七日的眼刺激分值，结果同溶剂对照组比较可见莪术油毫微囊滴眼液2只家兔在给药2-4天内结膜表现有轻-中度充血，从实验平均分值与眼刺激评价标准看莪术油毫微囊滴眼液没有明显刺激性。试验结束将各兔处死，解剖，观察心、肝、脾、肺、肾、胃肠、胸腺、生殖器官等主要脏器进行观察，未见异常变化。
表10 眼刺激反应评分
| 眼刺激反应 | 分值 |
| 角膜混浊(以最致密部位为准)无混浊散在或弥温性混浊，虹膜清晰可见半透明区易分辨，虹膜模糊不清出现灰白色半透明区，虹膜细节不清，瞳孔大小勉强可见角膜不透明，由于混浊，虹膜无法辨认虹膜正常皱褶明显加深，由于混浊、肿胀、角膜周围有轻度充血，瞳孔对光仍有反应出血、肉眼可见坏死，对光无反应(或出现其中一种病理反应)结膜A、充血(指睑结膜、球结膜部位)血管正常血管充血呈鲜色血管充血呈深红色，血管不易分辨弥温性充血呈紫红色B、水肿无水肿轻微水肿(包括瞬膜)明显水肿，伴有部分结膜外翻水肿致眼脸近半闭合水肿致眼脸超过半闭合C、分泌物无分泌物少量分泌物分泌物使眼睑和睫毛潮湿或粘着分泌物使整个眼区潮湿或粘着 | 011210120101010100101 |
| 总积分 | 14 |
表11 眼刺激评价标准
| 刺激程度 | 积分 |
| 无刺激性轻度刺激性中度刺激性强度刺激性 | 0-3.94-8.99-12.913-16.9 |
结论：由单次用药与多次用药结果表明：一次用药没有明显的刺激性反应，多次用药后2/8例家兔在连续用药两天后结膜出现轻到中度充血，到第六日后恢复正常，停药后未见异常改变，根据眼刺激性评价标准，多次给药眼刺激性综合平均分值最高值为0.66，属于无刺激性，结果表明莪术油毫微囊滴眼液连续用药没有明显刺激性。
四、制备实施例
实施例1
(1)本发明的莪术油毫微囊滴眼液中：莪术油5g，冰片25g，聚氰基丙烯酸正己酯40g；
(2)药物载体的制备方法：
将莪术油5g与冰片25g溶解在含有右旋糖酐或非离子型表面活性剂的酸性水溶液中，调解pH值2-3，在连续搅拌下，缓缓加入聚氰基丙烯酸正己酯40g，两者发生聚合反应，即得毫微囊。
(3)将上述毫微囊与80ml吐温-80混匀，搅拌加入到上述提取物溶液中，再加入41g氯化钠、10g亚硫酸氢钠、10g甲基纤维素、0.2g苯扎氯铵，充分搅拌，再加磷酸盐缓冲溶液至1000ml，微孔滤膜滤过，滤液分装成1000支，即得本发明莪术油毫微囊滴眼液。
实施例2
(1)本发明的莪术油毫微囊滴眼液中：莪术油3g，冰片15g，聚氰基丙烯酸正己酯24g；
(2)药物载体的制备方法：
将莪术油3g与15g溶解在含有右旋糖酐或非离子型表面活性剂的酸性水溶液中，调解pH值2-3，在连续搅拌下，缓缓加入聚氰基丙烯酸正己酯24g，两者发生聚合反应，即得毫微囊。
(3)将上述毫微囊与30ml吐温-80混匀，搅拌加入到上述提取物溶液中，再加入31g氯化钠、7g亚硫酸氢钠、6g甲基纤维素、0.1g苯扎氯铵，充分搅拌，再加磷酸盐缓冲溶液至1000ml，微孔滤膜滤过，滤液分装成1000支，即得本发明莪术油毫微囊滴眼液。
实施例3
(1)本发明的莪术油毫微囊滴眼液中：莪术油10g，冰片50g，聚氰基丙烯酸正丁酯80g；
(2)药物载体的制备方法：
将莪术油10g与冰片50g溶解在含有右旋糖酐或非离子型表面活性剂的酸性水溶液中，调解pH值2-3，在连续搅拌下，缓缓加入聚氰基丙烯酸正丁酯80g，两者发生聚合反应，即得毫微囊。
(3)将上述毫微囊与160ml吐温-80混匀，搅拌加入到上述提取物溶液中，再加入82g氯化钠、30g亚硫酸氢钠、20g甲基纤维素、0.4g苯扎氯铵，充分搅拌，再加磷酸盐缓冲溶液至1000ml，微孔滤膜滤过，滤液分装成1000支，即得本发明莪术油毫微囊滴眼液。
实施例4
(1)本发明的莪术油毫微囊滴眼液中：莪术油4g，冰片20g，聚氰基丙烯酸正丁酯32g；
(2)药物载体的制备方法：
将莪术油4g与冰片20g溶解在含有右旋糖酐或非离子型表面活性剂的酸性水溶液中，调解pH值2-3，在连续搅拌下，缓缓加入聚氰基丙烯酸正丁酯32g，两者发生聚合反应，即得毫微囊。
(3)将上述毫微囊与60ml吐温-80混匀，搅拌加入到上述提取物溶液中，再加入35g氯化钠、13g亚硫酸氢钠、10g甲基纤维素、0.15g苯扎氯铵，充分搅拌，再加磷酸盐缓冲溶液至1000ml，微孔滤膜滤过，滤液分装成1000支，即得本发明莪术油毫微囊滴眼液。
实施例5
(1)本发明的莪术油毫微囊滴眼液中：莪术油2g，冰片10g，聚氰基丙烯酸正己酯16g
(2)药物载体的制备方法：
将莪术油2g与冰片10g溶解在含有右旋糖酐或非离子型表面活性剂的酸性水溶液中，调解pH值2-3，在连续搅拌下，缓缓加入聚氰基丙烯酸正己酯16g，两者发生聚合反应，即得毫微囊。
(3)将上述毫微囊与20ml吐温-80混匀，搅拌加入到上述提取物溶液中，再加入14g氯化钠、8g亚硫酸氢钠、4g甲基纤维素、0.04g苯扎氯铵，充分搅拌，再加磷酸盐缓冲溶液至1000ml，微孔滤膜滤过，滤液分装成1000支，即得本发明莪术油毫微囊滴眼液。
Claims (9)
1.一种莪术油毫微囊滴眼液制剂及其制备方法，其特征在于，莪术油1-10重量份，氰基丙烯酸烷酯6-40重量份，增溶剂1-10重量份，抗氧剂0.5-5重量份，防腐剂0.001-0.003重量份，增粘剂0.1-100重量份，渗透压调节剂0.1-100重量份。
2.按权利要求1所述的莪术油毫微囊滴眼液制剂，其特征在于氰基丙烯酸烷酯选自聚氰基丙烯酸己酯，聚氰基丙烯酸戊酯，聚氰基丙烯酸丁酯，α-氰基丙烯酸己酯，α-氰基丙烯酸戊酯和α-氰基丙烯酸丁酯。
3.按权利要求1所述的莪术油毫微囊滴眼液制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)药物载体的制备方法：将莪术油溶解在含有右旋糖酐或非离子型表面活性剂的酸性水溶液中，调解pH值至适宜范围，在连续搅拌下，缓缓加入氰基丙烯酸烷酯，两者发生聚合反应，即得粒径为10-1000nm的毫微囊。(2)将上述毫微囊与增溶剂混匀，再加入渗透压调节剂、抗氧剂、增粘剂、防腐剂，充分搅拌，再加磷酸盐缓冲溶液至1000ml，微孔滤膜滤过，滤液分装，即得本发明莪术油毫微囊滴眼液制剂。
4.按权利要求1或权利要求3所述的莪术油毫微囊滴眼液，其特征在于非离子型表面活性剂选自脂肪酸山梨坦(Span)类物质、聚山梨酯(Tween)类物质、聚氧乙烯脂肪酸酯(Myrij)类物质、聚氧乙烯脂肪醇醚(Brij)类物质、聚氧乙烯—聚氧丙稀共聚物。
5.按权利要求4所述的莪术油毫微囊滴眼液，其中所说的脂肪酸山梨坦(Span)类物质可选自月桂山梨坦(Span 20)、棕榈山梨坦(Span 40)、硬脂山梨坦(Span 60)、三硬脂山梨坦(Span 65)、油酸山梨坦(Span 80)、三油酸山梨坦(Span 85)、或其混合物；所说聚山梨酯(Tween)类物质可选自聚山梨酯20(Tween 20)、聚山梨酯40、聚山梨酯60、聚山梨酯65、聚山梨酯80(Tween 80)、聚山梨酯85、或其混合物；所说的聚氧乙烯脂肪酸酯(Myrij)类物质可选自聚氧乙烯40硬脂酸酯；所说的聚氧乙烯脂肪醇醚(Brij)类物质可选自Brij30、Brij35、平平加O、埃莫尔弗(Emolphor)、西土马哥(Cetomacrogol)EL或其混合物；所说的聚氧乙烯—聚氧丙稀共聚物可选自泊洛沙姆(Poloxamer)188、泊洛沙姆(Poloxamer)237、或其混合物。
6.按权利要求1或权利要求3所述的莪术油毫微囊滴眼液制剂的制备方法，其特征在于调解pH值至适宜范围可包括pH2-3，pH3-4，pH4-5，pH5-6。
7.按权利要求1所述的莪术油毫微囊滴眼液制剂的制备方法，其特征在于增溶剂吐温-80的优选浓度0.5％。
8.按权利要求1所述的莪术油毫微囊滴眼液制剂的制备方法，其特征在于制备方法中采用NaHSO3作为抗氧剂，用量为0.1～0.2％。
9.按权利要求1所述的莪术油毫微囊滴眼液制剂的制备方法，其特征在于制备方法中采用苯扎氯铵作为抑菌剂，优选浓度为0.002％。
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